ES2214489T3 - Metodo para la separacion analitica de virus. - Google Patents
Metodo para la separacion analitica de virus.Info
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Abstract
EL PROCEDIMIENTO PERMITE LA COMPROBACION Y/O CUANTIFICACION ANALITICA POBRE DE PERTURBACIONES DE VIRUS O PARTICULAS VIRALES (ANALITO) EN UNA MATRIZ DE MUESTRA LIQUIDA CONTENIENDO COMPONENTES SECUNDARIOS ORGANICOS O INORGANICOS, EN PARTICULAR PARTES DE PROTEINA Y/O NUCLEOTIDOS Y/O OTROS VIRUS. PARA ESTE OBJETIVO SE SEPARAN LOS VIRUS O LAS PARTICULAS VIRALES DE LAS PORCIONES DE PROTEINA Y/O NUCLEOTIDOS EN LA MATRIZ DE MUESTRA DE FORMA ELECTROFORETICA CAPILAR Y AL MISMO TIEMPO DE REGISTRA EL ELECTROCEROGRAMA CORRESPONDIENTE. LAS FRACCIONES COORDINADAS CON EL ANALITO PUEDEN SER IDENTIFICADAS COMO PUNTOS DE VIRUS EN EL ELECTROCEROGRAMA MEDIANTE VALORACION ELECTROSCOPICA DE INTENSIDAD MAXIMA CARACTERISTICA APROXIMADA. PARA LA MEJOR IDENTIFICACION PUEDE SER AÑADIDA A LA MATRIZ DE MUESTRA UNA MUESTRA DE REFERENCIA DE UN VIRUS CONOCIDO O UNA PARTICULA VIRAL CONOCIDA.
Description
Método para la separación analítica de virus.
La invención se refiere a un método para la
detección analítica no destructiva y/o la cuantificación de virus o
partículas víricas (analitos) en una matriz de muestra líquida
conteniendo compuestos orgánicos o inorgánicos secundarios
concretamente parte de proteínas y/o nucleótidos y/o otros
virus.
Se conocen métodos inmunológicos basados en
interacciones especificas antfgeno-anticuerpo. Los
numerosos métodos aplicados, Vg. ELISA
(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay),
reacción de unión a complemento, SNT (Serum Neutralisation Test) y
anticuerpos marcados por fluorescencia SE diferencian únicamente en
el método de detección.
El problema de estos métodos radica en la elevada
especificidad de la reacción de detección respecto a la región
inmunogénica del virus. Tampoco es posible distinguir entre la
actividad antigénica de la partícula vírica y la de la proteína
inmunorreactiva. A la inversa, también pueden obtenerse resultados
positivas falsos o reactividades
cruzadas.
cruzadas.
La actividad especifica de los virus se mide
habitualmente basándose en los dos efectos siguientes.
a) Identificación de un efecto patogénico
específico del virus sobre las células blanco.
Se puede mencionar aquí a titulo de ejemplo la
inspección ocular de una población de células infectadas en
relación con su citopatogenicidad, hemoaglutinación o
hemoadsorción.
b) Por ejemplo, se puede medir una reacción
enzimática especifica de virus en retrovirus, por medio de la
actividad de la transcriptasa inversa.
El problema reside en este caso en el escaso
poder de cuantificación y la incertidumbre sobre la importancia de
los sistemas de ensayo para el poder de transferencia al huésped
natural.
Los métodos de biología molecular pueden
resumirse del modo siguiente.
a) En diagnósticos mediante sondas, las
secuencias de nucleótidos víricos se identifican por hibridación con
sondas de genes introducidas específicamente.
b) Los genes víricos se identifican mediante una
muestra con un corte específico producido mediante enzimas de
restricción.
c) Los virus se identifican mediante la
amplificación de secuencias específicas de genes (PCR).
d) Los genes víricos se identifican por
secuenciación de nucleótidos.
Estos métodos engloban la máxima información para
la identificación de un virus. Sin embargo, resultan relativamente
costosos, laboriosos y no muy adecuados para la cuantificación. Por
otra parte, estas técnicas analíticas describen el genotipo en vez
del fenotipo del virus.
El patrón de proteínas específico del virus puede
identificarse por separación mediante diversas técnicas de
electroforesis y cromatografía. Adicionalmente pueden reconocerse
las proteínas inmunogénicas por métodos inmunológicos (inmunoblot).
Los virus tienen que estar muy limpios antes de su corte (costes
añadidos de purificación) para poder clasificar las bandas de
proteínas. Los virus que ya están desnaturalizados también pueden
presentar el modelo
\hbox{correcto.}
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de
separación relativamente nueva, en la que la muestra a analizar se
separa en un capilar situado en un campo eléctrico de alta tensión,
debido a velocidades de migración diferentes. La detección tiene
lugar directamente en el capilar con ayuda de detectores ópticos
[1]. El ámbito de aplicación de la CE es muy amplio, extendiéndose
desde el análisis de iones, la separación de enantiomeros, el
análisis de proteínas y de nucleótidos, hasta la separación de
partículas y virus [2]. Hasta la fecha se han estudiado mediante
esta técnica, sobre todo moléculas individuales o partículas
homogéneas estables desde un punto de vista mecánico. Por ejemplo,
en [3] se describe la separación de partículas de lipoproteína
recombinante por electroforesis capilar. En [10] se describe la
separación de un virus por electroforesis capilar.
