JP2019515662A - 細菌の同定、および抗生物質感受性プロファイリング装置 - Google Patents

細菌の同定、および抗生物質感受性プロファイリング装置 Download PDF

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Abstract

細菌の同定のためのこのシステムは、医療現場および検査室ベースの診断システムとして使用できる。幾つかの実施において、本システムは、血液または他のサンプル内において他の外来物質を検出するために使用することができる。本システムは、システムから取り外し可能な使い捨て微小流体カートリッジを含むことができる。微小流体カートリッジは、細菌細胞を含む疑いがある血液サンプル等のサンプルを受け取り、細菌細胞を血液サンプルから分離することができる。細菌細胞が血液から分離されたら、当該システムは、細菌細胞を感染させ得るシステムに組換え検出バクテリオファージを導入することができる。次いで、当該システムは、組換え検出バクテリオファージからのレポータ遺伝子の発現を検出することができる。【選択図】図２Ａ

Description

関連出願に対する相互参照
この出願は、２０１６年３月２８日に出願された米国出願第６２／３１４，１６３号の利益および優先権を主張するものであり、その内容の全体を本明細書の一部として援用する。
技術分野
本技術は、一般に、細菌の同定および抗生物質感受性プロファイリング装置およびその使用に関する。
以下の本技術の背景の記載は本技術の理解を助けるためのものであり、本技術に対する先行技術を記載し、または先行技術を構成することを自認するものではない。
細菌感染は、患者の既存の病状を悪化し、幾つかの症例では死に至り得る。種々の細菌感染症に罹患している患者は、しばしば同様の症状を呈し、従って感染の原因となる細菌種または菌株を正確に同定および特徴付けることを困難にする。従来の実験室試験による細菌の正確な同定は困難であり、数日間のインキュベーション期間を必要とすることがあり得る。加えて、幾つかの細菌株は、その偏好性の性質を考慮すると、培養およびインビトロ分析には適さない。他の状況において、幾つかの菌株の観察可能な挙動は他のものと容易に区別できない。更に、特定の細菌種の個々の菌株は、別の方法では有効な抗生物質に対して耐性を示す可能性がある。
患者の病気の原因となる細菌株の早期且つ正確な同定、および種々の抗生物質に対するその感受性の決定は、治療選択決定プロセスの重要な側面である。
本開示の一態様によれば、システムは、微小流体カートリッジを含む。微小流体カートリッジは、サンプルを受入れるように構成された入口を含むことができる。このサンプルは、細菌細胞、ならびに血漿および複数の形成された成分を含む血液を含有することができる。微小流体カートリッジはまた、分離器を含むことができる。分離器は、第１の出口および第２の出口を含むことができる。分離器は、細菌細胞および血漿を第１の出口に流し、複数の形成された血液成分を第２の出口に流すように構成することができる。このシステムは、細菌細胞をインキュベートするように構成された貯蔵器を含むことができる。この貯蔵器は、微小流体チャネルの第１の出口と連結することができる。当該貯蔵器は、レポータ遺伝子を含む少なくとも１つの組換え検出バクテリオファージを収容するように構成することができる。当該システムは、光検出器であって、組換え検出バクテリオファージで感染されている細菌細胞に応答するレポータ遺伝子の発現により生じた信号を検出するように構成される光検出器を含むことができる。
微小流体カートリッジは、分離器の第１の出口に連結された濃縮器を含むことができる。分離器は、細菌細胞を収集し、第３の出口を通して細菌細胞を流すように構成することができる。微小流体カートリッジは、分離器の第３の出口と連結された微小流体チャネルを含むことができる。この微小流体チャネルは、第４の出口を含むことができる。当該システムはまた、細菌細胞が微小流体チャネルを通って流れるときに、この細菌細胞の数をカウントするように構成された計数器を含むことができる。
幾つかの実施において、微小流体カートリッジは取り外し可能である。微小流体カートリッジは使い捨てであることができる。微小流体カートリッジは、ポリスチレンを含むことができる。
幾つかの実施において、当該システムは音響波発生器を含むことができる。音響波発生器は、微小流体カートリッジの分離器を横切って定在音響波を発生するように構成することができる。定在音響波は、約０．８５ＭＨｚ〜約１．１ＭＨｚの周波数を有することができる。
レポータ遺伝子の発現によって生成された信号は、貯蔵器の壁を通して視認可能である。この信号は、発光信号、蛍光信号、またはクロマグラフィック（ｃｈｒｏｍａｇｒａｐｈｉｃ）信号のうちの少なくとも１つを含むことができる。
当該システムは、第４の出口に連結された複数の貯蔵器を含むことができる。複数の貯蔵器の各々は、異なる組換え検出バクテリオファージを収容するように構成することができる。計数器は、レーザ系フローサイトメータまたはインピーダンス系フローサイトメータの何れかであることができる。
本開示の別の態様によれば、微小流体システムは、サンプルを受入れるように構成された入口を含む。サンプルは、細菌細胞および血液を含み得る。血液は、血漿および複数の形成された成分を含むことができる。微小流体システムは、第１の出口および第２の出口を含む分離器を含むことができる。分離器は、細菌細胞および血漿を第１の出口へと流し、複数の形成された血液成分を第２の出口へと流すように構成することができる。微小流体システムは、細菌細胞をインキュベートするように構成された貯蔵器を含むことができる。貯蔵器は、第１の出口と連結することができ、少なくとも１つのバクテリオファージを収容するように構成することができる。
微小流体システムは、分離器の第１の出口に連結された濃縮器を含むことができる。濃縮器は、細菌細胞を収集し、細菌細胞を第３の出口を通して流すように構成することができる。微小流体システムは、濃縮器の第３の出口と結合された微小流体チャネルを含むことができる。この微小流体チャネルは第４の出口を含むことができる。
幾つかの実施において、微小流体システムは使い捨てである。微小流体チャネルの寸法は、実質的に単細胞サイズである。微小流体システムは、第４の出口に連結された複数の貯蔵器を含むことができる。複数のインキュベーション貯蔵器の各々は、異なるバクテリオファージを収容するように構成することができる。微小流体システムはポリスチレンを含むことができる。
本開示の別の態様によれば、方法は、サンプルを受入れることを含むことができる。サンプルは、細菌細胞および血液を含み得る。サンプルは、微小流体システムの入口で受け取ることができる。血液は、血漿および複数の形成された成分を含むことができる。当該方法は、分離器によって、細菌細胞をサンプルから分離することを含むことができる。細菌細胞は、分離器の第１の出口に流入することができる。形成された成分は、分離器の第２の出口に流入することができる。当該方法は、レポータ遺伝子を含む少なくとも１つの組換え検出バクテリオファージを含有し得る試験溶液を受入れることを含むことができる。この方法はまた、組換え検出バクテリオファージに感染している細菌細胞に応答したレポータ遺伝子の発現により生じる信号の検出することを含むことができる。
幾つかの実施において、当該方法は、インキュベーション貯蔵器内に細菌細胞を収集することを含むことができる。試験溶液は、インキュベーション貯蔵器の中に導入することができる。次いで、細菌細胞を所定時間だけインキュベートすることができる。
幾つかの実施において、当該方法は、抗生物質を微小流体システムの中に導入することを含むことができる。この方法はまた、微小流体システムの中に溶菌試薬を導入することを含むことができる。サンプルを導入する前に、幾つかの試薬をカートリッジ内に予め装填して保存することができる。
幾つかの実施において、当該方法は、微小流体システムの分離器を横切って定在音響波を適用することを含むことができる。定在音響波は、形成された成分を微小流体システムの分離器の凝集軸に向けて駆動させることができる。
本方法は、レーザ系フローサイトメータまたはインピーダンス系フローサイトメータのうちの１つを用いて、第１の出口に連結された微小流体チャネルを通って流れる多数の細菌細胞をカウントすることを含むことができる。この方法は、微小流体システムの濃縮器内で、細菌細胞を濃縮することを含むことができる。濃縮器は、分離器と微小流体チャネルとの間に連結することができる。レポータ遺伝子の発現によって生成される信号は、発光信号、蛍光信号、またはクロマグラフィック（ｃｈｒｏｍａｇｒａｐｈｉｃ）信号の少なくとも１つを含み得る。
当業者は、本明細書に記載の図面が説明のためのものに過ぎないことを理解するであろう。幾つかの例では、説明された実施の理解を容易にするために、記載された実施の様々な態様が誇張または拡大して示されることを理解されたい。図中において、同様の参照符号は、一般に様々な図面を通して同様の特徴、機能的に類似した、および／または構造的に類似した要素を指称する。図面は必ずしも一定の縮尺で示されてはおらず、むしろ教示の原理を図示することに重点が置かれている。図面は、如何なる意味でも本教示の範囲を限定するものではない。本システムおよび本方法は、以下の図面の参照と共に、以下の例示的な説明から更に良好に理解され得るであろう。
細菌の同定および抗生物質感受性プロファイリングのための例示的システムのブロック図を示す。 図１に示したシステムで使用するための、例示的微小流体カートリッジの概略図を示す。 図２Ａに示した分離器の出口部分を示す。 図１に示した例示的システムを使用して、サンプル中の細菌細胞を検出する例示的方法のフロー図を示す。 組換え検出Ｔ７ファージのＮｈｅＩ部位近傍に挿入された異種核酸配列（配列番号１）を示す。 ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポータ遺伝子の二重挿入を含む、組換え検出ファージＤＬＰＥＣ０２株の完全なゲノム配列（配列番号２）を示す。 様々な細菌宿主細胞濃度において、組換え検出ファージＤＬＰＥＣ０２株を感染させた細菌宿主細胞により経時的に生じる相対的光単位（ＲＬＵ）を示す。組換え検出バクテリオファージと接触させた１０分後、２０分後、４０分後および６０分後の信号を測定した。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発現の検出をＴとして定義する。 ＲＮＡ合成阻害剤であるリファンピシンで処理した後の、組換え検出ファージＤＬＰＥＣ０２株に感染した感受性および耐性の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、（Ｅ．ｃｏｌｉ））株の間での信号分離（δμと表される）を示す。組換え検出バクテリオファージと接触させた１０分後、２０分後、４０分後、および６０分後の信号を測定した。 タンパク質合成阻害剤であるテトラサイクリンで処理した後の、組換え検出ファージＤＬＰＥＣ０２株に感染した感受性および耐性の大腸菌株の間での信号分離（δμと表す）を示す。組換え検出バクテリオファージと接触させた１０分後、２０分後、４０分後、および６０分後の信号を測定した。 組換え検出ファージＤＬＰＥＣ０２株に感染した未処理の細菌細胞と処理（１０または２５μｇ／ｍＬのレボフロキサシン）された細菌細胞との間での信号分離（μで示す）を示す。各レボフロキサシン濃度の組換え検出バクテリオファージと接触させた２０分後、４０分後、６０分後、および８０分後の信号を測定した。 組換え検出ファージＤＬＰＥＣ０２株に感染した未処理の細菌細胞と処理（１００または２５０μｇ／ｍＬのアンピシリン）された細菌細胞との間での信号分離（μで示す）を示す。各アンピシリン濃度の組換え検出バクテリオファージと接触させた２０分後、４０分後、６０分後、および８０分後の信号を測定した。 組換え検出ファージＤＬＰＥＣ０２株の特異的宿主範囲を示す。 本明細書中に開示された組換え検出Ｋ１−５ファージに挿入された異種核酸配列（配列番号３）を示す。 本明細書に開示された組換え検出Ｋ１−５ファージの完全なゲノム配列（配列番号４）を示す。 ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポータ遺伝子の単一挿入を含む、組換え検出ファージＤＬＰＥＣ０１株の完全なゲノム配列（配列番号５）を示す。 組換え検出Ｔ７ファージのＳｗａｌ部位近傍に挿入された異種核酸配列（配列番号６）を示す。
本技術の実質的な理解を提供するために、以下では本方法の一定の態様、様式、実施形態、変形例および特徴が種々の詳細レベルで記載されることを理解されたい。
本方法を実施するに際しては、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの従来技術が使用される。例えば、下記を参照されたい：即ち、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｄｓ．（２００１）分子クローニング：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（２００７）分子生物学における現在のプロトコル、酵素学における一連の方法（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＣＲ１：実践的アプローチ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＰＣＲ２：実践的アプローチ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．（１９９９）抗体、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）動物細胞の培養：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇａｉｔ ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）核酸およびハイブリダイゼーション、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）核酸およびハイブリダイゼーション、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）転写および翻訳、固定化された細胞および酵素（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８６））、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）分子クローニングの実践ガイド、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）哺乳類細胞のための遺伝子導入ベクター（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｄ．（２００３）哺乳動物細胞における遺伝子導入および発現、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ ｅｄｓ．（１９８７）細胞および分子生物学における免疫化学的方法（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ）、およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ（１９９６）Ｗｅｉｒの実験免疫学ハンドブック。
