JP2019509746A - バクテリオファージ改変法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法およびキットを提供する。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１６年３月２８日に出願された米国特許出願第６２／３１４、１６３号の利益および優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本技術は、全般的には組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法およびキットに関する。
本技術の背景に関する以下の説明は、単に本技術を理解する上での補助として提供されるものであり、本技術の先行技術を説明または構成することを認めるものではない。
モデルファージは、異種タンパク質産物を細菌細胞に送達するために分子生物学的手法を用いて改変されてきた（例えば、米国特許第２００９／０１５５２１５号；Ｍ．Ｊ．Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６２巻、第４号、１１３３〜４０頁（１９９６））。これまでに改変されたモデルファージの天然宿主範囲は限られている。ファージゲノムのバリエーションを作り出し、新しいファージゲノムを改変する方法により、診断および治療に有用な多様な特性（例えば、多様な宿主範囲）を有するファージを同定することができる。
多様なファージの改変は、一般にファージゲノムの特性によりさらに困難となる。例えば、ファージゲノムは、制限部位が比較的少なく、大幅に修飾されるので、従来のクローン技術をファージと共に使用することは困難である。ファージは、非コードＤＮＡがほとんどないコンパクトなゲノムも有し、これによって、従来の改変に対応するゲノム中の部位を発見するのが困難になり得る。インビトロ戦略に依存する多くの既存のファージ改変技術は、一般に非効率的であり、拡大が困難である。さらに、細菌内でのファージの改変は、細菌に対するファージの毒性、ならびに大きく改変されたゲノムの安定性維持の難しさにより困難であり得る。
一態様において、本開示は、組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、（ａ）非組換えバクテリオファージゲノムとｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰ酵素複合体とを、インビトロで、ｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が、非組換えバクテリオファージゲノム中のプロトスペーサー配列を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で接触させることと、（ｂ）切断非組換えバクテリオファージゲノムを異種核酸と、インビトロで、組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることとを含む方法（別名、「切断および組換え３．０」（ＢＡＲ３．０）方法）を提供する。切断非組換えバクテリオファージゲノムは、第１の切断バクテリオファージゲノム断片および第２の切断バクテリオファージゲノム断片を含む。幾つかの実施形態において、異種核酸は、第１の切断バクテリオファージゲノム断片の３’末端に相同な５’フランキング領域、および第２の切断バクテリオファージゲノム断片の５’末端に相同な３’フランキング領域を含む。幾つかの実施形態において、プロトスペーサー配列は、５’ＧＣＴＴＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ３’（配列番号５）である。
さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、方法は、組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主中で増幅させることをさらに含む。細菌宿主は、非天然細菌宿主細胞または天然細菌宿主細胞であり得る。
さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４からなる群から選択されるＣａｓタンパク質である。ある種の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９である。
方法のある種の実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、Ｋ１−５ファージに対応する。組換えバクテリオファージゲノムの核酸配列は、配列番号３または配列番号４を含み得る。
別の態様において、本開示は、組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、（ａ）単一の第１の認識部位を含む非組換えバクテリオファージゲノムと第１の制限酵素とを、インビトロで、第１の制限酵素が第１の認識部位を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で接触させることと、（ｂ）切断非組換バクテリオファージゲノムを異種核酸と、インビトロで、組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることとを含む方法（別名、ＢＡＲ４．０方法）を提供する。切断非組換えバクテリオファージゲノムは、第１の切断バクテリオファージゲノム断片および第２の切断バクテリオファージゲノム断片を含む。幾つかの実施形態において、異種核酸は、第１の切断バクテリオファージゲノム断片の３’末端に相同な５’フランキング領域、および第２の切断バクテリオファージゲノム断片の５’末端に相同な３’フランキング領域を含む。
さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、方法は、組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主中で増幅させることをさらに含む。細菌宿主は、非天然細菌宿主細胞または天然細菌宿主細胞であり得る。
幾つかの実施形態において、第１の制限酵素はＳｗａＩである。他の実施形態において、第１の制限酵素は、ＮｈｅＩである。
方法のある種の実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（別名、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））Ｔ７に対応する。組換えバクテリオファージゲノムの核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号６または配列番号７を含み得る。
さらにまたはあるいは、本明細書に開示されたＢＡＲ３．０およびＢＡＲ４．０方法の幾つかの実施形態において、組換え系は、５’−３’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを含む。
一態様において、本開示は、組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、（ａ）非組換えバクテリオファージゲノムと、（ｉ）ｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体とを、インビトロで、ｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が、非組換えバクテリオファージゲノム中のプロトスペーサー配列を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で、または（ｉｉ）制限酵素とを、インビトロで、制限酵素が非組換えバクテリオファージゲノム中の唯一の認識部位を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で、接触させることと、（ｂ）切断非組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主細胞に形質転換することであって、細菌宿主細胞が、異種核酸を発現するベクターを含む、形質転換することと、（ｃ）切断非組換えバクテリオファージゲノムを異種核酸と、インビボで、非内因性組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることとを含む方法（別名、ＢＡＲｎｅｒ方法）を提供する。切断非組換えバクテリオファージゲノムは、第１の切断バクテリオファージゲノム断片および第２の切断バクテリオファージゲノム断片を含む。幾つかの実施形態において、異種核酸は、第１の切断バクテリオファージゲノム断片の３’末端に相同な５’フランキング領域、および第２の切断バクテリオファージゲノム断片の５’末端に相同な３’フランキング領域を含む。
切断非組換えバクテリオファージゲノムは、エレクトロポレーションにより細菌宿主細胞に形質転換され得る。細菌宿主細胞は、非天然細菌宿主細胞または天然細菌宿主細胞であり得る。幾つかの実施形態において、非内因性組換え系は、細菌宿主細胞に誘導される。ある種の実施形態において、非内因性組換え系は、アラビノースの添加により誘導される。
さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４からなる群から選択されるＣａｓタンパク質である。
さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、制限酵素は、ＡｃｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＭｌｕＣＩ Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＰｃｉＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｅＡＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｅＩ、ＡｌｕＩ、ＳｔｕＩ、ＳｃａＩ、ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｓｅＩ、ＳｗａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｓＳαＩ、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩ、ＢｍｇＢＩ、ＰｍｌＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｌｅＩ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＴｓｐＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｓｌＩ、ＦｓｐＥＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｃｃＩ、ＮｃｏＩ、ＢｓｅＹＩ、ＦａｕＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＴｓｐＭＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＬｐｎＰＩ、ＡｃｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｒＢＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＳｃｒＦＩ、ＢｓｓＫＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｌＩ、ＢｔｇＩ、ＮｃｉＩ、ＡｖｒＩＩ、ＭｎｌＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、ＳｂｆＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＥｃｏＮＩ、ＨｐｙＡＶ、ＢｓｔＮＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＩ、ＢｃｇＩ、ＰｖｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＥａｇＩ、ＲｓｒＩＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＪＩ、ＳｇｒＡＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＸｈｏＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＴｌｉＩ、ＥａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＰｓｔＩ、ＢｐｍＩ、ＤｄｅＩ、ＳｆｃＩ、ＡｆｌＩＩ、ＢｐｕＥＩ、ＳｍｌＩ、ＡｖａＩ、ＢｓｏＢＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｂｓＩ、ＸｍｎＩ、ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｇａＩ、ＡａｔＩＩ、ＺｒａＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＰｆｌＦＩ、ＰｓｈＡＩ、ＡｈｄＩ、ＤｒｄＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｅＲＩ、ＰｌｅＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＭｌｙＩ、ＨｉｎｆＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＤｐｎＩＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩ、ＢｓａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｂｖＩ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓαＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｐｈＩ、ＳｒｆＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮａｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＢｇｌＩ、ＡｓｉＳＩ、ＢｔｇＺＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＮｏｔＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮｈｅＩ、ＢｍｔＩ、ＳａｐＩ、ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、ＢｌｐＩ、ＴｓｅＩ、ＡｐｅＫＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、ＢａｍＨＩ、ＦｏｋＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＰｈｏＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩ、ＮａｒＩ、ＫａｓＩ、ＳｆｏＩ、ＰｌｕＴＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｉＩ、ＢｓｍＦＩ、ＡｐａＩ、ＰｓｐＯＭＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＮｌａＩＶ、ＫｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＢｓａＩ、ＨｐｈＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｎＩ、ＢａｅＧＩ、ＢｓａＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＲｓａＩ、ＣｖｉＱＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｃｉＶＩ、ＳａｌＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｃｏＤＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｓｇＩ、ＡｃｃＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＨｐａＩ、ＰｍｅＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＡｐｏＩ、ＮｓｐＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＦαＩ、ＢｓｔＹＩ、ＨａｅＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＰｐｕＭＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＳｎａＢＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＥＩ、ＭｍｅＩ、ＴａｑαＩ、ＮｒｕＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＦｓｐＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＭｓｃＩ、ＢｓｒＧＩ、ＭｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｉＩ、ＢｓｔＢＩ、ＤｒａＩ、ＰｓｐＸＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＡＩおよびＥａｅＩである。
別の態様において、本開示は、組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、（ａ）無傷非組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主細胞に形質転換することであって、細菌宿主細胞が、異種核酸を発現するベクターを含む、形質転換することと、（ｂ）無傷非組換えバクテリオファージゲノムを異種核酸と、インビボで、非内因性組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることとを含む方法（別名、ＢＲＥＤｎｅｒ方法）を提供する。幾つかの実施形態において、異種核酸は、無傷非組換えバクテリオファージゲノム中の第１の領域に相同な５’フランキング領域、および無傷非組換えバクテリオファージゲノム中の第２の領域に相同な３’フランキング領域を含み、そこで、無傷非組換えバクテリオファージゲノムの第１の領域は、５’から無傷非組換えバクテリオファージゲノムの第２の領域までに位置する。無傷非組換えバクテリオファージゲノムは、エレクトロポレーションにより細菌宿主細胞に形質転換され得る。細菌宿主細胞は、非天然細菌宿主細胞または天然細菌宿主細胞であり得る。幾つかの実施形態において、非内因性組換え系は、細菌宿主細胞に誘導される。ある種の実施形態において、非内因性組換え系は、アラビノースの添加により誘導される。
さらにまたはあるいは、本明細書に開示されたＢＲＥＤｎｅｒおよびＢＡＲｎｅｒ方法の幾つかの実施形態において、組換え系は、誘導性プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）に機能し得る形で連結されたλＲｅｄタンパク質Ｇａｍ、ＥｘｏおよびＢｅｔａを含む。