Para la detección sensible por fluorescencia se
utilizan con éxito para el DMA y el RNA, reactivos de tinción de
unión a DNA/RNA [4, 5]. Estas tinciones muestran en selectividades
algo distintas para los nucleótidos de cadena simple y los de
cadena doble, o máximos distintos de fluorescencia para RNA y DNA.
Así, por ejemplo, el anaranjado de acridina muestra un máximo de
emisión de fluorescencia a 520 nm para DNA y a 650 nm para RNA. La
detección por fluorescencia en la CE se describe asimismo, casi
exclusivamente para DNA bicatenario [6].
En la bibliografía se han descrito numerosos
métodos para la determinación de constantes de unión en las
interacciones proteína-ligando mediante la
utilización de CE [7, 8]. Los métodos se basan en un desplazamiento
del tiempo de migración durante la interacción o en modificaciones
del área del pico de un componente interactuante. Esto puede
ponerse en practica experimentalmente mediante los siguientes
procedimientos.
- 1.
- Los componentes interactuantes se incuban antes de la separación por CE y los complejos formados se separan de los componentes individuales utilizando CE.
- 2.
- Un componente interactuante se introduce en el tampón CE y se mide el desplazamiento en el tiempo de migración del otro componente (electroforesis capilar de afinidad).
El primer método tiene la ventaja de ser
económico en material y variable en cuanto a la elección de los
componentes participantes, por lo que es el que se ha estudiado
principalmente.
La invención tiene por objeto la mejora de la
investigación analítica de virus, de modo que se puedan identificar
y/o cuantificar de modo rápido y precise en una matriz de muestra
liquida conteniendo compuestos orgánicos o inorgánicos secundarios,
particularmente mitades de proteínas y/o nucleótidos.
El objeto se consigue de acuerdo con la invención
utilizando un método, en el que los virus o las partículas víricas
se separan de las mitades de proteínas y/o nucleótidos en la matriz
de muestra mediante electroforesis capilar y al mismo tiempo se
registra el electroferograma asociado con el proceso y se
identifican las fracciones asignada a los analitos corno picos
correspondientes a virus en el electroferograma mediante la
interpretación espectroscópica con ayuda de máximos característicos
utilizando colorantes de unión a RNA/DNA, identificables por
espectroscopia, para teñir E virus o las partículas víricas.
Las partículas víricas son por definición virus
activos y virus inactivados, así come partículas modificadas, bien
químicamente, mediante biología molecular o mediante enzimas, que
deben considerarse de tipo vírico debido a las propiedades de si
superficie o por su composición estructural. Los virus (partículas
víricas) pueden contener DMA o RNA, de cadena doble o simple y
pueden presentar envoltura o no La separación no depende del tamaño
del virus; los viroides o viriones también pueden caracterizarse
con este procedimiento.
Los virus pueden identificarse directamente a
partir de cualquier matriz de muestra Vg. de material biológico
(suero, orina, células, plasma, sobrenadante de células humor
acuoso, saliva, etc.) o a partir de formulaciones no biológicas
(agua medicamentos, muestras de tierra, etc.). Mediante la
utilización de colorantes fluorescentes en combinación con
detección por fluorescencia puede alcanzarse una sensibilidad
particularmente elevada.
Para la identificación es conveniente añadir a la
matriz de muestra una muestra de referencia de un virus conocido o
de una partícula vírica conocida.
Otra mejora consiste en incubar el virus o la
particular vírica con anticuerpos específicos, que produzcan un
desplazamiento del tiempo de migración electroforética o una
modificación en el pico característico del virus.
Mediante el nuevo método puede supervisarse y
controlarse favorablemente la producción de virus durante la
fabricación de vacunas.
Otra aplicación muy importante reside en la
posibilidad de diagnostico directo de virus en materiales
biológicos, particularmente en los humores corporales.
La utilización del método según la invención
aporta las siguientes ventajas.
En comparación con las técnicas analíticas
actuales, la separación de las partículas víricas por
electroforesis capilar es superior por la sencilla preparación de
las muestras, los cortos tiempos de análisis, la posibilidad de una
cuantificación exacta, la posibilidad de automatización, la
posibilidad de estandarización y por la calidad añadida de la
información, ya que es la primera vez que pueden identificarse y
cuantificarse virus intactos sin un análisis cualitativo.
Estas ventajas tienen repercusiones
particularmente ventajosas:
- a)
- En el Control de Procesos
- b)
- La utilización de este método permite por primera vez, además de supervisar el proceso, controlarlo durante la fabricación de vacunas, debido a la rapidez del análisis y a que este es cuantitativo.
- b)
- En Control de Productos
- Mediante este procedimiento es posible gestionar por primera vez la garantía de calidad del producto final utilizando un método estandarizado, desde el momento de la formulación, hasta la supervisión de la estabilidad de almacenamiento y de las condiciones de transporte.
- c)
- En el Diagnostico de virus
- La utilización de este método permite por primera vez detectar e identificar directamente virus. Esto tiene gran importancia para supervisar el producto durante la producción de virus y para garantizar la ausencia de virus en materiales biológicos.
d) En la Supervisión de Terapias
- Cuando se utilizan fármacos antivíricos puede supervisarse directamente el resultado de la terapia.
- e)
- En la Identificación de Virus
- Debido a las distintas propiedades electroforéticas de los virus y a la detectabilidad especifica en el capilar, pueden identificarse virus conocidos y determinarse virus desconocidos. De este modo también pueden identificarse paralelamente varios virus (cepas de virus) distintos.
