KR20220068196A - CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 박테리오파지 유전체 편집 방법 및 이의 용도 - Google Patents

CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 박테리오파지 유전체 편집 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 크리스퍼 유전자가위를 이용하여 박테리오파지 유전체에 단일 염기 점 돌연변이(single base point mutation)를 도입하는 방법과 용균 파지를 제작하는 방법에 관한 것으로서, 유전체에 박테리오파지가 삽입된 용원성 균주가 박테리오파지에 의해 감염되지 않고 용균되지 않는 내성을 극복할 수 있는 방법을 제공한다. 이를 통해 파지 요법으로 다양한 항생제 내성균을 효과적으로 제어할 수 있는 원천적인 기술과 방법을 제공하는 효과가 있다.

Description

CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 박테리오파지 유전체 편집 방법 및 이의 용도{Method for Editing Bacteriophage Genome Based on CRISPR/ Cas9 System and Uses Thereof}
본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 박테리오파지 유전체 편집 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
박테리오파지(bacteriophage) 또는 파지(phage)는 박테리아(bacteria)를 감염하는 바이러스로서, 좁은 숙주 범위에 의한 높은 특이성으로 인해 여러 항생제 내성균 제어를 위한 수단으로 재조명받고 있다. 항생제 내성균은 특정한 제어법이 없어 보건의료분야에 꾸준한 사망자와 경제적 손해를 유발하고 있다. 항생제 내성균 외에도 유해 병원성 미생물로 널리 알려진 시가독소 생산 대장균(Shiga toxin producing Escherichia coli, STEC)은 감염 시 신장기능에 심각한 손상을 입히는 용혈성 요독 증후군을 유발할 수 있는데, 1982년 처음 피해 사례가 보고된 이후 전 세계적으로 연간 수백 명의 사망자를 꾸준히 발생시키고 있다. 하지만 시가독소 생산 대장균(STEC) 감염에 항생제 사용이 불가능하여 보존적인 치료만이 가능한 실정이다. 축산업에서 항생제 오남용으로 인한 항생제 내성균의 증가와 더불어 항생제 내성을 갖는 시가독소 생산 대장균(STEC)또한 발생할 수 있고, 이들이 사육 과정에서 식재료 등을 오염시킬 수 있어 이를 해결하기 위해 박테리오파지를 이용하는 새로운 제어 방법이 요구되고 있다.
박테리오파지 또는 파지 요법(Phage therapy)은 20세기 중반 항생제의 개발 이후 일부 동유럽 국가에서만 연구됐으나, 최근 항생제 내성균이 큰 문제로 대두되면서 다시 전 세계적으로 활발히 연구되고 있다. 미생물 세포를 용균시키는 박테리오파지는 숙주 세포의 특정 수용체에만 특이적으로 결합하기 때문에 표적 미생물만 선택적으로 사멸시킬 수 있어 적용 범위가 넓은 항생제와 달리 사람이나 동, 식물 및 공생하는 유익균 등에는 영향이 거의 없는 것으로 알려져 있다. 영국의 의료진은 항생제 내성 Mycobacterium abscessus에 감염된 환자에 여러 종의 박테리오파지를 칵테일 형태로 처리하여 큰 부작용 없이 질병이 호전된 결과를 보고하였다(Rebekah M. Dedrick et al., 2019). 프랑스와 벨기에의 연구진이 공동으로 참여한 연구에서는 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)에 감염된 중증 화상 환자에게 박테리오파지 칵테일을 처리하여 일부에서 세균 감염이 감소한 것을 확인하였다(Patrick Jault et al, 2019). 상기와 같이 박테리오파지 요법은 감염된 병원성 미생물을 제어하는 방법으로 활발히 연구되고 있다.
박테리오파지를 용도에 맞게 유전체 편집하는 방법도 개발되었는데, 중국 연구진들은 박테리오파지에 저항성을 가지는 Klebsiella pneumoniae 균주와 크리스퍼/캐스9 시스템을 이용하여 파지 프로모터, DNA 프라이머 합성효소, 외피 단백질 등에 유전자 결실, 교체, 점 돌연변이 도입 등에 성공하였다(Shen, Zhou et al. 2018). 캐나다 연구진들은 젖산균 감염 파지에서 기능이 알려지지 않은 유전자에 결실, 점 돌연변이 도입 등에 성공한 바 있다(Lemay, Tremblay et al. 2017).
프랑스와 벨기에 연구진의 실험에서 일부 화상 환자로부터 박테리오파지에 내성을 갖는 녹농균이 발견되었는데 (Patrick Jault et al, 2019), 이러한 내성 균주의 출현은 박테리오파지의 세균 제어 효과를 떨어뜨리는 장애물로 작용한다. 박테리오파지의 내성 기작 중 하나인 중복감염 면역(superinfection immunity)은 박테리오파지가 숙주 미생물 유전체에 통합되어 용원성 균주의 출현으로 발생한다. 용원성 균주는 다른 종류 파지의 감염으로부터 보호되어 용균화되지 않는 면역력을 갖게 된다(Boyd 1956).
상기와 같이 박테리오파지를 이용하여 세균 감염을 치료하는 연구가 활발히 수행되고 크리스퍼 시스템을 이용한 박테리오파지 유전체 편집 연구가 이루어지고 있으나, 중복감염 면역을 돌파하여 용원성 균주를 제어하는 방법에 관한 연구는 이루어진 바 없다. 항생제 내성을 보유하여 항생제를 사용할 수 없거나, 파지 요법에 걸림돌이 될 수 있는 용원성 균주의 경우, 중복감염 면역으로 인한 박테리오파지 내성을 극복하고, 박테리오파지에 면역을 갖는 용원성 세균에 대해 효과적으로 제어할 수 있는 용균성 박테리오파지의 제작 방법에 관한 연구가 필요하다.
US 2017/0283779 A1 (2017.10.5) US 2019/0330643 A1 (2019.10.31)
Lemay ML, Tremblay DM, Moineau S. Genome Engineering of Virulent Lactococcal Phages Using CRISPR-Cas9. ACS Synth Biol. 2017;6(7):1351-8. Shen J, Zhou J, Chen GQ, Xiu ZL. Efficient Genome Engineering of a Virulent Klebsiella Bacteriophage Using CRISPR-Cas9. J Virol. 2018;92(17).