本技術の方法の上記実施形態のいずれかにおいて、異種核酸は、約５００〜１０５０塩基対または１０５０塩基対〜５ｋｂの長さである。異種核酸は、生物発光タンパク質、蛍光タンパク質、化学発光タンパク質、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードするオープンリーディングフレームを含み得る。生物発光タンパク質の例としては、エクオリン、ホタルルシフェエラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、赤色ルシフェラーゼ、ｌｕｘＡＢまたはナノルシフェラーゼが挙げられる。化学発光タンパク質の例としては、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、またはアルカリホスファターゼが挙げられる。蛍光タンパク質の例としては、ＴａｇＢＦＰ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、単量体Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、単量体ＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ―Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｄｓＲｅｄ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、ｉＲＦＰ、ｍＫｅｉｍａ Ｒｅｄ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、ＰＡＴａｇＲＦＰ、Ｋａｅｄｅ（緑色）、Ｋａｅｄｅ（赤色）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）、ＫｉｋＧＲ１（赤色）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑色）、ｍＥｏｓ２（赤色）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅまたはＤｒｏｎｐａが挙げられる。
さらにまたはあるいは、本明細書に開示された方法の幾つかの実施形態において、異種核酸のオープンリーディングフレームは、生物発光タンパク質、蛍光タンパク質、化学発光タンパク質またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導できる発現制御配列に機能し得る形態で連結される。発現制御配列は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターであり得る。
配列番号１〜４または６のいずれか１つを含む核酸配列を有するゲノムを含む、組換えバクテリオファージも本明細書で提供される。異種核酸配列をバクテリオファージゲノムに組み込むためのキットも本明細書で開示される。
ナノルシフェラーゼ（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））レポーター遺伝子の二重挿入を含有するＤＬＰＥＣＯ２ファージ株を生成するために用いられた本技術のＢＡＲ４．０方法を概説する図である。 本明細書に開示されたＢＡＲ４．０方法を用いてＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の単一挿入を含有する、組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｔ７ファージの回収を示す図である。単離したプラークを選択し、Ｎａｎｏｌｕｃ（登録商標）の挿入部位をフランキングするプライマーを用いてＰＣＲによりＮａｎｏｌｕｃ（登録商標）の挿入についてスクリーニングした。アンプリコンサイズの７００ｂｐの増幅は、ＳｗａＩ制限部位でのＴ７ゲノムへのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の挿入の成功と相関していた。 ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の単一挿入を含有する、ＤＬＰＥＣＯ１ファージ株の発光活性プロファイルを示す図である。 ＳｗａＩ制限部位でのＴ７ゲノムへのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の挿入を示す図である。 本明細書に開示されたＢＡＲ４．０方法を使用するＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の第２の挿入を含有する、組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｔ７ファージの回収を示す図である。単離したプラークを選択し、ＰＣＲによりＮｈｅＩ制限部位でのＴ７ゲノムへのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の挿入についてスクリーニングした。約１ｋｂのＰＣＲ産物は、ＮｈｅＩ制限部位でのＴ７ゲノムへのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の挿入の成功と相関していた。 ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の二重挿入を含有する、ＤＬＰＥＣＯ２ファージ株の発光活性プロファイルを示す図である。 ＮｈｅＩ制限部位でのＴ７ゲノムへのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の挿入を示す図である。 ＤＬＰＥＣＯ１（Ｓ）ファージ株とＤＬＰＥＣＯ２（Ｄ）ファージ株との間の相対発光単位（ＲＬＵ）の比較を示す図である。様々な細菌宿主細胞濃度でのファージ感染を、発光を測定する６０分前に行った。ＤＬＰＥＣＯ２ファージ株は、ＤＬＰＥＣＯ１ファージ株で観察されたものと比較して、発光レベルと感受性の両方の増加を示した。 ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の二重挿入を含有する、組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｔ７ファージの特異的宿主範囲を示す図である。 ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の単一挿入を含有する、組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｔ７ファージ株ＤＬＰＥＣＯ１の完全ゲノム配列（配列番号１）を示す図である。 ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の二重挿入を含有する、組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｔ７ファージ株ＤＬＰＥＣＯ２の完全ゲノム配列（配列番号２）を示す図である。 非組換えバクテリオファージＫ１−５に本明細書に開示されたＢＡＲ３．０方法を行った後、単離した３６個の得られたプラークの発光活性プロファイルを示す図である。 分離株＃３０に由来するバクテリオファージに感染したＫ５大腸菌が、高度の発光を示す図である。 組換え接合部が、推定組換えＫ１−５ファージに存在するが、野生型Ｋ１−５ファージには存在しないことを示す図である。約９１６ｂｐのＰＣＲ産物は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の挿入の成功と相関していた。 本明細書に開示されたＢＡＲ３．０方法を用いてＫ１−５ファージに挿入された異種核酸配列（配列番号３）を示す図である。 組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｋ１−５ファージの完全ゲノム配列（配列番号４）を示す図である。 本明細書に開示されたＢＡＲ４．０方法を用いてＴ７ファージのＮｈｅＩ部位付近に挿入された異種核酸配列（配列番号６）を示す図である。 本明細書に開示されたＢＡＲ４．０方法を用いてＴ７ファージのＳｗａＩ部位付近に挿入された異種核酸配列（配列番号７）を示す図である。
本方法のある種の態様、様式、実施形態、バリエーションおよび特徴は、本技術が実質的に理解されるように、様々なレベルの詳細により以下に記載されることが認識されるべきである。
ファージゲノムを改変する最も一般的に用いられる十分に確立された方法の一つは、その細菌宿主における相同組換えであり、これは、２３ｂｐなどの短い２つの相同ＤＮＡ配列間で起こり得る（Ａｌｂｅｒｔｓ Ｂら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＴＨＥ ＣＥＬＬ、第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００７）； Ｓｎｙｄｅｒ Ｌら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＡ、第４版、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（２０１３））。相同組換えは、プラスミドとファージゲノムとの間で起こり、異種遺伝子をファージゲノムに組み込み、最終的にはファージ粒子にパッケージングすることを可能にする。しかし、相同組換えでは、ごく一部の組換え子孫ファージしか得られない。報告された組換え率は、１０−１０〜１０−４の範囲である（Ｌｏｅｓｓｎｅｒ Ｍ．ら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６２：１１３３〜１１４０（１９９６）；Ｌｅ Ｓ．ら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ６８５６２（２０１３）；Ｍａｈｉｃｈｉ Ｆ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２９５：２１１〜２１７（２００９））。組換えバクテリオファージの生成の主な問題の一つは、このようなバクテリオファージを作り出すのに用いられる組換え方法が非効率的であり、その結果、組換えバクテリオファージゲノムの収率が低い場合が多いことである。大きなバクテリオファージゲノム（例えば、約４０〜４８ｋｂまたは４０〜４８ｋｂ超）の形質転換は、多くの細菌株および種において禁止されており、形質転換後の生存バクテリオファージ粒子の単離を困難にしている。例えばＣｈａｕｔｈａｉｗａｌｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５６（４）：５７７〜５９２（１９９２）を参照されたい。またＶａｕｇｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９〜３１４（１９９６）も参照されたい。したがって、従来のファージスクリーニング法を用いた所望のクローンの発見は、労働集約的であり、予測不可能である。
本開示は、異種核酸配列をバクテリオファージゲノムに組み込み、異種核酸配列を発現する組換えバクテリオファージを単離する方法を提供する。本明細書に開示された方法は、従来のファージ改変法、例えば、エレクトロポレーションされたＤＮＡのバクテリオファージリコンビニアリング（ＢＲＥＤ）で観察されたものと比較して、異種核酸配列に関連する表現型特性を発現する、組換えバクテリオファージゲノムをより多く回収することを可能にする（Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ ＬＪら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ３：ｅ３９５７（２００８））。例えば、組換えバクテリオファージゲノムの全収率は、本技術のＢＡＲ４．０方法では約４４％〜６９％、および本技術のＢＡＲ３．０方法では２．７８％であった。対照的に、ＢＲＥＤを使用すると、組換えバクテリオファージは生成されなかった（すなわち、組換えバクテリオファージゲノムの回収０％）。
本方法の実施において、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの従来の技術が用いられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ編（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 第３版；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１）ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第５版；Ｇａｉｔ編（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４６８３１９５号；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ編（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ編（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ）；およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６）Ｗｅｉｒ‘ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい。
定義
他に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術および科学用語は、全般的にこの技術が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「１つ（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他のものを明らかに指示しない限り、複数の支持対象を含む。例えば、「細胞」の言及は、２つ以上の細胞の組み合わせなどを含む。一般に、本明細書で用いられる命名法、ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学、核酸化学、およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順は、当技術分野で周知であり、一般に用いられるものである。
本明細書で用いられる数値に関する用語「約」は、他に記載のない限り、または文脈から明白でない限り、数値のプラスマイナス１％、５％または１０％（超または未満）の範囲に含まれる数値を含むと一般に解釈される（ただし、このような数値が、可能な値の０％未満または１００％超である場合は除く）。
本明細書で用いられる「バクテリオファージ」または「ファージ」は、細菌に感染するウイルスを指す。バクテリオファージは、宿主生合成機構（すなわち、細菌に感染するウイルス）の一部またはすべてを利用することにより、細菌内部で増幅する、偏性細胞内寄生体である。様々なバクテリオファージが、様々な物質を含有し得るが、これらはすべて、核酸およびタンパク質を含有し、ある種の状況下で、脂質膜に封入され得る。ファージに応じて、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであってよい（しかし、両方はない）。
本明細書で用いられる「発現」は、以下の１つ以上を含む：遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写；成熟ｍＲＮＡを産生するための前駆体ｍＲＮＡのスプライシングおよび他のプロセシング；ｍＲＮＡの安定化；成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドンの使用量およびｔＲＮＡの有用性を含む）；ならびに適切な発現および機能に必要な場合、翻訳産物のグリコシル化および他の修飾。
本明細書で用いられる「発現制御配列」は、機能し得る形で連結されたコード配列の発現に影響を与えるのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象、および翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに所望される場合、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり、原核生物において、このような制御配列は、一般にプロモーター、リボソーム結合部位および転写末端配列を含む。用語「制御配列」は、最低限、その存在が発現に必須である任意の構成要素を包含することが意図され、その存在が有利であるさらなる構成要素、例えば、リーダー配列も包含し得る。
本明細書で用いられる、「異種核酸配列」は、通常は生じないゲノムの位置に配置される任意の配列である。異種核酸配列は、バクテリオファージで天然に生じない配列を含み得るか、または異種核酸配列は、バクテリオファージで天然に見出されるが、ゲノムの通常は生じない位置に配置される配列のみを含む。幾つかの実施形態において、異種核酸配列は、天然ファージ配列ではない。ある種の実施形態において、異種核酸配列は、異なるファージ由来の天然ファージ配列である。他の実施形態において、異種核酸配列は、野生型ファージのゲノムで天然に生じる配列ではあるが、その後、天然に生じない別の部位に移動し、新しい部位においてその配列を異種配列にする。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間での配列類似性を指す。相同性は、比較のためにアラインメントされ得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較される配列の位置が、同じ核酸塩基またはアミノ酸により占められている場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列により共有されるマッチングまたは相同位置の数の関数である。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対して一定のパーセンテージ（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有し、アラインメントされたとき、２つの配列を比較すると、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が同一であることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを用いて決定され得る。幾つかの実施形態において、デフォルトパラメーターがアラインメントに用いられる。１つのアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列：ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎで見出すことができる。生物学的に同等なポリヌクレオチドは、指定されたパーセント相同性を有し、同じまたは類似の生物活性を有するポリペプチドをコードするものである。２つの配列が、互いに４０％未満の同一性または２５％未満の同一性を共有する場合、それらは、「無関係」または「非相同性」とみなされる。
本明細書で用いられる「宿主細胞」は、ファージに感染させて、子孫ファージ粒子を生成することができる細菌細胞である。宿主細胞は、特定の種類のファージゲノムＤＮＡからファージ粒子を形成できる。幾つかの実施形態において、ファージゲノムＤＮＡは、宿主細胞をファージに感染させることにより、宿主細胞に導入される。幾つかの実施形態において、ファージゲノムＤＮＡは、形質転換、エレクトロポレーションまたは任意の他の好適な技術を用いて宿主細胞に導入される。幾つかの実施形態において、ファージゲノムＤＮＡは、宿主細胞に導入されたとき、実質的に純粋である。幾つかの実施形態において、ファージゲノムＤＮＡは、宿主細胞に導入されたとき、ベクター中に存在する。宿主細胞の定義は、ファージによって異なり得る。例えば、大腸菌は、特定の種類のファージの天然宿主細胞であり得るが、肺炎桿菌はそうではない。