A continuación se describe, con ayuda de ejemplos
y mediante la utilización de curvas, el procedimiento que permite
separar virus y partículas víricas por electroforesis capilar,
identificarlas y cuantificarlas directamente mediante la nueva
técnica analítica.
Las Figs. 1 (a y b): ilustran un electroferograma
capilar de una muestra de referencia inactivada de fiebre aftosa,
detección a 210\pm8 nm (a) y 257\pm8 nm (b). La seria
correspondiente al virus puede identificarse por su incremento en la
detección a 257 nm.
La Fig. 2: ilustra un espectro DAD del virus
inactivado de la fiebre aftosa de la Fig. 1.
Las Figs 3 (a y b): ilustran un
electroferograma capilar de un concentrado inactivado de fiebre
aftosa. Detección a 210\pm8 nm (a) y 257\pm8 nm (b). El virus
esta indicado con una flecha.
Las Figs. 4 (a y b): ilustran una
comparación de las separaciones CE de las muestras de referencia
inactiva (a) y activa (b) de fiebre aftosa. Detección a 257 nm.
La Fig. 5: ilustra la separación CE del virus
tenido, inactivado de fiebre aftosa de la Fig. 1. Detección a
257\pm8 nm. La serial a 3.8 min podría deberse a un exceso de
bromuro de etidio procedente de la incubación. La serial
correspondiente al virus no se desplazo por causa de la tinción
(comparar con la Fig. 1).
La Fig. 6: ilustra los espectros DAD de bromuro
de etidio (a) y del virus tenido, inactivado de la fiebre aftosa
(b) de la Fig. 5. De este modo pudo verificarse el éxito de la
tinción del virus. La serial correspondiente al virus también se
especificó de este modo.
La Fig. 7: ilustra la separación por CE del
concentrado tenido (YOYO), inactive de fiebre aftosa de la Fig. 3
utilizando detección LIF. De la mezcla de complejo (Fig. 3) solo
sigue siendo detectable el virus, que se detecta con una
sensibilidad claramente superior.
Las Figs. 8 (a y b): ilustran una
comparación de separaciones mediante CE de virus inactive de
dermatitis pustulosa contagiosa ovina antes (a) y después de la
incubación utilizando un MAB específico de dermatitis pustulosa
contagiosa ovina (b). El virus se tino con YOYO y se detecto
mediante LIF.
Las Figs. 9 (a y b): ilustran separaciones
por CE del núcleo del virus de dermatitis pustulosa contagiosa
ovina después de la tinción con YOYO, detección a 257 nm (a y
detección LIF (b). Los distintos tiempos de migración son
consecuencia de la: distintas condiciones de separación.
La Fig. 10: ilustra el espectro DAD del núcleo
del virus de dermatitis pustulosa contagiosa ovina con YOYO
intercalado de la Fig. 9. La intercalación produjo un máximo de
absorción en la región de excitación del láser de argón del detector
LIF (495 nm).
Las Figs. 11 (a y b): muestran una
comparación de los tiempos relativas de migración de fiebre aftosa
On (a) y fiebre aftosa Oi_{m} (b) sin MAB (bandas oscuras)
después de incubación con diferentes MAB de Oi
anti-fiebre aftosa (bandas claras).
La muestra objeto de análisis se introduce en
forma liquida (solución, suspensión) en un capilar previamente
lavado con el tampón de separación o relleno con un sistema tampón.
El transporte del flujo esta asegurado en ambos extremes del capilar
por contacto directo, o a través de un tampón conductor, y se crea
un campo eléctrico e el capilar mediante la aplicación de una
corriente de alto voltaje. Los virus se separar por efecto del
campo eléctrico. La identificación directa de los virus en el
capilar se realiza por detección de absorción UV a una o varias
longitudes de onda. Dado que los virus se componen de proteínas y
de nucleótidos, la detección especifica de los virus es posible
mediante detección a 256-260 nm (máximo de absorción
para nucleótidos) y 210, 280 nm (absorción de proteínas). Cuando
los virus son muy grandes la dispersión de la luz impide la
identificación directa por absorción UV (cf. ejemplo 2.3). Sin
embargo, en caso de virus conocidos puede utilizarse la dispersión
de la luz para la identificación y la cuantificación. El tampón de
separación contenido en el capilar se ajusta para la separación y
la estabilidad del virus (valor de pH, concentración fónica,
detergentes, aditivos). El aparato necesario es cualquier
dispositivo de CE dotado de un detector óptico. La muestra puede
introducirse en el capilar de modo electrocinético, hidrodinámico o
por inyección en vacío o mediante aplicación de presión. No existen
limitaciones respecto al capilar (capilar de sílice fundida),
revestido o no, Teflón o cualquier otro material orgánico o
inorgánico). El diámetro del capilar tampoco influye en la
separación, estando este únicamente limitado por las condiciones de
la electroforesis (transporte de flujo, capacidad de detección,
disipación de calor).
Los virus de la fiebre aftosa pertenecen al grupo
de los Picornavirus y presentan una estructura con superficie
icosaédrica formada a partir de cuatro proteínas viricas. El
diámetro aproximado es de 25 nm. En el interior hay un RNA de cadena
sencilla con una longitud aproximada de 5000 bases.