상술한 상황 하에서, 본 발명자들은 박테리오파지에 면역을 갖도록 하는 용원성 세균의 중복감염 면역을 효과적으로 돌파하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 CRISPR-Cas9 시스템을 기반으로 올리고뉴클레오타이드를 이용한 단일염기편집 및 PCR 산물을 이용한 상동성 재조합을 통해 용균성 박테리오파지를 제작하였고, 상기 용균성 박테리오파지를 이용하여 용원성 세균의 유전체에 용균성 유전자를 도입했을 때, 용원성 균주의 중복감염 면역을 효과적으로 제어할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 CRISPR/Cas9 시스템 기반 박테리오파지의 유전체 편집 방법들을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 CRISPR/Cas9 시스템 기반 용균성 박테리오파지의 제작 방법들을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR/Cas9 시스템 기반 용균성 박테리오파지의 제작 방법에 따라 제작된, 용균성 박테리오파지들을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 용원성 미생물 균주의 중복감염 면역(superinfection immunity)을 극복하는 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 용원성 미생물 균주의 중복감염 면역(superinfection immunity) 극복용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 서열", "염기 서열", "뉴클레오타이드 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드 서열"은, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 유전체, 플라스미드 서열 및 이의 단편 또는 일부, 및 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 의미하고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 박테리오파지 생활사 경로 관련 유전자를 표적 DNA로 하여 이에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) 시스템 기반 박테리오파지의 유전체 편집 방법을 제공하며, 상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 박테리오파지의 생활사 경로 관련 유전자는, 박테리오파지의 생활사를 주관하는 전사억제인자(repressor)인 cI 또는 cro이고(바람직하게는, cI), 본 발명에서는 이를 저해하여 용균성 생활사 경로가 일어나도록 하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 용어 "유전체 편집(genome editing)"은, 특별한 언급이 없는 한, 표적 DNA의 표적 부위에서의 Cas9 절단에 의한 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 유전자 기능을 편집, 회복, 수정, 상실 및/또는 변경시키는 것을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명에서 가이드 RNA와 표적 DNA 간의 1 개 이상의 불일치 뉴클레오타이드가 오히려 CRISPR 시스템의 편집 효과를 향상시키는 것을 특징으로 한다.
상기 가이드 RNA와 표적 DNA 간의 1 개 이상의 미스매치는 공여 핵산 분자의 도입 및 인위적인 가이드 RNA 상의 불일치 도입에 의해 달성된다.
본 발명에서 CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집을 언급하면서 사용되는 용어 "공여 핵산 분자" 또는 "공여체 핵산 서열"은 표적 DNA에 삽입하고자 하는 목적의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 천연의 또는 변형된 폴리뉴클레오티드, RNA-DNA 키메라, 또는 DNA 단편, 또는 PCR 증폭된 ssDNA 또는 dsDNA 단편 또는 이의 유사체를 지칭한다.
이러한 공여 핵산 분자는 표적 DNA 상에 변형을 유발하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 형태, 예컨대, 단일-가닥 및 2중-가닥 형태를 포함할 수 있다.
상기 표적 DNA 상의 변형은 임의의 목적 위치에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 녹아웃(knockout), 녹인(knockin), 내인성 핵산 서열의 상동, 이종상동성(endogenous) 또는 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 바람직하게는, 상기 표적 DNA 상의 변형은 야생형 DNA 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환에 의해 점 돌연변이가 도입(유도)된 것이고, 이러한 점 돌연변이의 도입은 예컨대, 올리고뉴클레오타이드에 의한 것이다.
상술한 점 돌연변이의 도입은 표적 DNA와의 미스매치를 유발한다.
본 명세서에서 돌연변이 유도(유발)를 언급하면서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"의 길이는, 10개의 내지 90개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 15개 내지 85개의 뉴클레오타이드(mer), 더욱 바람직하게는 20개 내지 50개의 뉴클레오타이드(프로브 또는 암플리머(amplimer)로서 사용될 수 있음)의 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 일시예에서, 상기 돌연변이 유발을 위한 올리고뉴클레오타이드(mutagenic oligonucleotide)는 41 mer의 길이로 사용하였으나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용하는 용어 "불일치" 또는 "미스매치(mismatch)"는 DNA간 또는 DNA와 RNA 염기 간에 상보적인 결합에서 비상보적인 서열이 존재하는, 부적정 염기쌍이 발생한 상태를 의미한다. 본 발명자는 올리고뉴클레오타이드 및 CRISPR/Cas에 이용되는 가이드 RNA를 이용하여, 야생형 DNA 서열에서 1 개 이상의 뉴클레오타이드가 점 돌연변이됨으로써 존재하는 미스매치와, 표적 DNA에 상보적인 가이드 RNA 간에 의도적인 불일치 염기를 부여하여 발생한 미스매치로 인해 CRISPR가 표적 DNA를 인식하지 못함을 확인하였다.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "불일치 뉴클레오타이드", "불일치 염기"또는 "미스매치 뉴클레오타이드"는 비-상보적인 뉴클레오타이드를 의미하며 혼용된다.
또한, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 불일치 뉴클레오타이드는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 가이드 RNA 상의 다양한 위치(site)에 위치시킬 수 있다.
즉, 상기 가이드 RNA 상의 불일치 뉴클레오타이드의 위치는, 표적 DNA와 이에 상보적인 가이드 RNA 간에 인위적 불일치 염기를 부여함으로써, CRISPR가 표적 DNA를 인식하지 못하도록 하는 한, 임의의 위치에 존재할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 공여 DNA 상의 점 돌연변이가 존재하는 위치에 상응하는, 가이드 RNA 상의 위치로부터 1 개의 뉴클레오타이드가 이격된 바로 근접한 부위에 위치하거나, 또는 10 개 이상 원격된 부위에 위치할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 불일치 뉴클레오타이드의 수는 제한되지 않으나, 바람직하게는, 불일치 뉴클레오타이드의 수는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 더욱 더 바람직하게는 1 내지 2개, 가장 바람직하게는 1개(단일 불일치 뉴클레오타이드)일 수 있다.
또한, 가이드 RNA에 최소 2 개의 불일치 뉴클레오타이드가 있는 경우, 불일치 뉴클레오타이드는 연속적 또는 불연속적으로 위치할 수 있다.
