CN108474792B - 用于检测细菌的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于细菌检测的快速、简单并且非常灵敏的方法，包括以下步骤：提供一种或多种悬浮液，每种所述悬浮液包含至少一个种类的标记的测试噬菌体，所述标记的测试噬菌体特异性结合待检测的细菌种类；将待测试是否存在至少一种待检测的细菌种类的样品添加到所述一种或多种悬浮液中；过滤反应混合物；检测渗余物中过滤器表面上的细菌‑噬菌体‑复合物，条件是存在至少一种待检测的细菌种类，其中所述复合物由所述至少一种待检测的细菌种类的细菌和结合至其的所述至少一个种类的测试噬菌体的测试噬菌体组成；检测滤液中未结合的测试噬菌体；处理器辅助处理接收到的检测信号并输出检测结果。此外，公开了用于实施所述方法的反应容器和测量仪器。

Description

用于检测细菌的方法和设备
技术领域
本发明涉及用于细菌检测的方法，特别是用于细菌性病原体检测的加速并且高度灵敏的方法，其基于形成特异性的细菌-噬菌体-复合物。另外，公开了用于实施本发明方法的反应容器和测量装置。
背景技术
细菌通常被认为是严重疾病的病原体。特别地，也称为“医院病原体”的多重耐药细菌菌株是造成医院大量细菌感染的原因。特别是鉴于人口变化和现代重症监护医学的可能性，在重症监护病房发现越来越多的特别容易感染细菌的老年患者。重症监护疗法的重要组成部分之一是微生物诊断。对感染的病原体的快速和正确的鉴定不仅显著影响患者的死亡率，而且还能够使用细菌特异性抗生素，从而可以避免广谱抗生素的大量使用和多重耐药菌株的相关选择。但是，迄今为止的现有程序通常耗时并且费用高昂。
例如，血培养一直是迄今为止血流感染的诊断中的主要支柱之一。因此，培养在需氧和厌氧条件下在培养瓶中进行。除了血液之外，诸如点状物或液体试样的无菌流体也适用于此目的。通常，在室温下取约3-4个含有10ml全血的培养瓶用于诊断。血培养瓶在半自动系统中培养，其中通过CO2产量的增加或通过瓶压的增加来测量细菌生长的增加。在大多数情况下常规培养是48-72小时。因此，生长缓慢的细菌可能需要培养5至21天，因此在常规程序中容易被忽视，这造成了特殊的问题。同样，特殊的培养基或着色过程会使得充分且快速的诊断复杂化和延迟。如果检测到血培养瓶阳性，则从系统中选择。从该瓶中取样并且再次在不同的培养基上制备需氧和厌氧的亚培养物。再过8个小时后，可以进行伴随抗生素测试的抗性的粗略测定。
使用乳胶凝集检测肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis)、大肠杆菌(E.coli)和伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的抗原，在1-2小时内直接从阳性血培养瓶中实现更快的病原体鉴定。近来用于检测核酸的方法(例如DNA杂交、荧光原位杂交(FISH)和特异性核酸扩增技术(NAT))已用于菌血症和脓毒症的诊断，但仅在非常少的几个实验室用到。因此，可以在1-3小时内从阳性血培养瓶测定病原体。此外，近年来，一些临床实验室已经用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间)质谱仪进行了升级，该质谱仪允许在仅仅几分钟内鉴定细菌。然而，上述现代检测方法仍然需要检测阳性的血培养瓶。因此，使用阳性血培养来检测细菌病原体通常只能在取样后24至36小时的时间窗内成功。
在一些情况下，PCR诊断方法能够在采集血液样品后4-6小时内检测血液样品中的细菌，而无需培养血培养物的中间步骤，例如，用于金黄色葡萄球菌。最现代的方法是多重扩增方法，可以检测最常见的病原体。这些包括LightCycler、SeptiFast和SepsiTest。但是，这些测试很容易受到污染，从而给出错误或假阳性结果。这些方法的另一个缺点是工作量和成本结构，因为PCR诊断不仅需要材料，还需要合适的专业人员和合适的基础设施。
此外，应该指出的是，在所有情况的2-3％中，检测到阳性的血培养物也来自样本污染或采样后的加工错误。其后果是不正确的抗生素治疗以及不必要的、有时大量的成本，这就是为什么用于细菌病原体检测的快速、易于使用和高度灵敏的方法是期望的。
关于高灵敏度和特异性的要求，噬菌体(简称噬菌体(phage))提供了一个有前途的起点。噬菌体是特异性靶向细菌细胞的病毒，经由表面受体结构识别它们，以钥匙-锁样方式结合它们，并使用细菌的遗传和酶促设备在随后的步骤中用于它们自己的繁殖。被感染的细菌细胞溶解并释放大量新的噬菌体。这个生物学过程链持续进行，直到游离噬菌体可接近的所有宿主细菌细胞都被除去。噬菌体几乎总是仅影响一种细菌种类内的菌株，即它们对某一细菌种类具有高度特异性。由于许多细菌种类可以在许多生境中普遍存在，根据生物学原理，可以预期它们的互补噬菌体也可以在其中找到。全球范围内，专家估计的噬菌体数量超过细菌的10倍(C.Rohde&J.Sikorski:Bakteriophagen-Vielfalt,Anwendungund ihre Bedeutung für die Wissenschaft vom Leben.Naturwiss.Rundschau(2011),64,5-14)。通常可以通过对目标细菌的简单取样和随后的筛选从所有可能的水生栖息地中提取所需的噬菌体。
由于它们极大的宿主特异性和溶菌特性，噬菌体已经在临床研究和分析中以多种方式使用，例如，在针对细菌感染的噬菌体疗法中。此外，Thanki、Malik、Clokie描述了用于鉴定艰难梭菌(Clostridium difficile)的生物发光报道噬菌体的发展，其中将编码萤光素酶的基因盒luxA和LuxB克隆到质粒中以接合到艰难梭菌特异性噬菌体中，并且用于同源插入到噬菌体基因组中(A.Thanki,D.Malik,M.Clokie,The Development of a ReporterPhage for the Identification of Clostridium difficile,Bacteriophages(2015),摘要,25)。Mosier-Boss等的科学出版物进一步描述了使用荧光标记的P22噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌LT2(Salmonella typhimurium LT2)的特异性检测。噬菌体的标记完全限于噬菌体的DNA(用SYBRgold培养P22 10分钟)，其在感染时被注入宿主细菌中。通过荧光显微镜对它们进行分离后，进行特定的鼠伤寒沙门氏菌-P22-噬菌体复合物的检测。(P.A.Mosier-Boss’等Use of Fluorescently Labeled Phage in the Detection and Identificationof Bacterial Species,Applied Spectroscopy(2003),57,1138-1144)。
简单可靠的细菌检测在食品工业和饮用水供应中也很重要。军团菌菌株可在20℃至45℃的饮用水中增殖，因此需要定期测试饮用水，并且这在许多国家也是法律规定的。例如，德国饮用水规章规定对军团菌进行定期检测。预计法律规定将进一步收紧。因此研究机构和官方(例如饮用水实验室或卫生部门)急于对军团菌菌株进行快速、简单、灵敏和安全的细菌检测。目前这是缺乏的，需要改进。
另一方面，食源性细菌食物中毒和食物毒素感染是全球性问题，并造成巨大的经济损失。直到获得可靠的病原体检测的长时间段意味着相当大的经济损失，因为直到转售的产品存储时间延长或者相应的食物甚至可能被召回。更快更安全的检测方法可以显著促进食品安全并将经济损失降至最低。在食品领域中可怕的病原体包括克罗诺杆菌属(Cronobacter spp)、沙门氏菌属(Salmonella spp)、志贺氏菌属(Shigella spp)、大肠杆菌(Escherichia coli)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、弧菌属(Vibrio spp)、气单胞菌属(Aeromonas spp)、邻单胞菌属(Plesiomonas spp)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。因此，快速排除或检测食物中的病原体对于它们的批准是必需的。
其它需要快速和简单的检测细菌的领域包括农业、兽医、军事应用或灾害控制。
鉴于现有技术的用于检测细菌的临床方法的缺点，特别是关于时间花费、复杂性和成本强度，需要一种新的、更快并且更特异的诊断方法，对于临床、人类医学或兽医、农业或军事应用或饮用水分析(仅举几个具体应用)，及时和选择性检测细菌是必需的。因此，本发明的目的是提供一种用于检测细菌检测的改进方法，其提供了对细菌病原体的更快和更可靠的鉴定、简化的操作和高灵敏度同时更低的成本。同样，提供了用于实施本发明方法的反应容器和测量装置。
发明内容
针对上述目的的本发明方案基于细菌和噬菌体之间进化上保守的、高度特异的相互作用。
因此，本发明公开了用于检测细菌的方法，其包括以下步骤：
A)提供一种或多种悬浮液，每种所述悬浮液包含至少一个种类的标记的测试噬菌体，所述标记的测试噬菌体特异性结合待检测的细菌种类；
B)将待测试是否存在至少一种待检测的细菌种类的样品添加到所述一种或多种悬浮液中；
C)过滤所得反应混合物；
D)检测渗余物中的细菌-噬菌体-复合物，条件是存在至少一种待检测的细菌种类，其中所述复合物由所述至少一种待检测的细菌种类的细菌和结合至其的所述至少一个种类的测试噬菌体的测试噬菌体组成；
E)检测滤液中未结合的测试噬菌体；
F)处理器辅助处理所接收的由步骤D)和E)中的检测产生的信号，并且将检测结果输出给用户。
此外，本发明涉及用于实施本发明的细菌检测方法的反应容器，其包含：
通过过滤器彼此分开的至少两个隔室，其中，一个隔室是含有悬浮液的噬菌体贮存室，所述悬浮液包含特异性结合待检测细菌种类的至少一个种类的标记的测试噬菌体，并且一个隔室是用于在向所述悬浮液中加入样品并通过所述过滤器过滤后接收滤液的收集贮存室；