本明細書で用いられる用語「単離した」は、（天然であるかまたは実験的設定であるかどうかにかかわらず）最初に産生されたときに結合していた構成要素の少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離した物質および／または実体は、それが最初に結合していた他の構成要素の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上から分離され得る。幾つかの実施形態において、単離した物質および／または実体は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％超純粋である。本明細書で用いられる物質は他の構成要素を実質的に含まない場合「純粋」である。
本明細書で用いられる「機能し得る形で連結された」は、発現制御配列が、目的の核酸に対して配置され、目的の核酸の転写を開始、調整または制御することを意味する。
本明細書で用いられる「ファージゲノム」は、天然に生じるファージゲノムおよびその誘導体を含む。一般に、誘導体は、天然に生じるファージと同じ宿主中で増幅する能力を有する。幾つかの実施形態において、天然に生じるファージゲノムと誘導体ファージゲノムとの間の唯一の違いは、（ゲノムが線状の場合）ファージゲノムの少なくとも一端または（ゲノムが環状の場合）ゲノムの少なくとも一点からのヌクレオチドの欠失および付加のうちの少なくとも１つである。
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、非修飾または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る任意のＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。ポリヌクレオチドとしては、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ならびに一本鎖、またはより典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む、３本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。
本明細書で用いられる用語「組換え」は、例えば、細胞もしくは核酸、タンパク質またはベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸もしくはタンパク質の変更により修飾されているか、または物質がこのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞では見出されない遺伝子を発現するか、またはさもなければ異常に発現される、不十分に発現される、またはまったく発現されない天然遺伝子を発現する。
本明細書で用いられる、生物のゲノム中の内因性核酸配列（またはその配列からコードされたタンパク質産物）は、この内因性核酸配列の発現が変更されるように、異種配列が内因性核酸配列に隣接して配置されている場合、本明細書において「組換え」とみなされる。この文脈において、異種配列がそれ自体が生物に内因性（同じ生物またはその子孫に由来する）または外因性（異なる生物またはその子孫に由来する）であるかどうかにかかわらず、異種配列は、内因性核酸配列に天然に隣接しない配列である。例として、プロモーター配列は、この遺伝子が変化した発現パターンを有するように、生物のゲノム中の遺伝子の天然プロモーターに（例えば、相同組換えにより）置換され得る。この遺伝子は、それが天然にフランキングする配列の少なくとも一部から分離されるため「組換え」である。核酸はまた、ゲノム中の対応する核酸で天然に生じない任意の修飾を含有する場合、「組換え」とみなされる。例えば、内因性コード配列は、例えば、ヒトの介入により人工的に導入される挿入、欠失または点変異を含有する場合「組換え」とみなされる。「組換え核酸」は、異種部位において宿主細胞染色体に組み込まれた核酸、およびエピソームとして存在する核酸構築物も含む。
本明細書で使用する「組換えバクテリオファージゲノム」は、異種核酸配列をバクテリオファージゲノムに挿入することにより遺伝的に修飾されたバクテリオファージゲノムである。「組換えバクテリオファージ」は、組換えバクテリオファージゲノムを含むバクテリオファージを意味する。幾つかの実施形態において、バクテリオファージゲノムは、規定された部位でゲノム中に異種核酸配列を導入する組換えＤＮＡ技術により修飾される。幾つかの実施形態において、異種核酸配列は、内因性ファージゲノムのヌクレオチドの対応する欠失なしに導入される。言い換えれば、塩基Ｎ１およびＮ２が、野生型バクテリオファージゲノムにおいて隣接している場合、異種核酸配列は、Ｎ１とＮ２との間に挿入される。したがって、得られる組換えバクテリオファージゲノムにおいて、異種核酸配列を、ヌクレオチドＮ１およびＮ２にフランキングする。幾つかの実施形態において、内因性ファージヌクレオチドは、異種核酸配列の挿入中に除去または置換される。例えば、幾つかの実施形態において、異種核酸配列は、除去される内因性ファージ配列の一部またはすべての代わりに挿入される。幾つかの実施形態において、内因性ファージ配列は、異種核酸配列の挿入部位（複数可）から離れたファージゲノムの位置から除去される。
本明細書で使用する用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、細菌酵素を指し、その各々が、「制限部位」、「認識部位」または「二本鎖認識部位」として公知の特定のヌクレオチド配列でまたはその付近で二本鎖ＤＮＡを切断する。
本明細書で使用する用語「試料」は、対象から得られる臨床試料、または単離された生物を指す。ある種の実施形態において、試料は、生物学的源（すなわち、生物学的試料）、例えば、対象から採取された組織、体液、または生物から得られる。試料源としては、粘液、痰、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、気管支洗浄液（ＢＷ）、全血、体液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、血漿、血清または組織が挙げられるが、これらに限定されない。
バクテリオファージ
バクテリオファージは、宿主生合成機構の一部またはすべてを利用することにより細菌内部で増幅する偏性細胞内寄生体である。ファージは、核酸およびタンパク質を含有し、脂質膜に覆われ得る。ファージに応じて、核酸ゲノムは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得るが、その両方ではなく、環状または線状形態のいずれかで存在し得る。ファージゲノムのサイズは、ファージに応じて異なる。最も単純なファージは、数千ヌクレオチドのサイズのみであるゲノムを有し、より複雑なファージは、そのゲノムに１０００００超、稀に１００００００超のヌクレオチドを含有し得る。ファージ粒子の個々の種類のタンパク質の数および量はファージに応じて異なる。タンパク質は、感染時に機能し、環境ヌクレアーゼから核酸ゲノムを保護する。
ファージゲノムは、様々なサイズおよび形状（例えば、線状または環状）で出現する。多くのファージは、直径２４ｎｍから２００ｎｍまでサイズに幅がある。カプシドは、１つ以上のファージタンパク質の多くのコピーからなり、ファージゲノムの周囲の保護エンベロープとして作用する。多くのファージは、ファージカプシドに付着した尾部を有する。尾部は、ファージ核酸が感染中に通過する中空管である。尾部のサイズは、様々であり得、一部のファージは、尾部構造すらない。より複雑なファージでは、尾部は、細菌宿主細胞の感染中に収縮する収縮鞘に囲まれている。ファージは、尾部の末端に、基底薄層およびそれに付着する１つ以上の尾部繊維を有する。基底薄層および尾部繊維は、ファージの宿主細胞への結合に関与する。
溶菌性または毒性ファージは、細菌中でのみ増幅し得、ファージの生活環の最後で細菌宿主細胞を溶菌し得るファージである。溶菌性ファージの生活環は、暗黒期から始まる。暗黒期中、感染性ファージ粒子は、宿主細胞の内側においても、またはその外側においても発見できない。ファージ核酸は、宿主生合成機構を引き継ぎ、ファージ特異的ｍＲＮＡおよびタンパク質が産生される。初期ファージｍＲＮＡは、ファージＤＮＡ合成、および宿主ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質生合成の遮断に必要とされる初期タンパク質をコードする。場合によって、初期タンパク質は、実際に宿主染色体を分解する。ファージＤＮＡが作製された後、後期ｍＲＮＡおよび後期タンパク質が作製される。後期タンパク質は、ファージを含む構造タンパク質および細菌細胞の溶菌に必要なタンパク質である。次の段階において、ファージ核酸および構造タンパク質が集められ、感染性ファージ粒子が細胞内に蓄積する。細菌は、ファージ溶菌性タンパク質の蓄積により溶菌を開始し、細胞内ファージ粒子が放出される。感染細胞ごとに放出される粒子数は、１０００超と高くてよい。溶菌性ファージは、プラークアッセイにより列挙され得る。アッセイは、各プラークが、単一の感染性ファージから生じるように十分に低いファージ濃度で行われる。プラークを生じさせる感染性粒子は、ＰＦＵ（プラーク形成単位）と呼ばれる。
溶原性ファージは、溶菌サイクルを通じて増幅し得るか、または宿主細胞の静止状態に入り得るファージである。静止状態において、ファージゲノムは、プロファージとして存在する（すなわち、それは、ファージを産生する可能性を有する）。多くの場合、ファージＤＮＡは、実際に、宿主染色体に組み込まれ、宿主染色体とともに複製され、娘細胞に伝達される。プロファージを寄生させる宿主細胞は、プロファージの存在による悪影響を受けず、溶原状態をいつまでも持続することができる。溶原状態は、悪条件に曝されると終了し得る。溶原状態の終了を支持する条件としては、乾燥、紫外線または電離放射線への曝露、変異原性化学物質への曝露などが挙げられる。悪条件により、プロテアーゼ（ＲｅｃＡタンパク質）の産生、ファージ遺伝子の発現、逆組み込みプロセス、および溶菌の増大が生じ得る。
幾つかの実施形態において、ファージゲノムは、少なくとも５キロベース（ｋｂ）、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも５５ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも６５ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも７５ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも８５ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも９５ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１０５ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１１５ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１２５ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１３５ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１４５ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１７５ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２２５ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも２７５ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３２５ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも３７５ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４２５ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、少なくとも４７５ｋｂまたは少なくとも５００ｋｂの核酸を含む。
本技術のファージ改変方法
ＢＡＲ３．０
一態様において、本開示は、組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、（ａ）非組換えバクテリオファージゲノムとｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰ酵素複合体とを、インビトロで、ｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が非組換えバクテリオファージゲノム中のプロトスペーサー配列を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で接触させることと、（ｂ）切断非組換えバクテリオファージゲノムを異種核酸と、インビトロで、組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で、組み換えることとを含む方法を提供する。切断非組換えバクテリオファージゲノムは、第１の切断バクテリオファージゲノム断片および第２の切断バクテリオファージゲノム断片を含む。幾つかの実施形態において、異種核酸は、第１の切断バクテリオファージゲノム断片の３’末端に相同な５’フランキング領域、および第２の切断バクテリオファージゲノム断片の５’末端に相同な３’フランキング領域を含む。幾つかの実施形態において、プロトスペーサー配列は、５’ＧＣＴＴＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ３’（配列番号５）である。
ＢＡＲ３．０方法の幾つかの実施形態において、異種核酸の相同５’フランキング領域は、約２０〜３０塩基対（ｂｐｓ）、３０〜４０ｂｐｓ、４０〜５０ｂｐｓ、５０〜６０ｂｐｓ、６０〜７０ｂｐｓ、７０〜８０ｂｐｓ、８０〜９０ｂｐｓ、９０〜１００ｂｐｓ、１００〜１１０ｂｐｓ、１１０〜１２０ｂｐｓ、１２０〜１３０ｂｐｓ、１３０〜１４０ｂｐｓ、１４０〜１５０ｂｐｓ、１５０〜１６０ｂｐｓ、１６０〜１７０ｂｐｓ、１７０〜１８０ｂｐｓ、１８０〜１９０ｂｐｓ、１９０〜２００ｂｐｓ、２００〜２１０ｂｐｓ、２１０〜２２０ｂｐｓ、２２０〜２３０ｂｐｓ、２３０〜２４０ｂｐｓ、２４０〜２５０ｂｐｓ、２５０〜２６０ｂｐｓ、２６０〜２７０ｂｐｓ、２７０〜２８０ｂｐｓ、２８０〜２９０ｂｐｓ、２９０〜３００ｂｐｓ、３００〜３１０ｂｐｓ、３１０〜３２０ｂｐｓ、３２０〜３３０ｂｐｓ、３３０〜３４０ｂｐｓ、３４０〜３５０ｂｐｓ、３５０〜３６０ｂｐｓ、３６０〜３７０ｂｐｓ、３７０〜３８０ｂｐｓ、３８０〜３９０ｂｐｓ、３９０〜４００ｂｐｓ、４００〜４１０ｂｐｓ、４１０〜４２０ｂｐｓ、４２０〜４３０ｂｐｓ、４３０〜４４０ｂｐｓ、４４０〜４５０ｂｐｓ、４５０〜４６０ｂｐｓ、４６０〜４７０ｂｐｓ、４７０〜４８０ｂｐｓ、４８０〜４９０ｂｐｓ、４９０〜５００ｂｐｓ、５００〜５１０ｂｐｓ、５１０〜５２０ｂｐｓ、５２０〜５３０ｂｐｓ、５３０〜５４０ｂｐｓ、５４０〜５５０ｂｐｓ、５５０〜５６０ｂｐｓ、５６０〜５７０ｂｐｓ、５７０〜５８０ｂｐｓ、５８０〜５９０ｂｐｓまたは５９０〜６００ｂｐｓの長さを有する。
さらにまたはあるいは、ＢＡＲ３．０方法の幾つかの実施形態において、異種核酸の相同３’フランキング領域は約２０〜３０塩基対（ｂｐｓ）、３０〜４０ｂｐｓ、４０〜５０ｂｐｓ、５０〜６０ｂｐｓ、６０〜７０ｂｐｓ、７０〜８０ｂｐｓ、８０〜９０ｂｐｓ、９０〜１００ｂｐｓ、１００〜１１０ｂｐｓ、１１０〜１２０ｂｐｓ、１２０〜１３０ｂｐｓ、１３０〜１４０ｂｐｓ、１４０〜１５０ｂｐｓ、１５０〜１６０ｂｐｓ、１６０〜１７０ｂｐｓ、１７０〜１８０ｂｐｓ、１８０〜１９０ｂｐｓ、１９０〜２００ｂｐｓ、２００〜２１０ｂｐｓ、２１０〜２２０ｂｐｓ、２２０〜２３０ｂｐｓ、２３０〜２４０ｂｐｓ、２４０〜２５０ｂｐｓ、２５０〜２６０ｂｐｓ、２６０〜２７０ｂｐｓ、２７０〜２８０ｂｐｓ、２８０〜２９０ｂｐｓ、２９０〜３００ｂｐｓ、３００〜３１０ｂｐｓ、３１０〜３２０ｂｐｓ、３２０〜３３０ｂｐｓ、３３０〜３４０ｂｐｓ、３４０〜３５０ｂｐｓ、３５０〜３６０ｂｐｓ、３６０〜３７０ｂｐｓ、３７０〜３８０ｂｐｓ、３８０〜３９０ｂｐｓ、３９０〜４００ｂｐｓ、４００〜４１０ｂｐｓ、４１０〜４２０ｂｐｓ、４２０〜４３０ｂｐｓ、４３０〜４４０ｂｐｓ、４４０〜４５０ｂｐｓ、４５０〜４６０ｂｐｓ、４６０〜４７０ｂｐｓ、４７０〜４８０ｂｐｓ、４８０〜４９０ｂｐｓ、４９０〜５００ｂｐｓ、５００〜５１０ｂｐｓ、５１０〜５２０ｂｐｓ、５２０〜５３０ｂｐｓ、５３０〜５４０ｂｐｓ、５４０〜５５０ｂｐｓ、５５０〜５６０ｂｐｓ、５６０〜５７０ｂｐｓ、５７０〜５８０ｂｐｓ、５８０〜５９０ｂｐｓまたは５９０〜６００ｂｐｓの長さを有する。
さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、ＢＡＲ３．０方法は、組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主中で増幅させることをさらに含む。例えば、細菌宿主は、エレクトロポレーションにより組換えバクテリオファージゲノムで形質転換され得る。細菌宿主は、非天然細菌宿主細胞または天然細菌宿主細胞であり得る。
さらにまたはあるいは、ＢＡＲ３．０方法の幾つかの実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、Ｔ３、Ｔ７、Ｍ６、Ｋ１１、Ｆ９２、Ｋ１−５およびＫ１Ｆに対応する。ＢＡＲ３．０方法のある種の実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、Ｋ１−５ファージに対応する。ＢＡＲ３．０方法のある種の実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、ミオウイルス科、サイフォウイルス科、ポドウイルス科、リポスリックスウイルス科、ルディウイルス科、アンプラウイルス科、バイカウダウイルス科（Ｂｕｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科、コルチコウイルス科、シストウイルス科、フセロウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科（Ｍｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科およびテクティウイルス科からなる群から選択されるファージ群に対応する。組換えバクテリオファージゲノムの核酸配列は、配列番号３または配列番号４を含み得る。
ＢＡＲ４．０
別の態様において、本開示は、組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、（ａ）単一の第１の認識部位を含む非組換えバクテリオファージゲノムと第１の制限酵素とを、インビトロで、第１の制限酵素が、第１の認識部位を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で接触させることと、（ｂ）切断非組換えバクテリオファージゲノムを異種核酸と、インビトロで、組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることとを含む方法を提供する。切断非組換えバクテリオファージゲノムは、第１の切断バクテリオファージゲノム断片および第２の切断バクテリオファージゲノム断片を含む。幾つかの実施形態において、異種核酸は、第１の切断バクテリオファージゲノム断片の３’末端に相同な５’フランキング領域、および第２の切断バクテリオファージゲノム断片の５’末端に相同な３’フランキング領域を含む。