본 명세서에서 불일치 뉴클레오타이드 위치를 언급하면서 사용되는 용어"바로 근접한(immediately adjacent)"은, 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자(예컨대, 올리고뉴클레오타이드) 상에, 점 돌연변이가 존재하는 위치에 상응하는 위치로부터 5'- 또는 3'-말단 방향으로 인접(juxtaposition)한, 즉, 1 개 뉴클레오타이드만큼 이격된 부위에 위치하는 것을 의미한다.
용어 "가이드 RNA"는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다.
상기 가이드 RNA는 표적 DNA와 혼성화하는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA (transactivating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dualRNA), 또는 상기 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하고 표적 DNA와 혼성화하는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서 상기 가이드 RNA는 sgRNA이다.
상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 가이드 RNA라도 본 발명에 사용될 수 있다.
상기 crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.
가이드 RNA는 RNA의 형태 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 세포 또는 유기체에 전달될 수 있다. 또한, 가이드 RNA는 분리된 RNA의 형태, 바이러스 벡터에 포함되어 있는 RNA, 또는 벡터에 암호화되어있는 형태일 수도 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 (agrobacterium) 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전체 편집을 언급하면서 사용되는 용어 "불일치 가이드 RNA"는 표적 DNA와 가이드 RNA 서열 간에 불일치 뉴클레오타이드가 1 개 이상 존재하는 crRNA를 포함하는 sgRNA로서, 본 명세서에서 target-mismatched sgRNA와 혼용하여 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase)를 형성한다.
Cas 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터 (national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas 단백질을 암호화하는 CRISPR-연관 (CRISPR-associated, cas) 유전자는 종종 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)과 관련된다. CRISPR-Cas 시스템은 두 개의 class와 여섯 개의 type이 존재하며, 이들 중에서, Cas9 단백질 및 crRNA 및 tracrRNA를 수반하는 type ±시스템이 대표적으로 잘 알려져 있다.
상기 표적 DNA는 상기 crRNA 또는 sgRNA와 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 및 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함한다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 표적 DNA의 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함한다.
상기 PAM은 5'-NGG-3' 트리뉴클레오타이드 (trinucledotide)이다.
종래 기술인 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드를 세포에 삽입하면, DNA를 복제하는 과정에서 낮은 수율로 돌연변이가 도입될 뿐이었다. 종래 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하는 경우에도 CRISPR/Cas9의 불일치 허용으로 인해 단일 염기 점 돌연변이를 도입하는데 어려움이 있었다.
이에, 본 발명자들은 이전에 CRISPR/Cas9의 불일치 허용을 극복하면서 표적 유전자의 목표 염기에 점 돌연변이를 도입시켜 효과적으로 편집 효과를 달성하는 데 영향을 미치는, 불일치 가이드 RNA를 설계하고 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이와 함께 CRISPR/Cas9 시스템에 적용한 바가 있다.
그 결과, 점 돌연변이에 의한 불일치 염기 수 및 상기 불일치 가이드 RNA (target-mismatched sgRNA)에 의해 증가한 불일치 염기 수로 인해 유전자 가위가 표적으로 인식하지 않아 표적 DNA가 절단되지 않고 살아남음으로써, 효과적인 목적 유전체 편집 효과를 달성함을 규명하였고, 이를 본 발명에 도입하였다.
한편, 숙주 세포(미생물 균주)의 유전체에 박테리오파지 유전체가 삽입된 균주(이하, 용원성 균주)는, 이로 인해 외부의 다른 박테리오파지에 의해 감염되지 않아 용균되지 않는 중복감염 면역(superinfection immunity)을 갖게 되어 파지 요법을 통해 제어할 수 없는 어려움이 있다. 반복적인 파지 요법에 의해 발생하는 용원성 균주는 파지 요법에 대한 내성의 원인이 된다.
따라서, 이를 해결하기 위하여, 본 발명자들은, 박테리오파지의 생활사 경로를 조절하기 위해, 상술한 크리스퍼 유전자 가위를 기반으로 박테리오파지 유전체를 편집하는 기술을 확립하였으며, 보다 구체적으로, 파지 요법에 내성을 갖는 용원성 미생물 균주 내 존재하는 CI(박테리오파지의 생활사에서 용균성 경로를 억제시켜 용원성 경로가 일어나도록 하는 전사억제인자(repressor))를 타겟으로 하는 CRISPR/Cas9을 이용하여 CI를 억제시킴으로써, 박테리오파지의 생활사가 용원성 경로에서 용균성 경로로 바뀌게 되고, 이에 따라 용원성 균주의 중복감염 면역을 극복할 수 있도록 한다.
또한, 본 발명은 상술한 바와 같이, 박테리오파지 생활사 경로 관련 유전자를 표적 DNA로 하여 이에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) 시스템 기반 용균성 박테리오파지의 제작 방법으로서, 상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함하는, 용균성 박테리오파지의 제작 방법을 제공한다.
또한, 상술한 본 발명의 방법에 따라 유전체가 편집되어 용균성 생활사 경로로 전환된 용균성 박테리오파지가 제공되며, 상기 용균성 박테리오파지는 용원성 미생물 균주의 중복감염 면역(superinfection immunity)을 회피시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 대장균 MG1655 균주에 용균성 경로 억제 단백질 유전자인 cI 유전자의 199번 염기에 점돌연변이가 일어난 박테리오파지 람다를 처리하여 용원성 균주를 얻었다.
cI 유전자 부위의 1~2개 염기 (198 ~ 199번)에 점 돌연변이를 올리고뉴클레오티드를 세포에 삽입하여 위치 유도 돌연변이 도입 후 단일염기 불일치 가이드 RNA를 이용한 크리스퍼/캐스9으로 음성 선택하여 LB 배지에 도말 하였고, 199번 단일 염기, 198 ~ 199번 2개 염기에 점 돌연변이가 도입된 균주를 얻었다.
위의 방식으로 얻은 용원성 대장균 MG1655를 서열분석하여 모균주의 유전체 서열과 비교 분석한 결과, 목표 염기에 단일 염기, 2개 염기 점 돌연변이가 도입된 것을 확인했다.