用于识别所述反应容器的工具；和
至少两个测量窗，其中，一个测量窗布置在面向所述噬菌体贮存室的过滤器表面的区域中，一个测量窗布置在所述收集贮存室的区域中。
此外，本发明涉及一种盒，其包括两个或更多个根据本发明的反应容器，所述反应容器彼此平行和/或串联布置，
其中每个平行反应容器含有在噬菌体贮存室的所述悬浮液中的不同种类的标记的测试噬菌体，每种标记的测试噬菌体特异性结合不同的待检测的细菌种类。
此外，本发明涉及用于实施本发明的细菌检测方法的测量装置，其包括：
一个槽，其中插入根据本发明的反应容器或者根据本发明的盒；
至少两个检测光学器件，每个所述检测光学器件布置在所述插入的反应容器或盒的测量窗的区域中，其中每个所述检测光学器件包括用于将由所述噬菌体标记发射的光聚焦到至少一个传感器上的透镜系统，所述至少一个传感器检测所述发射的光；
处理器，其分别连接到所述检测光学器件的所述至少一个传感器，并且处理接收到的检测信号；和
连接到所述处理器的输出单元，所述输出单元将检测结果输出给用户。
一方面，本发明的有利效果在于快速并且高度灵敏地鉴定细菌病原体。因此，本发明的方法不需要血培养。相反，可以在取样后立即使用待测试是否存在特定细菌种类的样品。因此，在不需要运输和储存样品的情况下，可以在不到1个小时的时间内理想地检测到细菌。这可以允许更快、更细菌特异性的应用抗生素，从而避免预防性使用广谱抗生素。另外，通过本发明的方法，可以以小于每毫升100个细菌的浓度检测细菌。另一方面，本方法的特征在于取出后立即使用样品并且易于加工，使其不易受加工错误的影响。此外，使用本发明的反应容器和本发明的测量仪器实施该方法不需要经过验证的专业人员或特殊的基础设施，这显著降低了成本。
附图说明
图1：本发明用于细菌检测的方法的优选实施方式的示意图
图2：本发明用于细菌检测的方法的另一个优选实施方式的示意图
图3A：本发明用于细菌检测的反应容器的优选实施方式的示意图
图3B：在使用图3A的本发明反应容器的本发明方法的优选实施方式中的荧光的时间分辨测量的理论过程。
图4A：本发明用于细菌检测的盒的优选实施方式的示意图，a)正视图，b)俯视图和c)侧视图。
图4B：在使用图4A的本发明盒的本发明的方法的优选实施方式中的荧光的时间分辨测量的理论过程。
图5：在一个实施方式中的本发明的反应容器和测量装置的装配的示意图。
图6：作为用于识别本发明反应容器的工具的RFID芯片。
图7：用荧光素-NHS酯标记TB54噬菌体。
图8：荧光素标记的TB54噬菌体的激发和发射光谱。
图9A：细菌-噬菌体相互作用的荧光显微镜图像。
图9B：细菌-噬菌体相互作用的明视场像。
图10A：在透射光和荧光显微镜表示中的用荧光素标记的TB54噬菌体感染的大肠杆菌细菌的光学截面图。
图10B：用荧光素标记的TB54噬菌体感染的大肠杆菌细菌的三维重构。
图11A：在不同浓度的噬菌体中荧光素标记的TB54噬菌体的荧光光谱。
图11B：在不同浓度的噬菌体下图10A的荧光光谱的520nm和530nm之间的积分表示。
图12A-C：一系列稀释的细菌悬浮液的光密度的测量，检测到的在渗余物的过滤器表面上的大肠杆菌C600-TB54噬菌体复合物荧光信号的表示，和检测到的滤液中的未结合的TB54噬菌体的荧光信号的表示，它们各自在不同浓度的细菌中。
具体实施方式
根据本发明的方法包括在步骤A)中提供一种或多种悬浮液，每种所述悬浮液包含至少一个种类的标记的测试噬菌体，所述标记的测试噬菌体特异性结合待检测的细菌种类。优选地，所述标记对于标记的测试噬菌体的各个种类是特征性的。这意味着与测试噬菌体的不同种类偶联的标记是分离的。或者，所述标记也可以部分重叠，由此单独的标记和不同种类的测试噬菌体的信号可以分别借助光谱分析方法在光谱上分离，并且因此可以清楚地分配。在这种情况下，也可以顺序检测重叠标记。
优选地，悬浮液的体积在0.5ml和5.0ml之间。
噬菌体在悬浮液中的浓度(也称为噬菌体滴度)优选为103-1012pfu/ml(pfu＝“噬斑形成单位”)，进一步优选为104-1010pfu/ml。最优选的是悬浮液中的噬菌体滴度为105-107pfu/ml。
根据待检测的细菌种类，选择与该细菌种类特异性结合(即特异性感染该细菌种类)的测试噬菌体种类用于制备该悬浮液。由于噬菌体的进化保守、极大的宿主特异性，甚至有可能特异性检测细菌种类内的个别菌株。在这种情况下，选择测试噬菌体的种类用于制备悬浮液，其特异性结合细菌种类内的特定菌株。因此，所选择的测试噬菌体的种类与除了待检测细菌种类以外的细菌种类或除待检测菌株之外的其它菌株几乎不可能结合。结果，通过本发明方法获得假阳性检测的可能性最小，并且本发明的检测方法的结果是非常可靠的。当提供几种悬浮液时，可以相应地选择不同种类的测试噬菌体(其各自特异性结合待检测的不同细菌种类)，使得每种悬浮液含有一种特定种类的测试噬菌体。这使得可以在一个样品内检测几种细菌种类。为了能够在进一步的步骤中检测至少一个种类的测试噬菌体和所得到的细菌-噬菌体-复合物，所述测试噬菌体带有标记。优选地，所述标记对于相应种类的测试噬菌体是特征性的，即一个种类的所有测试噬菌体携带与其它种类的标记可区分的相同标记。
为了制备悬浮液，优选将相应的至少一个种类的标记的测试噬菌体悬浮在水中或合适的缓冲溶液或其它水溶液中。合适的缓冲溶液优选为0.01-0.3M磷酸盐缓冲液，pH6.5-9.5；0.01-0.3M碳酸盐缓冲液，pH 6.5-9.5；磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或者它们的混合物。进一步优选的，水和合适的缓冲溶液含有MgCl2、MgSO4和/或CaCl2。MgCl2、MgSO4和CaCl2的浓度各自优选为1mM至15mM。
在本发明方法的步骤B)中，将待测试是否存在至少一种待检测的细菌种类的样品添加到所述一种悬浮液或所述多种悬浮液中。优选地，所述样品由以下组成：人或动物体液(例如血液、尿液、唾液或其它体液)，取自人或动物的拭子，来自饮用水系统的水，或用水溶液制备的食物或食物成分。取样后，可将样品直接加入到所述一种或多种悬浮液中而无需进一步预处理。食物或食物成分被放入水溶液中。这显著减少了检测细菌所需的时间，并将运输和/或储存期间污染的风险降至最低。此外，本发明的方法还允许检测源自制备的细菌培养物的样品中的细菌。
在添加之前，样品优选通过孔径为0.5-10.0μm的粗过滤器过滤以除去任何通过颗粒(>0.5μm)的污染，以便可以避免在随后的步骤C)中可能的过滤器堵塞。或者，也可以使用具有0.5-10μm的递减孔径的多级粗过滤器。
样品的体积优选为0.05-2.5ml，进一步优选为0.1-2.0ml，最优选为0.5-2.0ml。所述体积范围的组合也是可能的。
优选地，在步骤B)之后，在步骤G)中混合所述样品与所述悬浮液，并培养所得反应混合物。优选通过反复旋转或适度搅拌来进行混合。所得到的反应混合物优选培养2-30分钟，进一步优选5-15分钟，甚至更优选5-10分钟。培养期间的温度优选为4-60℃，进一步优选10-30℃。反应混合物在室温(RT，20-25℃)下培养是最优选的。假设存在至少一种待检测的细菌种类，则混合和培养应该确保在步骤C)中随后的过滤之前待检测的每种细菌被相应的至少一个种类的标记的测试噬菌体结合或感染。
优选地，在步骤C)中使用孔径为0.1-0.5μm的过滤器来过滤反应混合物。所使用的过滤器的孔径进一步优选为0.2-0.5μm，特别优选0.3-0.5μm的孔径，最优选0.2-0.4μm的孔径。所使用的过滤器的孔径以这样的方式选择，使得至少一种待检测的细菌种类和细菌-噬菌体-复合物(其由至少一种待检测的细菌种类的细菌和结合至其的至少一个种类的测试噬菌体的测试噬菌体组成)被保留并固定在过滤器表面上，而未结合的噬菌体可通过该过滤器。由此，实现了待检测的细菌种类的细菌-噬菌体-复合物和其它可能存在的细菌与未结合的噬菌体的分离。因此使用的过滤器的孔径根据相应的待检测的细菌种类的尺寸和形态来选择。
过滤器优选由膜(membrane)、薄膜(film)或基质组成，例如球形床或者丝状或管状材料(例如纤维/中空纤维)的纳米或微米结构表面。
优选地，过滤材料由以下组成：合成或天然聚合物，例如聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、聚醚砜(PES)、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAA)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、淀粉、碳水化合物、乳胶或硅胶；金属或金属合金，其可以是磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或非磁性的；玻璃，例如硼硅酸盐玻璃；纤维素，例如甲基纤维素或再生纤维素；或者其它碳化合物，例如活性炭。
过滤优选通过重力、通过施加真空或通过超压进行。
在步骤D)中在渗余物的过滤器表面上检测细菌-噬菌体-复合物以及在步骤E)中在滤液中检测未结合的测试噬菌体是基于标记的检测，利用所述标记分别提供噬菌体。例如，所述标记可以由具有荧光性质的报告分子组成。在合适激发所述报告分子后，可以经由传感器检测发射的荧光信号。所述荧光信号可以经由光发射滤波器瞬时整合检测，也可以作为波长光谱以分光光度法进行测量。此外，这两种检测方案也可以结合。第一种检测方案的优点是具有更高的信噪比和更快的测量。如果使用几种不同的测试噬菌体，第一种检测方案的缺点是可能对分离荧光标记造成限制。分光光度检测方案的优点在于，即使是部分重叠的标记也可以用于几种不同的测试噬菌体，因为它们可以在光谱上分离，并且因此在下游处理方法中明确地被分配。
从步骤D)和E)接收到的信号(例如，各自检测到的荧光信号和/或荧光光谱)在步骤F)中由处理器处理，并且最终将检测结果输出给用户。
所述输出优选通过连接到所述处理器的光学显示器来执行。或者，检测结果可以从所述处理器无线传输到平板电脑或远程计算机终端。