ＢＡＲ４．０方法の幾つかの実施形態において、異種核酸の相同５’フランキング領域は、約２０〜３０塩基対（ｂｐｓ）、３０〜４０ｂｐｓ、４０〜５０ｂｐｓ、５０〜６０ｂｐｓ、６０〜７０ｂｐｓ、７０〜８０ｂｐｓ、８０〜９０ｂｐｓ、９０〜１００ｂｐｓ、１００〜１１０ｂｐｓ、１１０〜１２０ｂｐｓ、１２０〜１３０ｂｐｓ、１３０〜１４０ｂｐｓ、１４０〜１５０ｂｐｓ、１５０〜１６０ｂｐｓ、１６０〜１７０ｂｐｓ、１７０〜１８０ｂｐｓ、１８０〜１９０ｂｐｓ、１９０〜２００ｂｐｓ、２００〜２１０ｂｐｓ、２１０〜２２０ｂｐｓ、２２０〜２３０ｂｐｓ、２３０〜２４０ｂｐｓ、２４０〜２５０ｂｐｓ、２５０〜２６０ｂｐｓ、２６０〜２７０ｂｐｓ、２７０〜２８０ｂｐｓ、２８０〜２９０ｂｐｓ、２９０〜３００ｂｐｓ、３００〜３１０ｂｐｓ、３１０〜３２０ｂｐｓ、３２０〜３３０ｂｐｓ、３３０〜３４０ｂｐｓ、３４０〜３５０ｂｐｓ、３５０〜３６０ｂｐｓ、３６０〜３７０ｂｐｓ、３７０〜３８０ｂｐｓ、３８０〜３９０ｂｐｓ、３９０〜４００ｂｐｓ、４００〜４１０ｂｐｓ、４１０〜４２０ｂｐｓ、４２０〜４３０ｂｐｓ、４３０〜４４０ｂｐｓ、４４０〜４５０ｂｐｓ、４５０〜４６０ｂｐｓ、４６０〜４７０ｂｐｓ、４７０〜４８０ｂｐｓ、４８０〜４９０ｂｐｓ、４９０〜５００ｂｐｓ、５００〜５１０ｂｐｓ、５１０〜５２０ｂｐｓ、５２０〜５３０ｂｐｓ、５３０〜５４０ｂｐｓ、５４０〜５５０ｂｐｓ、５５０〜５６０ｂｐｓ、５６０〜５７０ｂｐｓ、５７０〜５８０ｂｐｓ、５８０〜５９０ｂｐｓまたは５９０〜６００ｂｐｓの長さを有する。
さらにまたはあるいは、ＢＡＲ４．０方法の幾つかの実施形態において、異種核酸の相同３’フランキング領域は、約２０〜３０塩基対（ｂｐｓ）、３０〜４０ｂｐｓ、４０〜５０ｂｐｓ、５０〜６０ｂｐｓ、６０〜７０ｂｐｓ、７０〜８０ｂｐｓ、８０〜９０ｂｐｓ、９０〜１００ｂｐｓ、１００〜１１０ｂｐｓ、１１０〜１２０ｂｐｓ、１２０〜１３０ｂｐｓ、１３０〜１４０ｂｐｓ、１４０〜１５０ｂｐｓ、１５０〜１６０ｂｐｓ、１６０〜１７０ｂｐｓ、１７０〜１８０ｂｐｓ、１８０〜１９０ｂｐｓ、１９０〜２００ｂｐｓ、２００〜２１０ｂｐｓ、２１０〜２２０ｂｐｓ、２２０〜２３０ｂｐｓ、２３０〜２４０ｂｐｓ、２４０〜２５０ｂｐｓ、２５０〜２６０ｂｐｓ、２６０〜２７０ｂｐｓ、２７０〜２８０ｂｐｓ、２８０〜２９０ｂｐｓ、２９０〜３００ｂｐｓ、３００〜３１０ｂｐｓ、３１０〜３２０ｂｐｓ、３２０〜３３０ｂｐｓ、３３０〜３４０ｂｐｓ、３４０〜３５０ｂｐｓ、３５０〜３６０ｂｐｓ、３６０〜３７０ｂｐｓ、３７０〜３８０ｂｐｓ、３８０〜３９０ｂｐｓ、３９０〜４００ｂｐｓ、４００〜４１０ｂｐｓ、４１０〜４２０ｂｐｓ、４２０〜４３０ｂｐｓ、４３０〜４４０ｂｐｓ、４４０〜４５０ｂｐｓ、４５０〜４６０ｂｐｓ、４６０〜４７０ｂｐＳ、４７０〜４８０ｂｐｓ、４８０〜４９０ｂｐｓ、４９０〜５００ｂｐｓ、５００〜５１０ｂｐｓ、５１０〜５２０ｂｐｓ、５２０〜５３０ｂｐｓ、５３０〜５４０ｂｐｓ、５４０〜５５０ｂｐｓ、５５０〜５６０ｂｐｓ、５６０〜５７０ｂｐｓ、５７０〜５８０ｂｐｓ、５８０〜５９０ｂｐｓまたは５９０〜６００の長さを有する。
さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、ＢＡＲ４．０方法は、組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主中で増幅させることをさらに含む。例えば、細菌宿主は、エレクトロポレーションにより組換えバクテリオファージゲノムで形質転換され得る。細菌宿主は、非天然細菌宿主細胞または天然細菌宿主細胞であり得る。
さらにまたはあるいは、ＢＡＲ４．０方法の幾つかの実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、Ｔ３、Ｔ７、Ｍ６、Ｋ１１、Ｆ９２、Ｋ１−５およびＫ１Ｆに対応する。ＢＡＲ４．０方法のある種の実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、大腸菌Ｔ７に対応する。ＢＡＲ４．０方法のある種の実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、ミオウイルス科、サイフォウイルス科、ポドウイルス科、リポスリックスウイルス科、ルディウイルス科、アンプラウイルス科、バイカウダウイルス科（Ｂｕｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科、コルチコウイルス科、シストウイルス科、フセロウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科（Ｍｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科およびテクティウイルス科からなる群から選択されるファージ群に対応する。組換えバクテリオファージゲノムの核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号６または配列番号７を含み得る。
ＢＡＲｎｅｒ
一態様において、本開示は、組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、（ａ）非組換えバクテリオファージゲノムと、（ｉ）ｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体とを、インビトロで、ｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が非組換えバクテリオファージゲノム中のプロトスペーサー配列を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で、または（ｉｉ）制限酵素とを、インビトロで、制限酵素が非組換えバクテリオファージゲノム中の唯一の認識部位を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で接触させることと、（ｂ）切断非組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主細胞に形質転換することであって、細菌宿主細胞が、異種核酸を発現するベクターを含む、形質転換することと、（ｃ）切断非組換えバクテリオファージゲノムを異種核酸と、インビボで、非内因性組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることとを含む方法を提供する。切断非組換えバクテリオファージゲノムは、第１の切断バクテリオファージゲノム断片および第２の切断バクテリオファージゲノム断片を含む。幾つかの実施形態において、異種核酸は、第１の切断バクテリオファージゲノム断片の３’末端に相同な５’フランキング領域、および第２の切断バクテリオファージゲノム断片の５’末端に相同な３’フランキング領域を含む。切断非組換えバクテリオファージゲノムは、エレクトロポレーションにより細菌宿主細胞に形質転換され得る。細菌宿主細胞は、非天然細菌宿主細胞または天然細菌宿主細胞であり得る。幾つかの実施形態において、非内因性組換え系は、細菌宿主細胞に誘導される。ある種の実施形態において、非内因性組換え系は、アラビノースの添加により誘導される。
ＢＡＲｎｅｒ方法の幾つかの実施形態において、異種核酸の相同５’フランキング領域は、約２０〜３０塩基対（ｂｐｓ）、３０〜４０ｂｐｓ、４０〜５０ｂｐｓ、５０〜６０ｂｐｓ、６０〜７０ｂｐｓ、７０〜８０ｂｐｓ、８０〜９０ｂｐｓ、９０〜１００ｂｐｓ、１００〜１１０ｂｐｓ、１１０〜１２０ｂｐｓ、１２０〜１３０ｂｐｓ、１３０〜１４０ｂｐｓ、１４０〜１５０ｂｐｓ、１５０〜１６０ｂｐｓ、１６０〜１７０ｂｐｓ、１７０〜１８０ｂｐｓ、１８０〜１９０ｂｐｓ、１９０〜２００ｂｐｓ、２００〜２１０ｂｐｓ、２１０〜２２０ｂｐｓ、２２０〜２３０ｂｐｓ、２３０〜２４０ｂｐｓ、２４０〜２５０ｂｐｓ、２５０〜２６０ｂｐｓ、２６０〜２７０ｂｐｓ、２７０〜２８０ｂｐｓ、２８０〜２９０ｂｐｓ、２９０〜３００ｂｐｓ、３００〜３１０ｂｐｓ、３１０〜３２０ｂｐｓ、３２０〜３３０ｂｐｓ、３３０〜３４０ｂｐｓ、３４０〜３５０ｂｐｓ、３５０〜３６０ｂｐｓ、３６０〜３７０ｂｐｓ、３７０〜３８０ｂｐｓ、３８０〜３９０ｂｐｓ、３９０〜４００ｂｐｓ、４００〜４１０ｂｐｓ、４１０〜４２０ｂｐｓ、４２０〜４３０ｂｐｓ、４３０〜４４０ｂｐｓ、４４０〜４５０ｂｐｓ、４５０〜４６０ｂｐｓ、４６０〜４７０ｂｐｓ、４７０〜４８０ｂｐｓ、４８０〜４９０ｂｐｓ、４９０〜５００ｂｐｓ、５００〜５１０ｂｐｓ、５１０〜５２０ｂｐｓ、５２０〜５３０ｂｐｓ、５３０〜５４０ｂｐｓ、５４０〜５５０ｂｐｓ、５５０〜５６０ｂｐｓ、５６０〜５７０ｂｐｓ、５７０〜５８０ｂｐｓ、５８０〜５９０ｂｐｓまたは５９０〜６００ｂｐｓの長さを有する。
さらにまたはあるいは、ＢＡＲｎｅｒ方法の幾つかの実施形態において、異種核酸の相同３’フランキング領域は、約２０〜３０塩基対（ｂｐｓ）、３０〜４０ｂｐｓ、４０〜５０ｂｐｓ、５０〜６０ｂｐｓ、６０〜７０ｂｐｓ、７０〜８０ｂｐｓ、８０〜９０ｂｐｓ、９０〜１００ｂｐｓ、１００〜１１０ｂｐｓ、１１０〜１２０ｂｐｓ、１２０〜１３０ｂｐｓ、１３０〜１４０ｂｐｓ、１４０〜１５０ｂｐｓ、１５０〜１６０ｂｐｓ、１６０〜１７０ｂｐｓ、１７０〜１８０ｂｐｓ、１８０〜１９０ｂｐｓ、１９０〜２００ｂｐｓ、２００〜２１０ｂｐｓ、２１０〜２２０ｂｐｓ、２２０〜２３０ｂｐｓ、２３０〜２４０ｂｐｓ、２４０〜２５０ｂｐｓ、２５０〜２６０ｂｐｓ、２６０〜２７０ｂｐｓ、２７０〜２８０ｂｐｓ、２８０〜２９０ｂｐｓ、２９０〜３００ｂｐｓ、３００〜３１０ｂｐｓ、３１０〜３２０ｂｐｓ、３２０〜３３０ｂｐｓ、３３０〜３４０ｂｐｓ、３４０〜３５０ｂｐｓ、３５０〜３６０ｂｐｓ、３６０〜３７０ｂｐｓ、３７０〜３８０ｂｐｓ、３８０〜３９０ｂｐｓ、３９０〜４００ｂｐｓ、４００〜４１０ｂｐｓ、４１０〜４２０ｂｐｓ、４２０〜４３０ｂｐｓ、４３０〜４４０ｂｐｓ、４４０〜４５０ｂｐｓ、４５０〜４６０ｂｐｓ、４６０〜４７０ｂｐｓ、４７０〜４８０ｂｐｓ、４８０〜４９０ｂｐｓ、４９０〜５００ｂｐｓ、５００〜５１０ｂｐｓ、５１０〜５２０ｂｐｓ、５２０〜５３０ｂｐｓ、５３０〜５４０ｂｐｓ、５４０〜５５０ｂｐｓ、５５０〜５６０ｂｐｓ、５６０〜５７０ｂｐｓ、５７０〜５８０ｂｐｓ、５８０〜５９０ｂｐｓまたは５９０〜６００ｂｐｓの長さを有する。
さらにまたはあるいは、ＢＡＲｎｅｒ方法の幾つかの実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、Ｔ３、Ｔ７、Ｍ６、Ｋ１１、Ｆ９２、Ｋ１−５およびＫ１Ｆに対応する。ＢＡＲｎｅｒ方法のある種の実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、ミオウイルス科、サイフォウイルス科、ポドウイルス科、リポスリックスウイルス科、ルディウイルス科、アンプラウイルス科、バイカウダウイルス科（Ｂｕｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科、コルチコウイルス科、シストウイルス科、フセロウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科（Ｍｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科およびテクティウイルス科からなる群から選択されるファージ群に対応する。
ＢＲＥＤｎｅｒ
別の態様において、本開示は、組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、（ａ）無傷非組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主細胞に形質転換することであって、細菌宿主細胞が、異種核酸を発現するベクターを含む、形質転換することと、（ｂ）無傷非組換えバクテリオファージゲノムを異種核酸と、インビボで、非内因性組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることとを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、異種核酸は、無傷非組換えバクテリオファージゲノム中の第１の領域に相同な５’フランキング領域、および無傷非組換えバクテリオファージゲノム中の第２の領域に相同な３’フランキング領域を含み、そこで、無傷非組換えバクテリオファージゲノムの第１の領域は、５’から無傷非組換えバクテリオファージゲノムの第２の領域までに位置する。無傷非組換えバクテリオファージゲノムは、エレクトロポレーションにより細菌宿主細胞に形質転換され得る。細菌宿主細胞は、非天然細菌宿主細胞または天然細菌宿主細胞であり得る。幾つかの実施形態において、非内因性組換え系は、細菌宿主細胞に誘導される。ある種の実施形態において、非内因性組換え系は、アラビノースの添加により誘導される。
ＢＲＥＤｎｅｒ方法の幾つかの実施形態において、異種核酸の相同５’フランキング領域は、約２０〜３０塩基対（ｂｐｓ）、３０〜４０ｂｐｓ、４０〜５０ｂｐｓ、５０〜６０ｂｐｓ、６０〜７０ｂｐｓ、７０〜８０ｂｐｓ、８０〜９０ｂｐｓ、９０〜１００ｂｐｓ、１００〜１１０ｂｐｓ、１１０〜１２０ｂｐｓ、１２０〜１３０ｂｐｓ、１３０〜１４０ｂｐｓ、１４０〜１５０ｂｐｓ、１５０〜１６０ｂｐｓ、１６０〜１７０ｂｐｓ、１７０〜１８０ｂｐｓ、１８０〜１９０ｂｐｓ、１９０〜２００ｂｐｓ、２００〜２１０ｂｐｓ、２１０〜２２０ｂｐｓ、２２０〜２３０ｂｐｓ、２３０〜２４０ｂｐｓ、２４０〜２５０ｂｐｓ、２５０〜２６０ｂｐｓ、２６０〜２７０ｂｐｓ、２７０〜２８０ｂｐｓ、２８０〜２９０ｂｐｓ、２９０〜３００ｂｐｓ、３００〜３１０ｂｐｓ、３１０〜３２０ｂｐｓ、３２０〜３３０ｂｐｓ、３３０〜３４０ｂｐｓ、３４０〜３５０ｂｐｓ、３５０〜３６０ｂｐｓ、３６０〜３７０ｂｐｓ、３７０〜３８０ｂｐｓ、３８０〜３９０ｂｐｓ、３９０〜４００ｂｐｓ、４００〜４１０ｂｐｓ、４１０〜４２０ｂｐｓ、４２０〜４３０ｂｐｓ、４３０〜４４０ｂｐｓ、４４０〜４５０ｂｐｓ、４５０〜４６０ｂｐｓ、４６０〜４７０ｂｐｓ、４７０〜４８０ｂｐｓ、４８０〜４９０ｂｐｓ、４９０〜５００ｂｐｓ、５００〜５１０ｂｐｓ、５１０〜５２０ｂｐｓ、５２０〜５３０ｂｐｓ、５３０〜５４０ｂｐｓ、５４０〜５５０ｂｐｓ、５５０〜５６０ｂｐｓ、５６０〜５７０ｂｐｓ、５７０〜５８０ｂｐｓ、５８０〜５９０ｂｐｓまたは５９０〜６００ｂｐｓの長さを有する。
さらにまたはあるいは、ＢＲＥＤｎｅｒ方法の幾つかの実施形態において、異種核酸の相同３’フランキング領域は、約２０〜３０塩基対（ｂｐｓ）、３０〜４０ｂｐｓ、４０〜５０ｂｐｓ、５０〜６０ｂｐｓ、６０〜７０ｂｐｓ、７０〜８０ｂｐｓ、８０〜９０ｂｐｓ、９０〜１００ｂｐｓ、１００〜１１０ｂｐｓ、１１０〜１２０ｂｐｓ、１２０〜１３０ｂｐｓ、１３０〜１４０ｂｐｓ、１４０〜１５０ｂｐｓ、１５０〜１６０ｂｐｓ、１６０〜１７０ｂｐｓ、１７０〜１８０ｂｐｓ、１８０〜１９０ｂｐｓ、１９０〜２００ｂｐｓ、２００〜２１０ｂｐｓ、２１０〜２２０ｂｐｓ、２２０〜２３０ｂｐｓ、２３０〜２４０ｂｐｓ、２４０〜２５０ｂｐｓ、２５０〜２６０ｂｐｓ、２６０〜２７０ｂｐｓ、２７０〜２８０ｂｐｓ、２８０〜２９０ｂｐｓ、２９０〜３００ｂｐｓ、３００〜３１０ｂｐｓ、３１０〜３２０ｂｐｓ、３２０〜３３０ｂｐｓ、３３０〜３４０ｂｐｓ、３４０〜３５０ｂｐｓ、３５０〜３６０ｂｐｓ、３６０〜３７０ｂｐｓ、３７０〜３８０ｂｐｓ、３８０〜３９０ｂｐｓ、３９０〜４００ｂｐｓ、４００〜４１０ｂｐｓ、４１０〜４２０ｂｐｓ、４２０〜４３０ｂｐｓ、４３０〜４４０ｂｐｓ、４４０〜４５０ｂｐｓ、４５０〜４６０ｂｐｓ、４６０〜４７０ｂｐｓ、４７０〜４８０ｂｐｓ、４８０〜４９０ｂｐｓ、４９０〜５００ｂｐｓ、５００〜５１０ｂｐｓ、５１０〜５２０ｂｐｓ、５２０〜５３０ｂｐｓ、５３０〜５４０ｂｐｓ、５４０〜５５０ｂｐｓ、５５０〜５６０ｂｐｓ、５６０〜５７０ｂｐｓ、５７０〜５８０ｂｐｓ、５８０〜５９０ｂｐｓまたは５９０〜６００ｂｐｓの長さを有する。
さらにまたはあるいは、ＢＲＥＤｎｅｒ方法の幾つかの実施形態において、無傷非組換えバクテリオファージゲノムは、Ｔ３、Ｔ７、Ｍ６、Ｋ１１、Ｆ９２、Ｋ１−５およびＫ１Ｆに対応する。ＢＲＥＤｎｅｒ方法のある種の実施形態において、非組換えバクテリオファージゲノムは、ミオウイルス科、サイフォウイルス科、ポドウイルス科、リポスリックスウイルス科、ルディウイルス科、アンプラウイルス科、バイカウダウイルス科（Ｂｕｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科、コルチコウイルス科、シストウイルス科、フセロウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科（Ｍｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科およびテクティウイルス科からなる群から選択されるファージ群に対応する。
さらにまたはあるいは、本明細書に開示された方法（ＢＡＲ３．０、ＢＡＲ４．０、ＢＡＲｎｅｒおよびＢＲＥＤｎｅｒ）の上記実施形態のいずれかにおいて、組換え系は、５’−３’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを含む。一実施形態において、５’−３’エキソヌクレアーゼは、Ｔ５エキソヌクレアーゼであり、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼであり、ＤＮＡリガーゼは、Ｔａｑリガーゼである。本明細書に開示された方法の他の実施形態において、組換え系は、誘導性プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）に機能し得る形で連結されたλＲｅｄタンパク質Ｇａｍ、ＥｘｏおよびＢｅｔａを含む。本明細書に開示された方法のある種の実施形態において、組換え系は、ＲｅｃＥＴ（ＲｅｃＥ、ＲｅｃＴ）オペロンを含む。本明細書に開示された方法の他の実施形態において、組換え系は、ＲｅｃＡリコンビナーゼまたはＲｅｃＡ機能獲得バリアントを含む。
生体試料内の細菌種の正確な同定は、細菌感染を治療するのに好適な療法の選択についての情報を提供する。本明細書に開示された方法を用いて生成される組換えバクテリオファージを使用して、生体試料（例えば、全血、血漿、血清）内に存在する細菌を同定することができる。このような方法は、生体試料と本明細書に開示された方法を用いて生成された組換えバクテリオファージとを接触させることと、組換えファージに感染した細菌宿主細胞の存在を検出することであって、組換えファージが、検出可能な遺伝子産物をコードする異種核酸を含む、検出することとを伴い、それにより、生体試料内に存在する細菌が同定される。
さらにまたはあるいは、本明細書に開示された方法を用いて生成される組換えバクテリオファージは、生体試料（例えば、全血、血漿、血清）内に存在する細菌の抗生物質感受性をプロファイリングする方法で用いられ得る。これらの方法は、（ａ）生体試料と抗生物質および本明細書に開示された方法を用いて生成された組換えバクテリオファージとを接触させることと、（ｂ）組換えファージに感染した細菌宿主細胞の存在を検出することであって、そこで組換えファージが、検出可能な遺伝子産物をコードする異種核酸を含む、検出することと、（ｃ）組換えファージに感染した細菌宿主細胞の数が未治療の対照試料で観察された数と比較して減少しているとき、抗生物質が、生体試料内に存在する細菌を阻害するのに有効であることを判断することとを含む。
ＣＲＩＳＰＲ酵素
様々なＣＲＩＳＰＲ酵素が、本開示の開示されたＢＡＲ３．０およびＢＡＲｎｅｒ方法との併用に利用できる。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ切断を触媒する。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ切断を触媒する。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、任意のＣａｓ９タンパク質、例えば、任意の天然発生細菌Ｃａｓ９、ならびにそれらの任意のバリアント、相同体またはオルソログである。Ｃａｓタンパク質の非限定的例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体またはそれらのバリアントが挙げられる。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位で標的核酸の両鎖を切断する。ＢＡＲ３．０方法のある種の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９である。
