CZ2018686A3 - Afinitní nosič pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci a způsob selektivního vychytávání bakteriofágů a/nebo jejich separace pomocí kapilární elektroforézy - Google Patents

Afinitní nosič pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci a způsob selektivního vychytávání bakteriofágů a/nebo jejich separace pomocí kapilární elektroforézy Download PDF

Info

Publication number
CZ2018686A3
CZ2018686A3 CZ2018-686A CZ2018686A CZ2018686A3 CZ 2018686 A3 CZ2018686 A3 CZ 2018686A3 CZ 2018686 A CZ2018686 A CZ 2018686A CZ 2018686 A3 CZ2018686 A3 CZ 2018686A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
bacteriophages
substrate
separation
affinity
capillary
Prior art date
Application number
CZ2018-686A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ308274B6 (cs
Inventor
Filip Růžička
Roman Pantůček
Marie Horká
Original Assignee
Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně filed Critical Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně
Priority to CZ2018-686A priority Critical patent/CZ2018686A3/cs
Publication of CZ308274B6 publication Critical patent/CZ308274B6/cs
Publication of CZ2018686A3 publication Critical patent/CZ2018686A3/cs

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
    • B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/125—Electrophoretic separation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Vynález popisuje afinitní nosič, který je určený pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci. Tento nosič je tvořený substrátem, přičemž povrch substrátu je opatřený naadherovanými buňkami alespoň jednoho bakteriálního kmene. Po napadení buněk specifickými bakteriofágy a po jejich inkubaci se bakteriofágy z buněk uvolní. Následně se pak izolují a separují, s výhodou pomocí kapilární elektroforézy.

Description

Afinitní nosič pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci a způsob selektivního vychytávání bakteriofágů a/nebo jejich separace pomocí kapilární elektroforézy
Oblast techniky
Vynález se týká afmitního nosiče pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci a způsobu selektivního vychytávání bakteriofágů a/nebo jejich separace pomocí kapilární elektroforézy.
Dosavadní stav techniky
Bakteriofágy jsou viry přirozeně napadající pouze bakteriální buňky. Vyskytují se v místech, kde je větší množství jejich hostitelských bakterií, i volně v prostředí. Virulentní bakteriofágy se množí bezprostředně po infekci hostitelské buňky, do které penetrují. Dochází k biosyntéze a maturaci bakteriofágů, a nakonec k jejich uvolnění lyží z buňky, což je pro bakterie letální. Bakteriofágy mají celou řadu aplikačních využití, počínaje od samotného usmrcování (lyže) bakterií, což je jejich svou přirozenou podstatou, dále použití jako částic pro doručování letálních genů nebo substancí do buňky, použití jako biosenzorů pro specifické rozpoznávání buněk a jako zdroj celé řady genů a proteinů, jimiž se dá inspirovat aplikovaný výzkum, např. pro vývoj nových antimikrobiálních látek.
Bakteriofágy mají relativně úzké rozmezí hostitelů často omezené na druhy mikroorganizmů, případně jen na některé kmeny. Nenarušují tedy přirozenou mikroflóru organismu. Na druhou stranu, pokud je třeba získat širokospektrý léčebný přípravek, je nutno kombinovat více bakteriofágů.
V době, kdy se vůči antibiotikům rozvíjí rezistence a antibiotika přestávají účinkovat, je terapeutické využití bakteriofágů velice aktuální. Bakteriofágy lze také využít průmyslově, např. ke konzervaci potravin. Bakteriofágy jsou však v různé míře druhově či kmenově specifické, což umožňuje specificky zacílit terapii. Pokud však neznáme kmen bakterie, na kterou bakteriofágem působíme, je nutno použít směs bakteriofágů. Proto se hledají stále nové bakteriofágy, často s účinkem na konkrétní kmen bakterie. Jejich izolace z prostředí (povrchové a odpadní vody) je však poměrně komplikovaná a náročná.