위의 방식으로 얻은 재조합 파지를 대장균 MG1655와 용원성 대장균 MG1655에 각각 처리한 결과, 대장균 MG1655에서만 플라크가 형성되고, 용원성 대장균 MG1655에서는 박테리오파지 람다에 의해 플라크가 형성되지 않는 것을 확인하였다.
cI 유전자 부위의 6개 염기 (197 ~ 202번) 에 점 돌연변이 및 미성숙합성 정지를 일으키는 올리고뉴클레오티드를 세포에 삽입하여 위치 유도 돌연변이 도입 후 단일염기 불일치 가이드 RNA를 이용한 크리스퍼/캐스9으로 음성 선택 및 제한효소 처리를 통하여 cI 유전자에 6개 염기 점 돌연변이 및 미성숙합성 정지가 도입된 재조합 박테리오파지를 얻었다.
위의 방식으로 얻은 재조합파지를 대장균 MG1655와 용원성 대장균 MG1655에 각각 처리한 결과, 두 대장균 모두에서 plaque이 형성되었으나, 용원성 대장균 MG1655에서 PFU가 크게 감소된 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 cI 전사억제인자(repressor)에 대한 안티센스 전령RNA(antisense mRNA)를 도입하는 단계를 포함하는, CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) 시스템을 기반으로 하는, 박테리오파지의 유전체 편집 방법 또는 용균성 박테리오파지의 제작 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 방법은 cI 유전자의 열린 번역틀(open reading frame)을 역방향으로 삽입함으로써, cI 전사억제인자를 저해하여 용균성 생활사 경로가 일어나도록 하고, 이에 따라 중복감염 면역을 회피하여 용원성 세균을 감염시킬 수 있는 변이 박테리오파지 람다를 제공한다.
바람직하게는, 상기 안티센스 전령RNA는 람다-레드 재조합 효소가 과발현된 균주에 도입되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 용원성 대장균을 높은 PFU로 감염시키기 위해 PCR 산물 상동성 재조합과 불일치 가이드 RNA를 이용한 크리스퍼/캐스9 음성 선택으로 박테리오파지 유전체에서 억제 단백질의 역방향 전령 RNA 돌연변이를 도입하였고, 만들어진 역방향 억제 단백질 전령 RNA 재조합 박테리오파지 람다가 대장균 MG1655와 용원성 대장균 MG1655 모두에 대해 높은 감염성을 갖는 것을 확인하였다.
상술한 바와 같이 본 발명은 중복감염 면역을 극복하여 박테리오파지를 이용해 용원성 미생물 균주를 제어할 수 있음을 입증한다.
따라서, 본 발명의 특징은, 대장균의 유전체에 삽입된 용원성 박테리오파지의 유전체를 조작하는 방법을 구축하고 이를 이용하여, 재조합 용균성 박테리오파지를 제작하여 용원성 세균을 제어할 수 있다는 데 있다.
본 발명의 방법은 목적 효과를 달성할 수 있는 한, 박테리아 및 박테리오파지의 종류를 제한하지 않으며, 예컨대, P1, P2, 람다(lambda)와 같은 박테리오파지 및 다른 박테리오파지로부터 DNA를 편집시키는데 본 방법이 사용될 수 있다.
다양한 목적상 그들의 유용한 성질을 개선시키기 위해 및/또는 박테리오파지의 사용을 손상시키는 임의의 성질을 감소시키거나 또는 제거하기 위해, 박테리오파지 게놈의 조작을 허용한다. 유사하게, 해로운 성분(예컨대, 독성 유전자)을 플라스미드로부터 제거하기 위해 박테리아에 거주하는 플라스미드를 변형시키는데 및 플라스미드의 다른 유용한 성질을 개선시키는데 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, cas9 유전자가 유전체에 통합된 균주를 사용하기 때문에 cas9 플라스미드를 삽입하는 과정이 불필요하고, Cas9 단백질의 안정적인 과발현을 유도할 수 있다. dsDNA를 사용하여 증폭, 정제 과정을 추가로 필요로 하지 않고, 단일 점 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드(mutagenic oligonucleotide)와 가이드 RNA 플라스미드의 삽입 과정만이 필요하므로, 유전체의 교정까지 전체적인 시간을 단축시켰다.
본 발명의 일 실시예에 사용된 가이드 RNA 플라스미드의 경우 42℃에서 배양함에 따라 소실되기 때문에 연속적인 유전체의 편집이 가능하고, 유전체에 통합된 cas9 유전자의 경우 P1 transduction 및 L-arabinose가 포함된 최소배지에서의 배양으로 손쉽게 제거되기 때문에 아무런 흔적 없이 유전체를 편집하는 것이 가능하므로 유전자 변형 생물체와 관련된 문제로부터 큰 영향을 받지 않을 수 있다.
상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas9 단백질은 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 것도 이용할 수 있으나, 바람직하게는 스트렙토코커스 속 (genus Streptococcus)으로부터 유래한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상술한 박테리오파지(즉, 용균성 박테리오파지)를 용원성 미생물 균주에 처리하는 단계를 포함하는, 용원성 미생물 균주의 중복감염 면역(superinfection immunity)을 극복하는 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법 및 조성물은 상기 용균성 박테리오파지를 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명에 따르면, 상술한 박테리오파지(즉, 용균성 박테리오파지)를 용원성 미생물 균주에 처리하는 단계를 포함하는, 용원성 미생물 균주의 항생제 내성 극복 방법 및 조성물을 제공할 수 있다.
즉, 본 발명의 유전자 편집 기술이 적용된 박테리오파지로 기존 항생제의 문제점(항생제 내성의 출현 및 전파)을 해결하는 데에 기여할 수 있다. 예컨대, 증가하는 항생제 내성 세균 감염을 치료할 수 있는 방안으로써 파지 요법(Phage Therapy)를 이용하여 기존 항생제를 무력화시키는 다양한 내성균의 사멸 및 내성균 감염병 치료가 가능할 것으로 기대된다.
본 발명은 크리스퍼 유전자가위를 이용한 박테리오파지 람다의 유전체 편집 방법 및 이에 의해 박테리오파지의 생활사 경로를 조절하는 억제 단백질에 대해 역방향의 유전정보를 가지는 전령RNA를 발현시키도록 유전체-편집된 변이 박테리오파지를 이용하여 용원성 균주의 중복감염 면역을 억제하는 방법에 관한 것으로서, 박테리오파지 용균성 경로 억제 단백질의 발현을 억제함으로써 박테리오파지의 생활사가 용원성에서 용균성 경로로 바뀌게 되어 변이 박테리오파지를 이용한 용원성 세균의 제어가 가능하게 되는 효과가 있다.