Ａ．定義
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、この技術が属する技術の当業者が共通に理解するのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、その内容が明確に他のことを指示しない限り、複数の指示対象が含まれる。例えば、「細胞」への言及は、２以上の細胞の組み合わせ等を含む。一般に、細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションにおける、本明細書で使用する命名法および以下に記載する実験手順は、当技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。
本明細書で使用するとき、「μ」とは、組換え検出ファージに感染した未処理の細菌宿主細胞と、組換え検出ファージに感染し且つ抗生物質で処理された細菌宿主細胞との間の信号分離である（μ＝組み換え検出ファージに感染した未処理の宿主細胞の信号／組換え検出ファージに感染し且つ抗生物質で処理された宿主細胞の信号）。幾つかの実施形態において、２以上のμ値は、所定の細菌宿主が抗生物質感受性であることを示す。
本明細書で使用するとき、数字に関する「約」および「実質的に」の用語は、特に指示がなく、またはその内容から別途明らかでないときは、一般に、何れの方向においても１％、５％、または１０％（超または未満）の範囲内に入る数を含むと解釈される（但し、その数値が可能な値の０％未満の場合または１００％を超える場合を除く）。
本明細書で使用するとき、「バクテリオファージ」または「ファージ」とは、細菌に感染するウイルスをいう。バクテリオファージは、宿主の生合成機構の幾つかまたは全てを利用することによって、細菌の内部で増殖する偏性細胞内寄生体（即ち、細菌に感染するウイルス）である。異なるバクテリオファージは異なる物質を含むことができるが、それらは全て核酸およびタンパク質を含み、一定の状況下で脂質膜の中に封入され得る。ファージに応じて、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡの何れかであり得る（両方ではない）。
本明細書で使用するとき、「有効量」の用語は、所望の効果を達成するのに十分な量、例えば、細菌の同定および／または抗生物質感受性の同定をもたらす組換え検出バクテリオファージの量を言う。サンプルと接触した組換え検出バクテリオファージの量は、細菌感染の程度、型および重症度に依存する。当業者は、これら要因および他の要因に応じて、適切な投薬量を決定することができるであろう。
本明細書で使用するとき、「発現」とは、以下の１以上を含むものである：即ち、遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写、成熟ｍＲＮＡを産生するための前駆体ｍＲＮＡのスプライシングおよび他のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性、成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドン使用およびｔＲＮＡ利用可能性を含む）、および翻訳産物のグリコシル化および／または他の改変（適切な発現および機能のために必要とされる場合）である。
本明細書で使用するとき、「異種核酸配列」とは、ゲノム中における通常は生じない位置に配置された任意の配列である。異種核酸配列は、天然にはバクテリオファージ中に存在しない配列を含むことができ、またはバクテリオファージ内で天然に見いだされ配列ではあるが、ゲノム中の正常には生じない位置に配置された配列のみを含み得る。幾つかの実施形態において、異種核酸配列は天然のファージ配列ではない。他の実施形態において、異種核酸配列は、野生型ファージのゲノム中に天然に存在する配列ではあるが、天然に存在しない別の部位に再配置され、その新しい部位での異種配列となる。
本明細書で使用するとき、「宿主細胞」とは、ファージに感染して子孫ファージ粒子を産生することができる細菌細胞である。宿主細胞は、特定のタイプのファージゲノムＤＮＡからファージ粒子を形成することができる。幾つかの実施形態において、ファージゲノムＤＮＡは、宿主細胞をファージで感染させることによって宿主細胞に導入される。幾つかの実施形態において、ファージゲノムＤＮＡは、形質転換、エレクトロポレーション、または任意の他の適切な技術を用いて宿主細胞に導入される。幾つかの実施形態において、ファージゲノムＤＮＡは、宿主細胞に導入されときには実質的に純粋である。幾つかの実施形態において、ファージゲノムＤＮＡは、宿主細胞に導入されるときにはベクター中に存在する。宿主細胞の定義はファージごとに異なる。例えば、大腸菌は、特定のタイプのファージに対する天然の宿主細胞であり得るが、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）はそうではない。
本明細書で使用するとき、「単離された」の用語は、（天然であろうと実験設備中においてであろうと）それが最初に産生されたときに付随していた成分の少なくとも幾つかから分離された物質または実体を指す。単離された物質および／または実体は、それらが最初に付随されていた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％から分離され得る。幾つかの実施形態において、単離された物質および／または実体とは、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用するとき、他の成分を実質的に含まない場合、その物質は「純粋」である。
本明細書で使用するとき、「ファージゲノム」とは、天然に存在するファージゲノムおよびその誘導体を含むものである。一般に、当該誘導体は、天然に存在するファージと同じ宿主内で増殖する能力を有する。幾つかの実施形態において、天然に存在するファージゲノムと誘導体ファージゲノムとの間の唯一の相違は、ファージゲノムの少なくとも１つの末端（ゲノムが線状である場合）またはゲノム中の少なくとも１点（ゲノムが環状である場合）における、ヌクレオチドの欠失または付加のうちの少なくとも１つである。
本明細書で使用するとき、「ポリヌクレオチド」または「核酸」の用語は、任意のＲＮＡまたはＤＮＡを意味し、これは非修飾のまたは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。ポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ならびに一本鎖もしくはより典型的には二本鎖、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドの用語はまた、１以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに安定性または他の理由のために修飾された骨格を備えたＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
本明細書で使用するとき、「組換え」の用語は、例えば細胞、核酸、タンパク質、またはベクターを参照して使用される場合、当該細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸またはタンパク質の導入、または天然の核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されたこと、或いは材料がそのように改変された細胞に由来することを意味する。従って、例えば、組換え細胞は、天然の形態（非組換え）の細胞には見出されない遺伝子を発現するか、そうでなければ異常に発現されているか、過少発現されているか、または全く発現されていない天然遺伝子を発現する。
本明細書で使用するとき、「組換え検出バクテリオファージ」または「組換え検出ファージ」または「ＲＤＢ」とは、そのゲノムＤＮＡが、生物発光タンパク質、蛍光タンパク質、発色タンパク質またはそれらの任意の組合せをコードする異種核酸を含むバクテリオファージを意味する。
本明細書で使用するとき、「Ｔ」は、組換え検出バクテリオファージに感染した細菌宿主細胞が産生する発光信号をバックグラウンド信号で割ったものを指し、ここでのバックグラウンド信号は検出下限（ＬＬｏＤ）により定義され、これは陰性対照（即ち、細菌宿主細胞の非存在下における組換え検出ファージ株）に加えられた標準偏差の３倍に等しい。幾つかの実施形態において、２以上のＴ値は、組換え検出バクテリオファージにより標的とされる細菌種の存在を示す。
本明細書で使用するとき、「個体」、「患者」または「被験体」の用語は互換的に使用され、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトを指称する。特定の実施形態において、個体、患者または被験体はヒトである。
本明細書で使用するとき、「サブサンプル」とは、被験体から得られた試験サンプルに由来する、細菌細胞を含有する１以上のサンプルを言う。幾つかの実施形態において、サブサンプルには、非細菌細胞（例えば、ヒト細胞）が存在しない。幾つかの実施形態において、サブサンプルは溶解されたヒト細胞を含有する。
本明細書で使用するとき、「試験サンプル」とは、被験体から採取されたサンプルであって、細菌の存在について、および／または当該サンプル中に存在する細菌の抗生物質感受性についてアッセイされるものをいう。幾つかの実施態様において、試験サンプルは、血液、痰、粘液、洗浄液または唾液である。幾つかの実施において、試験サンプルは被験者からのスワブである。
Ｂ．バクテリオファージ
バクテリオファージは、宿主の生合成機構の一部または全部を利用することによって、細菌の内部で増殖する偏性細胞内寄生体である。ファージは、核酸およびタンパク質を含み、脂質膜によって包まれていてもよい。ファージに応じて、核酸ゲノムはＤＮＡまたはＲＮＡの何れかであることができるが、両方であることはできず、環状形態または線状形態の何れかで存在し得る。ファージゲノムのサイズはファージによって異なる。最も単純なファージは数千ヌクレオチドのサイズのゲノムを有するが、より複雑なファージは、ゲノム中に１００，０００を超えるヌクレオチドを含み、稀にそのサイズは１，０００，０００ヌクレオチドを超える。ファージ粒子中の個々の種類のタンパク質の数および量は、ファージに応じて変化するであろう。これらのタンパク質は感染において機能し、周囲のヌクレアーゼから核酸ゲノムを保護する。
ファージゲノムは、様々なサイズおよび形状（例えば、直線状または環状）で生じる。殆どのファージは直径が２４〜２００ｎｍである。キャプシドは、１以上のファージタンパク質の多くのコピーから構成され、ファージゲノム周囲の保護エンベロープとして作用する。多くのファージは、ファージキャプシドに付着した尾部を有している。この尾部は、感染の際にファージ核酸が通過する中空のチューブである。尾部の大きさは変化し得るものであり、また幾つかのファージは尾部構造をもたない。より複雑なファージにおいて、尾部は収縮性の鞘に取り囲まれており、この鞘は細菌宿主細胞の感染の間に収縮する。尾部の末端において、ファージは、ベースプレートおよびそれに取り付けられた１以上の尾部繊維を有する。ベースプレートおよび尾部繊維は、ファージの宿主細胞への結合に関与する。
溶菌性または毒性のファージは、ファージのライフサイクルの終期にバクテリア中でのみ増殖し、細菌宿主細胞を溶解させ得るファージである。溶菌性ファージのライフサイクルは暗黒期から始まる。暗黒期の間、宿主細胞の内部または外部の何れにも感染性ファージ粒子は見出せない。ファージ核酸が宿主生合成機構を引き継ぎ、ファージ特異的なｍＲＮＡおよびタンパク質が産生される。初期のファージｍＲＮＡは、ファージＤＮＡ合成のために必要とされ、また宿主ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の生合成を停止させるために必要とされる初期タンパク質をコードする。幾つかの場合、この初期タンパク質は実際に宿主染色体を分解する。ファージＤＮＡを作製した後、後期ｍＲＮＡおよび後期タンパク質が作製される。後期タンパク質は、ファージ、ならびに細菌細胞の溶解に必要なタンパク質を含む構造タンパク質である。次の段階では、ファージ核酸および構造タンパク質が組み立てられ、感染性ファージ粒子が細胞内に蓄積される。細菌は、ファージ溶解タンパク質の蓄積により溶解し始め、細胞内ファージ粒子の放出をもたらす。感染した細胞当たりの放出される粒子数は、１０００以上の高レベルであり得る。溶菌性ファージは、プラークアッセイによって数えることができる。このアッセイは、各プラークが単一の感染性ファージから生じるように、十分に低い濃度のファージで実施される。プラークを生じる感染性粒子は、ＰＦＵ（プラーク形成単位）と呼ばれる。