Dosud se nové lyrické bakteriofágy získávají aplikací tekutého vzorku s potenciálními bakteriofágy zakoncentrovaného tangenciální průtokovou filtrací nebo extrahovaného z půdy či sedimentů na povrch pevných kultivačních médií s kulturou dané bakterie. Po vhodné inkubaci se sledují zóny lýzy bakteriální kultury, tzv. plaky, které způsobil příslušný bakteriofág. Ten je odtud dále izolován a pomnožen ve větším množství. Tyto kroky nesou s sebou řadu nevýhod. Jde zejména o nízkou koncentraci hledaných cílových bakteriofágů, což snižuje účinnost a citlivost metody. Dále je to možný vliv dalších přítomných mikroorganizmů a látek ve vzorcích z prostředí, které mohou inhibovat či interferovat s cílovými bakteriofágy, nebo pomnožovacími kulturami.
Evropská přihláška vynálezu EP 1511998 se týká systémů vícenásobné kapilární elektroforézy. Účelem je separace a detekce proteinů, peptidů, biomolekul a jejich konjugátů, malých molekul a jejich konjugátů a polymerů. Předpokládá paralelní separaci ve více kapilárách nebo elektroforetických trubičkách. Separaci bakteriofágů (virů) nezmiňuje, pouze jejich částí proteinů, biomolekul. Touto metodou se nezíská čistá kultura bakteriofága, se kterou se dá dále komfortně pracovat. Nevýhodou je také to, že touto metodou nelze docílit selektivní separace viru.
- 1 CZ 2018 - 686 A3
Další patentový dokument US 5723031 popisuje postup nedestruktivní analytické detekce a/nebo kvantifikace virů nebo virových částic (analytů) v kapalném vzorku. Tady pro lepší identifikaci viru je použit referenční vzorek se známým virem pro srovnání nebo se do vzorku přidávají známé virové částice. Tato metoda neumožňuje specifické vychytávání bakteriofága ze vzorku. V kapiláře při elektroforéze používají separační pufr obsahující DNA/RNA vazebné činidlo, které se váže na viry nebo virové částice.
Podobnou metodu kvantifikace virů popisuje i patentový dokument WO 2016/131895. Zde také není zmíněn krok selektivního vychytávání fágů v kapiláře. Kvantifikace (adeno)virových částic je provedena na základě standardní křivky odpovídající referenčnímu vzorku.
Podstata vynálezu
Cílem vynálezu není identifikace či kvantifikace bakteriofágů, ale jejich selektivní separace a zakoncentrování, aby je bylo možné použít například k přípravě případných léčiv. Jednoduše řečeno ze vzorku, který obsahuje bakteriofágy, například z odpadní vody, se izolují a pomnoží jen ty bakteriofágy, které jsou ve středu zájmu a které jsou specifické vůči bakteriálním buňkám naadherovaných na afinitním nosiči. Nevýhody vyplývající ze stavu techniky jsou překonány afinitním nosičem a způsobem selektivního vychytávání bakteriofágů ze vzorku nebo vnějšího prostředí, jak jsou definovány v nárocích.
Podstata afinitního nosiče spočívá v tom, že je určený pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci, přičemž je tvořený substrátem, kde povrch substrátu je opatřený naadherovanými buňkami alespoň jednoho bakteriálního kmene.
S výhodou povrch substrátu afinitního nosiče podle vynálezu umožňuje pevnou adhezi bakteriálních buněk alespoň jednoho kmene (vybraného typu bakterie), přičemž substrát je vybrán ze skupiny obsahující: sklo, kovové povrchy, s výhodou nerez, organické povrchy, s výhodou celulóza a povrchy z plastů, s výhodou tvrzený polystyren, polypropylen, teflon, polyethylen, textilie.