도 1(가)는 용원성 균주의 제작에 대한 개념, 도 1(나)는 제작 과정 및 도 1(다)는 용원성 균주 형성 확인 결과(다)를 보여준다.
도 2(가)는 용원성 박테리오파지 람다의 염기 편집에 대한 개념, 도 2(나)는 재조합 파지의 생어 염기서열 분석 결과, 도 2(다)는 재조합 파지의 감염능 및 도 3(라)는 생활사 변경 여부를 보여준다.
도 3(가) 및 3(나)는 용원성 박테리오파지 람다의 b2 region, 레드 재조합 효소 부위 등 비필수 유전자의 제거 및 유전자 삽입 결과, 도 3(다)는 재조합 파지의 감염능을 보여준다.
도 4(가) 및 4(나)는 안티센스 전령RNA가 cI 억제 단백질 합성을 저해하는 원리에 대한 개념도, 도 4(다)는 안티센스 전령RNA를 발현하는 재조합 람다파지가 용원성 균주를 높은 pfu로 감염시키는 결과를 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 박테리오파지 람다 유전체 편집을 위한 용원성 균주 제작
본 발명자들은, 하기 실시예의 목적 대상 박테리오파지 람다(λ) 유전체 편집에 사용하기 위한 사전 준비로서 용원성 균주(세균)를 확보하기 위하여, cas9 유전자가 유전체에 삽입되어 있는 돌연변이 대장균 균주(E. coli MG1655 araBAD::PBAD-cas9-KmR) HK1059에, 박테리오파지 람다를 처리하여, 박테리오파지의 유전체가, 숙주인 대장균(미생물 균주)의 유전체에 삽입되도록 하여 용원성 균주를 제작하였다(도 1(가)).
이때, 사용한 박테리오파지 람다는 DNA 상 cI 유전자 내 199번 염기가 G에서 A로 치환된 cI857 변이를 가지며, 이로 인해 30℃에서는 용원성을 가지나, 42℃의 온도 조건에서는 CI 단백질의 열안정성이 낮아져 쉽게 용균되는 특성을 가진다.
즉, 온도에 따라 조절되므로, 42℃로 온도를 상승시키지 않는 한, 본 실시예 1에서 제작한 박테리오파지의 유전체가 삽입된 균주는 용원성을 유지하게 된다.
상기 과정은 다음과 같다:
cas9 유전자가 유전체에 삽입되어 있는 돌연변이 대장균 균주(E. coli MG1655 araBAD::PBAD-cas9-KmR) HK1059를 LB 고체배지에 도말 후 자라난 단일 콜로니를 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 30℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 40 ㎖의 10% glycerol로 세척하는 과정을 두 번 거쳐 electrocompetent cell로 제조하였다.
람다 DNA (NEB #N3011S)를 HK1059에 전기 천공으로 삽입 후 MgSO4, CaCl2를 10 mM, 5 mM 농도로 첨가하여 42℃에서 24시간 동안 배양하여 얻은 상등액을 0.6% LB 한천 용액 15 ㎖, 37℃에서 16시간 배양시킨 대장균 MG1655 150 ㎕ 와 섞고, MgSO4, CaCl2를 10 mM, 5 mM 농도로 첨가하여 LB 고체배지에 덧부은 후 37℃에서 16시간 배양시켜 단일 플라크(plaque)을 분리하였다.
30℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양한 HK1059에 MgSO4, CaCl2를 10 mM, 5 mM 농도로 첨가하고 단일 plaque을 접종시킨 후 37℃에서 2시간동안 배양시켜 박테리오파지 람다를 증폭시켰으며, 상기와 같은 방법으로 PFU(plaque forming unit)을 측정했다.
0.6% LB 한천 용액 15 ㎖, 37℃에서 16시간 배양시킨 대장균 MG1655 150 ㎕, MgSO4, CaCl2를 10 mM, 5 mM 농도로 첨가한 용액을 LB 고체배지에 붓고, 마르고 난 후 증폭시킨 박테리오파지 람다를 4 ㎕ 떨어뜨리고 30℃에서 16시간, 실온에서 추가로 일주일간 배양시켜 얻은 플라크를 LB 배지에 선상도말하였다(도 1(나)).
선상도말하였을 때 자라난 콜로니를 추가로 2회 계대배양하여 용원성 균주로 추정되는 단일 콜로니들을 얻었다. 각각 대장균 유전자와 박테리오파지 람다의 유전자에 결합하는 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 HK1059의 유전체에 박테리오파지 람다(유전체)가 삽입된 것을 확인하였으며 각각 HL012, HL013, HL014, HL015, HL016로 명명하였다(도 1(다)).
이 중 HL012 균주를 유전체 분석하여 박테리오파지 람다의 삽입과 전체 서열 확인을 완료하였다.
상술한 바와 같이 확보된 상기 용원성 HL012(λcI857) 균주를 이하 실시예에 이용하였다.
실시예 2. CRISPR/Cas9을 이용한 박테리오파지 유전체 편집 효과
2-1. CRISPR-Cas9 및 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이를 이용한 박테리오파지 람다 유전체 염기 편집
본 발명자들은 이전에 미생물 유전체를 단일 염기 수준으로 정교하게 편집하기 위해, 유전체에 목적 단일 점 돌연변이가 도입되도록 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이(oligonucleotide-directed mutagenesis); 및 특정 위치에 불일치(미스매치) 서열이 존재하도록 설계한 불일치 가이드 RNA를 이용하는 CRISPR/Cas9 시스템을 확립하였다(대한민국 특허 출원 제10-2021-0043583호 참조).
간략하게는, 본 발명자들은 가이드 RNA에 미리 가이드 RNA가 상보적으로 결합하는 타겟 유전자 서열과 상보적이지 않은 염기 서열, 즉, 불일치(미스매치) 서열이 존재하도록 불일치 가이드 RNA를 설계하였다. 이에 의해, 점 돌연변이 도입에 의한 표적 DNA와의 불일치 염기 1 개 및 가이드 RNA 상 부여한 불일치 염기 1 개의 총 2 개의 불일치가 생성된다. 이후, 유전자 가위의 타겟 DNA 서열에 올리고뉴클레오타이드에 의해 돌연변이가 도입된 경우, 돌연변이가 도입된 서열은 유전자 가위가 타겟 서열로 인식하지 못해 세포는 생존할 수 있는 반면, 돌연변이가 유발되지 않은 타겟은 유전자 가위의 불일치 허용에 의해 이중가닥의 DNA가 절단되어 세포는 생존하지 못하게 되므로(음성선택, Negative selection), 목적 유전체를 단일 염기 수준으로 효과적으로 편집할 수 있을 뿐만 아니라, 선별할 수 있다.