溶原性ファージは、宿主細胞において、溶菌サイクルを介して増殖できるか、または休止状態に入ることができるものである。休止状態において、ファージゲノムはプロファージ（即ち、ファージを産生する能力を有する）として存在する。殆どの場合、ファージＤＮＡは実際に宿主染色体に組み込まれ、宿主染色体と共に複製され、娘細胞へと受け継がれる。プロファージを有する宿主細胞は、プロファージの存在によって悪影響を受けず、溶原性状態は無期限に存続し得る。溶原性状態は、悪条件に曝露されると終結することができる。溶原性状態の終了に有利な条件には、乾燥、ＵＶもしくは電離放射線への曝露、突然変異誘発性化学物質への曝露などが含まれる。悪条件は、プロテアーゼ（ｒｅｃＡタンパク質）の産生、ファージ遺伝子の発現、組み込みプロセスの逆転、および溶解増殖（ｌｙｔｉｃ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を導く。
幾つかの実施形態において、ファージゲノムは、少なくとも５キロベース（ｋｂ）、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも５５ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも６５ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも７５ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも８５ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも９５ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１０５ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１１５ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１２５ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１３５ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１４５ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１７５ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２２５ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも２７５ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３２５ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも３７５ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４２５ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、少なくとも４７５ｋｂ、または少なくとも５００ｋｂの核酸を含む。
ファージ群には、ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アンパラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、ブカウダウイルス科（Ｂｕｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラビアウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロブロウイルス科（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉａｄｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）、およびテクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）が含まれる。
Ｃ．本技術の組換え検出バクテリオファージ
本技術の組換え検出バクテリオファージのゲノムは、生物発光タンパク質、蛍光タンパク質、発色タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせをコードする異種核酸（まとめて「レポータ遺伝子」として知られる）を含む。幾つかの実施形態において、コードされた遺伝子産物は、適切な刺激に曝露されると検出可能な信号を生成し、その結果得られる信号は、組換え検出ファージに感染した細菌宿主細胞の検出を可能にする。一定の実施形態において、異種核酸によりコードされるタンパク質は、この異種核酸配列を含む組換え検出ファージに感染した細菌宿主細胞をスクリーニングすることにより同定できるマーカーとして機能する。幾つかの実施形態において、異種核酸配列は更に、バクテリオファージにおいて天然に見出される配列ではあるが、ゲノム中の正常でない位置に存在する配列を含むものである。
幾つかの実施形態において、組換え検出ファージゲノムは、１、２、３、４または５のレポータ遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、組換え検出ファージゲノムは、２以上のレポータ遺伝子を含む。レポータ遺伝子は同一であっても異なっていてもよい。
蛍光タンパク質は、青色／ＵＶ蛍光タンパク質（例えば、ＴａｇＢＦＰ、アズライト、ＥＢＦＰ２、ｍカラマル、シリウス、サファイア、およびＴ−サファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍターコイズ、モノマー・ミドリイシ−シアン、ＴａｇＣＦＰ、およびｍＴＦＰｌ）、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、エメラルド、スーパーフォルダーＧＦＰ、モノマー・アザミ緑、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、およびｍワサビ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＥＹＦＰ、シトリン、ビーナス、ＳＹＦＰ２、およびＴａｇＹＦＰ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、モノマー・Ｋｕｓａｂｉｒａ−オレンジ、ｍΚＯｋ、ｍＫＯ２、ｍオレンジ、およびｍオレンジ２）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍラズベリー、ｍチェリー、ｍストロベリー、ｍタンゲリン、ｔｄトマト、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍアップル、ｄｓ赤、およびｍルビー）、遠赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍプラム、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ｍＫａｔｅ２、ｍネプチューンおよびＮｉｒＦＰ）、近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、およびｉＲＦＰ）、長ストークスシフトタンパク質（例えば、ｍＫｅｉｍａ赤、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅｌ、およびＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２）、光活性化可能な蛍光タンパク質（例えばＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍチェリー１、およびＰＡＴａｇＲＦＰ）、光活性化可能な蛍光タンパク質（例えば、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍチェリー１、およびＰＡＴａｇＲＦＰ）、光変換蛍光タンパク質（例えば、Ｋａｅｄｅ（緑）、Ｋａｅｄｅ（赤）、ＫｉｋＧＲｌ（緑）、ＫｉｋＧＲｌ（赤）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑）、ｍＥｏｓ２（赤）、ＰＳｍオレンジ、およびＰＳｍオレンジ）、フルオレセイン、ローダミン、および光スイッチ可能な蛍光タンパク質（例えば、ドロンパ）を含むが、これらに限定されない。
生物発光タンパク質の例には、エクオリン（クラゲのＡｅｑｕｏｒｅａ・ｖｉｃｔｏｒｉａ）およびルシフェラーゼ（ホタルおよびレニラ由来のルシフェラーゼ、ナノールルシフェラーゼ、赤色ルシフェラーゼ、ｌｕｘＡＢなどを含む）が含まれる。化学発光タンパク質の例には、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびアルカリホスファターゼが含まれる。
幾つかの実施形態において、組換え検出バクテリオファージは、Ｔ３、Ｔ７、Ｍ６、Ｋ１１、Ｆ９２、Ｋ１−５、およびＫ１Ｆからなる群から選択されるファージ型に属する。
一定の実施形態において、組換え検出バクテリオファージは、配列番号１の核酸配列を含む。他の実施形態において、組換え検出バクテリオファージは配列番号２の核酸配列を含む。幾つかの実施形態において、組換え検出バクテリオファージは配列番号２の核酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、組換え検出バクテリオファージは配列番号３の核酸配列を含む。図１２を参照されたい。一定の定の実施形態において、組換え検出バクテリオファージは配列番号４の核酸配列を含む。図１３を参照されたい。他の実施形態において、組換え検出バクテリオファージは配列番号５の核酸配列を含む。図１４を参照されたい。
Ｄ．細菌の同定システム
概説として、細菌の同定システムは、必要なものが単一の自己完結型、医療現場型またはラボベースの診断システムとすることができる。このシステムは、血液または他のサンプル中の細菌のような外来物質を検出するために使用することができる。このシステムは、血液または他のサンプルを入力として受け取り、サンプル中に外来因子が存在するかどうか、およびどの程度まで外来因子が存在するかの指標を出力することができる。このシステムは、細菌検出の時間スケールを数時間に短縮し、病院、研究室、および他の医療施設内における医療現場の診断ツールとして役立つ。以下で更に説明するように、このシステムは、システムから取り外し可能で且つ試験と試験の間で交換できる使い捨ての微小流体カートリッジを含むことができる。この微小流体カートリッジは、細菌細胞を含有することが疑われる血液サンプル等のサンプルを受け取り、この血液サンプルから細菌細胞を分離することができる。細菌細胞が血液から分離されると、当該システムはＲＤＢをシステムに導入することができる。ＲＤＢは、１以上のレポータ遺伝子を含むことができる。ＲＤＢが特定の細菌細胞型に接触すると、ＲＤＢはその細菌細胞にレポータ遺伝子を感染させることができる。感染すると、その細菌細胞はレポータ遺伝子を発現することができる。当該システムは、光検出器を用いて、レポータ遺伝子の発現に応答して生成された信号を検出することができる。この信号は、発現されたレポータ遺伝子に応答して生じる発光、蛍光、またはクロマグラフィック信号を含むことができる。当該システムは、この信号を外部物質の存在の指標として表示することができ、または別の方法で報告することができる。
図１は、例示的なシステム１００のブロック図を示す。システム１００は、上記のＲＤＢを使用する細菌の同定および抗生物質感受性プロファイリングを行う装置であることができる。システム１００は、医療現場型またはラボベースのシステムである単一ユニットとして収容される単一の自己完結型システムであることができる。システム１００は、微小流体カートリッジ１０２を含むことができる。微小流体カートリッジ１０２は、分離器１０６と連結された微小流体カートリッジ１０２を含む。微小流体カートリッジ１０２はまた、濃縮器１０８および微小流体チャネル１１０を含んでいる。微小流体チャネル１１０の出力は、インキュベーション貯蔵器１１２（１）〜１１２（ｎ）（まとめてインキュベーション貯蔵器１１２と総称する）に供給される。インキュベーション貯蔵器１１２の各々は、検出チャンバ１１４（１）〜１１４（ｎ）（まとめて検出チャンバ１１４と総称する）のそれぞれ１つと連結されることができる。微小流体カートリッジ１０２の２つの要素が互いに連結されるとき、その連結は直接的または間接的であることができる。例えば、貯蔵器１１２は両方に、即ち、直接連結を介して微小流体チャネル１１０に連結され、また微小流体チャネル１１０を介して間接的に濃縮器１０８に連結される。
システム１００はまた、１以上の緩衝液貯蔵器１１６、洗浄液貯蔵器１１８、および廃液貯蔵器１２０を含むことができる。システム１００は、計数器１２２および光検出器１２４を含むことができる。システム１００は、ファージカクテル貯蔵器１２６、抗生物質溶液貯蔵器１２８、および溶菌試薬貯蔵器１３０を含む。
システム１００は、微小流体カートリッジ１０２を含むことができる。微小流体カートリッジ１０２の部品を、図２Ａに関連して更に説明する。微小流体カートリッジ１０２は、カートリッジ内に収容することができる。カートリッジは、取り外し可能および使い捨てであることができる。例えば、システム１００の部品をサンプルとサンプルの間で殺菌する必要がないように、各患者について新しいカートリッジを使用することができる。試験の終了後、カートリッジを交換し、システム１００を介して第２のサンプルを処理することができるので、カートリッジ内に流体を含めることにより、システム１００のスループットを増加させることができる。
微小流体カートリッジ１０２の部品を収容するカートリッジは、ポリスチレンを含むことができる。このカートリッジは、他の熱可塑性樹脂、例えば、アクリル（ポリメチルメタクリレート）、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、環状オレフィンコポリマー、シリコーン、液晶ポリマー、およびフッ化ポリビニリデンを含むことができる。幾つかの実施において、カートリッジはガラスを含むことができる。微小流体カートリッジ１０２のカートリッジは多くの製造技術を使用して製造することができ、これら技術にはミリング、射出成形、エンボス加工、およびエッチングが含まれるが、これらに限定されない。