如果样品中存在至少一种待检测细菌种类，则至少一个种类的标记的测试噬菌体特异性结合所述至少一种待检测细菌种类，并因此形成相应的细菌-噬菌体-复合物。过滤将这些复合物和其它细菌一起从未结合的细菌噬菌体中分离出来。因此，由于结合的测试噬菌体的标记，可以检测固定在过滤器表面上的复合物。过量的未结合的测试噬菌体可以通过过滤器，并且由于其标记可以在滤液中检测到。如果样品不含任何待检测的细菌种类，则不会形成复合物，并且在滤液中检测到只有未结合的测试噬菌体。在该步骤中也可以在渗余物中检测到过量未结合的测试噬菌体，特别是如果过滤器(部分)堵塞。因此，除了滤液以外，渗余物中未结合的测试噬菌体的测量信号也可以包括在检测中。
步骤E)中未结合的测试噬菌体的附加检测降低了当过滤器堵塞时获得假阳性信号的风险。如果样品不含有待检测的细菌种类并且过滤器被例如不可检测的细菌种类或反应混合物中的其它颗粒堵塞，则未结合的测试噬菌体不能通过过滤器并保留在渗余物中。这导致了在渗余物中的检测，尽管不能形成特异的细菌-噬菌体-复合物。结果是待检测的细菌种类的假阳性检测。如果在步骤E)中滤液中未结合的测试细菌噬菌体检测不可行，则表明过滤器被堵塞。因此，在步骤E)中的未结合的测试噬菌体的附加检测增加了根据本发明的检测方法的可靠性。
或者，在步骤E)中缺乏对滤液中未结合的测试噬菌体的检测可能是由于所有测试噬菌体都与至少一种待检测细菌种类结合。尽管由于高噬菌体滴度这种可能性不太大，还是优选悬浮液包含标记参考噬菌体，该标记参考噬菌体不结合任何待检测的细菌种类，并且具有与测试噬菌体分离的标记以进一步增加根据本发明的检测方法的可靠性。由于标记，参考噬菌体也是可检测的。所述参考噬菌体的标记与所述测试噬菌体的标记分离，使得参考噬菌体可以明确且独立于相应的测试噬菌体进行检测。由于参考噬菌体不与任何待检测的细菌种类结合，即它不与任何细菌形成复合物，所以它可以在过滤后理想地仅在滤液中检测到。但是，如果在滤液中未检测到参考噬菌体，则表明过滤器完全堵塞。
即使过滤器在该步骤中部分或完全堵塞，参考噬菌体的使用也能提供非常可靠的检测结果。为此目的，确定渗余物中参考噬菌体的总信号强度与滤液中参考噬菌体的总信号强度的商，并将其与渗余物中至少一种测试噬菌体的总信号强度与滤液中至少一种测试噬菌体的总信号强度的商进行比较。如果针对至少一种测试噬菌体确定的商显著高于针对参考噬菌体确定的商，则这提供了在所使用的样品中存在至少一种待检测细菌种类的明确证据。然而，如果在渗余物和滤液中均发现至少一种测试噬菌体的信号，但是出现与参考噬菌体可比的商，则可以假定在该步骤中过滤器的非特异性堵塞，例如，被不可检测的细菌。
作为标记参考噬菌体的替代物，可以使用标记的微米或纳米颗粒。它们不会与任何待检测的细菌种类结合，并且由于其尺寸小而可以通过过滤器。
本发明方法的另一个优点是它不限于特定的待检测的细菌种类，而是普遍适用的。唯一的要求是存在与待检测的细菌种类互补的噬菌体。遵循一种生物学原理，根据这种生物学原理，疑似在众多的细菌种类栖息地中也存在互补噬菌体，必须假定对于每个细菌种类有至少一种特异性感染这种细菌种类的噬菌体。
然而，待检测的细菌种类优选地选自包含下列的组：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylocossus epidermidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、赫氏埃希菌(Escherichia hermannii)、EHEC、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecum)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、屎肠球菌(Entercoccus faecium)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、B-链球菌(无乳链球菌)(B-Streptococcus(agalactiae))、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、嗜麦芽寡食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)，炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、肉毒梭菌(Clostridiumbutolinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、披衣菌(Clamydia trachomatis)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、阴道加德纳菌(Gardenella vaginalis)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、星状诺卡菌(Nocardia asteriodes)、邦戈沙门菌(Salmonella bongori)、肠道沙门菌(Salmonella enterica)，志贺氏菌属(Shigellaspp.)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、贝纳特考克斯体(Coxiella burnettii)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)，邻单胞菌属(Plesiomonasspp.)、嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、侵蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、小螺菌(Spirillum minus)、普氏立克次体(Rickettsia prowazeki)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、康氏立克次体(Rickettsia conorii)、克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)、弯曲杆菌属(Campylobacterspp.)和嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)。
特别优选地，待检测的细菌种类可以选自由下列组成的组：金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)(特别是haMRSA＝医院获得的MRSA、caMRSA＝社区获得的MRSA、laMRSA＝家畜相关的MRSA、VRSA＝耐万古霉素金黄色葡萄球菌)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌亚种腐生菌(Staphylococcussaprophyticus subsp.saprophyticus)、肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、单核细胞增多性李斯特菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、粘质沙雷氏菌、鲍氏不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、绿脓杆菌、嗜麦芽寡食单胞菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、摩氏摩根菌、雷氏普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、脆弱拟杆菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体亚种苍白球(Treponema pallidum ssp.pallidum)、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、多杀巴斯德菌、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、空肠弯曲杆菌、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、土拉弗朗西斯菌、百日咳杆菌和嗜肺军团菌(Legionella pneumophilas)。
在本发明方法的一个实施方式中，所述一种或多种悬浮液优选各自包含两个或更多个种类的标记的测试噬菌体。该种类特异性结合待检测的不同细菌种类。优选地，所述种类的标记是分离的或部分重叠的，因此对于测试噬菌体的各个种类是特征性的。这使得能够在一批样品中同时检测两个或更多个细菌种类的存在。优选地，所述一种或多种悬浮液各自含有多达6个不同种类的标记的测试噬菌体，进一步优选多达5个不同种类，甚至更优选多达4个不同种类，最优选多达3个不同种类。
在另一个实施方式中，本发明的方法用两种或更多种悬浮液平行进行，每种悬浮液包含不同种类的标记的测试噬菌体，其中所述种类的标记优选是分离的或部分重叠的。待测试的样品分布在两个或更多个悬浮液上。优选地，待测试样品通过微流体系统分配，使得样品不必单独添加到悬浮液中，而是通过微流体系统的微流体通道同时添加。优选地，在该实施方式中使用6个平行的悬浮液，进一步优选5个平行的悬浮液，甚至进一步优选4个平行的悬浮液，最优选至多3个平行的悬浮液。这也使得能够在一个样品中同时检测两个或更多个细菌种类的存在。
在另一个实施方式中，所述方法在步骤A)之后还包括一个步骤，其中在加入样品之前在悬浮液中检测标记的噬菌体。该步骤用于获取源自未结合的噬菌体标记的全部信号作为初始参考。如果标记是诸如具有荧光性质的报告分子，在添加样品或使用分光光度计记录其荧光光谱之前，在适当的激发后检测未结合的噬菌体的总荧光作为初始参考。
优选地，所述方法还包括在过滤之前检测在步骤B)中或在任选的步骤G)中获得的反应混合物。