La tabla 1 resume la propagación y la separación
de los virus.
| Propagación del virus | Células en suspensión BHK-21 en cultivos de fermentación de hasta 1,5000 l, |
| recogida de virus después de la lisis celular | |
| Purificación preliminar | Clorificación preliminar de la suspensión de virus en bruto por centrifugación |
| continua a baja velocidad | |
| In activación | Etilenimina (in situ a partir de bromoetilenamina y NaOH) |
| Preparación del concentrado | Precipitación mediante PEG y nueva suspensión en 1/100 del volumen original |
| Purificación de muestras | Centrifugación en gradiente de densidad de CsCI para referencia la separación |
| de partículas 146S (virus enteros e 6 inactivos) |
Se separo una muestra de referencia (cf. tabla 1)
(100 ug/ml) por electroforesis; capilar en un aparato de
electroforesis capilar de la empresa Hewlett-Packarc
(tipo ^{30}HPCE). Las condiciones de medición se resumen en la
tabla 2. En la Fig 1 se muestra el electroferograma asociado. La
marcada serial a 6,9 min aparece claramente en la transición de 210
a 257 nm. El espectro UV de esta serial se registro directamente a
partir de la Fig. 1 mediante un conjunto detector de diodos (DAD).
El máximo registrado a 256 nm es característico de los nucleótidos,
mientras que el máximo intense de onda corta y la caída gradual a
300 nm solo se explica por porciones de proteínas adicionales (Fig.
2). E espectro UV medido en el capilar fue idéntico al espectro UV
del virus separada y, por tanto, pudo utilizarse para la
identificación directa de la serial correspondiente al virus.
Ninguno de los componentes secundarios de la Fig. 1 mostró un
espectro UV similar y, por tanto, tampoco representaba ninguna
partícula vírica intacta.
| Capilar: | Capilar de sílice fundido, 75 urn de diámetro interno, 64,5 cm. de longitud, 56 cm. |
| hasta el detector. | |
| Tensión: | 20 kV |
| Tampón: | Tris (25 mmolar) glicina (192 mmolar) pH 8,5 |
| Temperatura: | 25ºC |
| Detección: | DAD 190-600 nm, Xi 210\pm8 mm, X_{2} 257\pm8 mm |
| Inyección: | Presión (20 seg x 5 x 10^{3} Pa) |
| Lavado del capilar | 1 NaOH (0.1 N, 1 min., 5 x 10^{4} Pa) |
| previo a la inyección: | 2 Tampón (3 min, 5 x 10^{4} Pa) |
El virus inactivado pudo identificarse
directamente (Fig. 3, condiciones de medición en la tabla 3) en el
concentrado (cf. tabla 1). Como era de esperar apareció un
electroferograma del complejo a 210 nm. El ruido de fondo biológico
fue claramente mas bajo entre 210 y 257 nm y la serial que destacaba
fuertemente indicaba un contenido importante de nucleótidos. La
serial correspondiente al virus (flecha) se pudo identificar
mediante el espectro UV y por inyección conjunta utilizando la
correspondiente muestra de referencia (no representada en la
Figura). En el ejemplo 2.2 se muestra una identificación mas
sencilla y directa.
| Capilar: | Capilar de sílice fundido, 50 urn de diámetro interno, 64,5 cm de longitud, 56 cm |
| hasta el detector | |
| Tensión: | 20 kV |
| Tampón: | Tris (25 mmolar) glicina (292 mmolar) dodecilsulfato sodico (50 mmolar), pH 8,5 |
| Temperatura: | 25ºC |
| Detección: | DAD 190-600 nm, A,i 210\pm8 mm, X_{2} 257\pm8 mm |
| Inyección: | Presión (20 seg x 5 x 10^{3} Pa) |
| Lavado del capilar | 1. NaOH (o,1 N, 1 min, 5 x 10^{4} Pa) |
| previo a la inyección: | 2. Tampón (3 min, 5 x 10^{4} Pa) |
Se purificaron muestras de referencia del
material video antes y después de la inactivación (cf. tabla 1). La
actividad del virus se observe por titración en cultivos de células
BHK (valoración>10^{7} KID_{SO}). Ambas muestras (activa e
inactiva) se ajustaron a la misma cantidad de partículas 146S y se
separaron con un aparato de electroforesis capilar Perkin Elmer
(tipo ABI 270 A-HT) (condiciones de medición en la
tabla 4). La detección a 257 nm mostró electroferogramas comparables
para ambos preparados (Fig. 4). Los virus active e inactive no
pudieron separarse mediante CE. Tampoco cabía esperar cambios en la
condición de carga de la superficie, de importancia fundamental
para la separación CE, ya que el reactivo de in activación
reacciona preferentemente en el interior del virus de la fiebre
aftosa.
| Capilar: | Capilar de sílice fundido, 50 urn de diámetro interno, 72 cm de longitud, 51 cm |
| hasta el detector | |
| Voltaje: | 20 kV |
| Tampón: | Tris (25 mmolar) glicina (192 mmolar) pH 8,5 |
| Temperatura: | 35ºC |
| Detección: | UV 257 nm |
| Inyección: | Vacío (5 seg x 17 x 10^{3} Pa) |
| Lavado del capilar | 1. NaOH (0.1 N, 1 min, 68 x 10^{3} Pa) |
| previo a la inyección: | 2. Tampón (3 min, 68 x 10^{3} Pa) |
Los ejemplos 1.1 - 1.3 muestran claramente la
idoneidad de esta nueva técnica analítica para la identificación
directa de virus actives y partículas víricas inactivadas (muestras
inactivadas). Incluso las matrices de muestra de complejo, que se
dan Vg. en el concentrado, no interfieren con la separación. En
este case resulta muy ventajoso el alto rendimiento de separación
de la electroforesis capilar y la buena compatibilidad de la
técnica analítica con la matriz, que esta libre de material de
separación en fase sólida. El nuevo método universal podría
demostrarse con éxito y utilizarse mediante estos ejemplos. Los
virus pueden detectarse e identificarse directamente mediante esta
nueva técnica analítica.