Mikroorganismus, jehož buňky jsou naadherovány na povrch substrátu afinitního nosiče podle vynálezu, je vybrán ze skupiny bakterií. Jde především o stafylokoky, zejména s výhodou Staphylococcus aureus, gramnegativní nefermentující bakterie, s výhodou Burkholderia cepacia, pseudomonády, s výhodou Pseudomonas aeruginosa, enterobakterie, s výhodou Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter sp., streptokoky, s výhodou Streptococcus mutons, listerie, s výhodou Listeria monocytogenes, enterokoky, s výhodou Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium.
Podle dalšího provedení vynálezu je povrch substrátu afinitního nosiče planámí, s výhodou povrch desky nebo povrch disku, nebo vnitřní povrch kapiláry.
Podle dalšího provedení vynálezu se na bakteriální buňky, které jsou naadherované na povrchu substrátu afinitního nosiče, specificky vážou bakteriofágy a napadají je. Takto upravený afinitní nosič podle vynálezu slouží k separaci specifických bakteriofágů. Buňky bakterií naadherované na povrchu afinitního nosiče podle vynálezu obsahují po inkubaci se vzorkem nebo vnějším prostředím alespoň jeden kmen bakteriofága.
S výhodou jsou vybrány ze skupiny obsahující lytické bakteriofágy z řádu Caudivirales, s výhodou stafylokokový bakeriofág Kayavirus z čeledi Myoviridae.
Ještě dalším provedením vynálezu je způsob selektivního vychytávání bakteriofágů ze vzorku nebo vnějšího prostředí, přičemž zahrnuje následující kroky:
-2CZ 2018 - 686 A3
- kontakt afmitního nosiče podle vynálezu se vzorkem nebo vnějším prostředím obsahujícím bakteriofágy,
- inkubaci substrátu afmitního nosiče se vzorkem nebo vnějším prostředím obsahujícím bakteriofágy.
Způsob podle vynálezu dále s výhodou zahrnuje krok
- promytí povrchu substrátu afmitního nosiče. Tento krok není nezbytný, ale je výhodný, protože odstraní kontaminanty z povrchu substrátu afmitního nosiče podle vynálezu.
Poté následuje inkubace afmitního nosiče s naadherovanými bakteriálními buňkami napadenými specifickými bakteriofágy podle vynálezu v inkubačním médiu.
Po namnožení specifických bakteriofágů v napadených buňkách, dochází k jejich lýzi a uvolnění z povrchu substrátu afmitního nosiče podle vynálezu.
Podle ještě dalšího provedení způsobu podle vynálezu se uvolněné specifické bakteriofágy buď dále izolují a separují.
S výhodou se separace specifických bakteriofágů provede pomocí kapilární elektroforézy, přičemž povrch substrátu afmitního nosiče je vnitřním povrchem kapiláry.
Způsob podle vynálezu umožňuje vychytávat a zakoncentrovat cílové bakteriofágy a většinu kontaminant odstranit oplachem. Při použití kapilárního formátu je možno též virové částice charakterizovat na základě elektromigračních vlastností již po pomnožení v kapiláře. Také umožní jejich účinnou separaci již v prvním kroku. To vše celý proces usnadní a urychlí.
Způsob podle vynálezu s využitím upraveného povrchu, ať již planámího, či povrchu vnitřního kapiláry, tento způsob selekce bakteriofágů urychlí a usnadní. Umožní tak selektivně zachytit vhodného bakteriofága proti konkrétní bakterii.
Ve způsobu podle vynálezu za účelem selektivního záchytu vhodných bakteriofágů z prostředí se použije vhodný substrát, na jehož povrchu jsou /.mobilizovány (naadherovány) bakterie alespoň jednoho kmene a/nebo směsi bakteriálních kmenů. S výhodou je mobilizován jeden bakteriální kmen.
