ES2656117T3 - Método y aparato para la detección de microorganismos - Google Patents

Abstract

Un método para la identificación y detección de microorganismos en una muestra, caracterizado por que comprende: - llevar a cabo al menos una reacción de inmunoensayo en una muestra previamente recogida, para aislar y separar al menos un analito diana seleccionado que es un microorganismo susceptible de estar contenido en esta, incubando la muestra con uno o más reactivos que son anticuerpos, siendo cada uno específico para un microorganismo diana, conjugado con una partícula magnética, de tal modo que el microorganismo diana se acopla al anticuerpo magnético específico durante la incubación y posteriormente se separa del resto de la muestra por medio de magnetismo; - llevar a cabo una segunda reacción de inmunoensayo en la muestra sometida previamente a la primera reacción de inmunoensayo, para marcar el microorganismo acoplado previamente al anticuerpo específico conjugado con la partícula magnética antes de la cuantificación del mismo, incubando la muestra con al menos un segundo reactivo, que es un anticuerpo específico para el microorganismo diana y conjugado con un marcador fluorescente; y - detectar y cuantificar la cantidad del microorganismo separado acoplado previamente a los anticuerpos iluminando al mismo y midiendo la fluorescencia emitida.

Description

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DESCRIPCION

Método y aparato para la detección de microorganismos Campo técnico de la invención

La presente invención se encuadra en el campo de la salud, especialmente la salud en la industria alimentaria, en lo referente a la detección, control y eliminación de patógenos y contaminantes biológicos en ambientes de procesamiento y almacenamiento de alimentos, en concreto, en superficies tales como superficies duras. No obstante, la invención también se encuadra en otros muchos campos en los que la detección de microorganismos indeseados en superficies sea útil, por ejemplo el farmacéutico, hospitalario o de control ambiental, entre otros.

Antecedentes de la invención

Importancia del control de patógenos en las industrias alimentarias

En los últimos años, una serie de incidentes negativos en relación a la seguridad alimentaria han aumentado la concienciación de los consumidores acerca de los productos alimentarios y su producción. Aparte de aumentar las preocupaciones acerca de la seguridad alimentaria, a menudo impulsadas por los informes de los medios de comunicación, los cambios legislativos crearon una oportunidad para los laboratorios de control de calidad y fabricantes de equipos de ensayos analíticos para proporcionar seguridad a lo largo de toda la cadena de suministro alimentario, desde la granja hasta el mostrador del vendedor. El control de la seguridad alimentaria es una actividad económica importante con un volumen de 1.667.059.500 € y una tasa de crecimiento del 12%. La detección e identificación de patógenos transmitidos por los alimentos sigue basándose en técnicas de cultivo convencionales. Estas son muy elaboradas, caras y consumen tiempo. Los laboratorios de control de calidad alimentaria existentes usan técnicas convencionales, proporcionando un abanico limitado de análisis. Por este motivo son incapaces de cubrir las necesidades del mercado doméstico, por lo que la relación oferta-demanda es extremadamente baja. En consecuencia, hay una principal necesidad por métodos simples, rápidos, específicos, sensibles y económicamente viables.

La Comisión del Codex Alimentarius (CCA) definió la higiene alimentaria como "todas las condiciones y medidas necesarias para asegurar la inocuidad y la idoneidad de los alimentos en todas las etapas de la cadena alimentaria". Además, la Directiva General Europea sobre Higiene Alimentaria definió la higiene alimentaria como "todas las medidas necesarias para asegurar la seguridad y salubridad de los productos alimentarios".

El enfoque preventivo al problema incluye examinar cada etapa del proceso donde puede suceder la contaminación para asegurar que el producto final es seguro. En esta línea, el análisis de los ambientes de producción y procesamiento es una de las formas más eficaces para identificar y prevenir la presencia de microorganismos patógenos en los productos alimenticios, en concreto, de microorganismos patógenos tales como Salmonella, Campylobacter, Escherichia coli o Listeria monocytogenes. Esto es todavía más importante si tenemos en mente su capacidad para unirse a las superficies y formar biopelículas.