噬菌体的标记优选包含至少一种具有荧光或化学发光性质的报告分子或至少一种通过与二级分子相互作用而发光的报告分子。进一步优选的是至少一种具有荧光或化学发光性质的报告分子。至少一种具有荧光性质的报告分子是特别优选的。
具有荧光性质的报告分子包括：
·有机荧光团，例如氧杂蒽、罗丹明、香豆素、吖啶衍生物、荧光素以及Aexa Fluor衍生物、SYBR Green和SYBR Gold；
·无机荧光团及其复合物，例如量子点(QD)；
·荧光磁性粒子；和
·荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或者它们的衍生物。
通过与二级分子相互作用而发光的报告分子包括
·酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，它们通过转化相应的标记底物而发光；和
·生物素，其通过结合链霉亲和素作为相互作用伴侣而发光，反过来携带荧光或化学发光标记。
对于噬菌体的标记，有机荧光团是最优选的。
噬菌体可以通过将至少一个报告分子偶联至噬菌体的DNA、偶联至噬菌体衣壳区域中的蛋白质(头部包膜蛋白)或尾部区域中的蛋白质(尾纤维蛋白质)来标记。至少一个报告分子与噬菌体衣壳区域中的蛋白偶联是优选的。
优选地，通过在至少一个报告分子和噬菌体之间形成共价键来获得偶联。为此目的，使用下列物质：
·用于与氨基偶联的至少一种报告分子的活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)或磺基四氟苯酯(STFP酯)；
·用于与氨基偶联的至少一个报告分子的异硫氰酸酯；
·用于与巯基偶联的至少一个报告分子的马来酰亚胺；
·用于经由两阶段叠氮化合物-炔烃环加成反应偶联至炔烃的至少一个报告分子的叠氮化合物；和
·用于非特异性偶联的至少一个报告分子中的光反应性基团。
实例为：作为活性酯的5(6)-羧基荧光素-NHS-酯，作为异硫氰酸酯的异硫氰酸荧光素(FITC)，作为马来酰亚胺的Alexa Fluor 488-马来酰亚胺，作为叠氮化合物的5-叠氮基-四甲基罗丹明(5-TAMRA-叠氮化合物)和作为光反应基团的光生物素。
在本发明方法的一个优选实施方式中，噬菌体的标记由至少一种荧光报告分子组成。激发分别由照明单元实施，该照明单元优选包括一个或多个激光器或一个或多个发光二极管(LED)。此外，激发在200-1000nm的波长范围内、进一步优选在350-700nm的波长范围内进行。通过经由使用光学传感器的光学发射滤波器测量积分的荧光和/或通过测量荧光强度谱来进行渗余物中过滤器表面上的细菌-噬菌体-复合物的检测和滤液中未结合的噬菌体的检测。优选使用荧光显微镜和/或光学传感器和/或分光光度计来测量荧光。光学传感器进一步优选地选自由下列组成的组：光电倍增器(PMT)、CCD传感器(电荷耦合器件)和CMOS传感器(互补金属氧化物半导体)。分光光度计允许以预定的波长间隔扫描荧光强度，优选地以20nm步长、更优选以10nm步长、特别优选以2-5nm步长扫描。
在另一个优选的实施方式中，通过光发射的时间分辨测量来进行检测，即在一定时间段内连续检测由报告分子发射的光。当噬菌体的标记是至少一种荧光报告分子时，激发和检测按上述实施方式中所述进行，条件是以时间分辨方式测量荧光。
优选地，用于细菌检测的本发明方法还包括预分离细菌-噬菌体-复合物和未结合的噬菌体的步骤，其中预分离在步骤B)或任选的步骤G)之后进行。反应混合物的预分离优选根据使用凝胶基质的凝胶过滤(凝胶渗透色谱或尺寸排阻色谱)的原理进行。这意味着细菌-噬菌体-复合物和未结合的噬菌体由于它们的尺寸不同而彼此分离，由此较大的复合物在较小的未结合的噬菌体之前离开凝胶基质。凝胶基质优选由以下组成：合成或天然聚合物，如聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、聚醚砜(PES)、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAA)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、淀粉、碳水化合物、乳胶或硅胶；金属或金属合金，其可以是磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或非磁性的；玻璃，如硼硅酸盐玻璃；纤维素，如甲基纤维素或再生纤维素；或者其它碳化合物。
所述凝胶基质优选具有0.01-5μm的孔径。凝胶基质的材料和孔径的选择取决于待检测的至少一种细菌种类的尺寸和形态，以便实现细菌-噬菌体-复合物与未结合的噬菌体的最佳预分离。
在另一个实施方式中，本发明的方法还包括在步骤C)中的过滤之前浓缩细菌-噬菌体-复合物和未结合的噬菌体的步骤。
所述浓缩可以机械地或电磁地进行。
进一步优选地，所述至少一个种类的测试噬菌体和任选的参考噬菌体用磁珠包被。在这种情况下，可以通过施加外部磁场(例如通过提供电磁体)来电磁地实现浓缩。
预分离和浓缩的任选步骤可以在本发明方法中单独或组合进行。
在另一个实施方式中，本发明方法可以包括在步骤C)中过滤反应混合物之后的冲洗步骤。在该冲洗步骤中，优选用中性溶液冲洗过滤器。所述中性溶液优选由水、缓冲溶液或任何其它水溶液或之前的无菌过滤样品组成。
另一方面，本发明描述了用于实施本发明的细菌检测方法的反应容器。
优选地，本发明的反应容器具有5-20mm的长度、5-20mm的宽度和50-100mm的高度。
本发明的反应容器包括至少两个通过过滤器彼此分离的隔室。过滤器的孔径优选为0.1μm至0.5μm，更优选为0.2μm至0.5μm。0.3-0.5μm的孔径是特别优选的，并且最优选的孔径是0.2-0.4μm。如前面针对该方法所描述的，所使用的过滤器的孔径根据待检测的各自细菌种类的尺寸和形态来选择，以便实现从未结合的噬菌体中有效分离细菌-噬菌体-复合物和可能存在的其它细菌。
过滤器优选由膜(membrane)、薄膜(film)或基质组成，例如球形床或者丝状或管状材料(例如纤维/中空纤维)的纳米或微米结构表面。
优选地，过滤材料由下列组成：合成或天然聚合物，例如聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、聚醚砜(PES)、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAA)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、淀粉、碳水化合物、乳胶或硅胶；金属或金属合金，其可以是磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或非磁性的；玻璃，例如硼硅酸盐玻璃；纤维素，例如甲基纤维素或再生纤维素；或者其它碳化合物，例如活性炭。
反应容器的一个隔室是含有悬浮液的噬菌体贮存室，该悬浮液包含至少一种特异性结合待检测细菌种类的标记的测试噬菌体。优选地，所述标记对于各种测试噬菌体是特征性的。
在另一个实施方式中，噬菌体贮存室中的悬浮液包含两个或更多个种类的标记的测试噬菌体，每个标记的测试细菌噬菌体的种类特异性结合待检测的不同细菌种类，其中种类的标记是分离的或部分重叠的，所以标记对于测试噬菌体的各个种类是特征性的。
噬菌体在悬浮液中的浓度、悬浮液的体积和悬浮液的其它规格对应于本发明方法所述的一般信息。
同样，关于标记的测试噬菌体及其标记的方法的一般信息经必要修改后适用于本发明的反应容器。
优选地，噬菌体贮存室中的悬浮液进一步包含标记参考噬菌体，其不结合任何待检测的细菌种类并且具有与测试噬菌体不同的标记。针对本发明的方法详细描述了该实施方式的有益效果。
在根据本发明的反应容器的一个实施方式中，噬菌体贮存室由可压缩膜密封，使得悬浮液不直接接触过滤器。只有在加入待测试是否存在至少一种待检测的细菌种类的样品时压入所述可压缩膜，所得到的反应混合物才流到过滤器上。
本发明的反应容器的一个隔室是收集贮存室，其旨在添加样品到悬浮液中并随后过滤之后收集反应混合物的滤液。
此外，所述反应容器含有用于其识别的工具。
这优选地是RFID芯片(射频识别)或条形码。更优选地，RFID芯片(射频识别)或条形码优选含有关于序列号、生产日期、有效期、悬浮液中的噬菌体滴度和/或待检测的细菌种类或菌株的数据。用于识别的工具能够简单并且明确地识别反应容器，这使反应容器混乱的风险最小化并因此提高了用所述反应容器进行的检测方法的可靠性。
此外，本发明的反应容器包括至少两个测量窗，其中一个测量窗布置在面向噬菌体贮存室的过滤器表面的区域中，并且其中一个测量窗布置在收集贮存室的区域中。当使用本发明的反应容器进行根据本发明的检测方法时，这使得能够检测渗余物中过滤器表面上的细菌-噬菌体-复合物以及检测滤液中未结合的噬菌体。本发明的反应容器还可以在测量窗的区域中附加地包含激发窗口，其能够激发具有荧光特性的报告分子。或者，可以通过测量窗进行激发。
在一个优选的实施方式中，所述反应容器包含噬菌体贮存室和过滤器之间的另一隔室，其含有至少一个预过滤器。所述至少一个预过滤器使得能够在过滤之前在反应混合物中从未结合的噬菌体中预分离细菌-噬菌体-复合物。
预过滤器进一步优选为凝胶基质，其根据凝胶过滤的原理预分离反应混合物。凝胶基质优选由下列组成：合成或天然聚合物，例如聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、聚醚砜(PES)、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAA)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、淀粉、碳水化合物、乳胶或硅胶；金属或金属合金，其可以是磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或非磁性的；玻璃，如硼硅酸盐玻璃；纤维素，如甲基纤维素或再生纤维素；或者其它碳化合物。此外，凝胶基质优选具有0.01-5μm的孔径。凝胶基质的材料和孔径的选择取决于待检测的至少一种细菌种类的尺寸和形态，以便实现从未结合的噬菌体中对细菌-噬菌体-复合物的最佳预分离。