El área del pico correspondiente a la serial del
virus guarda relación con la cantidad del virus, por lo cual es
apto para la cuantificación directa de la concentración de este. El
ejemplo del virus de la fiebre aftosa indicaba que la absorción UV
podía utilizarse para la identificación directa de la serial
correspondiente al virus. En el caso de virus muy grandes la
difracción de la luz impide la identificación directa por absorción
UV. Además, el limite de detección para los virus que absorben
radiación UV es del orden de microgramos por mililitro
(>10^{6} partículas/ml) y por tanto inadecuado a efectos
prácticos en muchos cases. En la sección siguiente se exponen
métodos de detección especifica para este tipo de virus.
A continuación se describe el modo de utilización
de colorantes de unión a DNA/RNA para la tinción directa de virus.
En una extensión del método de separación de virus y partículas
víricas expuesto en la Sección 1 se describe también en primer
lugar la facilidad de localización de la serial, o la mera
posibilidad de localización de la serial por vez primera,
particularmente en sistemas de complejo, y en segundo lugar el modo
de conseguir una especificación mas exacta y, sobre todo, un
incremento extraordinario de la sensibilidad mediante la detección
por fluorescencia.
Los virus tenidos de este modo pueden separarse
de otros componentes que contienen DNA/RNA mediante CE. Esto
permite identificar directamente el virus marcado. Puede
conseguirse una especificación mas del virus a través de IE
selectividad de los colorantes correspondientes al DNA o al RNA, de
cadena doble o de cadena simple respectivamente. Los virus con y
sin envoltura también pueden diferenciarse basándose en la
diferente velocidad de paso de los colorantes a través de las
membranas.
Debido a la incorporación múltiple de colorantes
(fragmentos de un total de 10 a 20 bases), la detección por
fluorescencia produce un aumento extraordinario de la sensibilidad.
Así, estadísticamente se incorporan hasta 15.000 moléculas de
colorante, cada una de las cuales contribuye a la serial por
fluorescencia. Mediante un simple calculo se llega a la conclusión
de que el límite de detección por fluorescencia para determinados
virus es inferior a una partícula.
De este modo, por primera vez se separan virus
tenidos mediante CE, se identificar con ayuda de la absorción
característica de radiación UV y se detectan por fluorescencia con
una sensibilidad alta. Mediante la utilización de procedimientos
basados empíricamente en los ejemplos 1.1 - 1.3. Se tiñeron virus de
fiebre aftosa con colorantes de unión a DNA/RNA y se analizaron
mediante detección por CE y DAD. Los máximos de absorción de onda
larga de los virus teñidos corresponden en una primera aproximación
a los máximos de absorción del RNA o DNA tenidos libres.
La muestra objeto del análisis:
- a)
- se incuba con el colorante de unión a DNA/RNA y a continuación se separa y analiza según el método descrito en la Sección 1, o bien
- c)
- se añade el colorante de unión a DNA/RNA al tampón de separación y el virus se tiñe en el capilar durante la separación. El virus con el DNA/RNA marcado por el colorante puede detectarse por la absorción UVA/IS especifica o por la extinción y emisión especifica de la fluorescencia.
Aquí se exponen a modo de ejemplo dos de los
numerosos métodos de detección por tinción satisfactoriamente
utilizados con diferentes virus y colorantes.
En primer lugar se describe la separación,
identificación y detección de alta sensibilidad de virus de fiebre
aftosa tenidos.
Al teñir con los colorantes de unión a DNA/RNA se
desplaza el espectro de absorción de onda corta y aparece una
absorción adicional en la zona visible. Por tanto, por primera vez
es posible utilizar la absorción UV para detectar el éxito de la
separación de los virus tenidos, pudiendo además identificarse el
virus independientemente mediante su espectro de absorción
característico.
Otro factor de complicación reside en que los
virus de la fiebre aftosa contienen RNA de cadena simple, mientras
que los reactivos de tinción han sido desarrollados para DNA de
cadena doble. No obstante, las investigaciones preliminares indican
que el DNA y el RNA libres de cadena simple también pueden teñirse
y detectarse mediante CE, si bien en menor grado.
La muestra de referencia del virus de fiebre
aftosa del ejemplo 1.1 (300 ug/ml) conteniendo 10 ug/ml de bromuro
de etidio (vease, Vg., R.P. Haugland, Handbook of Fluorescent
Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. 1992) se
incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente y a continuación
se estudio con ayuda de CE (las condiciones se exponen en la tabla
2). Se detectaron dos señales (Fig. 5). Los espectros UVA/IS en la
CE están representados en la Fig. 6. La serial a 3,8 min indicaba
un exceso de bromuro de etidio en la incubación (confirmado asimismo
por inyección conjunta). El pico a 6,9 min indicaba máximos de
absorción a 200, 257 (intense) y 510 nm (débil). El desplazamiento
para la onda larga del máximo de absorción visible correspondiente
al bromuro de etidio libre (495 to 510 nm) es característico de la
intercalación con bases de ácidos nucleicos. La posición de la
serial correspondiente al virus en el electroferograma prácticamente
no se desplazo por la adición de bromuro de etidio (cf. Fig 1 y
5).