微小流体カートリッジ１０２は、サンプル貯蔵器１０４を含むことができる。サンプル貯蔵器１０４は、全血のサンプルを受入れるように構成された入口であることができる。例えば、サンプルは採血管に収容され、入口で微小流体カートリッジ１０２に接続された管を通して微小流体カートリッジ１０２へとポンプ輸送される。全血サンプルは、血漿、複数の形成された成分、および細菌を含むことができる。形成された血液成分は、赤血球、白血球および血小板を含むことができる。サンプル貯蔵器１０４は、約１ｍＬ〜約１５ｍＬ、約２ｍＬ〜約１２ｍＬ、約３ｍＬ〜約１０ｍＬ、または約５ｍＬ〜約１０ｍＬを保持するように適切に構成することができる。
微小流体カートリッジ１０２は、分離器１０６を含むことができる。分離器１０６は、サンプル貯蔵器１０４に結合された入口を含むことができる。分離器１０６は、２以上の出口を含むことができる。廃液を含む流体は、出口のうちの１つへと駆動され、細菌を含む流体は、出口の異なる１つに駆動され得る。分離器１０６は、血液の形成された成分から細菌を分離するために、慣性的、流体力学的、誘電泳動的、磁気的、表面捕捉的、音響分離的、およびサイズ排除的な装置を使用することができる。例えば、分離器１０６は、音響分離装置とすることができる。システム１００は、分離器１０６の流路を横切って定在音響波を発生する音響波発生器を含むことができる。定在音響波は、形成された成分および細菌を、流路の整列軸に向かって駆動させることができる。分離器１０６の整列軸は、流路内の定在波の正または負のノードの位置とすることができる。幾つかの実施において、形成された成分は、整列軸に向かって駆動される。他の実施では、形成された成分および細菌が、整列軸に向かって駆動される。これらの実施において、形成された成分および細菌は異なる速度でアライメント軸に向かって駆動されることができ、細菌および形成された成分が整列軸に向かって駆動された距離に基づいて分離され得るようになっている。分離器１０６の流路は、約０．２ｍｍ〜約１ｍｍ、約０．２ｍｍ〜約０．８ｍｍ、約０．４ｍｍ〜約０．６ｍｍ、または約０．４ｍｍ〜約０．５ｍｍの幅を有することができる。分離器１０６の流路は、約０．２ｍｍ〜約１ｍｍ、約０．２ｍｍ〜約０．８ｍｍ、約０．２ｍｍ〜約０．６ｍｍ、または約０．２ｍｍ〜約０．４ｍｍの高さを有することができる。
微小流体カートリッジ１０２は、濃縮器１０８を含むことができる。濃縮器１０８は、分離器１０６の出口に連結されることができる。濃縮器１０８は、細菌が分離器１０６を出て行く分離器１０６の出口に連結することができる。細菌は、細菌、血漿および緩衝液を含み得る流体の流れとして分離器１０６から出て行くことができる。濃縮器１０８は、流体の流れの中に細菌を濃縮することができる。例えば、濃縮器１０８に入る流体の流れは、約１〜約１００コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬの細菌濃度で、濃縮器１０８に入ることができる。濃縮器１０８を出る流体の流れは、約５〜約５０００ｃｆｕ／ｍＬの細菌濃度で濃縮器１０８を出ることができる。濃縮器１０８は、出口流体の流れの中の細菌濃度を約５倍から約１００倍まで増加させることができる。濃縮器１０８によって生成された濃縮流体の流れは、出口を通って微小流体カートリッジ１０２の濃縮部分を出て、微小流体チャネル１１０に入ることができる。
微小流体カートリッジ１０２は、微小流体チャネル１１０を含むことができる。微小流体チャネル１１０は、実質的に一度に１個の細菌細胞のみが微小流体チャネル１１０を通過できるような高さおよび幅にまで狭くすることができる。微小流体チャネル１１０は、実質的に一度に１個の細胞のみが微小流体チャネル１１０を通って流れることを可能にできるので、微小流体チャネル１１０の寸法は単細胞的と呼ぶことができる。システム１００は、計数器１２２へのインターフェースとして機能することができる。
微小流体カートリッジ１０２は、インキュベーション貯蔵器１１２を含むことができる。微小流体カートリッジ１０２は、１〜約３８４個、約１〜約９６個、約１〜約５０個、約１〜約２４個、または１〜約６のインキュベーション貯蔵器１１２を含むことができる。微小流体チャネル１１０を出る流体は、インキュベーション貯蔵器１１２に入ることができる。例えば、インキュベーション貯蔵器１１２の各々は、微小流体チャンネル１１０を出て行く実質的に等しい量の流体がインキュベーション貯蔵器１１２の各々に流入するように、微小流体チャネル１１０の出口に連結させることができる。幾つかの実施においては、微小流体チャンネル１１０を出て行く異なる量の流体は、それぞれのインキュベーション貯蔵器１１２の各々の中に流れることができる。流体チャンネル寸法の設定または弁を使用して、インキュベーション貯蔵器１１２の各々の中へ流れる流体の量を制御することができる。例えば、インキュベーション貯蔵器１１２を微小流体チャンネル１１０に連結する流れチャンネルの寸法を狭くして（例えば流れに対する抵抗が増大する）、狭くなった流れチャンネルを通ってより少ない流体が流れ、それぞれのインキュベーション貯蔵器１１２に流入するようにすることができる。比較的より大量の流体を受入れるインキュベーション貯蔵器１１２は、より広い流れチャンネル（流れに対してより小さい抵抗を有する）を備えた微小流体チャンネル１１０と連結させて、比較的大量の流体が流れチャンネルを通って流れ、それぞれのインキュベーション貯蔵器１１２へと流入するようにすることができる。他の実施では、流量計および弁を使用して、インキュベーション貯蔵器１１２の各々に流入する流体の量を制御することができる。別の例では、異なる量の流体を収容するように複数のインキュベーション貯蔵器１１２を製造し、インキュベーション貯蔵器１１２が一杯になったときには、追加の流体がこのインキュベーション貯蔵器１１２には流入できないようにすることができる。幾つかの実施において、インキュベーション貯蔵器１１２の１以上の壁（例えば、天井）は透明であり、発光がインキュベーション貯蔵器１１２の壁を通して目で見えるようになっている。
インキュベーション貯蔵器１１２は、微小流体チャネル１１０からの流体内でバクテリオファージおよび細菌の生存を可能にするように構成された、環境的に制御されたチャンバであってよい。コントローラはまた、インキュベーション貯蔵器１１２内の温度レベル、湿度レベル、および他の条件のような、インキュベーション貯蔵器１１２内の環境条件を制御するコントローラを含むことができる。幾つかの実施において、インキュベーション貯蔵器１１２の各々には、バーコードのようなコード化できる固有のチャンバコードを割り当てることができる。この固有なチャンバコードは、微小流体チャネル１１０からの各サブサンプルを自動的に追跡することを可能にする。幾つかの実施において、各インキュベーション貯蔵器１１２は、互いに異なる環境条件（例えば、異なる温度および湿度レベル）の下で維持することができる。幾つかの構成において、インキュベーション貯蔵器１１２は、灌流システムを含むことができる。灌流システムは、複数の微小流体の流れチャネルおよびポンプを含むことができる。灌流システムは、増殖培地および他の細胞培養液（例えば、サンプルおよびバクテリオファージの生存のための栄養素を含む液体）と共に、サブサンプルおよびバクテリオファージを供給することができる。培養液は、サンプルおよびバクテリオファージを含むウェルの中に、所定の間隔でまたは連続的に灌流することができる。幾つかの実施において、インキュベーション貯蔵器１１２は、外部環境へ開放されることができる。これらの実施において、インキュベーション貯蔵器１１２は、気体がインキュベーション貯蔵器１１２の中へおよび外へと移動できるように、気体透過性膜で封止することができる。これらの実施において、微小流体チャネル１１０は、微小流体カートリッジ１０２をインキュベータ内に一時的に移動させることができる。各インキュベーション貯蔵器１１２内の環境は、インキュベータ内の環境と実質的に同じであり得る。微小流体カートリッジ１０２は、インキュベーション段階の間、所定の時間だけインキュベータ内に保存することができる。
システム１００はまた、インキュベーション貯蔵器１１２の各々に連結された複数の貯蔵器を含むことができる。増殖培地貯蔵器に加えて、ファージカクテル貯蔵器１２６、抗生物質溶液貯蔵器１２８、溶菌試薬貯蔵器１３０、および洗浄液貯蔵器１２０は、インキュベーション貯蔵器（複数）１１２（まとめて貯蔵器と呼ばれる）の各々と連結することができる。インキュベーション貯蔵器１１２はそれぞれ、同じ組成の流体または異なる組成の流体を含む貯蔵器と連結することができる。例えば、インキュベーション貯蔵器１１２の各々は、異なる抗生物質溶液を含有する異なる抗生物質溶液貯蔵器１２８に連結することができる。幾つかの実施において、インキュベーション貯蔵器１１２に連結された１以上の貯蔵器に加えて、またはその代わりに、インキュベーション貯蔵器１１２は、１以上の貯蔵器からの流体で予め充填され得る。例えば、システム１００は、抗生物質溶液貯蔵器を含まなくてもよく、各インキュベーション貯蔵器１１２は異なる抗生物質溶液を予め充填されることができる。幾つかの実施において、各貯蔵器内に保存された乾燥形態または粉末形態の流体を、インキュベーション貯蔵器１１２に予め充填することができる。
微小流体カートリッジ１０２は、検出チャンバ１１４を含むことができる。検出チャンバ１１４は、壁を介して発光を視認可能にする１以上の視覚的に透明な壁を含むことができる。幾つかの実施において、検出チャンバ１１４は、インキュベーション貯蔵器１１２であることができる。例えば、光検出器１２４によって見られるときに、サブサンプルはインキュベーション貯蔵器１１２内に留まることができる。検出チャンバ１１４は、フィルタのような細菌トラップを含むことができ、該フィルタが細菌細胞を捕捉して細菌トラップ上で細菌細胞が濃縮されるときに、光検出器１２４により検出される光量の検出を向上させることができる。
微小流体カートリッジ１０２の外側に、システム１００は計数器１２２を含むことができる。計数器１２２は、細胞が微小流体チャネル１１０を通過するとき、その細胞をカウントすることができる。計数器１２２は、微小流体チャネル１１０を通過する細胞を同定でき、或いは分類することができる。例えば、インキュベーション貯蔵器１１２は、微小流体チャネル１１０を流れる細胞を、細菌細胞または赤血球としてカウントし、分類することができる。幾つかの実施において、計数器１２２は、レーザ系フローサイトメータまたはインピーダンス系フローサイトメータのうちの１つであることができる。計数器１２２は、微小流体チャネル１１０の何れかの側に送信機および受信機を含むことができる。レーザ系フローサイトメータの場合、送信機はレーザであることができ、また受信機は光検出器であることができる。インピーダンス系フローサイトメータの場合、送信機および受信機は各々が、微小流体チャンネル１１０の幅を横切るインピーダンスを測定する電極であることができる。
幾つかの実施形態において、計数器１２２は、インキュベーション貯蔵器（複数）１１２の各々に通じる１以上の弁を制御するコントローラと連結することができる。このコントローラは、計数器１２２により発生された細胞計数に基づいて、インキュベーション貯蔵器１１２の各々における細胞の数を制御することができる。例えば、コントローラは、細胞計数値がｎ個の細胞未満（ここで、ｎは、インキュベーション貯蔵器１１２の各々に存在することが望ましい細胞の数である）である間、第１のインキュベーション貯蔵器１１２への弁を開くことができる。細胞計数値がｎ未満である間、コントローラは、他のインキュベーション貯蔵器１１２の各々への弁を閉じることができる。細胞計数値がｎに達すると、コントローラは第１の弁を閉じて第２の弁を開くことができる。開放された第２の弁は、流体がインキュベーション貯蔵器１１２（２）へ流れることを可能にできる。細胞計数値が２ｎに達すると、コントローラは第２の弁を閉じて第３の弁を開くことができる。このプロセスは、コントローラがインキュベーション貯蔵器１１２の各々にｎ個の細胞を充填するまで続けることができる。
光検出器１２４は、レポータ遺伝子の発現に応答して生じた信号を検出し、測定することができる。この信号は、レポータ遺伝子によって生成された発光信号、蛍光信号、またはクロマグラフィック信号を含み得る。システム１００は、単一の光検出器１２４を含むことができる。この構成において、検出チャンバ１１４の各々は、光検出器の視野内に直列に配置され（例えば、ロボットアームによって）、各検出チャンバ内のレポータ遺伝子によって発生する信号１１４が測定される。他の実施において、システム１００は、複数の光検出器を含むことができる。例えば、システム１００は、各々の検出チャンバ１１４について別個の光検出器を含むことができる。光検出器１２４は、検出された信号を、この信号の中に細菌が存在するかどうかを判定するコントローラに提供することができる。例えば、このコントローラは、信号が所定の閾値を超えているかどうかを判定することができる。信号が所定の閾値よりも高い場合、コントローラは、ディスプレイまたはプリントアウトを介して、細菌細胞がサンプル中に存在することをユーザに知らせることができる。コントローラはまた、検出チャンバ１１４の何れから信号が検出されたかに基づいて、存在する細菌細胞の種類を示すこともできる。他の実施において、コントローラは、細菌細胞の存在に対するＹＥＳ／ＮＯの二者択一の判断に加えて、またはその代わりに、信号の値を表示することができる。信号の値は、レポータ遺伝子が発現された量の指標であることができ、これはサンプル中に存在する細菌細胞の量の代替として働くすることができる。
システム１００は、波形発生器を含むことができる。微小流体カートリッジ１０２は、波発生器の頂部に位置するように配置することができる。波形発生器は、定在音響波を発生して分離器１０６に印加することができる。波形発生器は、分離器１０６を通る流体の流れを横切る定在音響波を発生することができる。定在音響波は、流体成分（例えば、細菌および形成された成分）を、分離器１０６の壁に向かって、または壁から遠くへと駆動することができる。定在音響波は、細菌および形成された成分を１以上の凝集軸に向けて駆動することができる。波形発生器はバルク圧電音響変換器であることができる。波形発生器は、約０．５ＭＨｚ〜約１．５ＭＨｚ、約０．７ＭＨｚ〜約１．２ＭＨｚ、または約０．８５ＭＨｚ〜１．１ＭＨｚの周波数を有する定在音響波を発生させることができる。