본 발명자들은 상술한 바를 기반으로, CRISPR/Cas9을 이용하여 목적 대상 박테리오파지 람다 유전체 염기 편집 효과를 확인하기 위해, 박테리오파지의 용균성 생활사 경로 억제 유전자인 cI 전사억제인자(repressor)(NCBI accession no. 3827059)를 타겟으로 하여 적용하였다. 앞서 상술한 바와 같이 본 실시예에서 사용한 박테리오파지 람다는 DNA 상 cI 유전자 내 199번 염기가 G에서 A로 치환된 cI857 변이를 가지며, 이로 인해 CI 단백질의 열안정성이 낮아져 42℃의 온도 조건에서 쉽게 용균되는 특성을 가진다.
즉, cI 유전자의 1-2개 염기(198-199번)에 점 돌연변이를 유발하여 cI857 변이를 제거시키는 올리고뉴클레오티드를, 세포에 삽입하여 위치 유도 돌연변이 도입 후 단일염기 불일치 가이드 RNA를 이용한 크리스퍼/캐스9으로 음성 선택하고, LB 배지에 도말하여, 199번 단일 염기, 198-199번 2개 염기에 각각 점 돌연변이가 도입된 균주를 얻었다.
이때, 상기 cI 유전자의 1-2개 염기(198-199번)에 점 돌연변이를 유발하여 cI857 변이를 제거시킨 박테리오파지의 경우, 유전체가 편집(돌연변이 제거)되어 야생형 cI 유전자를 갖게 되므로, 온도에 상관없이 용원성을 유지한다.
상기 과정은 다음과 같다:
상기 실시예 1의 HL012 균주를 LB 고체배지에 도말 후 자라난 단일 콜로니를 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 30℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 40 ㎖의 10% glycerol로 세척하는 과정을 두 번 거쳐 electrocompetent cell로 제조하였다.
올리고뉴클레오티드에 의한 재조합을 돕기 위한 람다-레드 베타 발현 플라스미드를 HL012 균주에 삽입하여 도말 후 형성된 단일 콜로니를 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 30℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, L-arabinose를 1 mM 농도로 첨가해 3시간 추가로 배양하여 람다-레드 베타 단백질과 캐스9 단백질을 과발현시켰다. 이후 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 40 ㎖의 10% glycerol로 세척하는 과정을 두 번 거쳐 electrocompetent cell로 제조하였다.
돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드들은, cI 유전자의 198번 염기부터 199번 염기까지 각각 1개 또는 2개의 염기에 변이가 일어나 cI857 돌연변이가 제거되거나, cI 유전자의 197번 염기부터 202번 염기까지 6개의 염기가 치환되면서 종결 코돈이 발생하여 CI 단백질의 미성숙 합성 정지가 일어나도록 제작되었다.
단일 염기 돌연변이 또는 이중 염기 돌연변이 균주를 얻기 위해 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드와 올리고뉴클레오티드를 HL012에 전기 천공으로 삽입한 후 스펙티노마이신을 75㎎/L로 첨가한 LB 배지에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 이후 LB 배지에서 자라난 콜로니를 각각 6개씩 골라 cI 유전자를 생어 염기서열분석하였다.
cI 유전자의 197번 염기부터 202번 염기까지 6개의 염기가 치환되면서 종결 코돈이 발생하여 CI 단백질의 미성숙 합성 정지가 일어난 용균 파지를 제작하기 위해, 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드와 올리고뉴클레오티드를 HL012에 전기 천공으로 삽입한 후 MgSO4, CaCl2를 10 mM, 5 mM 농도로 첨가하여 37℃에서 6시간동안 배양하였다. 배양하여 얻은 상등액을 0.6% LB 한천 용액 15 ㎖, 37℃에서 16시간 배양시킨 대장균 MG1655 150 ㎕와 섞고, MgSO4, CaCl2를 10 mM, 5 mM 농도로 첨가하여 LB 고체배지에 덧부은 후 37℃에서 16시간 배양시켜 단일 플라크(plaque)을 분리하였다. OD600nm = 0.4 정도로 배양한 대장균 MG1655에 MgSO4, CaCl2를 10 mM, 5 mM 농도로 첨가하고, 5개의 단일 플라크를 각각 접종 후 37℃에서 배양하여 용균 파지를 얻었다. 위에서와 마찬가지로 cI 유전자를 생어 염기서열 분석하여 염기 변이를 관찰하였다.
그 결과, 도 2(나)에 나타낸 바와 같이, 고체 배지에서 형성된 콜로니의 cI 유전자를 생어 염기서열 분석했을 때, 단일 염기 돌연변이 균주들(HL017 내지 HL020)와 이중 염기 돌연변이 균주들(HL021 내지 HL025) 및 6 개 염기에 변이가 일어난 용균 파지 HJ001이 제조되는 것을 확인하였다.
또한, 도 2(다)에 나타낸 바와 같이, 상기 HL017, HL021 변이 균주를 용균시켜 얻은 재조합 파지와 용균 파지 HJ001을 대장균 MG1655에 감염시켰을 때 정상적으로 플라크(plaque)가 형성되는 것을 확인하였다.
또한, 도 2(라)에 나타낸 바와 같이, HL012(λcI857), HL017(λ199A to G; λWT), HL021(λ198TA to AG) 균주를 30℃ 및 42℃에서 배양했을 때, 온도 조절로 박테리오파지의 생활사가 조절 가능한 것을 확인하였다.
즉, 30℃ 온도 조건 하에서는 HL012, HL017 및 HL021 모두 용원성을 유지하였으나, 42℃온도 조건 하에서는 HL012만이 용균성을 나타내었고, HL017, HL021은 용원성을 유지하였다.
이는 단일 또는 이중 염기 돌연변이로 인해 cI857 돌연변이가 제거됨으로써 CI 단백질의 열안정성이 회복되었음을 의미한다.