制限酵素
様々な制限酵素が、本開示の開示されたＢＡＲ４．０およびＢＡＲｎｅｒ方法との併用に利用できる。制限酵素の非限定的例としては、ＡｃｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＭｌｕＣＩ Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＰｃｉＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｅＡＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｅＩ、ＡｌｕＩ、ＳｔｕＩ、ＳｃａＩ、ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｓｅＩ、ＳｗａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｓＳαＩ、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩ、ＢｍｇＢＩ、ＰｍｌＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｌｅＩ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＴｓｐＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｓｌＩ、ＦｓｐＥＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｃｃＩ、ＮｃｏＩ、ＢｓｅＹＩ、ＦａｕＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＴｓｐＭＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＬｐｎＰＩ、ＡｃｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｒＢＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＳｃｒＦＩ、ＢｓｓＫＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｌＩ、ＢｔｇＩ、ＮｃｉＩ、ＡｖｒＩＩ、ＭｎｌＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、ＳｂｆＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＥｃｏＮＩ、ＨｐｙＡＶ、ＢｓｔＮＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＩ、ＢｃｇＩ、ＰｖｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＥａｇＩ、ＲｓｒＩＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＪＩ、ＳｇｒＡＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＸｈｏＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＴｌｉＩ、ＥａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＰｓｔＩ、ＢｐｍＩ、ＤｄｅＩ、ＳｆｃＩ、ＡｆｌＩＩ、ＢｐｕＥＩ、ＳｍｌＩ、ＡｖａＩ、ＢｓｏＢＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｂｓＩ、ＸｍｎＩ、ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｇａＩ、ＡａｔＩＩ、ＺｒａＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＰｆｌＦＩ、ＰｓｈＡＩ、ＡｈｄＩ、ＤｒｄＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｅＲＩ、ＰｌｅＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＭｌｙＩ、ＨｉｎｆＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＤｐｎＩＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩ、ＢｓａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｂｖＩ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓαＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｐｈＩ、ＳｒｆＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮａｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＢｇｌＩ、ＡｓｉＳＩ、ＢｔｇＺＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＮｏｔＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮｈｅＩ、ＢｍｔＩ、ＳａｐＩ、ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、ＢｌｐＩ、ＴｓｅＩ、ＡｐｅＫＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、ＢａｍＨＩ、ＦｏｋＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＰｈｏＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩ、ＮａｒＩ、ＫａｓＩ、ＳｆｏＩ、ＰｌｕＴＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｉＩ、ＢｓｍＦＩ、ＡｐａＩ、ＰｓｐＯＭＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＮｌａＩＶ、ＫｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＢｓａＩ、ＨｐｈＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｎＩ、ＢａｅＧＩ、ＢｓａＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＲｓａＩ、ＣｖｉＱＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｃｉＶＩ、ＳａｌＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｃｏＤＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｓｇＩ、ＡｃｃＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＨｐａＩ、ＰｍｅＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＡｐｏＩ、ＮｓｐＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＦαＩ、ＢｓｔＹＩ、ＨａｅＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＰｐｕＭＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＳｎａＢＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＥＩ、ＭｍｅＩ、ＴａｑαＩ、ＮｒｕＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＦｓｐＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＭｓｃＩ、ＢｓｒＧＩ、ＭｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｉＩ、ＢｓｔＢＩ、ＤｒａＩ、ＰｓｐＸＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＡＩおよびＥａｅＩが挙げられる。ＢＡＲ４．０方法の幾つかの実施形態において、第１の制限酵素は、ＳｗａＩである。ＢＡＲ４．０方法の他の実施形態において、第１の制限酵素は、ＮｈｅＩである。
異種核酸
本明細書に開示された方法の幾つかの実施形態において、異種核酸は、生物発光タンパク質、蛍光タンパク質、化学発光タンパク質、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードするオープンリーディングフレームを含む。幾つかの実施形態において、コードされた遺伝子産物（複数可）は、適当な刺激にさらされると検出可能なシグナルを発生し、得られたシグナルにより、組換えファージに感染した細菌宿主細胞の検出が可能になる。ある種の実施形態において、オープンリーディングフレームは、オープンリーディングフレームを含む異種核酸配列を含む組換えファージに感染した細菌宿主細胞をスクリーニングすることにより同定され得るマーカーとして働くタンパク質をコードする。このようなマーカーの例としては、例として、蛍光標識、発光標識、化学発光標識または酵素標識が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、異種核酸配列は、バクテリオファージで天然に見出されるが、ゲノムの通常は生じない位置に配置されている配列をさらに含む。
幾つかの実施形態において、異種核酸配列の長さは、少なくとも１００塩基、少なくとも２００塩基、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、少なくとも７００塩基、少なくとも８００塩基、少なくとも９００塩基、少なくとも１キロ塩基（ｋｂ）、少なくとも１．１ｋｂ、少なくとも１．２ｋｂ、少なくとも１．３ｋｂ、少なくとも１．４ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも１．６ｋｂ、少なくとも１．７ｋｂ、少なくとも１．８ｋｂ、少なくとも１．９ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．１ｋｂ、少なくとも２．２ｋｂ、少なくとも２．３ｋｂ、少なくとも２．４ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも２．６ｋｂ、少なくとも２．７ｋｂ、少なくとも２．８ｋｂ、少なくとも２．９ｋｂ、少なくとも３．０ｋｂ、少なくとも３．１ｋｂ、少なくとも３．２ｋｂ、少なくとも３．３ｋｂ、少なくとも３．４ｋｂ、少なくとも３．５ｋｂ、少なくとも３．６ｋｂ、少なくとも３．７ｋｂ、少なくとも３．８ｋｂ、少なくとも３．９ｋｂ、少なくとも４．０ｋｂ、少なくとも４．５ｋｂ、少なくとも５．０ｋｂ、少なくとも５．５ｋｂ、少なくとも６．０ｋｂ、少なくとも６．５ｋｂ、少なくとも７．０ｋｂ、少なくとも７．５ｋｂ、少なくとも８．０ｋｂ、少なくとも８．５ｋｂ、少なくとも９．０ｋｂ、少なくとも９．５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂまたはそれ以上である。ある種の実施形態において、異種核酸配列は、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂおよび１０ｋｂからなる群から選択される長さ以下である長さを含む。幾つかの実施形態において、異種核酸配列は、ファージゲノムを含むファージ粒子にパッケージングされ得る異種核酸配列の最大長以下である長さを含む。
幾つかの実施形態において、異種核酸配列の長さは、１００〜５００塩基、２００〜１０００塩基、５００〜１０００塩基、５００〜１５００塩基、１ｋｂ〜２ｋｂ、１．５ｋｂ〜２．５ｋｂ、２．０ｋｂ〜３．０ｋｂ、２．５ｋｂ〜３．５ｋｂ、３．０ｋｂ〜４．０ｋｂ、３．５ｋｂ〜４．５ｋｂ、４．０ｋｂ〜５．０ｋｂ、４．５ｋｂ〜５．５ｋｂ、５．０ｋｂ〜６．０ｋｂ、５．５ｋｂ〜６．５ｋｂ、６．０ｋｂ〜７．０ｋｂ、６．５ｋｂ〜７．５ｋｂ、７．０ｋｂ〜８．０ｋｂ、７．５ｋｂ〜８．５ｋｂ、８．０ｋｂ〜９．０ｋｂ、８．５ｋｂ〜９．５ｋｂまたは９．０ｋｂ〜１０．０ｋｂである。
幾つかの実施形態において、異種核酸配列は、内因性ファージゲノム配列の欠失なしにファージゲノムに挿入される。幾つかの実施形態において、異種核酸配列は、内因性ファージゲノム配列を置換する。幾つかの実施形態において、異種核酸配列は、ファージゲノムから以前に除去された内因性ファージゲノム配列を含む。
ある種の実施形態において、異種核酸配列は、異種核酸配列の長さより短い内因性ファージゲノム配列を置換する。したがって、幾つかの実施形態において、組換えファージゲノムの長さは、野生型ファージゲノムの長さよりも長い。幾つかの実施形態において、異種核酸配列は、異種核酸配列の長さより長い内因性ファージゲノム配列を置換する。したがって、幾つかの実施形態において、組換えファージゲノムの長さは、野生型ファージゲノムの長さよりも短い。ある種の実施形態において、異種核酸配列は、異種核酸配列の長さに等しい内因性ファージゲノム配列を置換する。
ある種の実施形態において、異種核酸のオープンリーディングフレームは、異種核酸を発現する組換えファージに感染した宿主細胞に目的の表現型を付与するタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、目的の表現型は、異種核酸のオープンリーディングフレームによりコードされた遺伝子産物の発現である。
ある種の実施形態において、異種核酸のオープンリーディングフレームは、オープンリーディングフレームの発現を誘導できる発現制御配列に機能し得る形で連結され、そこでオープンリーディングフレームは、生物発光タンパク質、蛍光タンパク質、化学発光タンパク質またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする。幾つかの実施形態において、発現制御配列は、異種核酸配列内に位置する。他の実施形態において、発現制御配列は、内因性ファージゲノム配列に位置する。例えば、オープンリーディングフレームは、内因性ファージオープンリーディングフレーム配列の下流またはその代わりにファージゲノムに挿入され得る。幾つかの実施形態において、発現制御配列は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターである。例えば、Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ＆Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ２０（１）：１１９〜１２６（１９９８）を参照されたい。誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターは、内因性ファージプロモーター配列、非内因性ファージプロモーター配列または細菌宿主プロモーター配列であり得る。さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ｐＨ感受性プロモーターまたは温度感受性プロモーターである。
幾つかの実施形態において、異種核酸配列は、第１のオープンリーディングフレームおよび少なくとも１つの補足的なオープンリーディングフレームを含む。ある種の実施形態において、第１および少なくとも１つの補足的なオープンリーディングフレームは、同じ発現制御配列に機能し得る形で連結される。幾つかの実施形態において、第１および少なくとも１つの補足的なオープンリーディングフレームは、異なる発現制御配列に機能し得る形で連結される。
蛍光タンパク質としては、青色／ＵＶ蛍光タンパク質（例えば、ＴａｇＢＦＰ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、ＳａｐｐｈｉｒｅおよびＴ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、単量体Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰおよびｍＴＦＰ１）、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧおよびｍＷａｓａｂｉ）黄色蛍光タンパク質（例えば、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２およびＴａｇＹＦＰ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅおよびｍＯｒａｎｇｅ２）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｄｓＲｅｄ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅおよびｍＲｕｂｙ）、遠赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅおよびＮｉｒＦＰ）、近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４およびｉＲＦＰ）、ロングストークスシフトタンパク質（例えば、ｍＫｅｉｍａＲｅｄ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ１およびＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２）、光活性化蛍光タンパク質（例えば、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１およびＰＡＴａｇＲＦＰ）、光変換性蛍光タンパク質（例えば、Ｋａｅｄｅ（緑色）、Ｋａｅｄｅ（赤色）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）、ＫｉｋＧＲ１（赤色）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑色）、ｍＥｏｓ２（赤色）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅおよびＰＳｍＯｒａｎｇｅ）、フルオレセイン、ローダミンおよび光切り替え可能な蛍光タンパク質（例えば、Ｄｒｏｎｐａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
生物発光タンパク質の例としては、エクオリン（クラゲであるオワンクラゲ由来）およびルシフェラーゼ（ホタルおよびウミシイタケ由来のルシフェラーゼ、ナノルシフェラーゼ、赤色ルシフェラーゼ、ｌｕｘＡＢなどを含む）がある。また、これらのタンパク質は、タンパク質ドメインが密接に共局在化している場合にのみ光を発生する、２つの異なる機能ドメインに遺伝的に分離されている。これらのタンパク質両方の様々な発光スペクトルシフト変異誘導体は、過去数十年にわたって生成されており、生細胞内のマルチカラーイメージングおよび共局在化に用いられている。
化学発光タンパク質の例としては、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼが挙げられる。ペルオキシダーゼは、光を発生させる反応においてルミノールを酸化する過酸化物を生成し、アルカリホスファターゼは、基質分子からリン酸塩を除去し、これを不安定化して、発光をもたらすカスケードを開始する。