幾つかの実施において、定在音響波の周波数は、分離器１０６の寸法に応じて選択される。例えば、分離器１０６内の流路の一部（例えば、凝集チャネルの一部）の幅は、流体中の音響波の波長の約半分に等しくすることができる。他の実施において、音響波の波長は、分離器の凝集チャネルの内部幅よりも約１〜約５倍、約２〜約４倍、または約３〜約４倍大きくすることができる。
図２Ａは、例示的な微小流体カートリッジ１０２の概略図を示す。微小流体カートリッジ１０２は、微小流体カートリッジ１０２の複数の構成要素（例えば、微小流体チャネル）を画定する基板を含み得る。幾つかの実装形態において、基板はシリコン、ガラス、金属、または他の材料のような剛性材料を含み、これは微小流体カートリッジ１０２のチャネルを通って流れる流体と基板との間に高い音響コントラストを樹立する。他の実施において、基板は、基板のチャネルを通って流れる流体と基板との間により低い音響コントラストを樹立する比較的弾性のある材料を含んでいる。これらの材料は、ポリスチレン、アクリル（ポリメチルメタクリレート）、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、環状オレフィン共重合体、シリコーン、液晶ポリマーおよびフッ化ポリビニリデン等の熱可塑性物質を含むことができる。
サンプルは、サンプル貯蔵器１０４において微小流体カートリッジ１０２に装填することができ、これは微小流体カートリッジ１０２への入口であることができる。サンプルは、分離器１０６の第１の入口２０２に入ることができる。平行流緩衝液は、分離器１０６の第２の入口２０４を介して分離器１０６に入ることができる。定在音響波は、分離器の凝集チャンネル２３４を横切って印加され得る。この定在音響波は、サンプル内の粒子（例えば血液サンプルの形成された成分）を、分離器１０６の凝集軸に向けて駆動することができる。定在音響波は、細菌細胞を凝集軸に向かって駆動することもできるが、サンプル中の他の粒子よりも遅い速度である。細菌細胞は第１の出口２０６を通って分離器１０６を出ることができ、粒子は廃棄物として第２の出口２０８を通して分離器１０６を出ることができる。濃縮器１０８は、分離器１０６の第１の出口２０６と連結される。濃縮器１０８は、第１の微小流体チャネル２１４を含むことができ、これは透過性膜またはフィルタによって第２の微小流体チャネル２１６から分離される。第２の微小流体チャネル２１６は、入口２１０および出口２１２を有することができ、そこを通って洗浄流体がポンプ輸送される。分離器１０６を出て行く細菌細胞は、第１の微小流体チャネル２１４と第２の微小流体チャネル２１６との間の膜上で捕捉することができる。細菌細胞は、第１の微小流体チャネル２１４および第２の微小流体チャネル２１６内を流れる流体の間の圧力差によって、流体が第１の微小流体チャンネル２１４から第２の微小流体チャンネル２１６の中へと駆動されるときに、膜上で補足することができる。細菌細胞のサイズよりも小さい孔径を有する膜は、細菌細胞を捕捉する。流体が第２の微小流体チャネル２１６から第１の微小流体チャネル２１４へと駆動されるように、圧力差を逆転させることによって、細菌細胞を膜から放出させることができる。
濃縮器１０８は、細菌細胞がそれらを通って流れるときに細菌細胞を捕捉して保持するために、音響、光学、誘電泳動、または他の手段を使用することができる。この濃縮器は、リガンドを含む表面コーティングを使用することができ、当該リガンドは、細菌が液体試薬によって放出されるまで細菌を表面に選択的に結合する。
図２Ａに示すように、サンプルは４つのサブサンプルに分割される。これらのサブサンプルは４つの別個の微小流体チャネル１１０中へと通過され、これらは計数器１２２へのインターフェースとして機能する。計数器１２２は微小流体カートリッジ１０２から分離され得るが、微小流体カートリッジ１０２は、計数器１２２が微小流体カートリッジ１０２上に着座できるように、或いは当該カートリッジをインターフェースできるように機械加工することができる。計数器１２２は、微小流体チャネル１１０の各々を通過する細菌細胞の数をカウントすることができる。サブサンプルは、微小流体チャネル１１０からそれぞれの検出チャンバ１１４の中へと通過することができる。ファージカクテル貯蔵器１２６は、検出チャンバ１１４の各々と連結することができる。ファージカクテル貯蔵器１２６は、ＲＤＢを含むことができる。貯蔵器１２６は、抗生物質を含むことができる。流体は、それぞれのポート２１８および２２０を介して、検出チャンバ１１４およびファージカクテル貯蔵器１２６の内部へ、またはそこから外部へとポンプ輸送することができる。１以上のポートを、微小流体カートリッジ１０２の入口、出口、およびポートと結合することができる。例えば、第１のポンプは第２の出口２０８に連結することができ、第２のポンプは濃縮器１０８の出口２１２に連結することができ、第３のポンプは、ポート２１８および２２０に連結することができる。
幾つかの実施において、システムは、ポート２２０に結合されたチャネルに放出されたレポータ分子を検出するように配置された、光検出器を含むことができる。例えば、ＲＢＤとのインキュベーションの後に、溶菌剤を貯蔵器１１２に加えて、レポータ分子はポート２２０に流れ、他の細胞断片はフィルタに保持されるようにしてもよい。光検出器は、貯蔵器から放出されて、インキュベーション貯蔵器のポート２２０に接続されたチャネルに配置された検出点を通過する、正味の信号を測定する。
図２Ｂは、第２の出口２０８を含む分離器１０６の出口部分を示す。凝集チャネル２３４の脚部２２２は、分離器１０６の第１の出口２０６と連結される。第２の入口２０４では、分離器１０６の凝集軸２２８に沿って緩衝液が導入される。矢印２３２は、分離器１０６を通る流れの方向を示している。サンプルは、分離器１０６の壁２３０の近傍の入口を介して導入される。例えば細菌細胞２２６および形成された成分２２４を含むサンプルは、最初は壁２３０付近の分離器１０６の長さに沿って流れる。定在音響波の存在下では、形成された成分２２４は、凝集軸２２８に向かって駆動される。形成された成分２２４は、第２の出口２０８を通って分離器１０６を出る。細菌細胞２２６は、壁２３０に十分に近接して残る結果、脚部２２２および第１の出口２０６を介して分離器１０６を出るようになっている。
図３は、サンプル中の細菌を検出するための例示的方法３００の流れ図を示している。方法３００は、サンプルを微小流体カートリッジの中に受入れることを含むことができる（ステップ３０２）。方法３００は、サンプルから細菌を分離することを含むことができる（ステップ３０４）。方法３００は、分離器を出て行くサンプルの一部分内で細菌を濃縮することを含むことができる（ステップ３０６）。方法３００はまた、微小流体カートリッジに試験溶液を受入れることを含むことができる（ステップ３０８）。方法３００は、レポータ遺伝子の発現によって生成された信号を検出することを含むことができる（ステップ３１０）。
上述したように、方法３００は、サンプルを微小流体カートリッジに受入れることを含むことができる（ステップ３０２）。微小流体カートリッジは、図２および図３に関連して上述した微小流体カートリッジに類似することができる。微小流体カートリッジは、図１に関連して上述したシステムに類似した、異常に収容されたバクテリア同定システムの構成要素とすることができる。サンプルは、複数の生細胞を含む体液または組織の集合であることができる。このサンプルは、血液採取、生検、組織スワブ、または他の類似の採取法の結果として受取ることができる。サンプルは、その中に含まれる細胞が被験体の体外で生存するための十分な条件下（例えば、制御された温度、湿度およびｐＨ条件下）で、１以上の容器の中で維持することができる。サンプルは、微小流体カートリッジに供給される前に、全体のサンプルサイズを大きくするために培養することができる。サンプルには、受け取ったサンプルを他の患者のサンプルから区別するために、固有のコード（例えば、バーコードまたはＱＲコード）を使用することができる。固有のコードは、微小流体カートリッジ、バイアル、容器、皿、または他のそのような患者サンプル保存デバイスに与えられてよい。サンプルは、細菌を含むことが疑われる血液サンプルであり得る。サンプルは、可能性のある細菌に加えて、血漿および形成された成分を含む全血であり得る。全血はまた、抗体、遊離タンパク質、電解質および他の成分を含むことができる。サンプルはまた、細菌を含むことが疑われる任意の他の流体であることもできる。サンプルは、約１ｍＬ〜約２０ｍＬであることができる。サンプルが微小流体カートリッジの入口貯蔵器に装填されたら、ポンプはこのサンプルを入口貯蔵器から分離器へ、また分離器を通して流すことができる。微小流体カートリッジがサンプルを受取ったら、１以上のポンプが、このサンプル（またはその一部）を分離器の中にポンプ輸送することができる。
方法３００は、サンプルから細菌を分離することを含むことができる（ステップ３０４）。分離器は、試験サンプル中の細菌細胞を、形成された成分およびそこに配置された他の成分（例えば、抗体、遊離タンパク質、電解質）のような、サンプル中の他の成分から分離することができる。幾つかの実施において、これらの成分は、方法３００におけるその後の検出工程において、合併症を引き起こす可能性がある。例えば、サンプル中の免疫系成分（例えば、抗体）は、バクテリオファージの作用を妨害する可能性がある。細菌細胞は、粒子遠心分離、接着、音響泳動、または高調波の使用を含む多くの粒子分離手順の何れかによってサンプルから分離することができる。分離器は、音響分離器とすることができる。これらの実施において、定在音響波を、分離器内の流体チャネルを横切って印加することができる。定在音響波は、形成された成分および細菌を分離器内の凝集軸に向けて駆動することができる。例えば、定在音響波は、形成された成分を、分離器内の流体チャネルの中心付近の凝集軸に向けて駆動することができる。定在音響波が細菌を凝集軸に十分に近づけないので、流体チャンネルの壁の近くに配置された第１の組の出口は、細菌を集めることができる。流体チャネルの中心に配置され、凝集軸に沿って配置された第２の出口は、形成された成分を集めることができる。
方法３００は、分離器を出て行くサンプルの一部内において細菌を濃縮することを含むことができる（ステップ３０６）。上述のように、細菌細胞は、サンプル由来の希釈された血漿と混合されて分離器を出ることができる。濃縮器は、細菌細胞が方法３００の次のステップへと供給される前に、細菌細胞を濃縮することができる。一つの実施において、分離器を出る流体は、フィルタで第２の流路から分離された第１の流路へと入ることができる。最初は、第２の流路内の圧力は、細菌細胞がフィルタに向かって駆動されるように、第１の流路内の圧力より低くすることができる。フィルタは、細菌細胞のサイズよりも小さい孔サイズを有し、細菌細胞を捕捉することができる。所定の時間が経過した後、第２の流路において圧力が上昇する。第２の流路における圧力の増加は、流体を第２の流路から膜を介して第１の流路へと駆動させることができる。第２の流路から第１の流路への流体の流れの逆転は、細菌細胞をフィルタから追出し、細菌細胞の第１の流路への濃縮された放出を提供することができる。
方法３００は、細菌細胞をカウントすることを含むことができる。細菌細胞は、一度に１つの細菌細胞のみが微小流体チャネルを流れることができるように、実質的に単細胞の大きさを有する微小流体チャネルに流入することができる。細菌細胞が微小流体チャネルを流れるとき、フローサイトメータ等の細胞計数器は細菌細胞の数をカウントし、任意の所定時間に微小流体チャネルを流れる細菌細胞の数を決定することができる。コントローラは、細胞計数器および複数の弁と連結することができる。弁は、インキュベーション貯蔵器へのサンプルの流れを制御できる。コントローラは、微小流体チャネルを流れるサンプルから、サブサンプルを生成するように構成することができる。各サブサンプルは、インキュベーション貯蔵器へと供給できる。コントローラは、細胞計数器が行った計数に基づいて、インキュベーション貯蔵器の各々を、それぞれが実質的に同じ数の細菌細胞を受入れるように連続的に満たすことができる。例えば、細胞計数器によりカウントされるとき、最初の１００個の細菌細胞が第１のインキュベーションチャンバに提供され、第２の１００個の細菌細胞が第２のインキュベーションチャンバに提供される等のように、コントローラは弁を開閉することができる。インキュベーション貯蔵器の各々に対して実質的に同数の細菌細胞を提供することにより、細胞の凝集を低減して、インキュベーション貯蔵器間でより一貫した結果を提供することができる。
インキュベーション貯蔵器内において１回、当該システムは、培地流体を各インキュベーション貯蔵器に加えることができる。培地流体は、細菌細胞が患者の体外で生存し続けるために、水分、ｐＨ、および浸透圧バランス等の細菌細胞の要求に適応できるような、細菌細胞のための置換環境を提供するように構成することができる。
方法３００はまた、試験溶液を微小流体カートリッジに受入れることを含むことができる（ステップ３０８）。試験溶液はＲＤＢを含むことができる。ＲＤＢは、１以上のレポータ遺伝子を含むことができる。レポータ遺伝子は、発光タンパク質、蛍光タンパク質、またはクロマトグラフィータンパク質を発生することができる。試験溶液は、各サブサンプルを含むインキュベーション貯蔵器に導入することができる。インキュベーション貯蔵器中の細菌細胞は、細菌細胞が試験溶液中のバクテリオファージに曝露されて接触することができるように、所定の試験溶液と接触させられる。例えば、試験溶液のＲＤＢ部分は、微小流体カートリッジと連結されたファージカクテル貯蔵器内に保存することができる。所定の時間において、当該システムは、試験溶液を貯蔵器からインキュベーション貯蔵器の一つへと流すことができる。接触すると、ＲＤＢはサブサンプル内の対応する細菌型を認識しよう試みる機会を得ることができる。ＲＤＢがサブサンプル中の対応する細菌タイプを同定した場合、ＲＤＢは細菌に感染し、遺伝子レポータ遺伝子ペイロードを細菌に送達することができる。この時点で、細菌細胞はレポータタンパク質の合成を開始することができる。幾つかの実施においては、複数のＲＤＢ由来のＲＤＢを細菌細胞のサブサンプルと組み合わせることができる。幾つかのこのような実施において、ＲＤＢの各々は、異なる型のレポータ遺伝子を含むことができる。例えば、第１のＲＤＢは、第１のタイプのレポータ遺伝子（例えば、生物発光をコードする）を含むことができ、また第２のＲＤＢは、異なる第２のタイプのレポータ遺伝子（例えば、生物発光をコードする）を含むことができる。そのような例では、２つの異なる型の細菌細胞が、同じサブサンプル中で同定される可能性がある（例えば、光および蛍光の両方を検出し測定することによって）。