따라서, 본 발명에서는 박테리오파지 람다의 유전체를 단일염기 수준에서 자유자재로 편집할 수 있는 시스템을 구축하였음을 입증한다.
2-2. CRISPR-Cas9 및 PCR 산물을 이용한 상동성 재조합을 이용한 박테리오파지 람다 유전체 편집
본 발명자들은 CRISPR/Cas9을 이용하여 목적 대상 박테리오파지 람다 유전체 내 유전자의 삽입 및 결실 재조합에 의한 효과를 다음과 같이 확인하였다.
실시예 1의 HL012 균주를 LB 고체배지에 도말 후 자라난 단일 콜로니를 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 30℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 40 ㎖의 10% glycerol로 세척하는 과정을 두 번 거쳐 electrocompetent cell로 제조하였다.
PCR 산물에 의한 재조합을 돕기 위한 람다-레드 재조합효소 발현 pKD46 플라스미드를 HL012 균주에 삽입하여 도말 후 형성된 단일 콜로니를 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 30℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, L-arabinose를 1 mM 농도로 첨가해 3시간 추가로 배양하여 람다-레드 재조합효소와 캐스9 단백질을 과발현시켰다. 이후 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 40 ㎖의 10% glycerol로 세척하는 과정을 두 번 거쳐 electrocompetent cell로 제조하였다.
돌연변이 도입에 사용한 PCR 산물들은 ea31 (NCBI accession no. 3827052), gam (NCBI accession no. 2703509) 유전자 내부에 각각 클로람페니콜 항생제 내성 카세트가 삽입되거나, ea59 (NCBI accession no. 3827053), ea31, ea47 (NCBI accession no. 3827051) 또는 gam, bet (NCBI accession no. 3827055), exo (NCBI accession no. 2703522) 유전자가 결실되도록 제작되었다. 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드와 PCR 산물들을 HL012에 전기 천공으로 삽입한 후 스펙티노마이신을 75㎎/L로 첨가한 LB 배지에 도말하고 30℃에서 24시간동안 배양시켜 재조합 균주를 얻었다. 이후 자라난 콜로니 들을 각각 선상도말 하여 단일 콜로니로 분리하였고, b2 region, 레드 재조합 효소 부위를 PCR하여 변이를 확인하였다.
그 결과, 도 3(나) 및 3(다)에 나타낸 바와 같이, PCR을 통해 각 유전자의 삽입 및 결실을 확인하였으며, ea31 유전자 내부에 클로람페니콜 항생제 내성 카세트가 삽입된 재조합 균주를 HL047로, b2 region이 제거된 재조합 균주를 HL059로 명명하였다. gam 유전자 내부에 클로람페니콜 항생제 내성 카세트가 삽입된 재조합 균주를 HL048로, 레드 재조합 효소 부위가 제거된 재조합 균주를 HL060로 명명하였고, 상기 재조합 균주들을 용균시켜 얻은 파지가 대장균에 대해 정상적으로 감염능을 보이는 것을 확인하였다.
실시예 4. 안티센스 전령 RNA(antisense mRNA) 도입을 통한 용원성 균주의 제어
본 발명자들은, 박테리오파지 람다 유전체가 도입된 용원성 균주가 갖는 중복 감염 면역으로 인해 나타나는, 야생형 박테리오파지 람다 및 재조합 박테리오파지 람다에 대한 내성을 극복하기 위해, 박테리오파지 람다 cI 유전자의 열린 번역틀(open reading frame, ORF) 서열을 역방향으로 삽입하여, cI 유전자가 작동하지 못하도록 함으로써, 용원성 균주에 대한 제어 가능성을 다음과 같이 확인하였다.
실시예 2의 HL017 균주를 LB 고체배지에 도말 후 자라난 단일 콜로니를 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 30℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 40 ㎖의 10% glycerol로 세척하는 과정을 두 번 거쳐 electrocompetent cell로 제조하였다. PCR 산물에 의한 상동성 재조합을 돕기 위한 pKD46 플라스미드를 HL017 균주에 삽입하여 도말 후 형성된 단일 콜로니를 LB 액체배지 200 ㎖에 접종하여 30℃에서 OD600nm가 0.4가 될 때까지 배양하고, L-arabinose를 1 mM 농도로 첨가해 3시간 추가로 배양하여 람다-레드 엑소, 베타, 감마 단백질과 캐스9 단백질을 과발현시켰다. 이후 3500 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 40 ㎖의 10% glycerol로 세척하는 과정을 두 번 거쳐 electrocompetent cell로 제조하였다. cI 유전자의 열린 번역틀 서열은 PCR로 증폭되어 본래의 열린 번역틀 서열과 반대방향이면서 재조합을 위한 상동성 서열을 가지도록 PCR로 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물은 정제된 후 람다-레드 재조합 효소가 과발현된 HL017에 전기 천공으로 삽입되었고, MgSO4, CaCl2를 10 mM, 5 mM 농도로 첨가한 뒤 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양하여 얻은 상등액을 0.6% LB 한천 용액 15 ㎖, 37℃에서 16시간 배양시킨 대장균 MG1655 150 ㎕와 섞고, MgSO4, CaCl2를 10 mM, 5 mM 농도로 첨가하여 LB 고체배지에 덧부은 후 37℃에서 16시간 배양시켜 단일 플라크(plaque)을 분리하였다. OD600nm = 0.4 정도로 배양한 대장균 MG1655에 MgSO4, CaCl2를 10 mM, 5 mM 농도로 첨가하고, 6개의 단일 플라크를 각각 접종 후 37℃에서 배양하여 용균 파지를 얻었다.
위에서와 마찬가지로 cI 유전자를 생어 염기서열 분석한 결과, cI 유전자의 열린 번역틀이 안티센스 전령RNA 서열로 교체된 것을 확인하였으며, HJ002로 명명하였다.
또한, 도 4(다) 및 표 2에 나타낸 바와 같이, λ 파지 및 실시예 2에서 제조된 CI 단백질의 미성숙 합성 정지가 일어난 HJ001 (λcI amber) 파지는 대장균 MG1655만을 감염시켜 플라크를 형성하였다.