Povrch substrátu, jako například povrch kapiláry či povrch planámí (např. povrch disku či kuponu) je upraven fýzikálně-chemicky tak, aby umožnil adhezi buněk příslušného mikroorganismu, proti kterému se hledá vhodný bakteriofág. V případě kapilárního uspořádání je povrch substrátu hladký či zdrsněný např. leptáním superkritickou vodou. V případě planámího uspořádání může mít substrát také charakter vláken ve formě textilie. Pro lepší adhezi bakterií je možno na povrch navázat vhodné ligandy, jako je poly-U-lysin. Samotná adheze bakteriálních buněk je ovlivněna mnoha chemickými a fyzikálními vlastnostmi povrchu substrátu, které zahrnují jeho strukturu (hrubost nebo hladkost), povrchový náboj, hydrofobnost / hydrofilnost, pH, teplotu či vhodným kondiciováním (např. vazba sérových bílkovin či poly-U-lysinu).
Po adhezi alespoň jednoho bakteriálního kmene na modifikovaný povrch substrátu vzniká substrát s naadherovanými bakteriemi, který se ponoří do vzorku obsahující bakteriofágy, které jsou ve středu zájmu (např. odpadní vody, upravené odpadní vody, suspenze různých fágů, aj.). Případně je možné substrát s naadherovanými bakteriemi aplikovat přímo do prostředí. Vloží se tedy do vody v zevním prostředí, která obsahuje obrovské množství různých bakteriofágů.
Bakteriofágy ze vzorku nebo z vnějšího prostředí specificky napadnou bakterie naadherované na substrátu. Provede se inkubace. Doba inkubace je v rozmezí 1 až 25 minut, s výhodou 10 až 20
-3 CZ 2018 - 686 A3 minut. Inkubační teplota se pohybuje obvykle v rozmezí 10 °C až 40 °C a odpovídá izolovanému agens i mikroorganizmu sloužícímu pro jeho záchyt.
Po uplynutí vhodné doby inkubace je povrch substrátu s bakteriemi opláchnut, tak aby na povrchu substrátu zůstaly pouze naadherované bakterie napadené hledanými specifickými bakteriofágy. IC oplachu se s výhodou použije oplachový roztok vybraný ze skupiny obsahující fyziologický roztok nebo fosfáty pufrovaný roztok (PBS). Ostatní nezachycené složky vzorku jsou odstraněny (vymyty). Substrát s naadherovanými bakteriemi napadenými hledanými bakteriofágy je dále inkubován po dobu 30 minut až 48 hodin, s výhodou 60 minut až 24 hodin, v inkubačním médiu, vhodném pro daný typ mikroorganismu s výhodou je vybráno ze skupiny obsahující médium typu Tryptono-sójový bujón, Mueller Hintonové bujón, bujón z mozkosrdcové infuze, živný bujón. Dojde k pomnožení hledaných bakteriofágů. Odtud jsou potom dále izolovány. Inkubační teplota se pohybuje obvykle v rozmezí 10 °C až 40 °C.
Nebo je možné po inkubaci a oplachu substrátu afinitního nosiče podle vynálezu bakterie napadené bakteriofágy z povrchu substrátu uvolnit (desorbovat) a po lýzi buněk, uvolněné specifické bakteriofágy dále zpracovávat.
V provedení způsobu selektivního vychytávání bakteriofágů podle vynálezu pomocí kapilární elektroforézy (např. pomocí kapilární izoelektrické fokusace) je pak možno takto zachycené a pomnožené fágy dále separovat a následně zpracovávat. Bakteriofágy a další částice v kapiláře se na základě svých fyzikálně-chemických vlastností rozdělí do jednotlivých zón. Získáme tak izolovanou kulturu fága bez ostatních příměsí, případně bez dalších druhů bakteriofágů. S touto čistou kulturou se pak dá dále komfortně pracovat.
Způsob selektivního vychytávání bakteriofágů podle vynálezu s sebou nese řadu výhod. Zejména jde o zjednodušený primární selektivní záchyt bakteriofágů ze vzorku nebo vnějšího prostředí, který přináší zvýšení citlivosti, účinnosti a urychlení celého procesu selekce.