Técnicas actuales

Los métodos convencionales de análisis microbiológico se usan a pesar del tiempo de renovación debido a su gran selectividad y sensibilidad. Los métodos rápidos, en concreto biosensores, tienen el potencial de acortar el intervalo de tiempo entre la toma de la muestra y los resultados, pero su futuro depende de que alcancen una selectividad y sensibilidad comparable con los métodos establecidos a una fracción de su coste. Aunque no son tan críticos, también tienen que tenerse en consideración asuntos como la facilidad de uso, el bajo mantenimiento y la operación continua.

Los métodos establecidos, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), métodos de cultivo y de recuento de colonias así como métodos basados en inmunología son las herramientas más comunes para la detección de patógenos. Éstos implican el análisis de ADN, el recuento de bacterias y las interacciones antígeno- anticuerpo, respectivamente. A pesar de las desventajas tales como el tiempo necesario para el análisis o la complejidad de su uso, todavía representan un campo donde es posible progresar. Estos métodos, a menudo, se combinan para proporcionar resultados más sólidos. Los desarrollos recientes en el campo incluyen combinaciones de PCR con espectrometría de masas (EM), medidas de impedancia/conductividad, microcalorimetría, citometría de flujo, pruebas de nucleasa/lisado, medida de adenosín trifosfato (ATP), luminiscencia/fluorescencia, pruebas de biología molecular e inmunoensayos.

En general, los métodos rápidos aspiran a reemplazar (o, al menos, complementar) a los ensayos convencionales como los ensayos ELISA y los cultivos celulares. En el último caso, la identificación de una población de bacterias requiere varias semanas, que pueden reducirse a únicamente 5-48 horas usando un apropiado sistema de bioensayo avanzado. Sin embargo, el tiempo de ensayo se correlaciona de manera inversa con el tamaño de la población que se esté investigando, con una capacidad media de detección de 102-104 células/ml en un intervalo de

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tiempo de 5-7 horas.

Los métodos tradicionales actualmente suponen aproximadamente el 65 % de los ensayos realizados en todo el mundo en el año 2005 en el mercado de la microbiología alimentaria. Los métodos rápidos suponen el 35 % restante, o aproximadamente 220 millones de ensayos. Se espera, sin embargo, que para 2010 los métodos tradicionales representen únicamente el 52 % de todos los ensayos, con una tasa de crecimiento total del 11 %, mientras que el reparto de mercado de los métodos rápidos crecerá tres veces más rápido, alcanzando 394,6 millones de ensayos en 2010.

A pesar de la eficacia de los métodos anteriores, su aplicación requiere generalmente de personal bien entrenado y elevadas inversiones de capital para comprar equipamiento científico avanzado. Hasta ahora, se han aplicado en su mayoría con fines únicamente de investigación, proporcionando datos útiles para la comunidad científica y con fines de vigilancia. Durante varios años, han estado comercialmente disponibles una serie de instrumentos para la detección de patógenos alimentarios como Listeria monocytogenes, tales como:

• Un sistema de inmunocaptura de flujo continuo llamado Pathatrix® (MatrixMicroScience Ltd., Cambridgeshire, Reino Unido)

• Se ha usado para la detección un sistema de captura inmunomagnética automatizado llamado BeadRetriever (Dynal Biotech Ltd., Reino Unido).

En la Tabla 1 se proporciona un resumen de las tecnologías de biosensor más prominentes ya aplicadas de manera comercial en la seguridad microbiológica alimentaria en los Estados Unidos. Es evidente que los inmunosensores son el método de elección, aunque esto puede cambiar a medida que las tecnologías alternativas (por ejemplo, sensores basados en impedancia) se conviertan en los favoritos de muchos investigadores y compañías por todo el mundo.

Tabla 1. Patentes y solicitudes de patente relacionadas con tecnologías de biosensor para la detección de __________________ patógenos (L. Monocytogenes) en los Estados Unidos_____________________

Número de patente

Título

5089386

Prueba para Listeria

Fragmento de ácido nucleico capaz de hibridar con ARNr de Listeria monocytogenes y no con ARNr de Bacillus subtilis.