在该实施方式中，反应容器还包括一个或多个测量窗，其直接布置在含有至少一个预过滤器的隔室下方。
优选地，所述反应容器在从噬菌体贮存室到过滤器的方向上变窄，使得能够在过滤之前浓缩细菌-噬菌体-复合物和未结合的噬菌体。
另外，所述反应容器优选通过噬菌体贮存室的区域中的隔膜密封。
所述反应容器优选包含一个另外的测量窗，其布置在噬菌体贮存室的区域中。这允许检测源自未结合的噬菌体的标记的全部信号作为初始参考。当标记是诸如具有荧光特性的报告分子时，在合适的激发之后和加入样品之前或者使用分光光度计记录其荧光光谱之前，检测未结合的噬菌体的总荧光作为初始参考。
此外，所述反应容器优选包括一个或多个连接到收集贮存室的隔室并且被称为一个或多个后续浓缩贮存室。这些隔室的最后一个被称为废物贮存室。进一步优选地，通过孔径为0.1μm至0.5μm、优选0.2-0.5μm、进一步优选0.3-0.5μm并且最优选0.2-0.4μm的后续过滤器将一个或多个后续浓缩贮存室与收集贮存室分开或将一个或多个后续浓缩贮存室彼此分开。所述后续浓缩贮存室也可以配备它们自己的测量窗和激发窗。此外，后续过滤器的孔径可以在从收集贮存室到废物贮存室的方向上减小，这使得能够根据待检测的各个细菌种类的尺寸和形态连续分离不同的细菌和细菌-噬菌体-复合物。由孔径尺寸≤0.05μm的最终过滤器将废物贮存室与收集贮存室分离或者与一个或多个后续浓缩贮存室(如果存在的话)分离。通过最终过滤器去除所有的噬菌体，以便可以安全并且低成本地处理剩余的滤液。或者，所述废物贮存室含有吸收剂，该吸收剂从收集贮存室中或从一个或多个后续浓缩贮存室(如果存在的话)中吸收滤液。
在另一个实施方式中，所述反应容器包含过滤器和噬菌体贮存室之间的另一个隔室，其优选通过隔膜与其它隔室隔开。进一步优选地，该隔室含有具有标记的微米或纳米颗粒的指示剂溶液，所述标记的微米或纳米颗粒不结合任何待检测的细菌种类，并且由于其尺寸小而可以通过过滤器。因此，带有标记的微米或纳米颗粒的指示剂溶液可用作参考噬菌体的替代物，并通过刺穿膜添加。
本发明反应容器的不同实施方式不是相互排斥的，因此可以单独或组合实施。
另一方面，本发明涉及包含两个或多个彼此平行和/或串联布置的本发明反应容器的盒，其中每个平行反应容器含有噬菌体贮存室的悬浮液中不同种类的标记的测试噬菌体，每种所述标记的测试噬菌体特异性结合不同的待检测的细菌种类。这使得能够同时检测一个样品中两种或更多种细菌种类的存在。不同种类的标记的测试噬菌体的标记优选是分离的或部分重叠的。反应容器的串联布置使得能够根据待检测的各个细菌种类的尺寸和形态来分离不同的细菌和细菌-噬菌体-复合物。在这种情况下，下游的一个或多个反应容器的过滤器的孔径小于前一个反应容器中的过滤器的孔径。
所述盒优选包含多达6个平行布置的反应容器，进一步优选多达5个平行布置的反应容器，甚至更优选多达4个平行布置的反应容器，最优选多达3个平行布置的反应容器。
此外，所述盒优选包括微流体系统，待测试的样品被注入微流体系统中并且经由微流体通道将样品引导到平行布置的反应容器的噬菌体贮存室中，所以不需要单独将样品添加到悬浮液中。
本发明还涉及用于实施本发明的细菌检测方法的测量装置。
所述测量装置包括槽，本发明的反应容器或本发明的盒插入该槽中。
此外，所述测量装置包括至少两个检测光学器件和一个处理器，每个检测光学器件布置在插入的反应容器或盒的测量窗的区域中。
当测量装置包括用于反应容器的槽时，取决于反应容器的实施方式，即根据测量窗的数量，测量装置可以包含三个、四个或更多个检测光学器件。
另一方面，当测量装置包括用于盒的槽时，检测光学器件的数量取决于在盒内平行和/或串联布置的反应容器的数量，由此对每个平行排列的反应容器，测量装置可以含有2至4个或者更多个检测光学器件。
每个检测光学器件包括用于将由噬菌体标记发射的光聚焦到至少一个传感器上的透镜系统，所述至少一个传感器检测所发射的光。检测光学器件的至少一个传感器优选地包括一个或多个光学传感器和/或一个或多个分光光度计，其配备有或不配备发射过滤器，从而能够分辨荧光信号的光谱。在光学传感器和一个或多个分光光度计的组合的情况下，可以顺序地控制检测光学器件，使得它可以在具有高信噪比的快速检测(在光学传感器中对总体荧光强度的透镜聚焦检测)或者具有光谱的逐条记载的慢速检测(分光光度计)之间转换。在此处，分光光度计不是严格意义上的光学传感器。
优选地，所述光学传感器选自由光电倍增器(PMT)、CCD传感器(电荷耦合器件)和CMOS传感器(互补金属氧化物半导体)组成的组。
此外，优选每个检测光学器件都包括发射波长范围为200-1000nm的光的照明单元以及另一个用于将由照明单元发射的光聚焦到测量区域上的透镜系统。从而，照明单元也连接到处理器并由处理器控制。
优选地，所述照明单元发射波长范围350-700nm内的光。进一步优选地，所述照明单元包括一个激光器或一个或多个发光二极管(LED)。
所述处理器连接到检测光学器件的至少一个传感器并处理接收到的检测信号。
此外，所述测量装置包括连接到处理器的输出单元，该输出单元将检测结果输出给用户。
所述输出单元优选包括一个光学显示器。
进一步优选地，所述输出单元包括无线电接口，由此检测结果可以通过无线电从处理器无线传输到平板电脑或远程计算机终端。
优选地，所述测量装置还包括集成式读取器，该集成式读取器检测用于识别反应容器的工具并将检测到的数据转发给处理器，其中处理器处理检测到的数据，并且经由输出单元将识别结果输出给用户。
在一个优选实施方式中，测量装置还包括可以选择性地接通和断开的电磁体，例如环形线圈。所述电磁体进一步优选地布置在反应容器的过滤表面的区域中，该反应容器插入到面向噬菌体贮存室的槽中。
在下文中，参照附图详细描述本发明，并且进一步解释各种实施方式。
图1示出了本发明方法的一个实施方式。将待测试是否存在待检测的细菌种类的样品(3)注入在可净化的噬菌体贮存室(8)中提供的悬浮液(1)中。样品(3)可能含有其它不可检测的细菌种类。在该实施方式中，悬浮液(1)含有一种特异性结合待检测细菌种类的标记的测试噬菌体(2)。标记是具有荧光特性的报告分子。在将样品(3)与悬浮液(1)混合并培养反应混合物之后，其流到具有0.1μm和0.5μm之间的优选孔径的过滤器(4)上，并且通过重力过滤和/或在外部冲压或真空的作用下过滤('死端过滤')。由此，获得的细菌-噬菌体-复合物(5)和其它未检测的细菌种类固定在渗余物中的过滤器表面上，而剩余的未结合的测试噬菌体(2)穿过过滤器(4)的孔并收集作为收集贮存室(9)中的滤液。过滤器表面上的细菌-噬菌体-复合物(5)和滤液中未结合的测试噬菌体(2)的检测通过所用的荧光报告分子的特定激发并通过测量所得到的荧光来进行。通常，激发在发现各个荧光报告分子的最大吸收的波长范围内进行。在该实施方式中，悬浮液(1)还含有标记参考噬菌体(6)，其不与待检测的细菌种类结合，因此穿过过滤器(4)的孔并且也作为滤液收集在收集贮存室(9)中。参考噬菌体(6)的标记也由具有荧光性质的报告分子组成，其中测试噬菌体(2)和参考噬菌体(6)的报告分子优选是分离的。这意味着相应的荧光报告分子以这样的方式选择：它们可以吸收相同或不同激发波长的光，但发射不同波长的光。鉴于此，可以明显区分各个报告分子的发射荧光信号，从而明显区分相应噬菌体的发射荧光信号。因此，参考噬菌体(6)也通过其荧光报告分子的特异性激发并通过测量所得荧光来检测。然后由处理器处理来自渗余物和滤液的所获得的荧光信号，并将检测结果输出给用户。
在荧光的分光光度检测中，即当使用分光光度计作为传感器时，可以在可调节的光谱带波长范围上进行进一步检测，以便收集发射光谱。在这种情况下，可以使用重叠的荧光报告分子而不是分离的荧光报道分子，因为这些分子可以在多路复用方法中检测到，并且随后可以由处理器进行光谱分离。
可以经由连接到处理器的光学显示器进行输出或无线输出到平板电脑或远程计算机终端。基于分别针对测试噬菌体(2)和参考噬菌体(6)计算的渗余物中测量的荧光的总强度和滤液中测量的荧光的总强度的商，以及通过这些的比较，可以获得该检测方法的可靠结果。如果针对测试噬菌体(2)确定的商显著高于针对参考噬菌体(6)确定的商，则这提供了样品中存在待检测的细菌种类的明确证据。然而，如果在渗余物和滤液中都发现测试噬菌体(2)的荧光信号，但其比例可比于参考噬菌体(6)，则可以认为过滤器(4)在该步骤中以不明方式变得堵塞，例如通过不应该被检测到的细菌堵塞。
在图2中示出了本发明方法的另一个实施方式。此处，以与图1的上述实施方式中相同的方式实施该方法的各个步骤，不同之处在于平行使用三种不同的悬浮液(1)。每种所述悬浮液(1)含有特异性结合不同的待检测的细菌种类的不同种类的标记的测试噬菌体(2)，以及参考噬菌体(6)。这些标记分别是荧光报告分子，所述标记优选是分离的，或者当分光光度检测和随后的分离成为可能时，所述标记也可以部分重叠。在该优选实施方式中，待测试的样品(3)通过微流体系统(21)的微流体通道(22)分配到三个悬浮液(1)种，以便同时进行添加。由于优选的分离或部分重叠的标记，因此能够同时在一个样品(3)内进行三种待检测的细菌种类的特异性检测。