1) Doba inkubace substrátu s naadherovanými bakteriemi napadenými hledanými bakteriofágy je s výhodou v rozsahu 30 až 60 minut. Po lýzi buněk bakterií je výsledkem relativně vyčištěná a koncentrovaná suspenze potenciálně vhodných bakteriofágů. Navíc, při využití kapilární elektroforézy je možno jednotlivé typy bakteriofágů oddělit. To zvyšuje účinnost a citlivost celého procesu.
U klasické metody je nutná 24hodinová kultivace kultury dané bakterie na povrchu pevných kultivačních médií s primárním vzorkem.
2) Při klasické (kultivační) metodě je třeba ze vzorku odstranit nečistoty a vzít úvahu vliv inhibitorů bakteriálního růstu. To při provedení způsobu podle vynálezu není nezbytně nutné, je totiž možno jednoduše odstranit oplachem nečistoty a kontaminanty z povrchu substrátu afinitního nosiče podle vynálezu s adherovanými buňkami napadenými bakteriofágy.
3) Na základě urychlení a zjednodušení manipulace může způsob selektivního vychytávání bakteriofágů podle vynálezu usnadnit záchyt bakteriofágů obtížně kultivovatelných nebo pomalu rostoucích mikroorganismů.
Výhodná je možnost aplikace substrátu s naadherovanými bakteriemi přímo do prostředí a odtud izolovat vhodné bakteriofágy (ponoření kuponu s naadherovanou bakteriální kulturou přímo do prostředí s výskytem bakteriofágů, např. odpadní vody, s cílem rychlého záchytu vhodných fágů). To může urychlit izolaci bakteriofágů z prostředí. Způsobem podle vynálezu lze zachytit i jednotlivé bakteriofágy, častěji je však dosahováno minimální koncentrace 102 až 103 bakteriofágů na ml roztoku. Záleží na typu bakteriofága.
4) Provedení způsobu podle vynálezu se zařazením kapilární elektroforézy umožní zachycené a pomnožené bakteriofágy dále separovat a následně zpracovávat. Výhodou kapilární
-4CZ 2018 - 686 A3 elektroforézy je možnost separace a získání čistých kultur bakteriofágů. Dále pak možnost kontroly separace pomocí detektorů. Je také možné krok separace selektivně vychytaných bakteriofágů pomocí kapilární elektroforézy zautomatizovat anebo zminiaturizovat (například využitím mikrofluidiky aj.).
5) Po provedení kroku separace pomocí kapilární elektroforézy lze s výhodou provést detekci a charakterizaci izolovaného bakteriofága (pomocí detektorů na samotné kapiláře, příp. využití hmotnostní spektrometrie aj.) ve velmi krátkém čase.
Způsob selektivního vychytávání bakteriofágů a jejich separace podle vynálezu lze s výhodou provést v zařízení určeném pro kapilární elektroforézu. Oba konce prekoncentrační, preseparační kapiláry jsou ponořeny v elektrodových nádobkách, ve kterých jsou elektrody připojené ke zdroji vysokého napětí. Křemenná kapilára je parciálně zdrsněna na vhodnou hrubost jejího vnitřního povrchu. Kapilára je promyta vhodnými medii. Poté se promývá suspenzí buněk, které adherují na její zdrsněný povrch. Přebytečná suspenze se vytlačí z kapiláry. Bakteriofágy jsou vychytány z jejich prostředí následným naplněním této kapiláry roztokem obsahujícím bakteriofágy. Po určité době jejich interakce s podložním substrátem (buňky) je jejich roztok opět vytlačen z kapiláry. Kapilára je naplněna vhodným elektrolytem, k systému je připojeno stejnosměrné elektrické pole ze zdroje vysokého napětí a složka/-y vzorku se začnou separovat. Pohyb zón vzorku v kapiláře je nej častěji sledován on-column detektorem a signál je přenášen do počítače. Jinou možností je postupný odběr vzorku z kapiláry po jejich detekci on-column detektorem a identifikace jednotlivých zón pomoci techniky MALDI-TOF MS. Každý jednotlivý krok je možno kvantifikovat. Při použití vhodných elektrolytů - katolytu a anolytu, je možno zjistit kromě jejich MS spekter i izoelektrické body separovaných složek našeho zájmu.