幾つかの実施形態において、異種核酸のオープンリーディングフレームは、抗体または他の結合分子で検出され得るエピトープを含む。例えば、エピトープを認識する抗体は、（例えば、化学発光または蛍光タンパク質の共有結合により）シグナル発生部分に直接連結され得るか、またはシグナル発生部分に直接連結された、少なくとも１つの追加の結合試薬、例えば、二次抗体を用いて検出され得る。幾つかの実施形態において、エピトープは、野生型バクテリオファージおよび細菌宿主細胞には存在しない。したがって、試料中のエピトープの検出は、異種核酸を含む組換えファージに感染した細菌宿主細胞の存在を示し、そこで異種核酸のオープンリーディングフレームは、エピトープを含む。
他の実施形態において、異種核酸のオープンリーディングフレームは、オープンリーディングフレームの発現産物が、オープンリーディングフレームによりコードされたポリペプチドまたはタンパク質に融合したタグ（例えば、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）など）を含むように、ポリペプチドタグ配列を含む。
キット
本技術は、異種核酸配列をバクテリオファージゲノムに組み込むためのキットを提供する。配列番号１〜４または６のいずれか１つを含む核酸配列を有するゲノムを含む組換えバクテリオファージも本明細書において提供される。
一態様において、本技術のキットは、（ａ）複数のバクテリオファージゲノムを含有する１つ以上のコード化／標識バイアル、（ｂ）組換え系、および（ｃ）少なくとも１つのＣＲＳＰＲ酵素または制限酵素を含む。
幾つかの実施形態において、複数のバクテリオファージゲノムを含有する各コード化／標識バイアルは、異なるバクテリオファージ型に対応する。他の実施形態において、複数のバクテリオファージゲノムを含有する各コード化／標識バイアルは、同じバクテリオファージ型に対応する。幾つかの実施形態において、各ファージバイアルは、ファージバイアル中のバクテリオファージまたはバクテリオファージ株が感染する細菌の種類を識別する固有のコードが割り当てられる。固有のコードは、機械識別パターン、例えば、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、アルファニューメリックストリングまたはリーダーにより識別され得る任意の他のパターンによりコードされ得る。各固有のコードは、例えば、対応するファージ試料を保存するバイアルまたは容器のバーコードステッカーとして示され得る。幾つかの実施形態において、キットは、バクテリオファージゲノムの長期保存を可能にする条件下、例えば、バクテリオファージ特異的、制御温度、湿度およびｐＨ条件下で保存される。
幾つかの実施形態において、キットは、５’−３’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを含む、組換え系を含む。例えば、一実施形態において、５’−３’エキソヌクレアーゼは、Ｔ５エキソヌクレアーゼであり、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼであり、ＤＮＡリガーゼは、Ｔａｑリガーゼである。キットの他の実施形態において、組換え系は、誘導性プロモーター（例えば、ａｒａＢプロモーター）に機能し得る形で連結されたλＲｅｄタンパク質Ｇａｍ、ＥｘｏおよびＢｅｔａを含む。キットのある種の実施形態において、組換え系は、ＲｅｃＥＴ（ＲｅｃＥ、ＲｅｃＴ）オペロンを含む。他の実施形態において、組換え系は、ＲｅｃＡリコンビナーゼまたはそのバリアントを含む。
さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、キットはＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４からなる群から選択される１つ以上のＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。１つ以上のＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｓｇＲＮＡに結合し得る。ある種の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列５’ＧＣＴＴＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ３’（配列番号５）を標的とする。
さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、キットはＡｃｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＭｌｕＣＩ Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＰｃｉＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｅＡＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｅＩ、ＡｌｕＩ、ＳｔｕＩ、ＳｃａＩ、ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｓｅＩ、ＳｗａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｓＳαＩ、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩ、ＢｍｇＢＩ、ＰｍｌＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｌｅＩ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＴｓｐＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｓｌＩ、ＦｓｐＥＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｃｃＩ、ＮｃｏＩ、ＢｓｅＹＩ、ＦａｕＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＴｓｐＭＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＬｐｎＰＩ、ＡｃｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｒＢＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＳｃｒＦＩ、ＢｓｓＫＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｌＩ、ＢｔｇＩ、ＮｃｉＩ、ＡｖｒＩＩ、ＭｎｌＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、ＳｂｆＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＥｃｏＮＩ、ＨｐｙＡＶ、ＢｓｔＮＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＩ、ＢｃｇＩ、ＰｖｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＥａｇＩ、ＲｓｒＩＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＪＩ、ＳｇｒＡＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＸｈｏＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＴｌｉＩ、ＥａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＰｓｔＩ、ＢｐｍＩ、ＤｄｅＩ、ＳｆｃＩ、ＡｆｌＩＩ、ＢｐｕＥＩ、ＳｍｌＩ、ＡｖａＩ、ＢｓｏＢＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｂｓＩ、ＸｍｎＩ、ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｇａＩ、ＡａｔＩＩ、ＺｒａＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＰｆｌＦＩ、ＰｓｈＡＩ、ＡｈｄＩ、ＤｒｄＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｅＲＩ、ＰｌｅＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＭｌｙＩ、ＨｉｎｆＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＤｐｎＩＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩ、ＢｓａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｂｖＩ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓαＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｐｈＩ、ＳｒｆＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮａｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＢｇｌＩ、ＡｓｉＳＩ、ＢｔｇＺＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＮｏｔＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮｈｅＩ、ＢｍｔＩ、ＳａｐＩ、ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、ＢｌｐＩ、ＴｓｅＩ、ＡｐｅＫＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、ＢａｍＨＩ、ＦｏｋＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＰｈｏＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩ、ＮａｒＩ、ＫａｓＩ、ＳｆｏＩ、ＰｌｕＴＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｉＩ、ＢｓｍＦＩ、ＡｐａＩ、ＰｓｐＯＭＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＮｌａＩＶ、ＫｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＢｓａＩ、ＨｐｈＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｎＩ、ＢａｅＧＩ、ＢｓａＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＲｓａＩ、ＣｖｉＱＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｃｉＶＩ、ＳａｌＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｃｏＤＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｓｇＩ、ＡｃｃＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＨｐａＩ、ＰｍｅＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＡｐｏＩ、ＮｓｐＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＦαＩ、ＢｓｔＹＩ、ＨａｅＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＰｐｕＭＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＳｎａＢＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＥＩ、ＭｍｅＩ、ＴａｑαＩ、ＮｒｕＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＦｓｐＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＭｓｃＩ、ＢｓｒＧＩ、ＭｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｉＩ、ＢｓｔＢＩ、ＤｒａＩ、ＰｓｐＸＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＡＩおよびＥａｅＩからなる群から選択される１つ以上の制限酵素を含む。
さらにまたはあるいは、幾つかの実施形態において、キットは、天然または非天然細菌宿主細胞を含有するバイアルをさらに含む。幾つかの実施形態において、細菌宿主細胞は、大腸菌である。ある種の実施形態において、細菌宿主細胞は大腸菌株ＤＨ１０Ｂである。
幾つかの実施形態において、キットは、実験ラン間の組換え系の何らかの変動を補正する陽性対照異種核酸配列をさらに含む。キットは、使用説明書、自動分析ソフトウェア、容器、パッケージ、例えば、商業販売などを対象とした包装材料も含み得る。
キットは、洗浄緩衝液および／または試薬、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または試薬、標識緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段の１つ以上をさらに含み得る。緩衝液および／または試薬は、キットを対象とした特定の検出技術用に通常最適化される。また、手順の様々なステップを行うためにこれらの緩衝液および試薬を使用するプロトコルも、キットに含まれ得る。キットのさらなる任意選択の構成要素としては、本明細書に開示された異種核酸によりコードされた遺伝子産物の発現培地、例えば、生物発光のためのニュートリエントおよび補因子を含有する培地、装置、例えば、生物発光を検出するために特定の波長の光を照射するように構成されたランプ、ならびに異種核酸の発現の程度を測定するための装置、例えば、フォトメーターまたはフォトディテクターが挙げられ得る。
さらにまたはあるいは、本明細書に開示されたキットは、複数の抗体を含有するコード化および標識バイアルも含み得る。
実施例
実施例１：Ｔ７ファージの本技術のＢＡＲ４．０ファージ改変方法
本実施例は、本技術のＢＡＲ４．０方法が、異種核酸をバクテリオファージゲノム（例えば、Ｔ７ファージゲノム）に組み込むのに、および異種核酸配列を発現する組換えバクテリオファージを単離するのに有用であることを示す。
大きなＤＮＡ挿入物の細菌への形質転換は、多くの細菌株および種において従来禁止されていた（Ｐｉｅｒｓ Ｄ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ．８０（３）：５２３−４３（２０１６））。従来の方法、例えば、ＢＲＥＤによりＲｅｃＡ＋またはＲｅｃＡ−Ｋ１２大腸菌株において組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｔ３バクテリオファージおよび組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｔ７バクテリオファージを生成する以前の試みは成功しなかった。実際に、ＢＲＥＤを使用すると、組換えファージは得られなかった。
ＢＡＲ４．０は、インビトロ組換え方法であり、大きなＤＮＡ挿入物の細菌細胞への形質転換を可能にする。図１は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の単一挿入および二重挿入を各々含有する、組換えＴ７ファージ株ＤＬＰＥＣＯ１およびＤＬＰＥＣＯ２を生成するために使用した本技術のＢＡＲ４．０方法を概説している。ＤＬＰＥＣＯ１およびＤＬＰＥＣＯ２ファージ株の完全ゲノム配列を図１０および図１１各々に示す。図１７は、本明細書に開示されたＢＡＲ４．０方法を用いて、Ｔ７ファージのＮｈｅＩ部位付近に挿入された異種核酸配列（配列番号６）を示している。図１８は、本明細書に開示されたＢＡＲ４．０方法を用いて、Ｔ７ファージのＳｗａＩ部位付近に挿入された異種核酸配列（配列番号７）を示している。
Ｔ７バクテリオファージＤＮＡを、ＺｙｍｏＺＲウイルスＤＮＡキット（Ｃａｔ番号Ｄ３０１５）（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いて清澄ファージ溶菌液から抽出した。Ｔ７ファージＤＮＡ約１００ｎｇを、製造業者仕様書に従って制限酵素ＳｗａＩ（ＮＥＢ Ｒ０６０４）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で消化した。ウイルスゲノムに相同性の６０ｂｐに囲まれた、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子を含有する、ｇＢｌｏｃｋ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｉｌｌｅ、ＩＡにより合成）を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）によりＳｗａＩ切断部位に挿入した。
得られたＴ７／ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合産物２μｌをＮＥＢ１０β細胞（ＮＥＢ Ｃ３０３０Ｋ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）にエレクトロポレーションした。細胞を、ＬＢ寒天上にプレーティングし、０．６５％軟寒天をオーバーレイした。３７℃で一晩インキュベートした後、単離したプラークを選択し、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の挿入部位をフランキングするプライマーを用いてＰＣＲによりＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の挿入についてスクリーニングした（図２）。アンプリコンのサイズの７００ｂｐの増幅は、ＳｗａＩ制限部位でのＴ７ゲノムへのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の挿入の成功と相関していた。図２を参照されたい。細菌宿主細胞を組換えファージ株ＤＬＰＥＣＯ１に感染させ、発光を様々な細菌宿主細胞濃度で１０〜６０分間測定することにより、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発生を評価した。図３は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の単一挿入を含有する組換えＴ７ファージ株により発生したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）シグナルの強度が、細菌細胞濃度および時間に依存していたことを示している。
ＳｗａＩ部位でのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の単一挿入を有する組換えＴ７ファージ（図４参照）を単離した後、上に概説したクローニングプロトコルを用いて、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の第２の挿入をＮｈｅＩ制限部位（ＮＥＢ Ｒ０１３１）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で行った。３７℃で一晩インキュベートした後、単離したプラークを選択し、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の第２の挿入部位をフランキングする（すなわち、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）とファージゲノムＤＮＡとの間の接合部に及ぶ）プライマーを用いてＰＣＲによりＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の第２の挿入についてスクリーニングした。約１ｋｂのＰＣＲ産物は、ＮｈｅＩ制限部位でのＴ７ゲノムへのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の挿入の成功と相関していた。図５および図７を参照されたい。したがって、ＢＡＲ４．０技術を用いて得られた組換えＴ７ファージゲノムの全収率は、約４４％〜約６９％であった。