图3A示出了根据本发明的反应容器(7)的一个优选实施方式。它包括四个隔室(a)-(d)。隔室(a)是含有悬浮液(1)的噬菌体贮存室(8)，悬浮液(1)包含至少一个种类的特异性结合待检测细菌种类的标记的测试噬菌体，该标记优选为测试噬菌体的各个种类的特征。此外，噬菌体贮存室(8)中的悬浮液(1)可以含有标记的参考噬菌体，其不结合任何待检测的细菌种类并且具有与测试噬菌体分离的标记。噬菌体贮存室(8)由隔膜(23)密封。隔间(b)含有孔径为0.01-5μm的凝胶基质(24)作为预过滤器，其能够根据凝胶过滤原理预分离反应混合物。因此，由于它们的不同尺寸，细菌-噬菌体-复合物和不可检测的细菌从未结合的噬菌体中分离，由此较大的复合物在较小的未结合的噬菌体之前离开凝胶基质(24)。隔室(c)是收集贮存室(9)，其被设计为在向悬浮液(1)中加入样品以及随后的过滤之后收集反应混合物的滤液。隔间(d)是含有吸收剂(26)的废物贮存室(25)，所述吸收剂吸收来自收集贮存室(9)的滤液。隔室(a)和(b)通过孔径为0.1μm至0.5μm的过滤器(4)与隔室(c)和(d)分开。在所示出的实施方式中，反应容器还列出了用于识别的RFID芯片(10)和通过隔膜(27)与其它隔室隔开的附加隔室，附加隔室包含具有标记的微米或纳米颗粒的指示剂溶液(28)。它们不结合任何待检测的可检测的细菌种类并由于它们的小尺寸而通过过滤器(4)。因此，含有标记的微米或纳米颗粒的指示剂溶液(28)可以用作参考噬菌体的替代物，并且可以通过刺穿膜(27)将其添加到反应溶液中。在该实施方式中，反应容器在朝向过滤器(4)的方向上变窄，使得能够在过滤之前浓缩细菌-噬菌体-复合物和未结合的噬菌体。此外，所示出的反应容器(7)总共包括四个测量窗(11-14)。一个测量窗(11)布置在面向噬菌体贮存室的过滤器表面的区域中。另一个测量窗(12)位于收集贮存室的区域内。这使得能够检测渗余物中固定在过滤器表面上的细菌-噬菌体-复合物和滤液中未结合的噬菌体。另一个测量窗(13)被布置在噬菌体贮存室的区域中，使得源自噬菌体的标记的所有信号在添加待测试样品之前被检测作为初始参考。此外，第四测量窗(14)位于凝胶基质下方，用于在过滤之前从凝胶基质(24)中洗脱时检测反应混合物中的细菌-噬菌体复合物和未结合的噬菌体。在所示出的实施方式中，反应容器(7)在由曝气针(30)和隔膜(31)组成的废物贮存室(25)的区域内还具有集成的曝气机构(29)。当隔膜(31)被刺穿时，反应容器曝气并开始重力过滤。
图3B示出了使用图3A的本发明反应容器(7)的本发明方法的一个优选实施方式中荧光的时间分辨测量的理论过程。此处，待测试是否存在待检测的细菌种类的样品通过隔膜(23)注射到噬菌体贮存室(8)中的悬浮液(1)中，通过多次(3-5x)旋转与悬浮液(1)混合并在室温(RT)下培养5-10分钟。悬浮液(1)中的至少一个种类的测试噬菌体显示作为标记的荧光报告分子。通过刺穿集成曝气机构(29)中的隔膜(31)，同时开始反应容器(7)的四个测量窗(11-14)处荧光强度的时间分辨测量。作为曝气的结果，反应混合物一个接一个地流过隔室(b)和(c)，使得隔室(a)中的测量窗13处的荧光随时间连续降低直到不能够再被检测到。在隔室(b)中的凝胶基质(24)中，由于它们的尺寸不同，未结合的噬菌体与较大的细菌-噬菌体-复合物分离。较大的细菌-噬菌体-复合物在较小的未结合的噬菌体之前从凝胶基质(24)洗脱。因此，测量窗(14)处的荧光开始增加，直到所有细菌-噬菌体-复合物已经通过该测量区域。然后荧光稍微下降，直到未结合的噬菌体最终离开凝胶基质，其特征在于在测量窗(14)荧光再次增加。将细菌-噬菌体-复合物固定在过滤器(4)上，使得它们的荧光信号在测量窗(11)处增加，直到将所有细菌-噬菌体-复合物和不被检测的细菌种类分别固定在过滤器(4)上。未结合的噬菌体通过过滤器(4)并在收集贮存室(9)的测量窗(12)中显示为增加的荧光信号。已经完全通过反应容器的过量反应混合物被收集在隔室(d)中并被吸收剂(26)结合。
此外，图4A以a)正视图、b)俯视图和c)侧视图示出了用于检测细菌的本发明的盒(36)的一个优选实施方式的图示。根据本发明的盒(36)包括平行布置的两个反应容器(I、II)，其中的每一个基本上对应于如图3A所示的本发明反应容器(7)的实施方式。平行反应容器(I、II)的每一个含有四个测量窗(11-14)。一个测量窗(11)布置在面向噬菌体贮存室的过滤器表面的区域中。另一个测量窗(12)位于收集贮存室的区域内。这使得能够检测渗余物中固定在过滤器表面上的细菌-噬菌体-复合物和滤液中未结合的噬菌体。另一个测量窗(13)位于噬菌体贮存室的区域中，使得来源于噬菌体的标记的所有信号可以在添加待测试样品之前被检测作为初始参考。此外，第四个测量窗(14)位于凝胶基质下方，用于在从凝胶基质(24)中洗脱时并在过滤之前检测反应混合物中的细菌-噬菌体-复合物和未结合的噬菌体。在所示出的实施方式中，平行反应容器(I，II)各自在测量窗(11-14)的区域中还显示有四个激发窗口(11a-14a)，其用于激发具有荧光特性的报告分子。
图4B示出了使用图4A的本发明的盒(7)的本发明方法的一个优选实施方式中的荧光的时间分辨测量的理论过程。这涉及将待测试是否存在待检测的细菌种类的样品注入反应容器(I)中。将没有待检测细菌的中性溶液注入反应容器(II)中，使得不能形成细菌-噬菌体-复合物。两个反应容器(I和II)均用中性溶液冲洗。如已经针对图3B中的过程详细描述的那样，在两个反应容器(I和II)中随着时间在过滤过程中在测量窗(13)处的荧光持续减少，直到其不再能够被检测到。在反应容器(I)的情况下，由于通过凝胶过滤进行预分离，较大的细菌-噬菌体-复合物在较小的未结合的噬菌体之前从凝胶基质中洗脱。因此，测量窗(14)处的荧光开始增加，直到所有细菌-噬菌体-复合物已经通过该测量区域。然后荧光稍微下降，直到未结合的噬菌体最终离开凝胶基质，其特征在于在测量窗(14)处的荧光再次增加。由于没有添加样品，因此在反应容器(II)中不能形成细菌-噬菌体-复合物，因此测量窗(14)处的荧光增加仅仅是由于未结合的测试噬菌体；因此没有观察到测量窗(14)处荧光强度的“肩”。在用中性溶液冲洗的过程中，未结合的噬菌体(在反应容器(I)的情况下还有任何剩余的细菌-噬菌体-复合物)逐渐从该测量区域移除，导致在测量窗(14)处荧光减少至零。在反应容器(I)中形成的细菌-噬菌体-复合物固定在过滤器上，使得测量窗(11)处的荧光信号增加，直到所有细菌-噬菌体-复合物固定在过滤器上。之后，可以观察到反应容器的测量窗(11)处的荧光没有进一步增加。相反，即使在用中性溶液冲洗期间，该测量区域中的荧光也保持恒定。相比之下，反应容器(II)的测量窗(11)处的荧光信号也首先增加，然而，这是由于测试噬菌体在过滤器区域中的暂时积累。然而，通过用中性溶液冲洗，所有测试噬菌体都通过过滤器，使得该测量区域中的荧光减少，而反应容器(II)的后续收集贮存室的区域处的测量窗(12)处的荧光强度增加。通过用中性溶液冲洗，测试噬菌体最终转移到废物贮存室中。由此，反应容器(II)的测量窗(12)处的荧光信号再次降低。对于反应容器(I)也可以观察到在测量窗(12)处的荧光信号的类似过程。但是，这种荧光仅来自剩余的未结合的噬菌体。
在另一个优选实施方式中，本发明的反应容器(7)和测量装置(15)的组件的图示示出于图5中。所示出的反应容器(7)包含具有可压碎膜的噬菌体贮存室(8)，该噬菌体贮存室反过来包含悬浮液(1)，该悬浮液(1)包含特异性结合待检测细菌种类的至少一种标记的测试噬菌体(2)，该标记优选为各种测试噬菌体(2)的特征。此外，悬浮液(1)可以在可清除的噬菌体贮存室(8)中含有标记的参考噬菌体(6)，其不与任何待检测的细菌种类结合并且具有与测试噬菌体(2)分离的标记。在反应容器(7)的顶部用隔膜(23)密封，然后接有用孔径为0.5-10.0μm的粗过滤器(32)，以除去较大的悬浮颗粒和任何杂质。也可以使用具有0.5-10μm孔径逐渐减小的多级粗过滤器(32)。通过将待测样品(3)注入噬菌体贮存室(8)中的悬浮液(1)中，噬菌体贮存室(8)的膜被压碎。由于重力，所得到的反应混合物开始沿着孔径为0.2μm的过滤器(4)的方向流动。在所示出的实施方式中，反应容器(7)向下变窄，使得能够在过滤之前浓缩细菌-噬菌体-复合物(5)和未结合的噬菌体(2、6)。另外，通过选择性地接通和断开均匀磁场来电磁地实现浓缩。为此，测量装置(15)包括布置在过滤器(4)的过滤器表面的区域中的作为电磁体的环形线圈(33)。此外，用磁珠涂覆至少一个种类的测试噬菌体(2)以及任选的参考噬菌体(6)。收集贮存室(9)在过滤器(4)之后用于收集过滤后的滤液。收集贮存室(9)之后是另一个隔室，该隔室称为废物贮存室(25)，并且该废物贮存室通过孔径≤0.05μm的最终过滤器(34)与收集贮存室(9)分离。所有噬菌体都通过最终过滤器(34)去除，以便可以安全且低成本地处理剩余的滤液。在该实施方式中，噬菌体(2、6)的标记也由至少一种具有荧光性质的报告分子组成。因此，除了反应容器(7)插入的轴之外，测量装置(15)还包括两个检测光学器件(16)，每个检测光学器件布置在插入的反应容器(7)的测量窗(11、12)的区域中。在本实施方式中，这意味着一个检测光学器件(16)布置在用于检测细菌-噬菌体-复合物(5)的过滤器(4)的过滤器表面处的测量区域中，而第二个检测光学器件(16)布置在用于检测未结合的噬菌体(2、6)的端部过滤器(34)的过滤表面处的测量区域中。每个检测光学器件(16)都包含作为照明单元的LED(19)，根据所使用的荧光报告分子的吸收特性，LED发射波长范围为200-1000nm、优选350-700nm的光。如果可能，应该达到最大吸收，以便产生同样强烈的荧光信号。此外，每个检测光学器件(16)都包含用于将由LED发射的光聚焦到上述测量区域上的透镜系统(20)以及用于将由荧光报告分子发射的光聚焦到至少一个传感器(18)(例如，作为光学传感器的光电倍增器、CCD传感器或CMOS传感器)上的另一透镜系统(17)。替换地或另外地，可以应用分光光度计(18)作为用于记录发射光谱的传感器。此处，分光光度计不是严格意义上的光学传感器。两个检测光学器件(16)的传感器(18)各自检测入射光并将接收到的检测信号转发到与其连接的处理器。处理器最后处理接收到的检测信号并将检测结果转发到连接到处理器的显示器，该显示器将检测结果光学地输出给用户(未示出)。此外，一个或两个检测光学器件(16)可以包含用于几个颜色通道的光谱分离的分束器(35)。
在图6中，作为用于识别根据本发明的反应容器的工具的一个实施方式，示出了RFID芯片。RFID芯片包含关于序列号、生产日期、有效期、悬浮液中的噬菌体滴度和/或待检测的细菌种类或菌株的数据。RFID芯片能够简单并且明确地识别反应容器，这将反应容器混淆的风险降至最低，因此提高了用这种反应容器实施的检测程序的可靠性。
实验部分
1.噬菌体的分离