반면, 안티센스 전령RNA를 발현시키는 HJ002 파지(λcI anti-sense)는 각각 대장균 MG1655와 HL017 균주에 감염시켰을 때 두 균주 모두에서 플라크를 형성하였으며, HL017 균주에서는 65%의 플라크 형성률을 보였고, 용원성 대장균 MG1655에서 84%의 높은 플라크 형성률을 보이는 것을 확인하였다.
본 발명에 이용된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.
서열번호 프라이머 이름 프라이머 염기서열 (5'→3')
1 ara_promoter_rev GAGTGCAGTACTCATTTTTTATAACCTCCTTAGAGCTCGAATTC
2 rep101_for AAGGTGGCAGCATGACGCATCCTCACGATAATATCCGGGTAG
3 cI_F AAACCATTCTTCATAATTCAATCCAT
4 cI_R TCTTTCAGGGTTATGCGTTGTTCCAT
5 Lambda_cI198T_F GAGAATTTTTGTTAGCAATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
6 Lambda_cI198T_R CATTGCTAACAAAAATTCTCACTAGTATTATACCTAGGACTG
7 Lambda_cI198C_F GAGAATTTTTGTCAGCAATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
8 Lambda_cI198C_R CATTGCTGACAAAAATTCTCACTAGTATTATACCTAGGACTG
9 Lambda_cI200C_F GAGAATTTTTCTAAGCAATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
10 Lambda_cI200C_R CATTGCTTAGAAAAATTCTCACTAGTATTATACCTAGGACTG
11 Lambda_cI197CC_F GAGAATTTTTGTCCGCAATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
12 Lambda_cI197CC_R CATTGCGGACAAAAATTCTCACTAGTATTATACCTAGGACTG
13 Lambda_cI_1bp_F CTTATAACGCCGCATTGCTAGCAAAAATTCTCAAAGTTAGC
14 Lambda_cI_1bp_R GCTAACTTTGAGAATTTTTGCTAGCAATGCGGCGTTATAAG
15 Lambda_cI_2bp_F CTTATAACGCCGCATTGCGGGCAAAAATTCTCAAAGTTAGC
16 Lambda_cI_2bp_R GCTAACTTTGAGAATTTTTGCCCGCAATGCGGCGTTATAAG
17 cI_ATG_F ATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACAC
18 cI_TGA_R TCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCACTGAC
19 cI_RC_int_F CAACACGCACGGTGTTAGATATTTATCCCTTGCGGTGATAGATTTAACGTTCAGCCAAACGTCTCTTCAG
20 cI_RC_int_R ATTCTTGCTCAATTGTTATCAGCTATGCGCCGACCAGAACACCTTGCCGAATGAGCACAAAAAAGAAACC
21 cI_half_R GCTTACCCATCTCTCCGCATCACCTTTG
22 cI_half_F CAAAGGTGATGCGGAGAGATGGGTAAGC
23 gRNA_cI701_F AGACGTTTGGCTGATCGGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
24 gRNA_cI701_R TGCCGATCAGCCAAACGTCTACTAGTATTATACCTAGGACTG
25 gRNA_cI709_F GGCTGATCGGCAAGGTGTTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
26 gRNA_cI709_R GAACACCTTGCCGATCAGCCACTAGTATTATACCTAGGACTG
Phages
λ(cI857) HJ001 (λcI amber) HJ002 (λcI anti-sense)
A B A/B A B A/B A B A/B
E. coli No. of Plaques No. of added phages (%) No. of Plaques No. of added phages (%) No. of Plaques No. of added phages (%)
MG1655 50 85 58 79 97 81 102 156 65
MG1655
λ lysogen(HL017)		 0 85 0 0 97 0 132 156 84
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (14)

  1. 박테리오파지 생활사 경로 관련 유전자를 표적 DNA로 하여 이에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) 시스템 기반 박테리오파지의 유전체 편집 방법으로서,
    상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함하는, CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) 시스템 기반 박테리오파지의 유전체 편집 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 박테리오파지 생활사 경로 관련 유전자는 전사억제인자(repressor)인 cI 또는 cro인 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cas9 시스템 기반 박테리오파지의 유전체 편집 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 cI 전사억제인자(repressor)를 저해하여 용균성 생활사 경로가 일어나도록 하는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cas9 시스템 기반 박테리오파지의 유전체 편집 방법.
  4. 박테리오파지 생활사 경로 관련 유전자를 표적 DNA로 하여 이에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) 시스템 기반 용균성 박테리오파지의 제작 방법으로서,
    상기 표적 DNA와 상기 가이드 RNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함하는, 용균성 박테리오파지의 제작 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 용균성 박테리오파지는 용원성 미생물 균주의 중복감염 면역(superinfection immunity)을 회피시키는 것을 특징으로 하는,
    용균성 박테리오파지의 제작 방법.
  6. 제4항의 CRISPR/Cas9 시스템 기반 용균성 박테리오파지의 제작 방법에 따라 제작된 용균성 박테리오파지.
  7. cI 전사억제인자(repressor)에 대한 안티센스 전령RNA(antisense mRNA)를 도입하는 단계를 포함하는, CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) 시스템 기반 박테리오파지의 유전체 편집 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 cI 전사억제인자를 저해하여 용균성 생활사 경로가 일어나도록 하는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cas9 시스템 기반 박테리오파지의 유전체 편집 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 cI 전사억제인자의 열린 번역틀(open reading frame, ORF) 서열을 역방향으로 삽입하는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cas9 시스템 기반 박테리오파지의 유전체 편집 방법.
  10. cI 전사억제인자(repressor)에 대한 안티센스 전령RNA(antisense mRNA)를 도입하는 단계를 포함하는, CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) 시스템 기반 용균성 박테리오파지의 제작 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 용균성 박테리오파지는 용원성 미생물 균주의 중복감염 면역(superinfection immunity)을 회피시키는 것을 특징으로 하는,
    용균성 박테리오파지의 제작 방법.
  12. 제10항의 CRISPR/Cas9 시스템 기반 박테리오파지의 제작 방법에 따라 제작된 용균성 박테리오파지.
  13. 제6항 또는 제11항의 박테리오파지를 용원성 미생물 균주에 처리하는 단계를 포함하는, 용원성 미생물 균주의 중복감염 면역(superinfection immunity)을 극복하는 방법.
  14. 제6항 또는 제11항의 박테리오파지를 포함하는, 용원성 미생물 균주의 중복감염 면역(superinfection immunity) 극복용 조성물.
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