El ejemplo del bromuro de etidio ha permitido
demostrar con éxito la separación e identificación de virus
teñidos.
Tras diluir la muestra de concentrado de fiebre
aftosa del ejemplo 1.2 con el tampón de separación en una
proporción 1:15 (tabla 5) se incubo con tetrayoduro de
1,1'-(4.4,7.7-tetrametil-4,7-diazaundecametilen)bis-4-[3-metil-2,3-dihidrometil(benzo-1,3-oxazol)-2-metiliden]-quinolinio
(YOYO) (1 umolar) durante 30 minutos a temperatura ambiente y a
continuación se midió mediante CE (condiciones de medición en la
tabla 5). El concentrado mostró una única serial (Fig. 7). La
fluorescencia inherente de YOYO era tan baja que ya no se podía
detectar YOYO libre por fluorescencia. El resto de señales del
concentrado no eran visibles en esta detección especifica de
nucleótidos (compárese la detección UV de la muestra idéntica de la
Fig. 3). El desplazamiento brusco en el tiempo de migración se
produjo debido a las distintas longitudes del capilar y las
distintas intensidades de campo (cf. Tabla 3 y Tabla 5).
| Capilar: | Capilar de sílice fundida, 50 um de diámetro interno, 40 cm de longitud, 40 cm |
| hasta el detector | |
| Tensión: | 20 kV |
| Tampón: | Tris (25 mmolar) glicina (192 mmolar) dodecilsulfato sódico (50 mmolar), pH 8,5 |
| Temperatura: | 25ºC |
| Detección: | LIF (argón) EX 488, EM 520 nm, ganancia 100 |
| Inyección: | Presión (10 seg x 10^{3} Pa) |
| Lavado del capilar | 1. NaOH (0.1 N, 1 min, 5 x 10^{4} Pa) |
| previo a la inyección: | 2. Tampón (3 min, 5 x 10^{4} Pa) |
El virus de la dermatitis pustulosa contagiosa
ovina pertenece al grupo de los virus Parapox. El virus esta
constituido por un DMA bicatenario con aprox. 140.000 pares de
bases, empaquetado junto con un gran numero de enzimas por un
revestimiento de proteína (nucleo) y otro revestimiento de
lipoproteína. Por esta razón se trata de un tipo de virus
denominado virus con envoltura. La partícula vírica tiene forma de
ladrillo de tamaño aproximado de 400x200x200 nm, por lo que se
trata de uno de los virus mas grandes. En virtud de la estructura
superficial y el tamaño tan diferente en comparación con el virus de
la fiebre aftosa, el presente ejemplo debe demostrar la amplitud de
la aplicación del nuevo método.
El virus se separo del modo siguiente (tabla
6):
| Propagación del virus: | Células monocapa BK-clon 3 A en recipientes apilados; recogida de 150 l de |
| virus después de la lisis celular | |
| Purificación preliminar | Clarificación preliminar de la suspensión de virus en bruto por centrifugación |
| continua a baja velocidad | |
| Inactivación | (3-propiolactona |
| Segunda fase de purificación | Centrifugación continua a baja velocidad |
| Purificación de muestras | Centrifugación por gradiente de densidad en tartrato sódico para la separación |
| de referencia: | de la banda del virus |
La identificación espectroscópica directa por UV
queda excluida debido al tamaño del virus, puesto que en un virus
de este tamaño, la luz en el UV se dispersa. Por otra parte, la
muestra de dermatitis pustulosa contagiosa ovina presenta una
concentración demasiado baja para la detección UV, incluso después
de la segunda etapa de purificación (tabla 6). Por tanto, el virus
solo puede identificarse mediante detección por fluorescencia.
Baypamun® (un modulador inmunológico comercial de
la empresa Bayer AG a base de virus inactivados de dermatitis
pustulosa contagiosa ovina) se incubo con YOYO (1 umolar) durante
30 minutos a temperatura ambiente y a continuación se separo
mediante CE (condiciones de medición en la tabla 5, pero con
Tris/borato, 100 mmolar, pH 8,5 como tampón de separación). A 2,73
min el exceso de YOYO esta representado por un pico sumamente
pequeño (Fig. 8a). A 9,46 min pudo aislarse el virus de dermatitis
pustulosa contagiosa ovina y detectarse como serial individual. Los
picos adicionales que aparecen son debidos, probablemente, a la
matriz de muestra, ya que en esta zona del electroferograma fue
posible medir por UV una absorción ancha. Los picos siempre
aparecen durante dicha medición. No obstante, la posición de los
picos no es reproducible.
De este modo ha sido posible identificar mediante
detección por fluorescencia un virus con envoltura
extraordinariamente grande. En el ejemplo 3.2 se describe otra
identificación de la serial.
Como ya se ha indicado en la introducción del
ejemplo 2.3, el tamaño y la concentración de virus de la dermatitis
pustulosa contagiosa ovina no permiten la detección directa por UV.
Además, dado que se trata de un virus con envoltura, debería
intentarse estudiar el revestimiento proteínico interno que incluye
el DNA (núcleo).