幾つかの実施において、試験溶液は複数の溶液を含むことができる。試験溶液の複数の溶液をインキュベーション貯蔵器に同時に投与することができ、または当該複数の溶液を一定期間に亘って一連の溶液として、インキュベーション貯蔵器に送達することができる。例えば、上述したＲＤＢは、インキュベーション貯蔵器に投与することができる。所定のインキュベーション時間の後、第２の溶液をインキュベーション貯蔵器１１２に投与することができる。試験溶液中の第２の溶液は、試験溶液の第１の溶液とは異なることができる。例えば、試験溶液中の第２の溶液は、上記に記載した抗生物質貯蔵器の一つからの抗生物質溶液であることができる。適用される抗生物質は、上記で適用されたＲＤＢの標的とされる細菌タイプに対応することができる。幾つかの構成では、対照サンプル（存在する場合）を除き、サブサンプルの各々を抗生物質感受性について試験することができる。これらのサブサンプルは、異なるタイプの抗生物質に供されることができる。例えば、第１のサブサンプルは対照として働き、それに抗生物質を適用することはできない。抗生物質感受性について試験されるべき第２のサブサンプルは、第１の抗生物質（例えば、広域スペクトル抗生物質）に供され、抗生物質感受性について試験されるべき第３のサブサンプルは、第２の抗生物質（例えば、第１の抗生物質とは異なり、例えば別の広域スペクトル抗生物質または狭域スペクトル抗生物質）に供され、抗生物質感受性について試験されるべき第４のサブサンプルは、第３の抗生物質（例えば、第１および第２の抗生物質とは異なる）に供される。幾つかのこのような構成では、各対照サンプルおよび各抗生物質について複数の試験が実施される（例えば、第１の抗生物質は、抗生物質感受性について試験されるべき１０個のサブサンプルに適用され、第２の抗生物質は、抗生物質感受性について試験される別の１０個のサブサンプルに適用される）。加えて、幾つかの構成では、抗生物質感受性について試験されるべきサブサンプルは、同じ抗生物質の様々な用量強度に供され得る（例えば、第１の抗生物質５ｍｇを５つのサブサンプルに適用し、第１の抗生物質２５ｍｇを別の５つのサブサンプルに適用する）。抗生物質の各々は、各特定の抗生物質を同定する固有のコード（例えば、抗生物質容器上のバーコードまたはＱＲコードとして表される）と関連付けることができる。
方法３００は、レポータ遺伝子の発現によって生成された信号を検出することを含むことができる（ステップ３１０）。幾つかの実施において、発現は、サンプルがインキュベーション貯蔵器内にあるときに検出することができる。他の実施では、サンプルを検出チャンバへとポンプ輸送でき、サンプルが検出チャンバ内にあるときに発現をモニターできる。レポータ遺伝子は、試験溶液または複数の溶液を適用した所定時間の後に検出することができる。幾つかの実施では、レポータ遺伝子の検出中および／または検出前に、サンプルに対してレポータ遺伝子発現条件を適用することができる。提供される遺伝子発現条件は、サンプルに適用されるレポータ遺伝子の種類に対応することができる。例えば、生物発光遺伝子が適用される場合、低レベルの光およびエネルギー源（例えば、栄養素および共因子）が、サンプルに与えられる。別の例として、生物蛍光遺伝子が使用される場合、サンプルに対して、対応する生体蛍光タンパク質を蛍光発光させると予想される波長の光が与えられる。組立てられたレポータ遺伝子の種類に依存する他の構成もまた同様に使用することができる。この発現は、システムの光検出器によって検出することができる。
方法３００はまた、レポータ遺伝子発現を定量することを含むことができる。レポータ遺伝子発現の量は、対応するレポータタンパク質の存在に基づいて定量することができる。適用されたＲＤＢ中のバクテリオファージに対応する細菌がサンプル中に存在する場合、レポータ遺伝子が細菌細胞に送達され、レポータタンパク質が細菌細胞内で合成されるであろう。同様に、これら細菌細胞が存在しない場合、レポータタンパク質は合成されないであろう。例えば、レポータ遺伝子が生物発光タンパク質をコードする場合、対応する患者サンプルが与える任意の光を測定して、レポータ遺伝子発現を定量することができる。レポータ遺伝子発現は、細胞ごとに（例えば、細菌細胞が計数される場合）、またはバルク発現ベースで（例えば、生物発光の全体量が決定される場合）定量化され得る。細菌細胞の存在（またはその欠如）は、ユーザに報告され得るか、または別の方法でユーザに表示され得る。細菌の存在は、陽性（細菌が存在する）または陰性（細菌が存在しない）の結果としてユーザに報告され得る。幾つかの実施において、報告書はまたレポータ遺伝子発現量の指標を含むことができ、これはサンプル中に存在する細菌細胞数の指標を提供する。
幾つかの実施において、方法３００は、細菌細胞の抗生物質感受性を決定することを含むことができる。定量されたレポータ遺伝子発現量を用いて、抗生物質感受性を決定することができる。例えば、対照サブサンプル中のレポータ遺伝子発現は、抗生物質感受性について試験すべきサブサンプル中に標的細菌が存在する程度を示すベースラインとして使用することができる。このように、抗生物質感受性について試験すべき他のサブサンプルの間での遺伝子発現の比較レベルは、所定のサブサンプルにおいて、所定の抗生物質が細菌を殺滅したか、さもなければ不活性化した程度を示し得る。レポータ遺伝子発現が対照サンプルに匹敵するレベルに留まる場合、抗生物質感受性は低い可能性がある。同様に、レポータ遺伝子発現が低いかまたは存在しない場合、抗生物質感受性は高い可能性がある。
Ｅ．本技術によるバクテリアの同定および抗生物質感受性のプロファイリング方法
生物学的サンプル中の細菌種の正確な同定は、細菌感染症を治療するための適切な治療法の選択を知らせる。本明細書に開示される組換え検出バクテリオファージは、生物学的サンプル（例えば、全血、血漿、血清）内に存在する細菌を同定するために使用され得る。組換え検出バクテリオファージは、単独で、またはセクションＤに関連して上述したシステムと組み合わせて使用することができる。このような方法は、生物学的サンプルを本明細書中に開示する組換え検出バクテリオファージと接触させ、組換え検出ファージに感染した細菌宿主細胞の存在を検出することを含み、ここでの組換え検出ファージは検出可能な遺伝子産物をコードする異種核酸を含み、それによって生物学的サンプル内に存在する細菌の同定を導く。
追加的または代替的に、本明細書中に開示される組換え検出バクテリオファージは、生物学的サンプル（例えば、全血、血漿、血清）内に存在する細菌の抗生物質感受性をプロファイリングするための方法において使用され得る。この抗生物質感受性のプロファイリングは、単独で、またはセクションＤに関して上述したシステムと組み合わせて使用することができる。これらの方法は、（ａ）生物学的サンプルを、本明細書に開示する抗生物質および組換え検出バクテリオファージと接触させること、（ｂ）組換え検出ファージに感染した細菌宿主細胞の存在を検出し、ここでの組換え検出ファージは検出可能な遺伝子産物をコードする異種核酸を含むことと、（ｃ）組換え検出ファージに感染した細菌宿主細胞の数が、未処理の対照サンプルで観察されたものと比較して減少するときに、抗生物質が生物学的サンプル中に存在する細菌を阻害することにおいて有効であると決定することを含む。
１つの態様において、本開示は、被験体から得た試験サンプルにおける少なくとも一つの細菌株または種を同定する方法であって、（ａ）試験サンプルから単離された細菌細胞を１以上のサブサンプルに分離するステップと、（ｂ）各サブサンプルを、本明細書に開示される１つ以上の組換え検出バクテリオファージと接触させ、ここでの各組換え検出バクテリオファージは１以上のレポータ遺伝子をコードする異種核酸を含むことと、（ｃ）１以上の組換え検出バクテリオファージの１以上のレポータ遺伝子の発現を検出することによって、試験サンプルにおいて少なくとも１つの細菌株を同定することを含む方法を提供する。試験サンプルにおいて少なくとも１つの細菌株または種を同定することは、単独で、またはセクションＤに関連して上述したシステムと組み合わせて行うことができる。一定の実施形態において、１以上の組換え検出バクテリオファージの核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択される。一定の実施形態において、試験サンプルにおいて少なくとも１つの細菌株または種を同定することは、試験サンプルまたはサブサンプルからの細菌細胞を培養することを必要としない。
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの細菌株または種の同定には、１以上の組換え検出バクテリオファージの１以上のレポータ遺伝子の発現を検出することを含み、例えば、緑色蛍光の検出は細菌種Ａの存在を示すのに対して、青色蛍光の検出は細菌種Ｂの存在を示す。幾つかの実施形態において、少なくとも一つの細菌株または種の不存在は、１以上の組換え検出バクテリオファージの１以上のレポータ遺伝子の検出可能な発現の不存在によって同定され、例えば、緑色蛍光の検出不能な発現は、試験サンプルまたはサブサンプルにおける細菌種Ａの不存在を示す。これらの方法は、単独で、またはセクションＤにおいて上述した装置と組み合わせて使用することができる。
幾つかの実施形態において、１以上の組換え検出バクテリオファージは単一種の細菌に感染する。一定の実施形態において、１以上の組換え検出バクテリオファージは２以上の細菌種に感染する。限定ではなく一例として、幾つかの実施形態において、感染される細菌の種には、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎クレブシエラ、エルシニア・ペスティス、炭疽菌、バークホルデリア・マレイ、およびフラシセラ・トラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）が含まれる。これらの方法は、単独で、またはセクションＤで上述した装置と組み合わせて使用することができる。
幾つかの実施形態において。２以上の細菌種に感染する１以上の組換え検出バクテリオファージは異なるレポータ遺伝子を含み、ここでは同じ細菌種に感染する組換え検出バクテリオファージは同じレポータ遺伝子を含む。これらの方法は、単独で、またはセクションＤで上述した装置と組み合わせて使用することができる。
幾つかの実施形態において、レポータ遺伝子の発現の検出は、遺伝子産物そのもの、例えば蛍光タンパク質の検出である。幾つかの実施形態において、レポータ遺伝子の発現の検出は、レポータ遺伝子の発現を必要とする酵素反応の検出、例えばルシフェリンを触媒して光を生成するルシフェラーゼの発現の検出である。これらの方法は、単独で、またはセクションＤで上述した装置と組み合わせて使用することができる。
幾つかの実施形態において、１以上のレポータ遺伝子の発現は、サブサンプルを１以上の組換え検出バクテリオファージに接触させた後、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０分、またはこれら二つの値の間の任意の時間で検出される。これらの方法は、単独で、またはセクションＤで上述した装置と組み合わせて使用することができる。
別の態様において、本開示は、被験体から得られた試験サンプルにおける細菌株または種の抗生物質感受性を決定するための方法であって、（ａ）試験サンプルから単離された細菌細胞を複数のサブサンプルに分離することと、（ｂ）複数のサブサンプルを、本明細書に開示された組換え検出バクテリオファージおよび少なくとも一つの抗生物質と接触させ、ここでの組換え検出バクテリオファージはレポータ遺伝子をコードする異種核酸を含むことと、（ｃ）各抗生物質の存在下に、組換え検出バクテリオファージのレポータ遺伝子の発現を検出することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、当該方法は更に、抗生物質で処理されたサブサンプルにおける組換え検出バクテリオファージのレポータ遺伝子の発現が、抗生物質で処理されていない対照サブサンプルで観察されたものに比較して減少した場合には、試験サンプルにおける細菌株または種が抗生物質に対して感受性であると判定することを含む。他の実施形態において、当該方法は更に、抗生物質で処理されたサブサンプルにおける組換え検出バクテリオファージのレポータ遺伝子の発現が、抗生物質で処理されていない対照サブサンプルで観察されたものと同等である場合には、試験サンプル中の細菌株または種が抗生物質に対して耐性であると判定することを含む。一定の実施形態において、組換え検出バクテリオファージの核酸配列は配列番号１、配列番号２、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選択される。一定の実施形態において、試験サンプルにおける細菌株または種の抗生物質感受性を決定するための方法は、試験サンプルまたはサブサンプルからの細菌細胞を培養することを必要としない。これらの方法は、単独で、またはセクションＤで上述した装置と組み合わせて使用することができる。