細菌宿主細胞を組換えファージ株ＤＬＰＥＣＯ２に感染させ、発光を様々な細菌宿主細胞濃度で１０〜６０分間測定することにより、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発生を評価した。図６は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の二重挿入を含有する組換えＴ７ファージ株により発生したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）シグナルの強度が、細菌細胞濃度および時間に依存していたことを示している。図８は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の二重挿入を含有する組換えＴ７ファージ株が、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の単一挿入を含有する組換えＴ７ファージ株で観察されたものと比較して、有意に高い感受性と共に、有意に高い発光を示したことを示している。
ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発生が、Ｔ７ファージに感染できる細菌宿主細胞に特異的であることを確実にするために、ＤＨ１０Ｂ細胞（正常なＴ７宿主）を、Ｔ７に感染できない尿路病原性大腸菌株ＵＰＥＣと並行して感染させた。図９は、発光が、感染したＤＨ１０Ｂ細胞で検出されたが、発光がＵＰＥＣでは検出されなかったことを示している。
Figure 2019509746
これらの結果は、本技術の方法により、（ａ）目的の異種核酸配列を含有し、（ｂ）目的の異種核酸配列に関連する表現型特性を発現する、組換えバクテリオファージゲノムが生成されることを示している。したがって、本明細書に開示された方法は、組換えバクテリオファージゲノムを生成するのに有用である。
実施例２：Ｋ１−５ファージにおける本技術のＢＡＲ３．０ファージ改変方法
本実施例は、本技術のＢＡＲ３．０方法が、異種核酸をバクテリオファージゲノム（例えば、Ｋ１−５ファージゲノム）に組み込むのに、および異種核酸配列を発現する組換えバクテリオファージを単離するのに有用であることを示す。
Ｋ１−５ファージは、Ｋ１またはＫ５莢膜型のいずれかを有する様々な大腸菌株を感染させる、４４３８５ｂｐの末端冗長性の溶菌性バクテリオファージである。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子（上流リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有する）を、本明細書に開示されたＢＡＲ３．０方法を用いてＫ１−５ゲノムの３’末端に向けて挿入した。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーターの意図されるゲノム挿入部位は、ヌクレオチド位置４３９１３と４３９１４との間であった。プロトスペーサー配列５’ＧＣＴＴＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ３’（配列番号５）を標的とするｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体は、Ｋ１−５ゲノムのヌクレオチド位置４３８９８と４３８９９との間の切断を誘導するように設計された。ＲＢＳ／ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）カセットはまた、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体により除去されるＫ１−５ゲノムの３’末端に存在する核酸配列を含有していた。したがって、異種核酸挿入物は、５’（Ｋ１−５ゲノムのヌクレオチド位置４３８７２〜４３９１３）＋（ＲＢＳ）＋（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））＋（Ｋ１−５ゲノムのヌクレオチド位置４３９１４〜４４３８５）３’を含んでいた。図１５は、本明細書に開示されたＢＡＲ３．０方法を用いてＫ１−５ファージに挿入された異種核酸配列（配列番号３）を示している。図１６は、組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｋ１−５ファージの完全ゲノム配列（配列番号４）を示している。
ｓｇＲＮＡを生成するために、標的特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、ＥｎＧｅｎ（登録商標）ｓｇＲＮＡ合成キット、化膿レンサ球菌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）の鋳型として使用した。標的特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＥｎＧｅｎ（登録商標）ｓｇＲＮＡ反応混合物に供給される化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｏｌｉｇｏに相補的なＴ７プロモーター配列、標的プロトスペーサー配列、および１４ヌクレオチドオーバーラップ配列を含有する。標的特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＥｎＧｅｎ２Ｘ ｓｇＲＮＡ反応混合物（ＮＴＰ、ｄＮＴＰ、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｏｌｉｇｏ）およびＥｎＧｅｎ ｓｇＲＮＡ酵素混合物（ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ）と室温で混合した。ＤＮＡ合成および転写反応は、３７℃で３０分のインキュベーション期間中行われた。得られたｓｇＲＮＡは、標的特異的／ｃｒＲＮＡ配列ならびにｔｒａｃｒＲＮＡを含有していた。続いて、ＤＮＡ汚染物を、ＤＮａｓｅＩ処理で実質的に除去し、ｓｇＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキットで精製した。
化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を、供給業者のプロトコルに従って、精製したｓｇＲＮＡで共インキュベートした後、これを使用して、精製したＫ１−５ゲノムＤＮＡ約２．４μｇを切断した。切断したＫ１−５ゲノムＤＮＡをフェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール抽出、次いで、エタノール沈殿により精製した。
切断したＫ１−５ゲノムＤＮＡ約２μｇおよび挿入ＤＮＡ２００ｎｇを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリクローニングキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いてギブソンアセンブリ反応で結合した。反応が５０℃で１時間行われた後、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール抽出、次いで、エタノール沈殿により精製した。
この精製反応からの全ＤＮＡ約４４０ｎｇを、エレクトロポレーション（２．４ｋＢ、６００Ω、２５μＦ）により、非天然細菌宿主であるＮＥＢ（登録商標）１０−βエレクトロコンピテント大腸菌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）に形質転換し、ＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭ Ｎａｃｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４および２０ｍＭグルコース）９５０μｌに３７℃で約２時間回収した。上清（ファージ粒子を含有）を使用して、天然宿主を感染させることができるように、形質転換反応物を遠心分離した。上清約１００μｌを使用して、Ｋ５大腸菌１００μｌを感染させた。感染媒体を、０．６５％ＬＢトップ寒天３ｍＬにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートして、プラークを発現させた。
表現型分析。何百ものプラークが、一晩インキュベートした後、観察された。合計３６個のプラークを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ＋１０ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２０μＬに採取した。これらの分離株を使用して、ログ相のＫ５大腸菌１００μＬをＭｇＳＯ４の存在下で約１時間感染させた。図１２は、分離株＃３０により発生したＲＬＵが、任意の他の分離株よりも数倍高かったことを示している。高いＲＬＵ値が、実際に、組換えファージを示しているのか、または単に技術的ミスを示しているのかを判断するために、より大きなＫ５大腸菌培養物を分離株＃３０により長時間感染させることにより、分離株＃３０をさらに分析した。分離株＃３０感染媒体の残りを使用して、ログ相のＫ５大腸菌の５ｍＬ培養物を再感染させた。図１３は、１．２５時間後、ファージまたは細菌細胞のみを含有する試料と比較して、細菌細胞とファージ（分離株＃３０に由来）の両方を含有する試料のみＲＬＵが高かったことを示している。ＢＡＲ３．０技術を用いて得られた組換えＫ１−５ファージゲノムの全収率は、約２．７８％であった。したがって、図１３は、本明細書に開示されたＢＡＲ３．０方法により、組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｋ１−５ファージゲノムが生成されることを示している。
遺伝子型分析。分離株＃３０プラークをＰＣＲの鋳型として使用して、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター挿入物内部からファージゲノムに及ぶ組換え接合部の存在についてスクリーニングした。図１４は、組換え接合部が、分離株＃３０由来の組換えＫ１−５ファージで検出されたが、野生型Ｋ１−５ファージでは検出されなかったことを示している。約９１６ｂｐのＰＣＲ産物は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子の挿入の成功と相関していた。したがって、図１４は、本明細書に開示されたＢＡＲ３．０方法により、組換えＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｋ１−５ファージゲノムが生成されることを示している。
これらの結果は、本技術の方法により、（ａ）目的の異種核酸配列を含有し、（ｂ）目的の異種核酸配列に関連する表現型特性を発現する組換えバクテリオファージゲノムが生成されることを示している。したがって、本明細書に開示された方法は、組換えバクテリオファージゲノムを生成するのに有用である。
実施例３：本技術のＢＲＥＤｎｅｒファージ改変方法
本実施例は、本技術のＢＲＥＤｎｅｒ方法が、組換えバクテリオファージゲノムを生成するのに有用であることを示す。
ＢＲＥＤｎｅｒプロトコルは、ｐＫＤ４６プラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．：ＡＹ０４８７４６．１）のλＲｅｄリコンビナーゼ系によりもたらされた相同組換え率の上昇を利用する。λＲｅｄリコンビナーゼ遺伝子（ｇａｍ−ｂｅｔ−ｅｘｏ）の発現は、ａｒａＢプロモーターに機能し得る形で連結される。細菌宿主細胞を、ｐＫＤ４６プラスミド、および両側が１００〜５００ｂｐの相同ファージ配列にフランキングするナノルシフェラーゼ配列（例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））を含む、第２のプラスミドで形質転換する。相同組換え系を、１０ｍＭアラビノースを添加することにより、ｐＫＤ４６プラスミドおよび第２のプラスミドを含有する形質転換された細菌宿主細胞に誘導する。
ｐＫＤ４６プラスミドと第２のプラスミドの両方を含有する細菌宿主細胞を中間−ログ相までアラビノースの存在下で培養した後、エレクトロポレーションでの使用のために、細胞を、１Ｍソルビトールで洗浄し１００倍濃縮する。ファージＤＮＡ約１００ｎｇを、ｐＫＤ４６プラスミドと第２のプラスミドの両方を含有する細菌宿主細胞にエレクトロポレーションする。次いで、エレクトロポレーションした細胞は、対応するファージ宿主株を含有する０．６５％トップ寒天にプレーティングする１時間前に回収できる。プレートを一晩インキュベートし、得られたプラークをＰＣＲにより、またはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発生についてスクリーニングし、組換え発光ファージ用に選択する。
これらの結果は、本技術の方法により、（ａ）目的の異種核酸配列を含有し、（ｂ）目的の異種核酸配列に関連する表現型特性を発現する組換えバクテリオファージゲノムが生成されることを示している。したがって、本明細書に開示された方法は、組換えバクテリオファージゲノムを生成するのに有用である。
実施例４：本技術のＢＡＲｎｅｒファージ改変方法
本実施例は、本技術のＢＡＲｎｅｒ方法が、組換えバクテリオファージゲノムを生成するのに有用であることを示す。
ＢＡＲｎｅｒプロトコルは、制限酵素を使用して、目的の異種核酸配列の所望の挿入部位を囲むファージＤＮＡに二本鎖切断を導入するＢＲＥＤｎｅｒプロトコルの変形である。
ＢＡＲｎｅｒプロトコルは、ｐＫＤ４６プラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．：ＡＹ０４８７４６．１）のλＲｅｄリコンビナーゼ系によりもたらされた相同組換え率の上昇を利用する。λＲｅｄリコンビナーゼ遺伝子（ｇａｍ−ｂｅｔ−ｅｘｏ）の発現は、ａｒａＢプロモーターに機能し得る形で連結される。細菌宿主細胞を、ｐＫＤ４６プラスミド、および両側が１００〜５００ｂｐの相同ファージ配列にフランキングするナノルシフェラーゼ配列（例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））を含む、第２のプラスミドで形質転換する。相同組換え系を、１０ｍＭアラビノースを添加することにより、ｐＫＤ４６プラスミドおよび第２のプラスミドを含有する形質転換された細菌宿主細胞に誘導する。ｐＫＤ４６プラスミドと第２のプラスミドの両方を含有する細菌宿主細胞を中間−ログ相までアラビノースの存在下で培養した後、細胞を、１Ｍソルビトールで洗浄し１００倍濃縮する。ファージＤＮＡ約１００ｎｇを、適当な制限酵素で切断し、フェノール／クロロホルムを用いて精製した後、細胞にエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションした細胞を、１時間回収し、適当な宿主株を含有する０．６５％トップ寒天上にプレーティングする。プレートを一晩インキュベートし、得られたプラークをＰＣＲにより、またはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の発生についてスクリーニングし、組換え発光ファージ用に選択する。
これらの結果は、本技術の方法により、（ａ）目的の異種核酸配列を含有し、（ｂ）目的の異種核酸配列に関連する表現型特性を発現する組換えバクテリオファージゲノムが生成されることを示している。したがって、本明細書に開示された方法は、組換えバクテリオファージゲノムを生成するのに有用である。
均等物
本技術は、本技術の個々の態様の単一の例として意図される、本出願に記載の特定の実施形態に関して限定されないものとする。当業者に明らかであるように、その精神および範囲から逸脱せずに本技術の多くの変形および変更が行われ得る。本明細書に列挙されたものに加えて、本技術の範囲内の機能的に均等な方法および装置は、前述の説明から当業者に明らかであろう。このような変形および変更は、本技術の範囲に含まれることが意図される。本技術は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物系に限定されず、当然ながら変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
さらに、本開示の特徴または態様は、マーカッシュ群に関して説明される場合、当業者であれば、それにより開示が、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても説明されることを認識されるであろう。
当業者に理解されるように、あらゆる目的のために、特に記述された説明を提供することに関して、本明細書で開示されるすべての範囲は、あらゆる可能な下位範囲およびその下位範囲の組み合わせも包含する。任意の列挙された範囲からは、少なくとも同等の２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などに分解されている同じ範囲を十分に説明し、可能にしていることが容易に認識され得る。非限定的例として、本明細書で考察される各範囲は、低位３分の１、中位３分の１および高位３分の１などに容易に分解され得る。当業者に理解されるように、すべての言語、例えば、「最大」、「少なくとも」、「超」、「未満」などは、列挙された数字を含み、上で考察された下位範囲に実質的に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者に理解されるように、範囲は、各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１、２または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４または５個などの細胞を有する群を指す。
本明細書において参照または引用したすべての特許、特許出願、仮特許出願および刊行物は、本明細書の明確な教示と矛盾しない程度に、すべての図および表を含む、その全体が参照により組み込まれる。

Claims (42)

  1. 組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、
    （ａ）非組換えバクテリオファージゲノムとｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体とをインビトロで、前記ｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が、前記非組換えバクテリオファージゲノム中のプロトスペーサー配列を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で接触させることと、
    （ｂ）前記切断非組換えバクテリオファージゲノムを異種核酸と、インビトロで、組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることと
    を含む、方法。