Se elimino la membrana lipoproteínica del
Baypamun según un procedimiento modificado (9) por agitación con
NP-40 (1%, 1 hora, 37ºC.) y se aglomero el núcleo
por centrifugación de gradiente de densidad (sacarosa 36%, PBS 150 m
molar, 225.000 g, 1 hora). La muestra así concentrada se incubo con
YOYO (concentración 1 umolar) durante 30 minutos a temperatura
ambiente y se midió por CE utilizando DAD (condiciones de medición
en la tabla 2). El electroferograma a 257 nm (Fig. 9a) mostró una
banda ancha a 4,5 min, que pudo identificarse como exceso de YOYO.
De las tres señales intensas entre 6,4 y 6,8 min solo la ultima
mostró el máximo de absorción a 495 nm característico de la
intercalación de YOYO (Fig. 10). La muestra idéntica se estudio a
continuación mas a fondo mediante detección LIF. Las condiciones de
medición corresponden a las de la tabla 5, exceptuando que se
prescindió de dodecilsulfato sódico en el tampón de separación
(mismo tampón que en la detección UV). El tiempo total de migración
se desplazo claramente debido al cambio de capilar y a la
modificación de la intensidad de campo en comparación con la
medición UV (Fig. 9). El YOYO en exceso se pudo identificar como un
pico minúsculo a 1,9 min. De las tres señales UV solo pudo
detectarse la correspondiente al producto teñido (el núcleo).
Además, se consiguió un aumento de sensibilidad en un factor de
10^{4} en comparación con la detección UV del núcleo sin
teñir.
Mediante estos estudios ha podido demostrarse,
que no solo pueden identificarse directamente virus completos (con
envoltura o sin ella), sino también partículas víricas modificadas,
que pueden prepararse a partir de virus con envoltura por
eliminación de la membrana lipoproteínica.
En la siguiente Sección se describe la
consecución de otra mejora, conseguida gracias a una especificación
adicional de las señales correspondientes al virus.
Se han realizado investigaciones sobre el modo de
diferenciar con claridad virus conocidos mediante anticuerpos
específicos (MAB). Aquí se dispone de toda la diferenciación
inmunológica de virus establecida en combinación directa con la
separación de virus en CE.
La muestra objeto de análisis:
- a)
- se incuba con el anticuerpo (MAB, antisueros, mezclas de anticuerpos, anticuerpos marcados) y se separan y analizan conforme a los métodos descritos anteriormente, o bien
- b)
- se añaden los anticuerpos (MAB, antisueros, mezclas de anticuerpos, anticuerpos marcados) al tampón de separación y se separa y analiza el virus según una electroforesis capilar de afinidad teniendo en cuenta los métodos descritos anteriormente.
La interacción especifica del anticuerpo
(anticuerpos) con el virus puede detectarse mediante un
desplazamiento del tiempo de migración o por una reducción de la
intensidad de la serial correspondiente al virus.
En los siguientes ejemplos se incubo el virus
objeto de estudio con anticuerpos específicos y a continuación se
separo utilizando CE. La estabilidad del enlace
anticuerpo-antígeno es lo suficientemente sólida
como para superar la separación en disolventes no desnaturantes y
permanecer el complejo intacto.
En consecuencia es posible medir la diferencia de
tiempo de migración entre el virus libre y el complejo
virus-anticuerpo de diferentes series de
separación.
La muestra de dermatitis pusturlosa contagiosa
ovina del ejemplo 2.3 después de la incubación con el colorante se
mezclo adicionalmente con un anticuerpo de virus de dermatitis
pustulosa contagiosa ovina (MAB) (2 ug/ml) y se incubo durante
otros 30 minutos a temperatura ambiente. Las condiciones de medición
fueron idénticas a las del ejemplo 2.3. La Fig. Bb ilustra
el electroferograma. Este solo difiere del electroferograma del
virus libre en la posición de la serial correspondiente al virus
(Fig. 8). La serial de fluorescencia del virus de dermatitis
pustulosa contagiosa ovina se desplazo de 9,46 min a 9,34 min debido
al enlace del MAB; el desplazamiento pudo reproducirse. Debido al
tamaño del virus no era de esperar un desplazamiento mayor. La
extensión del ámbito de aplicación del presente método pudo
demostrarse mediante este ensayo, por estar este virus entre los de
mayor tamaño en general. El desplazamiento de la serial demuestra
que la serial de fluorescencia procede de hecho del virus y, cuando
el MAB tiene la especificidad suficiente, también puede asignarse
la serial al virus de la dermatitis pustulosa contagiosa ovina. En
el ejemplo siguiente se expone como puede obtenerse un
desplazamiento claramente superior en el caso de virus mas
pequeños.
La muestra de referencia del ejemplo 1.1 (100
ug/ml), que corresponde a la cepa de virus OK, (Or Kaufbeuren)
conocida en la bibliografía, se mezclo con distintos MAB
(1-10 ug/ml) de virus de fiebre aftosa Oi y se
incubo con ácido
antraquinono-1-sulfónico como patron
interno (2 ug/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente y midio
en las condiciones indicadas en la tabla 2. Los tiempos relativas
de migración (t_{mf}) de las muestras incubadas se compararon con
el tmr del virus puro, muestras del cual se prepararon del mismo
modo y en las mismas condiciones de medición (Fig. 11a). Las bandas
oscuras muestran el t_{mr} del virus puro y las bandas claras
muestran el t_{m}, de los virus incubados con anticuerpos. Los
distintos MAB se registran en abscisas y se midieron de izquierda a
derecha en la secuencia. En las bandas oscuras se aprecia una ligera
caída inicial del t_{mr}, que puede atribuirse a un capilar no
totalmente equilibrado. Se pudo observar un desplazamiento algo
marcado del t_{mr} para los anticuerpos 24, 37, 48 y 99. De este
modo se pudo asignar la muestra de referencia investigada desde el
punto de vista serológico a la cepa Oi. La magnitud del
desplazamiento no representa una medida directa de la afinidad del
MAB. El desplazamiento viene determinado por el comportamiento de
migración y por el numero de anticuerpos enlazados. Todos los MAB
de acción positiva mostraron un desplazamiento del t_{mr} entre
0,05 y 0,13. El anticuerpo 75 no produjo un desplazamiento
apreciable del t_{mr} y, por tanto, la identificación del virus
mediante este anticuerpo no pudo demostrarse. Es posible que los
tiempos de migración del MAB 75 y de la cepa del virus de fiebre
aftosa OK, fueran demasiado parecidos, o bien que el MAB 75 no
reconoce esta cepa del virus.