Objasnění výkresů
Obr. 1 ukazuje schéma instrumentálního zařízení pro provedení způsobu selektivního vychytávání a separaci bakteriofágů podle vynálezu pomocí kapilární elekroforézy, které zahrnuje zdroj vysokého napětí, separační kapiláru, dvě elektrodové nádobky, dvě elektrody, detektor a počítač pro zpracování získaných dat.
Obr. 2 - růstová křivka bakteriofága označeného Kl/420 po inkubaci v kapiláře.
Obr. 3 - výstup signálu z UV detektoru při kapilární elektroforéze při různých dobách inkubace 5, 10, 20, 30 min (pík označený Kl/420 je bakteriofág; druhý pík patří .S', aureus, který je záchytným i pomnožovacím kmenem). Čím větší pík tím více příslušného mikroorganismu je ve vzorku.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Příprava planámího afmitního nosiče
Při použití planámího nosiče je možno využít materiál, který vytvoří adhezní povrch vhodný pro konkrétní bakterii. V případě .S', aureus to může být jako adhezní nosič použito sklo v podobě krycího sklíčka 22 x 22 mm pro mikroskopii (Menzel Glaser, Germany), které bylo odmaštěno v izopropylalkoholem (ponoření na 10 min při pokojové teplotě), vysušeno a sterilizováno autoklávováním. Toto sklo bylo položeno na dno jamky sterilní ójamkové mikrotitrační destičky (Nunc, Denmark) a přelito 5 ml Tryptono-sójového bujónu (Oxoid) a inokulováno 0,5 ml suspenze .S', aureus CCM 6118 (Česká sbírka mikroorganizmů, Brno) ve fyziologickém roztoku o hustotě 1 McFarlandovy stupnice. Po 6hodinové inkubaci při teplotě 37 °C bylo sklíčko vyjmuto, opláchnuto sterilním fýziologickým roztokem a ponořeno do 5 ml roztoku obsahující bakteriofág
-5 CZ 2018 - 686 A3
Kl/420 (105 *, PFU/mL) a inkubováno 10 minut při 37 °C. Po oplachu sterilním fyziologickým roztokem bylo sklíčko dále inkubováno v 5 ml Tryptono-sójového bujónu (Oxoid) po dobu 18 hodin při 37 °C. Výsledná koncentrace bakteriofága uvolněného do Tryptono-sójového bujónu odpovídala 3,9xl07, PFU/mL.
Příklad 2
Příprava kapilárního afinitního nosiče
Byla provedena adheze bakteriálních kmenů (methicillin-senzitivní .S', aureus CCM 3959, methicillin-rezistentní .S', aureus CCM 4750 a P. aeruginosa CCM 3955; všechny kmeny byly získány z České sbírky mikroorganizmů) probíhala v křemenné kapiláře (vnitřní průměr 100 pm a délka 500 mm, separační část 350 mm). Suspenze testovaných kmenů ve fyziologickém roztoku byly připraveny z 24hodinových kultur příslušných mikroorganizmů narostlých na Mueller-Hinton agaru (Oxoid, Spojené království) při 37 °C. Počet mikrobiálních buněk v suspenzi byl 107až 108 buněk ml1. Suspenze byly injikovány pomocí infůzní pumpy do kapiláry na straně anody při průtoku 5 až 500 nl.s1 po dobu až 3 hodiny. Buňky byly dynamicky adherovány na vnitřní upravenou stěnu kapiláry. Poté byla kapilára vypláchnuta fosfátovým pufirem od přebytku suspenze pomocí infuzní pumpy. Následně byl do kapiláry aplikován vzorek obsahující bakteriofágy. Zde proběhla inkubace po dobu 10 až 50 minut. Po této době byla vytlačena suspenze s přebytkem bakteriofágů z kapiláry. Ta pak byla propláchnuta opět fosfátovým pufirem. Vzniklé fágy byly uvolněny z povrchu kapiláry spolu s případnými zbytky bakteriálních buněk, a elektroforeticky separovány a detekovány pomocí UV detektoru, viz obr.