  2. 前記切断非組換えバクテリオファージゲノムが、第１の切断バクテリオファージゲノム断片および第２の切断バクテリオファージゲノム断片を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記異種核酸が、前記第１の切断バクテリオファージゲノム断片の３’末端に相同な５’フランキング領域、および前記第２の切断バクテリオファージゲノム断片の５’末端に相同な３’フランキング領域を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主中で増幅させることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記細菌宿主が、非天然細菌宿主細胞である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４からなる群から選択されるＣａｓタンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記プロトスペーサー配列が、５’ＧＣＴＴＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ３’（配列番号５）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記非組換えバクテリオファージゲノムがＫ１−５ファージに対応する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記組換えバクテリオファージゲノムの前記核酸配列が、配列番号３を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記組換えバクテリオファージゲノムの前記核酸配列が、配列番号４を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、
    （ａ）単一の第１の認識部位を含む非組換えバクテリオファージゲノムと第１の制限酵素とを、インビトロで、前記第１の制限酵素が、前記第１の認識部位を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で接触させることと、
    （ｂ）前記切断非組換えバクテリオファージゲノムを異種核酸と、インビトロで、組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることと
    を含む、方法。
  12. 前記切断非組換えバクテリオファージゲノムが、第１の切断バクテリオファージゲノム断片および第２の切断バクテリオファージゲノム断片を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記異種核酸が、前記第１の切断バクテリオファージゲノム断片の３’末端に相同な５’フランキング領域、および前記第２の切断バクテリオファージゲノム断片の５’末端に相同な３’フランキング領域を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記非組換えバクテリオファージゲノムが大腸菌Ｔ７に対応する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主細胞中で増幅させることをさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記細菌宿主細胞が、天然細菌宿主細胞である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第１の制限酵素が、ＳｗａＩである、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記第１の制限酵素が、ＮｈｅＩである、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記異種核酸が、約５００〜１０５０塩基対の長さである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記組換え系が、５’−３’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、
    （ａ）非組換えバクテリオファージゲノムと
    （ｉ）ｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体とを、インビトロで、前記ｓｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が前記非組換えバクテリオファージゲノム中のプロトスペーサー配列を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で、または
    （ｉｉ）制限酵素とを、インビトロで、前記制限酵素が、前記非組換えバクテリオファージゲノム中の唯一の認識部位を切断して、切断非組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で、
    接触させることと、
    （ｂ）前記切断非組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主細胞に形質転換することであって、前記細菌宿主細胞が、異種核酸を発現するベクターを含む、形質転換することと、
    （ｃ）前記切断非組換えバクテリオファージゲノムを前記異種核酸と、インビボで、非内因性組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることと
    を含む、方法。
  22. 前記切断非組換えバクテリオファージゲノムが、第１の切断バクテリオファージゲノム断片および第２の切断バクテリオファージゲノム断片を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記異種核酸が、前記第１の切断バクテリオファージゲノム断片の３’末端に相同な５’フランキング領域、および前記第２の切断バクテリオファージゲノム断片の５’末端に相同な３’フランキング領域を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４からなる群から選択されるＣａｓタンパク質である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記制限酵素が、ＡｃｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＭｌｕＣＩ Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＰｃｉＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｅＡＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｅＩ、ＡｌｕＩ、ＳｔｕＩ、ＳｃａＩ、ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｓｅＩ、ＳｗａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｓＳαＩ、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩ、ＢｍｇＢＩ、ＰｍｌＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｌｅＩ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＴｓｐＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｓｌＩ、ＦｓｐＥＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｃｃＩ、ＮｃｏＩ、ＢｓｅＹＩ、ＦａｕＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＴｓｐＭＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＬｐｎＰＩ、ＡｃｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｒＢＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＳｃｒＦＩ、ＢｓｓＫＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｌＩ、ＢｔｇＩ、ＮｃｉＩ、ＡｖｒＩＩ、ＭｎｌＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、ＳｂｆＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＥｃｏＮＩ、ＨｐｙＡＶ、ＢｓｔＮＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＩ、ＢｃｇＩ、ＰｖｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＥａｇＩ、ＲｓｒＩＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＪＩ、ＳｇｒＡＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＸｈｏＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＴｌｉＩ、ＥａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＰｓｔＩ、ＢｐｍＩ、ＤｄｅＩ、ＳｆｃＩ、ＡｆｌＩＩ、ＢｐｕＥＩ、ＳｍｌＩ、ＡｖａＩ、ＢｓｏＢＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｂｓＩ、ＸｍｎＩ、ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｇａＩ、ＡａｔＩＩ、ＺｒａＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＰｆｌＦＩ、ＰｓｈＡＩ、ＡｈｄＩ、ＤｒｄＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｅＲＩ、ＰｌｅＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＭｌｙＩ、ＨｉｎｆＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＤｐｎＩＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩ、ＢｓａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｂｖＩ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓαＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｐｈＩ、ＳｒｆＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮａｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＢｇｌＩ、ＡｓｉＳＩ、ＢｔｇＺＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＮｏｔＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮｈｅＩ、ＢｍｔＩ、ＳａｐＩ、ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、ＢｌｐＩ、ＴｓｅＩ、ＡｐｅＫＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、ＢａｍＨＩ、ＦｏｋＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＰｈｏＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩ、ＮａｒＩ、ＫａｓＩ、ＳｆｏＩ、ＰｌｕＴＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｉＩ、ＢｓｍＦＩ、ＡｐａＩ、ＰｓｐＯＭＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＮｌａＩＶ、ＫｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＢｓａＩ、ＨｐｈＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｎＩ、ＢａｅＧＩ、ＢｓａＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＲｓａＩ、ＣｖｉＱＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｃｉＶＩ、ＳａｌＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｃｏＤＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｓｇＩ、ＡｃｃＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＨｐａＩ、ＰｍｅＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＡｐｏＩ、ＮｓｐＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＦαＩ、ＢｓｔＹＩ、ＨａｅＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＰｐｕＭＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＳｎａＢＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＥＩ、ＭｍｅＩ、ＴａｑαＩ、ＮｒｕＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＦｓｐＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＭｓｃＩ、ＢｓｒＧＩ、ＭｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｉＩ、ＢｓｔＢＩ、ＤｒａＩ、ＰｓｐＸＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＡＩおよびＥａｅＩである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 組換えバクテリオファージゲノムを生成する方法であって、
    （ａ）無傷非組換えバクテリオファージゲノムを細菌宿主細胞に形質転換することであって、前記細菌宿主細胞が、異種核酸を発現するベクターを含む、形質転換することと、
    （ｂ）前記無傷非組換えバクテリオファージゲノムを前記異種核酸と、インビボで、非内因性組換え系の存在下で、組換えバクテリオファージゲノムを産生する条件下で組み換えることと
    を含む、方法。
  27. 前記異種核酸が、
    （ａ）前記無傷非組換えバクテリオファージゲノム中の第１の領域に相同な５’フランキング領域、および
    （ｂ）前記無傷非組換えバクテリオファージゲノム中の第２の領域に相同な３’フランキング領域
    を含み、
    前記無傷非組換えバクテリオファージゲノムの前記第１の領域が、５’から前記無傷非組換えバクテリオファージゲノムの前記第２の領域までに位置する、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記細菌宿主細胞が、非天然細菌宿主細胞または天然細菌宿主細胞である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記非内因性組換え系が、前記細菌宿主細胞に誘導される、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記非内因性組換え系が、アラビノースの添加により誘導される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記非内因性組換え系が、誘導性プロモーターに機能し得る形で連結された、λＲｅｄタンパク質Ｇａｍ、ＥｘｏおよびＢｅｔａを含む、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記誘導性プロモーターがａｒａＢである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記異種核酸が、生物発光タンパク質、蛍光タンパク質、化学発光タンパク質またはそれらの任意の組合せをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１〜８、または１１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記異種核酸の前記オープンリーディングフレームが、前記生物発光タンパク質、前記蛍光タンパク質、前記化学発光タンパク質またはそれらの任意の組合せの発現を誘導できる発現制御配列に機能し得る形で連結される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記生物発光タンパク質がエクオリン、ホタルルシフェエラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、赤色ルシフェラーゼ、ｌｕｘＡＢまたはナノルシフェラーゼである、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記化学発光タンパク質が、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、またはアルカリホスファターゼである、請求項３３または３４に記載の方法。
  37. 前記蛍光タンパク質が、ＴａｇＢＦＰ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、単量体Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｄｓＲｅｄ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、ｉＲＦＰ、ｍＫｅｉｍａ Ｒｅｄ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、ＰＡＴａｇＲＦＰ、Ｋａｅｄｅ（緑色）、Ｋａｅｄｅ（赤色）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）、ＫｉｋＧＲ１（赤色）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑色）、ｍＥｏｓ２（赤色）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅまたはＤｒｏｎｐａである、請求項３３または３４に記載の方法。
  38. 前記発現制御配列が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターである、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９である、請求項６に記載の方法。
  40. 前記組換えバクテリオファージゲノムの前記核酸配列が、配列番号２を含む、請求項１１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記組換えバクテリオファージゲノムの前記核酸配列が、配列番号１を含む、請求項１１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記組換えバクテリオファージゲノムの前記核酸配列が、配列番号６または配列番号７を含む、請求項１１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
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