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの抗生物質は、リファンピシン、テトラサイクリン、レボフロキサシン、およびアンピシリンのうちの１以上である。他の抗生物質の例には、ペニシリンＧ、メチシリン、オキサチリン、アモキシシリン、セファドロキシル、セフォラニド、セフォタキシム、セフトリアキソン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、シクロセリン、イソニアジド、リファンピン、テイコプラニン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リネゾリド、プリスチナマイシン、セフタビプロール、セフタロリン、ダルババンシン、ダプトマイシン、ムピロシン、オリタバンシン、テジゾリド、テラバンシン、チゲサイクリン、セフタジジム、セフェピム、ピペラシリン、チカルシリン、バージニアマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、スペクチノマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファゾリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフペラゾン、セフポドキシム、セフチブテン、セフチゾキシム、リンコマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、アズトレオナム、フラゾリドン、ニトロフラントイン、ポシゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、ナフシリン、ペニシリンＶ、テモシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、エノキサシン、ガチフロキサシン、ジェミフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、銀スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（Ｃｏ−トリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、スルホンアミドクリソイジン、デメクロサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、エタンブトール、エチオナミド、ピラジナミド、リファブチン、リファペンチン、アルスフェナミン、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、プラテンシマイシン、チアムフェニコール、チニダゾール、トリメトプリム（Ｂｓ）およびバンコマイシンが含まれる。
本方法の幾つかの実施形態では、抗生物質で処理したサブサンプルおよび未処理の対照サブサンプルにおいて観察される、組換え検出バクテリオファージのレポータ遺伝子の発現の差をμと定義する。
追加的または代替的に、本方法の幾つかの実施形態において、レポータ遺伝子の発現は、サブサンプルを、本明細書に開示された組換え検出バクテリオファージに接触させた後、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０分、またはこれら二つの値の間の任意の時間で検出される。
幾つかの実施形態では、２以上のサブサンプルが抗生物質感受性について連続的に試験される。幾つかの実施形態では、２つ以上のサブサンプルが抗生物質感受性について並行して試験される。幾つかの実施形態では、１以上のサブサンプルが、抗生物質感受性についてランニングアッセイで試験される（ここでは１つの抗生物質に対する耐性または感受性が決定され、第２、第３、第４、第５等の抗生物質に対する耐性または感受性がアッセイされる）。
本明細書中に開示される方法の幾つかの実施形態において、試験サンプルから細菌細胞を単離することには、試験サンプルを蒸留水と共にインキュベートして混合物を形成し、この混合物を遠心分離して細菌細胞を含むペレットを形成し、上清を廃棄した後にペレットを再懸濁して、単離された細菌細胞を含む細菌懸濁液を形成することが含まれる。ペレットは、リン酸緩衝液中に再懸濁され得る。幾つかの実施形態において、細菌懸濁液は１以上のサブサンプルに分割される。
本明細書に開示される方法の一定の実施形態において、試験サンプルを蒸留水と混合すると、細胞壁を欠く細胞（例えば、哺乳動物細胞および赤血球）の溶菌が導かれる一方、細胞壁を備えた細胞（例えば、細菌）はそのまま残される。理論に束縛されることを望むものではないが、幾つかの実施形態において、細胞壁を欠く細胞の除去は、無傷の非細菌細胞（例えば赤血球）がレポータ遺伝子の発現を抑制するので、組換え検出バクテリオファージで感染した細菌細胞におけるレポータ遺伝子発現の検出を向上させる。
本技術の方法の幾つかの実施形態において、当該混合物は、約９０％蒸留水および１０％試験サンプル、約８０％蒸留水および２０％試験サンプル、約７０％蒸留水および３０％試験サンプル、約６０％の蒸留水および４０％の試験サンプル、約５０％の蒸留水および５０％の試験サンプル、約４０％の蒸留水および６０％の試験サンプル、約３０％の蒸留水および７０％の試験サンプル、約２０％の蒸留水および８０％の試験サンプル、または約１０％の蒸留水および９０％の試験サンプルである。
本明細書に開示される方法の幾つかの実施形態では、混合物を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５分間、または先に列挙した２つの時点の間の任意の時間だけインキュベートされる。追加的にまたは代替的に、本明細書に開示された方法の特定の実施形態では、混合物は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５分間、または先に列挙した２つの時点の間の任意の時間だけ遠心分離される。
追加的または代替的に、本明細書に開示される方法の一定の実施形態において、１以上のサブサンプルの各々は、約５〜５００個、約１０〜４００個、約２０〜３００個、約３０〜３００個、約４０〜２００個または約５０〜１００個の細菌細胞を含む。本明細書に開示される方法の幾つかの実施形態において、１つ以上のサブサンプルの各々は、約１００〜１０，０００、約２００〜９，０００、約３００〜８，０００、約４００〜７，０００、約５００〜６，０００、６００〜５，０００、約７００〜４，０００個、約８００〜３，０００個、約９００〜２，０００個、または約１，０００〜１，５００個の細菌細胞を含む。
本技術の方法の上記の何れの実施形態においても、試験サンプルは、被験体から得られた血液、痰、粘液、洗浄液、唾液、またはスワブである。
本明細書中に開示される方法の幾つかの実施形態において、試験サンプルは、例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、およびウマなどの家畜；犬および猫などのペット動物；ラット、マウスおよびウサギのような実験動物を含む哺乳動物から得られる。一実施形態において、哺乳動物はヒトである。
Ｆ．キット
本技術は、細菌の同定および抗生物質感受性プロファイリングのためのキットを提供する。
一態様において、本技術のキットは、本明細書に開示される複数の組換え検出バクテリオファージを含む１以上のコード化／標識化されたバイアル、および使用説明書を含む。一定の実施形態において、複数の組換え検出バクテリオファージは、配列番号１、配列番号２、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択される１以上の核酸配列を含んでいる
幾つかの実施形態において、複数の組換え検出バクテリオファージを含む各コード化／標識化されたバイアルは、異なるバクテリオファージ型に対応する。他の実施形態において、複数の組換え検出バクテリオファージを含む各コード／標識化されたバイアルは、同じバクテリオファージ型に対応する。幾つかの実施形態において、各ファージバイアルには、ファージバイアル中の組換え検出バクテリオファージ、または組換え検出バクテリオファージ株が感染する細菌のタイプを同定する固有のコードが割り当てられる。固有のコードは、バーコード、ＱＲコード、英数字の文字列、またはリーダによって識別可能な他の任意のパターンのような機械識別可能なパターンによってコード化することができる。各固有のコードは、例えば、対応する組換え検出ファージサンプルを保存するバイアルまたは容器上のバーコードステッカーとして示すことができる。幾つかの実施形態において、キットは、バクテリオファージ特異的な制御された温度、湿度およびｐＨ条件のように、組換え検出バクテリオファージの延長期間での保存を可能にする条件下で保存される。
追加的または代替的に、幾つかの実施形態において、キットは更に、天然または非天然の細菌宿主細胞を含有するバイアルを含む。幾つかの実施形態において、細菌宿主細胞は大腸菌である。一定の実施形態において、細菌宿主細胞は大腸菌ＤＨ１０Ｂ株である。
キットはまた、自動分析用のソフトウェア、容器、商業販売等を目的とするパッケージング等のパッケージを具備し得る。
キットは更に、洗浄用緩衝液および／または試薬、ハイブリダイゼーション用緩衝液および／または試薬、標識用緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段のうちの１以上を含み得る。緩衝液および／または試薬は、通常、キットが意図される特定の検出技術のために最適化される。当該方法の異なるステップを実行するための、これら緩衝液および試薬を使用するためのプロトコルもまた、キットに含まれ得る。キットの更なる任意の構成要素には、生物発光のための栄養素および補因子を含有する培地のような、本明細書に開示される組換え検出ファージによりコードされる遺伝子産物の発現培地、生物蛍光を検出するための特定波長の光を照射するように構成されたランプ、光度計または光検出器のような装置が含まれる。
追加的または代替的に、本明細書に開示されるキットはまた、複数の抗生物質を含むコード化され且つ標識化されたバイアルも含み得る。幾つかの実施形態において、複数の抗生物質には、リファンピシン、テトラサイクリン、レボフロキサシン、およびアンピシリンのうちの１以上が含まれる。抗生物質の他の例には、ペニシリンＧ、メチシリン、オキサチリン、アモキシシリン、セファドロキシル、セフォラニド、セフォタキシム、セフトリアキソン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、シクロセリン、イソニアジド、リファンピン、テイコプラニン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リネゾリド、プリスチナマイシン、セフタビプロール、セフタロリン、ダルババンシン、ダプトマイシン、ムピロシン、オリタバンシン、テジゾリド、テラバンシン、チゲサイクリン、セフタジジム、セフェピム、ピペラシリン、チカルシリン、バージニアマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、スペクチノマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファゾリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフペラゾン、セフポドキシム、セフチブテン、セフチゾキシム、リンコマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、アズトレオナム、フラゾリドン、ニトロフラントイン、ポシゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、ナフシリン、ペニシリンＶ、テモシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、エノキサシン、ガチフロキサシン、ジェミフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、銀スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（Ｃｏ−トリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、スルホンアミドクリソイジン、デメクロサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、エタンブトール、エチオナミド、ピラジナミド、リファブチン、リファペンチン、アルスフェナミン、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、プラテンシマイシン、チアムフェニコール、チニダゾール、トリメトプリム（Ｂｓ）およびバンコマイシンが含まれる。
Ｇ．実施例
実施例１：細菌を検出し、抗生物質感受性プロファイルを決定する上での組換え検出バクテリオファージ株Ｔ７・ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の使用
この実施例は、本明細書に開示される組換え検出バクテリオファージ株が、細菌の同定および抗生物質感受性プロファイリングのための方法において有用であることを実証する。
図４は、組換え検出Ｔ７バクテリオファージのＮｈｅＩ部位近傍に挿入された異種核酸配列（配列番号１）を示す。図１５は、組換え検出Ｔ７ファージのＳｗａｌ部位近傍に挿入された異種核酸配列（配列番号６）を示す。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポータ遺伝子の二重挿入を含む組換えＴ７ファージであるＤＬＰＥＣ０２株の、完全なゲノム配列（配列番号２）を図５に示す。
Ｚｙｍｏ・ＺＲウイルスＤＮＡキット（カタログ番号Ｄ３０１５）（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いて、清澄化したファージ溶解物からＴ７バクテリオファージＤＮＡを抽出した。約１００ｎｇのＴ７ファージＤＮＡを、制限酵素Ｓｗａｌ（ＮＥＢ Ｒ０６０４）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用い、製造業者の仕様書に従って消化した。ウイルスゲノムに対して相同性の６０ｂｐにより囲まれたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子を含むｇＢｌｏｃｋ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡによって合成された）が、Ｇｉｂｓｏｎ・Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）によってＳｗａｌ切断部位に挿入された。