3. Z obrázku je patrné, že postupně dochází k poklesu koncentrace pomnožovacího kmene .S'. aureus a narůstá množství bakteriofága, v tomto případě Kl/420. Počet uvolněných fágových částic byl o 2-3 řády vyšší než jejich počet v původním roztoku, viz obr. 2.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Afinitní nosič určený pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci, vyznačující se tím, že je tvořený substrátem, kde povrch substrátu je opatřený naadherovanými buňkami alespoň jednoho bakteriálního kmene, přičemž substrát je vybrán ze skupiny obsahující sklo, kovové povrchy s výhodou nerez, organické povrchy s výhodou celulóza a povrchy z plastů, s výhodou tvrzený polystyren, polypropylen, teflon, polyethylen, textilie, a bakteriální buňky jsou vybrány ze skupiny bakterií, která obsahuje stafylokoky, gramnegativní nefermentující bakterie, pseudomonády, enterobakterie, streptokoky, listerie, enterokoky.
  2. 2. Afinitní nosič podle nároku 1, vyznačující se tím, že bakteriální buňky jsou vybrány ze skupiny bakterií, která obsahuje s výhodou Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter sp., Streptococcus mutans, listerie Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium.
  3. 3. Afinitní nosič podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že povrch substrátu je planámí, s výhodou povrch desky nebo povrch disku, nebo jde o vnitřní povrch kapiláry.
  4. 4. Afinitní nosič podle kteréhokoliv z nároků nároků 1 až 3 pro separaci specifických bakteriofágů, vyznačující se tím, že buňky bakterií po inkubaci obsahují alespoň jeden kmen bakteriofága.
  5. 5. Afinitní nosič podle nároku 4, vyznačující se tím, že bakteriofágy jsou specifické vůči bakteriálním buňkám naadherovaným na povrchu substrátu, přičemž jsou s výhodou vybrány ze
    -6CZ 2018 - 686 A3 skupiny obsahující lytické bakteriofágy z řádu Caudivirales, s výhodou stafylokokový bakeriofág Kayavirus z čeledi Myoviridae.
  6. 6. Způsob selektivního vychytávání bakteriofágů ze vzorku nebo vnějšího prostředí, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
    - kontakt afinitního nosiče podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 se vzorkem nebo vnějším prostředím obsahující bakteriofágy,
    - inkubaci substrátu afinitního nosiče se vzorkem obsahujícím bakteriofágy.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že s výhodou dále zahrnuje krok promytí povrchu substrátu afinitního nosiče s naadherovanými buňkami napadenými specifickými bakteriofágy.
  8. 8. Způsob podle nároku 6 nebo nároku 7, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok inkubace afinitního nosiče podle nároku 4 nebo nároku 5 v inkubačním médiu.
  9. 9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků nároku 6 až 8, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok uvolnění bakteriofágů z napadených bakteriálních buněk z povrchu substrátu afinitního nosiče podle nároku 4 nebo nároku 5.
  10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že uvolněné specifické bakteriofágy se dále izolují a separují.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se separace specifických bakteriofágů provede pomocí kapilární elektroforézy, přičemž povrch substrátu afinitního nosiče je vnitřním povrchem kapiláry.