由于噬菌体不具有其自身的代谢，它们只能在合适的宿主细菌上进行培养和增殖。宿主细菌需要一种可以最佳生长的培养基。细菌的生长越好，噬菌体的产量就越高。在第一步中，粉状培养基溶于水中并在高压釜中灭菌。然后将无菌培养基直接从高压釜泵入发酵罐中并预热至宿主细菌生长的最佳温度(例如30℃)。一旦培养基达到操作温度，就将宿主细菌从细菌预培养物添加到发酵罐中。这些细菌开始分裂。经过短暂的适应期后，宿主细菌指数增长，即具有对细菌类型特异的最高可能生长速率。
通过在光度计中测量600nm波长(OD600)处的光密度来监测细菌细胞的生长。当达到预实验优化的细胞密度时，例如，每毫升培养基5×108个细菌，将噬菌体从噬菌体预培养物加入到发酵罐中。使用经典滴定法预先确定预培养物中噬菌体的浓度，该经典滴定法是生物活性检测方法(参见例如Martha R.J.Clokie,Andrew M.Kropinski(eds.),Bacteriophages:Methods and Protocols,第1册:Isolation,Characterization,andInteractions,第501卷,C 2009Humana Press,Springer Science+Business Media的一部分)。调整浓度以便理想地使发酵罐中的每个细菌都被至少一种噬菌体识别和感染。在成功感染之后，宿主细菌产生新的噬菌体而不是如前所述新的细菌。噬菌体的增殖需要约一个小时。在此期间，每个细菌细胞产生大约100个新的噬菌体。
在该过程结束时，细菌溶解并将新的噬菌体释放到培养基中。在发酵罐中产生的溶液是高度粘性的，因为它不仅含有新的噬菌体，而且还含有裂解的细菌细胞的全部组分(细胞壁的片段、脂质、核糖体、细菌遗传物质等)以及培养基的原始成分(糖、盐和蛋白质)。出于这个原因，在可用于标记反应之前，必须使用多级过滤工艺对噬菌体首先进行纯化。纯化后，进行无菌过滤，例如，使用Sartorius Stedim Biotech公司生产的0.2μm
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过滤盒，并将其填充到储存容器(小桶)中。
在这种形式下，噬菌体是稳定的，可以容易地运输和储存数月而不会失去活性。
2.用报告分子标记噬菌体
为了避免在与报告分子偶联过程中的副反应和差的偶联效率，纯化噬菌体并在用活化的报告分子标记之前调节缓冲液。在分离蛋白质期间，在许多情况下必须进行缓冲液交换，例如，如果连续使用不同缓冲液的几种色谱方法。
纯化用于标记实验的噬菌体，并且如果需要，使用以下标准方法浓缩：
·超滤，截留分子量(MWCO)应为>100kDa
·聚乙二醇/氯化钠沉淀
·尺寸排阻色谱法(凝胶过滤)
·离子交换色谱法
·透析
通过用聚乙二醇和氯化钠沉淀和随后的离心从噬菌体溶液中分离小的过量分子(如盐、染料或生物素)(Jaye,D.L.,Edens,H.A.,Mazzucchelli,L.,Parkos,C.A.,2001.Novel G protein-coupled responses in leukocytes elicited by achemotactic bacteriophage displaying a cell type-selective bindingpeptide.J.Immunol.166,7250)。
偶联反应培养后，用聚乙二醇8000(PEG 8000)和NaCl溶液将噬菌体缀合物沉淀至少两次。这使缀合物溶液中游离报告分子的量最小化。最后，将缀合物小球重悬在合适的缓冲液中。也可使用基于具有MWCO>25kDa的葡聚糖的尺寸排阻材料的凝胶过滤柱。基于离子交换层析的纯化还允许缀合物从小分子中快速分离，其中最合适的梯度以及离子交换材料的类型和强度取决于所应用的标记分子和特定噬菌体的性质。事先优化参数是必要的。
实施例1：
将1×1011pfu事先纯化和浓缩的TB54噬菌体(见上文)重悬于含有0.1M NaHCO3的10ml PBS(pH 8.5)中。随后，每1×1010pfu加入100nmol 5(6)-羧基荧光素NHS酯。偶联反应在室温下在黑暗中进行1小时。如图7中示意性示出的，5(6)-羧基荧光素的NHS酯(2)与TB54噬菌体(1)表面上的蛋白质的伯氨基反应，形成稳定的酰胺键。
如上所述通过沉淀或通过色谱方法来纯化缀合物。随后，通过紫外/可见光和荧光光谱对该缀合物进行光物理表征。
在图8中，说明了5(6)-羧基荧光素标记的TB54噬菌体的激发光谱和发射光谱。光谱分别示出了波长495nm处和在520-530nm的范围内的5(6)-羧基荧光素的激发最大值和发射最大值。这些波长在下文中也用于细菌-噬菌体相互作用的荧光显微镜研究。
实施例2：
制备在0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.0)中的异硫氰酸荧光素(FTIC)溶液。将适当的等分试样加入到实施例1中制备的噬菌体溶液中并小心混合。将噬菌体悬浮液在室温下黑暗培养1小时。缀合物的纯化和表征如实施例1中所述进行。
3.细菌-噬菌体相互作用的特异性
为了证明标记种类的测试噬菌体的极大宿主特异性，在准备步骤中，在10ml TSB(胰酶大豆肉汤)(Sigma-Aldrich)中在37℃的标准条件下制备菌株C600(PTC PhageTechnology Center GmbH)、ECOR34(PTC Phage Technology Center GmbH)和XL10-Gold(Agilent)的大肠杆菌细菌的过夜培养物。第二天将过夜培养物稀释(在TSB中1:10)，并在37℃再培养2小时。然后将以这种方式获得的细菌悬液等比例混合(1:1:1)。为了进行噬菌体-宿主相互作用的荧光显微镜检测，将10μl大肠杆菌细菌的混合细菌培养物(C600，ECOR34，XL10-Gold)加入到990μl 5(6)-羧基荧光素标记的TB54噬菌体的PBS(pH 7.4)悬浮液(细菌滴度：～1×106个细胞/ml；噬菌体滴度：～1×108pfu/ml)中，并在室温(RT)下培养5分钟。从反应混合物中，将20μl转移到显微镜载玻片上并通过荧光显微镜(Eclipse Ti，100×物镜，Nikon)检查。
图9A示出了大肠杆菌细菌菌株C600、ECOR34和XL10-Gold与5(6)-羧基荧光素标记的TB54噬菌体培养后获得的荧光显微图像。左下角的图像部分示出了由白色框定义的图像区域的放大表示。
在图9B中，说明了大肠杆菌细菌菌株C600、ECOR34和XL10-Gold与5(6)-羧基荧光素标记的TB54噬菌体培养后的相应明场图像。左下角的图像部分示出了由白色框定义的图像区域的放大表示。白色箭头表示未标记的细菌，其形态不同于感染了标记的TB54噬菌体的大肠杆菌C600细菌细胞。这些未标记的细菌可以归属于菌株ECOR34或XL10-Gold(尺寸标记：10μm)。
测试结果证明用5(6)-羧基荧光素标记的TB54噬菌体具有极大的特异性。它们仅与大肠杆菌C600菌株结合，而不感染ECOR34和XL10-Gold菌株。因此，由于复合物的形成，仅大肠杆菌C600菌株的细菌在反应混合物中显示荧光信号。因此，由于噬菌体的极大的宿主特异性，本发明的方法提供了细菌种类清楚和可靠的检测。甚至可以检测一个细菌种类内的个体菌株。
图10A还示出了该实验中获得的大肠杆菌C600-TB54噬菌体复合物的光学横截面。以0.3μm的距离制备光学切面(尺寸标记2μm)。在上面一行中，复合物以透射光示出，而下面一行在荧光显微镜视野下示出相同的复合物。
点状荧光信号的分布表明荧光报告分子(5(6)-羧基荧光素)在细菌表面的定位。
图10B示出了在不同视角下接收的大肠杆菌C600-TB54噬菌体复合物的三维重构，这证实了荧光报告分子的表面定位。
4.程序的灵敏度
为了确定用于细菌检测的方法的灵敏度，通过使用PBS(pH 7.4)连续稀释5(6)-羧基荧光素标记的TB54噬菌体的初始悬浮液(PBS(pH 7.4)，噬菌体滴度：～1×108pfu/ml)来制备系列稀释。在具有～1×107pfu/ml、～1×106pfu/ml、～1×105pfu/ml、～1×104pfu/ml和～1×103pfu/ml的各个稀释阶段中，将各1ml转移到测量比色皿中并通过荧光光谱(Qwave紧凑型USB光谱仪，RGB激光系统)检查。作为参考，使用1ml不含标记的TB54噬菌体的PBS缓冲液。
获得的荧光光谱在图11A中示出。对于所有稀释阶段，在520nm和530nm之间的波长范围内发射的明显的最大值是可检测的，这对应于5(6)-羧基荧光素的发射最大值。因此，图11B示出了对于不同噬菌体滴度在520-530nm波长范围内的荧光积分。因此，对于仅～1×103pfu的噬菌体的量所获得的荧光积分仍可以与参照清楚地区分，即从仅～1×103个噬菌体开始的特异性检测成为可能。
每个感染的细菌具有平均～1×102个结合的噬菌体的量，这意味着本发明的方法可以提供从仅～10个细菌细胞/ml的细菌浓度开始的特异性检测。因此，本发明的方法不仅高度特异，而且高度灵敏。
5.细菌种类或细菌种类的菌株的特异性检测
在下文中，使用本发明的方法描述在不同细菌浓度下对细菌菌株大肠杆菌C600的特异性检测。
为此，首先在10ml TSB(胰酶大豆肉汤)(Sigma-Aldrich)中在标准条件下于37℃下制备细菌菌株大肠杆菌C600(PTC Phage Technology Center GmbH)的过夜培养物。第二天将过夜培养物稀释(在TSB中1:10)并在37℃下再培养2小时。然后通过用TSB连续稀释从所得培养物制备系列稀释。为了确定连续稀释的细菌悬浮液中的细菌浓度，在600nm处测量光密度(OD600)。图12A示出了不同稀释阶段的细菌滴度的数据。
通过将900μl 5(6)-羧基荧光素标记的TB54噬菌体和Alexa532标记的TB99噬菌体的悬浮液(在与10mM MgCl2混合的PBS中～108pfu/ml)与100μl TSB培养基混合并在室温(RT)培养5-10分钟，来确定添加待测试样品之前噬菌体悬浮液中的初始荧光强度。Alexa532标记的TB99噬菌体作为具有分离标记的参考噬菌体。随后使用酶标仪(PerkinElmer)测量测试噬菌体(5(6)-羧基荧光素-TB54)和参考噬菌体(Alexa532-TB99)的荧光信号。获得的数据被定义为在添加待测样品之前噬菌体悬浮液的初始强度或100％信号强度，初始强度在图12B的图中以虚线示出。