２μＬの得られたＴ７／ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合産物を、電気穿孔により、ＮＥＢ１０β細胞（ＮＥＢ Ｃ３０３０Ｋ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）の中に導入した。細胞を、０．６５％軟寒天オーバーレイを有するＬＢ寒天上に播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、単離されたプラークを選択し、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）挿入部位に隣接するプライマーを用いたＰＣＲを介して、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）挿入についてスクリーニングした。Ｓｗａｌ部位に単一のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）挿入を有する組換えＴ７ファージを単離した後に、上記で概説したクローニングプロトコルを使用して、Ｎｈｅｌ制限部位（ＮＥＢ Ｒ０１３１）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で２回目のＮａｎｏＬｕｃ挿入を行った。３７℃で一晩インキュベートした後、単離されたプラークを選択し、第二のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）挿入部位に隣接するプライマー（即ち、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）とファージゲノムＤＮＡ間の接合部に跨る）を用いたＰＣＲを介して、第二のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）挿入についてスクリーニングした。
ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の産生を、細菌宿主細胞を組換え検出ファージＤＬＰＥＣ０２株に感染させ、異なる細菌宿主細胞濃度で１０〜６０分間の発光を測定することにより評価した。図６は、組換え検出ファージＤＬＰＥＣ０２株に感染した細菌宿主細胞により産生されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）信号の強度が、細菌細胞の濃度および時間に依存したことを示している。
ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）産生がＴ７ファージに感染し得る細菌宿主細胞に特異的であることを確認にするために、ＤＨ１０Ｂ細胞（正常なＴ７宿主である）を、Ｔ７には感染し得ない尿路病原性大腸菌株ＵＰＥＣと並行して感染させた。図１１は、感染したＤＨ１０Ｂ細胞において発光が検出されたが、ＵＰＥＣでは発光が検出されなかったことを示す。これらの結果は、本明細書に開示された組換え検出バクテリオファージ株が、細菌の同定方法において有用であることを示している。
Figure 2019515662
図７は、ＲＮＡ合成阻害剤であるリファンピシンで処理した後の、組換え検出ファージＤＬＰＥＣＯ２株に感染した感受性大腸菌株と耐性大腸菌株との間の信号分離（δμと表す）を示す。図８は、タンパク質合成阻害剤であるテトラサイクリンで処理した後の、組換え検出ファージＤＬＰＥＣＯ２株に感染した感受性大腸菌株と耐性大腸菌株との間の信号分離（δμと表す）を示す。
図９は、組換え検出ファージＤＬＰＥＣＯ２株に感染した未処理の細菌細胞と、処理された細菌細胞（１０または２５μｇ／ｍＬのレボフロキサシン）との間での信号分離（μと表す）を示している。図１０は、組換え検出ファージＤＬＰＥＣＯ２株を感染させた未処理の細菌細胞と、処理された細菌細胞（１００または２５０μｇ／ｍＬのアンピシリン）との間での信号分離（μと表す）を示している。
纏めると、図６〜１０は、本明細書中に開示される組換え検出バクテリオファージ株が、抗生物質感受性プロファイリングのための方法において有用であることを示している。
従って、本明細書に開示される方法は、細菌の同定および抗生物質感受性プロファイリングのための方法において有用である。
Ｈ．均等物
本技術は、本願に記載された特定の実施形態に関して限定されるものではなく、これら実施形態は本技術の個々の態様の一つの例示を意図したものに過ぎない。当業者には明らかなように、本技術の精神および範囲から逸脱することなく、本技術の多くの改変および変形を行うことができる。本明細書に列挙したものに加えて、本技術の範囲内における機能的に均等な方法および装置は、前述の説明から当業者に明らかであろう。そのような改変および変形は、本技術の範囲内に入ることが意図されている。この本技術は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物学的システムには限定されず、当然ながら変化するものであることが理解されるべきである。また、本明細書で使用する用語は特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定を意図しないことも理解されるべきである。
更に、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループの用語で記載される場合、それによって、本開示はマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはサブグループに関しても記載しているものであることを当業者は認識するであろう。
当業者により理解されるように、任意のおよび全ての目的のために、特に書面による説明を提供する観点から、本明細書に開示される全ての範囲は、その可能な部分範囲、および部分範囲の組み合わせをも包含する。任意の列挙された範囲は、少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解されている範囲を十分に記述し、且つこれらの範囲を実施可能にするものとして容易に認識できる。非限定的な例として、ここで議論される各範囲は、下３分の１、中央３分の１、上３分の１等に容易に分解することができる。当業者には理解されるように、「以下」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」等のような全ての語句は、記載された数を含み、また上記で述べたように後で部分範囲に分解され得る範囲に言及するものである。最後に、当業者には理解されるように、範囲は各個別のメンバーを含むものである。従って、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１個、２個、または３個の細胞等を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４または５個の細胞を有する群を言う。
本明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲において、本明細書で参照または引用された全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、全ての図および表を含めて、その全体を本明細書の一部として援用する。

Claims (23)

  1. 微小流体カートリッジであって、
    細菌細胞ならびに血漿および複数の形成された要素を含む血液を含むサンプルを受入れるように構成された入口と、
    前記入口に連結された分離器であって、第１の出口および第２の出口を備え、前記細菌細胞および前記血漿を前記第１の出口に、また前記血液の前記複数の形成された成分を前記第２の出口に流すように構成された分離器と、
    前記細菌細胞をインキュベートするように構成された貯蔵器であって、前記第１の出口に連結されて、レポータ遺伝子を含む少なくとも一つの組換え検出バクテリオファージを受入れるように構成された貯蔵器と
    を具備する微小流体カートリッジと、
    少なくとも１つの組換え検出バクテリオファージに感染している前記細菌細胞に応答するレポータ遺伝子の発現によって生じた信号を検出する光検出器と
    を備えたシステム。
  2. 前記微小流体カートリッジが、
    前記分離器と前記貯蔵器との間で前記分離器の前記第１の出口に連結された濃縮器であって、前記細菌細胞を収集し、第３の出口を介して前記細菌細胞を流すように構成された濃縮器と、
    前記第３の出口に連結され、且つ第４の出口を備えた微小流体チャンネルであって、前記貯蔵器が前記第４の出口と連結される微小流体チャネルと
    を更に具備する、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記細菌細胞が前記微小流体チャネルを流れるときに、前記細菌細胞の数をカウントするように構成された計数器を更に具備する、請求項２に記載のシステム。
  4. 前記計数器はレーザ系フローサイトメータまたはインピーダンス系フローサイトメータのうちの１つである、請求項３に記載のシステム。
  5. 前記微小流体カートリッジが取り外し可能である、請求項１に記載のシステム。
  6. 前記微小流体カートリッジがポリスチレンを含む、請求項５に記載のシステム。
  7. 音響波発生器を更に具備し、前記音響波発生器は前記分離器を横切って音響波を発生するように構成される、請求項１に記載のシステム。
  8. 前記音響波は、前記分離器の凝集チャネルの幅の約３倍〜約４倍の間の音響波長を有する、請求項７に記載のシステム。
  9. 前記レポータ遺伝子の発現によって生じた信号は前記貯蔵器の壁を介して視認可能であり、また発光信号、蛍光信号、またはクロマグラフィック信号の少なくとも１つを含む、請求項１に記載のシステム。
  10. 前記第１の出口に連結された複数の貯蔵器を更に具備し、前記複数の貯蔵器の各々が、異なる組換え検出バクテリオファージを受入れるように構成される、請求項１に記載のシステム。
  11. 細菌細胞ならびに血漿および複数の形成された要素を含む血液を含むサンプルを受入れるように構成された入口と、
    第１の出口および第２の出口を備えた分離器であって、前記細菌細胞および前記血漿を前記第１の出口に、また前記血液の前記複数の形成された成分を前記第２の出口に流すように構成された分離器と、
    前記細菌細胞をインキュベートするように構成された貯蔵器であって、前記第１の出口に連結されて、少なくとも一つの組換え検出バクテリオファージを受入れるように構成された貯蔵器と
    を具備する微小流体システム。
  12. 前記微小流体システムが使い捨てである、請求項１１に記載の微小流体システム。
  13. 前記分離器と前記貯蔵器との間で前記分離器の前記第１の出口に連結された濃縮器であって、前記細菌細胞を収集し、第３の出口を介して前記細菌細胞を流すように構成された濃縮器と、
    前記第３の出口に連結され、且つ第４の出口を備えた微小流体チャンネルであって、前記貯蔵器が前記第４の出口と連結される微小流体チャネルと
    を更に具備する、請求項１１に記載の微小流体システム。
  14. 前記微小流体チャネルの一部の寸法が実質的に単細胞サイズである、請求項１３に記載の微小流体システム
  15. 前記第１の出口に連結された複数の貯蔵器を更に具備し、前記複数の貯蔵器の各々が、異なる組換え検出バクテリオファージを受入れるように構成される、請求項１１に記載の微小流体システム。
  16. 前記微小流体システムがポリスチレンを含む、請求項１１に記載の微小流体システム。
  17. 細菌細胞および血液を含むサンプルを微小流体システムの入口の中に受入れ、前記血液は血漿および複数の形成された要素を含むことと、
    分離器によって、前記細菌細胞サンプルを前記分離器の第１の出口へ、また前記形成された成分を前記分離器の第２の出口へと分離することと、
    レポータ遺伝子を含む少なくとも１つの組換え検出バクテリオファージを含有する試験溶液を受入れることと、
    少なくとも１つの前記組換え検出バクテリオファージに感染している前記細菌細胞に応答したレポータ遺伝子の発現により生じた信号を検出することと
    を含む方法。
  18. 前記細菌細胞をインキュベーション貯蔵器の中に回収することと、
    前記試験溶液を前記インキュベーション貯蔵器に導入することと、
    前記細菌細胞を所定の時間インキュベートすることと
    を更に含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 抗生物質を前記微小流体システムに導入することと、
    前記微小流体システムに溶菌試薬を導入することと
    を更に含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記微小流体システムの前記分離器を横切って音響波を印加し、前記音響波が、前記形成された成分を前記微小流体システムの前記分離器の凝集軸に向けて駆動することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
  21. レーザ系フローサイトメータまたはインピーダンス系フローサイトメータのうちの１つを用いて、前記第１の出口に連結された微小流体チャネルを通って流れる前記細菌細胞の数をカウントすることを更に含む、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記分離器と前記微小流体チャネルとの間に連結された前記微小流体システムの濃縮器内で、前記細菌細胞を濃縮することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記レポータ遺伝子の発現により生じる前記信号が、発光信号、蛍光信号、またはクロマグラフィック信号の少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の方法。
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