CZ2018-686A 2018-12-07 2018-12-07 Afinitní nosič pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci a způsob selektivního vychytávání bakteriofágů a/nebo jejich separace pomocí kapilární elektroforézy CZ2018686A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018-686A CZ2018686A3 (cs) 2018-12-07 2018-12-07 Afinitní nosič pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci a způsob selektivního vychytávání bakteriofágů a/nebo jejich separace pomocí kapilární elektroforézy

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018-686A CZ2018686A3 (cs) 2018-12-07 2018-12-07 Afinitní nosič pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci a způsob selektivního vychytávání bakteriofágů a/nebo jejich separace pomocí kapilární elektroforézy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ308274B6 CZ308274B6 (cs) 2020-04-08
CZ2018686A3 true CZ2018686A3 (cs) 2020-04-08

Family

ID=70053341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2018-686A CZ2018686A3 (cs) 2018-12-07 2018-12-07 Afinitní nosič pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci a způsob selektivního vychytávání bakteriofágů a/nebo jejich separace pomocí kapilární elektroforézy

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ2018686A3 (cs)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4438833A1 (de) * 1994-10-31 1996-05-02 Bayer Ag Verfahren zur analytischen Trennung von Viren
WO2003087773A2 (en) * 2002-04-12 2003-10-23 Amersham Biosciences (Sv) Corp Multiplexed capillary electrophoresis systems
EP3259374B1 (en) * 2015-02-19 2019-08-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method for quantification of virus particles using capillary zone electrophoresis.
CN106970223B (zh) * 2017-03-07 2018-12-11 中国农业科学院油料作物研究所 净化伏马毒素b1、黄曲霉毒素b1等五种真菌毒素免疫吸附剂及复合亲和柱

Also Published As

Publication number Publication date
CZ308274B6 (cs) 2020-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7210518B2 (ja) 組み換えバクテリオファージを使用する、微生物の迅速検出のための方法及びシステム
Wang et al. Electrochemical detection of Escherichia coli from aqueous samples using engineered phages
Tawil et al. Surface plasmon resonance detection of E. coli and methicillin-resistant S. aureus using bacteriophages
JP2019515662A (ja) 細菌の同定、および抗生物質感受性プロファイリング装置
US8092990B2 (en) Apparatus and method for detecting microscopic organisms using bacteriophage
Stevens et al. Bacterial separation and concentration from complex sample matrices: a review
US6746841B1 (en) FTA- coated media for use as a molecular diagnostic tool
Bennett et al. The use of bacteriophage‐based systems for the separation and concentration of Salmonella
US20090246752A1 (en) Apparatus and method for detecting microscopic living organisms using bacteriophage
Li et al. Magnetic bead-based separation of sperm from buccal epithelial cells using a monoclonal antibody against MOSPD3
Richter et al. Ordering of bacteriophages in the electric field: Application for bacteria detection
Perdikaris et al. Development of a portable, high throughput biosensor system for rapid plant virus detection
CN104245961A (zh) 用于微生物检测的方法和系统
US20200255820A1 (en) Process for concentrating cells from a sample and then isolating nucleic acids from said cells
Wu et al. Trace detection of specific viable bacteria using tetracysteine-tagged bacteriophages
Zurier et al. Engineering biorthogonal phage-based nanobots for ultrasensitive, in situ bacteria detection
US20050250096A1 (en) Microorganism detection using bacteriophage amplification
EP1613965A2 (en) Apparatus and method for detecting microscopic living organisms using bacteriophage
JP6005053B2 (ja) 微生物の検出および定量方法
JP4578478B2 (ja) バクテリオファージを使用した微生物を検出するための装置および方法
Andoh et al. Strand scission and rejoining of DNA in cultured mammalian cells induced by 4-nitroquinoline 1-oxide
CZ2018686A3 (cs) Afinitní nosič pro selektivní vychytávání bakteriofágů a/nebo pro jejich separaci a způsob selektivního vychytávání bakteriofágů a/nebo jejich separace pomocí kapilární elektroforézy
Suh et al. Advances in separation and concentration of microorganisms from food samples
EP1789572A2 (en) Microorganism detection using bacteriophage amplification
WO2014007560A1 (ko) 미생물 포획 및 방출용 마이크로 구조물