Con objeto de comprobar el enlace entre el MAB y
la cepa de fiebre aftosa Oi_{k}, se incubaron los mismos
anticuerpos con cepa de fiebre aftosa Oi_{m} bajo idénticas
condiciones y se midieron comparativamente (O_{1m}
(Oi-Manisa) es otra cepa de virus conocida en la
bibliografía). En este caso también se aprecia la caída inicial del
t_{mr} en las bandas oscuras. Tras incubación con los MAB (bandas
claras) solo el MAB 75 mostró un desplazamiento importante de 0,10.
Según esto, este MAB reconoce claramente la cepa de fiebre aftosa
O_{1m}. Dado que las cepas de fiebre aftosa O_{1m} y O_{1k}
se detectaron a un t_{mr} muy similar, se excluye el no
reconocimiento de la cepa de fiebre aftosa OK, debido a tiempos de
migración similares del virus y del complejo
virus-MAB. De este modo ha podido confirmarse el
MAB 75 como anticuerpo de la cepa del virus de fiebre aftosa
O_{1m} mientras que todos los demás MAB solamente reconocen la
cepa del virus de fiebre aftosa O_{1k}. El resto de los MAB
desplazan la cepa del virus de fiebre aftosa O_{1m} como máximo
en 0,02, lo cual debe considerarse no específico en comparación con
la Fig. 11a.
Las mediciones arriba descritas demuestran
claramente que los virus y las partículas víricas (virus
inactivados, núcleos) pueden analizarse y detectarse directamente
mediante la utilización del método que acaba de desarrollarse.
Incluso las matrices de muestras del complejo (concentrado bruto de
fiebre aftosa, Baypamun) no interfieren con el análisis. Ha podido
demostrarse la extensión del ámbito de aplicación de este método
para virus muy diferentes, mediante los ejemplos de virus pequeños
de tipo Picornavirus (fiebre aftosa), el virus de dermatitis
pustulosa contagiosa ovina, con un gran revestimiento, y el núcleo
de los mismos. Los virus han podido detectarse específicamente
mediante reactivos de tinción específicos para nucleótidos, tanto
por radiación UV como por fluorescencia. Con relación a esto, han
podido observarse aumentos enormes de sensibilidad. Los virus o
partículas víricas pueden detectarse específicamente por formación
de complejos con anticuerpos. El reconocimiento con anticuerpos ha
podido documentarse incluso en presencia de reactivos de tinción.
De este modo se aporta un repertorio analítico completo para la
identificación general de componentes víricos en matrices de
complejos. Por todo ello, este método tiene un potencial de
utilización considerable, tanto para el control de procesos como
para el diagnostico de virus.
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403, 47-61
Claims (7)
1. Método para la detección o cuantificación no
destructiva de virus o partículas víricas en una matriz de muestra
liquida conteniendo componentes secundarios orgánicos o inorgánicos,
partes de proteínas, nucleótidos u otros virus, por el cual
- a)
- se separan los virus o las partículas viricas de los fragmentos de proteínas y/o los nucleótidos en los fluidos corporales mediante un sistema de electroforesis capilar y se registran en un electroferograma y
- b)
- se identifican las fracciones como picos correspondientes a los virus mediante la interpretación de los datos del electroferograma, habiéndose teñido los virus o las partículas víricas con un reactive de unión a RNA/DNA, permitiendo la identificación espectroscópica.
2. Método según la reivindicación 1, que
comprende una etapa mas de incubación del virus o de las partículas
víricas con reactivos de unión a RNA/DNA antes de la separación por
electroforesis.
3. Método según la reivindicación 1, que
comprende una etapa mas de adición del reactive de unión a RNA/DNA
al tampón de separación, con la consiguiente tinción del virus o de
las partículas víricas en el capilar durante la separación por
electroforesis.
4. Método según las reivindicaciones
1-3, que comprende una etapa mas de adición de una
muestra de referencia de un virus conocido o de una partícula vírica
conocida al fluido corporal para la identificación de las
fracciones.
5. Método según las reivindicaciones
1-4, que comprende una etapa mas de incubación del
virus o de las partículas víricas con anticuerpos específicos, con
el consiguiente desplazamiento del tiempo de migración
electroforético o variación en la serial correspondiente al
virus.
6. Método según las reivindicaciones
1-5, caracterizado por permitir la
supervisión y control de virus durante la fabricación de
vacunas.
7. Método según las reivindicaciones
1-5, caracterizado por permitir el
diagnostico de virus en tejidos biológicos, concretamente en fluidos
corporales.
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