此外，将900μl上述悬浮液分别与100μl相应的连续稀释的大肠杆菌C600细菌悬浮液(在TSB中～104-107个细胞/ml)混合，并在室温(RT)下培养反应混合物5-10分钟。然后将反应混合物分别通过孔径为0.4μm的过滤器(微孔膜，milipore)过滤。
所得滤液中的荧光分别用酶标仪(Perkin Elmer)测量。图12B示出了滤液中未结合的5(6)-羧基荧光素标记的TB54噬菌体(显示为正方形)和Alexa532标记的TB99噬菌体(显示为三角形)的荧光强度。所指示的荧光强度各自通过归一化至初始强度的确定值而获得，即所测量的荧光强度均与初始强度有关。可以看出，测试噬菌体(示出为正方形的5(6)-羧基荧光素-TB54)的荧光强度显著降低。这证明测试噬菌体特异性感染细菌菌株大肠杆菌C600并形成相应的细菌-噬菌体-复合物，该细菌-噬菌体-复合物通过过滤除去。结果，滤液中未结合的测试噬菌体的数量低于初始噬菌体悬浮液中的数量，这反映在滤液中荧光强度的降低上。
在图12C中示出了渗余物中的荧光强度。所显示的数据是各个通过用标准物镜(20×，Nikon)对过滤器表面进行影印并且从每个过滤器表面的三个图像计算平均图像强度(平均值±标准差，N＝3)荧光显微确定的。数据显示测试噬菌体(5(6)-羧基荧光素-TB54)的荧光强度随着所添加样品中细菌浓度的增加而增加，而参考噬菌体(Alexa532-TB99)的荧光强度几乎没有变化。因此可以得出结论：测试噬菌体与待检测细菌特异性结合，并且通过过滤最终固定在过滤器表面上的形成的细菌-噬菌体-复合物的浓度随着细菌浓度的增加而增加。相反，参考噬菌体不结合待检测的细菌种类或菌株，从而细菌的浓度对渗余物中参考噬菌体测量的荧光强度没有影响。
如所证明的，本发明的方法允许对细菌进行高度特异性并且高度灵敏的检测。该方法易于实施并且提供非常可靠的结果。此外，该程序所需的时间短，因此自添加样本起不到一小时内即可进行检测。

Claims (19)

1.一种用于细菌检测的方法，包括以下步骤：
A)提供一种或多种悬浮液，每种所述悬浮液包含至少一个种类的标记的测试噬菌体，所述标记的测试噬菌体特异性结合待检测的细菌种类；
B)将待测试是否存在至少一种待检测的细菌种类的样品添加到所述一种或多种悬浮液中；
C)过滤所得反应混合物，其中使用孔径为0.1μm至0.5μm的过滤器；
D)检测渗余物中的细菌-噬菌体-复合物，条件是存在至少一种待检测的细菌种类，其中所述复合物由所述至少一种待检测的细菌种类的细菌和结合至其的所述至少一个种类的测试噬菌体的测试噬菌体组成；
E)检测滤液中未结合的测试噬菌体；
F)处理器辅助处理所接收的由步骤D)和E)中的检测产生的信号，并且将检测结果输出给用户，
其中，所述一种或多种悬浮液还包含标记的参考噬菌体，所述标记的参考噬菌体不结合任何待检测的细菌种类并且具有与所述测试噬菌体分离的标记，使得也能够在步骤E)中检测标记的参考噬菌体；或者其中使用标记的微米或纳米颗粒替代标记的参考噬菌体，所述标记的微米或纳米颗粒不结合任何待检测的细菌种类，并且由于其尺寸小而能够通过所述过滤器。
2.根据权利要求1所述的用于细菌检测的方法，其中，所述待检测的细菌种类选自包含下列组成的组：金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、赫氏埃希菌、EHEC、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌、屎肠球菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌、B-链球菌(无乳链球菌)、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、解脲支原体、人型支原体、肺炎支原体、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、弗氏柠檬酸杆菌、卡他莫拉菌、嗜麦芽寡食单胞菌、多杀巴斯德菌、鲍氏不动杆菌、雷氏普罗威登斯菌、百日咳杆菌，炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌、流产布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、披衣菌、白喉棒状杆菌、土拉弗朗西斯菌、阴道加德纳菌、单核细胞增多性李斯特菌、摩氏摩根菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、星状诺卡菌、邦戈沙门菌、肠道沙门菌，志贺氏菌属、霍乱弧菌、伯氏疏螺旋体、鼠疫耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、贝纳特考克斯体、气单胞菌属，邻单胞菌属、嗜麦芽黄单胞菌、梅毒螺旋体、侵蚀艾肯菌、小螺菌、普氏立克次体、立氏立克次体、康氏立克次体、克罗诺杆菌属、弯曲杆菌属和嗜肺军团菌。
3.根据权利要求1所述的用于细菌检测的方法，其中，每种所述一种或多种悬浮液包含两个或更多个种类的标记的测试噬菌体，每种所述标记的测试噬菌体特异性结合不同的待检测的细菌种类，并且其中所述种类的标记是分离的或部分重叠的，并且其中所述标记是测试噬菌体的各个种类的特征。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于细菌检测的方法，其中，所述标记包含至少一种具有荧光或化学发光性质的报告分子或者至少一种通过与二级分子相互作用而发光的报告分子。
5.根据权利要求4所述的用于细菌检测的方法，其中，所述标记分别由至少一种荧光报告分子组成，并且所述检测通过测量所述荧光进行，其中在200-1000nm的波长范围内进行至少一种荧光报告分子的激发。
6.根据权利要求4所述的用于细菌检测的方法，其中，所述至少一种报告分子与所述噬菌体的衣壳区域中的蛋白偶联。
7.根据权利要求4所述的用于细菌检测的方法，其中，通过光发射的时间分辨测量来进行所述检测。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的用于细菌检测的方法，还包括将所述样品与所述一种或多种悬浮液混合并培养所得反应混合物的步骤G)，其中步骤G)接着步骤B)。
9.根据权利要求8所述的用于细菌检测的方法，还包括对细菌-噬菌体-复合物与未结合的噬菌体进行预分离的步骤，其中所述预分离接着步骤B)或G)。
10.一种用于细菌检测的反应容器，包括：
通过过滤器彼此分开的至少两个隔室，
其中所述过滤器具有0.1μm至0.5μm的孔径，
其中，一个隔室是含有悬浮液的噬菌体贮存室，所述悬浮液包含特异性结合待检测细菌种类的至少一个种类的标记的测试噬菌体，并且
一个隔室是用于在向所述悬浮液中加入样品并通过所述过滤器过滤后接收滤液的收集贮存室；
用于识别所述反应容器的工具；和
至少两个测量窗，
其中，一个测量窗布置在面向所述噬菌体贮存室的过滤器表面的区域中，
一个测量窗布置在所述收集贮存室的区域中，
其中，所述悬浮液还包含标记的参考噬菌体，所述标记的参考噬菌体不结合任何待检测的细菌种类并且所述标记的参考噬菌体具有与所述测试噬菌体分离的标记；或者其中所述反应容器包含另一个隔室，所述另一个隔室含有具有标记的微米或纳米颗粒的指示剂溶液，所述标记的微米或纳米颗粒不结合任何待检测的细菌种类，并且由于其尺寸小而能够通过所述过滤器。
11.根据权利要求10所述的反应容器，其中，所述悬浮液包含两个或更多个种类的标记的测试噬菌体，每种所述标记的测试噬菌体特异性结合不同的待检测的细菌种类，并且其中所述种类的标记是分离的或部分重叠的，并且其中所述标记是测试噬菌体的各个种类的特征。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的反应容器，还包括在所述噬菌体贮存室和所述过滤器之间的隔室，所述隔室包含至少一个预过滤器。
13.一种盒，包括
两个或更多个根据权利要求10-12中任一项所述的反应容器，所述反应容器彼此平行和/或串联布置，
其中每个平行反应容器含有在所述噬菌体贮存室的所述悬浮液中的不同种类的标记的测试噬菌体，每种所述标记的测试噬菌体特异性结合不同的待检测的细菌种类。
14.根据权利要求13所述的盒，其中所述不同种类的标记的测试噬菌体的标记是分离的或部分重叠的。
15.一种用于细菌检测的测量装置，包括：
一个槽，其中插入根据权利要求10-12中任一项所述的反应容器或者根据权利要求13或14所述的盒；
至少两个检测光学器件，每个所述检测光学器件布置在所述插入的反应容器或盒的测量窗的区域中，
其中每个所述检测光学器件包括用于将由所述噬菌体的标记发射的光聚焦到至少一个传感器上的透镜系统，所述至少一个传感器检测所述发射的光；
处理器，其分别连接到所述检测光学器件的所述至少一个传感器，并且处理接收到的检测信号；和
连接到所述处理器的输出单元，所述输出单元将检测结果输出给用户。
16.根据权利要求15所述的测量装置，其中，每个所述检测光学器件还包括照明单元，所述照明单元发射在200-1000nm波长范围的光，以及用于将由所述照明单元发射的光聚焦到测量区域的透镜系统，其中所述照明单元也连接到所述处理器并由所述处理器控制。
17.根据权利要求15所述的测量装置，还包括集成的读取器，所述集成的读取器检测用于识别所述反应容器的工具并将检测到的数据转发给所述处理器，因此所述处理器处理所述检测到的数据并经由所述输出单元向用户输出鉴定的结果。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的测量装置，其中，所述至少一个传感器包括一个或多个光学传感器和/或一个或多个分光光度计。
19.根据权利要求18所述的测量装置，其中，所述至少一个传感器配备有发射过滤器。
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