20070259393

Medios de siembra para la identificación presuntiva de Listeria sp, Listeria monocytogenes y Listeria ivanovii

5389513

Método para detectar Listeria monocytogenes

Se desvela una sonda de ADN que es capaz de hibridar con una porción del genoma del patógeno Listeria monocytogenes pero que no hibrida con porciones de los genomas de otra Listeria.

5139933

Método de ensayo para detectar Listeria

Se proporciona un método de ensayo para detectar rápidamente la presencia de cepas de Listeria en muestras, caracterizado por el uso de anticuerpos para capturar selectivamente el peptidoglicano y ácido teicoico.

20070254320

Método y kit para detectar Listeria Spp.

La presente invención se dirige a un método y un kit para detectar Listeria spp. en muestras de alimentos, muestras biológicas (por ejemplo, sangre, saliva, muestras de tejido, muestras de células, etc.).

20060286559

Ácidos nucleicos para la detección de Listeria

5922538

Marcadores genéticos y métodos para la detección de Listeria monocytogenes y Listeria spp

20090203028

Los aptámeros se unen a proteínas de superficie de Listeria.

5376528

Sondas y métodos para la detección de Listeria

7645582

Aptámeros que se unen a proteínas de superficie de Listeria.

20040072279

Medio de cultivo para detectar bacterias del género Listeria

7351548

Medio de cultivo para detectar bacterias del género Listeria

7439022

Ácidos nucleicos para la detección de Listeria

5932415

Procesos y agentes para detectar Listerias

5294537

Ensayo de anticuerpos monoclonales para Listeria monocytogenes

6951925

Procesos y agentes para detectar Listerias

5134063

Métodos para la detección, identificación y especificación de Listerias

5824468

Detección de Listeria mediante bacteriófagos recombinantes

5550022

Método para la determinación de bacterias Listeria patogénicas

Ácidos nucleicos que hibridan preferentemente en las condiciones 5-6* SSC y 42° C a 60° C. con un fragmento grande Kpnl-BamHI de 2,5 kb de pLM63, preferentemente con un ácido nucleico.

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Número de patente

Título

2013011862

Proceso rápido para la detección de microorganismos con partículas magnéticas

Partículas inmunomagnéticas en suspensión así como una molécula de agente bloqueante para formar complejos de microorganismo-partículas magnéticas. Para desarrollar la señal, se lleva a cabo una reacción entre los complejos y los sustratos usando una enzima que actúa como marcador.

2009232852

Uso de proteína a de membrana externa (ompA, del inglés outer membrane protein a) en el tratamiento/prevención/diagnóstico de infecciones provocadas por Klebsiella pneumoniae y otras bacterias gram negativas

Limitaciones y dificultades

El análisis de ambientes presenta algunas restricciones resultantes de las limitaciones que vienen de los métodos de muestreo y métodos de ensayo asociados. Algunos métodos muestreo usados de manera común hoy en día en las industrias alimentarias son esponjas, hisopos, toallitas y placas de contacto de agar, entre otros. Sus principales limitaciones son sus bajas tasas de recuperación (menores del 10%, en algunos casos) y las restricciones en cuanto al tipo de superficies que pueden muestrearse (tamaño limitado y, en algunos casos, únicamente superficies planas). Con respecto a los métodos actuales de detección para el control rutinario de contaminación en plantas de producción, estos comprenden técnicas basadas en cultivos, moléculas e inmunoensayos, entre otros. Las principales limitaciones de estas técnicas son el resultado de la necesidad de enriquecer la muestra (debido a que los límites de detección no son lo suficientemente bajos) y de equipamiento y personal especializado (lo que generalmente implica externalizar los análisis).

Estas limitaciones, junto con el coste de los análisis y el tiempo para obtener los resultados, tienen una gran influencia en las compañías cuando se establecen la frecuencia de muestreo y los tiempos de envío. No obstante, se les permite usar métodos analíticos que no sean los de referencia, en particular métodos más rápidos, siempre que su uso pueda proporcionar resultados equivalentes.

Las dos últimas referencias de los Estados Unidos enumeradas anteriormente se pueden considerar la técnica previa más cercana. La solicitud de patente US2013011862 desvela un método para la determinación rápida y sensible de la presencia de microorganismos en un amplio rango de muestras por medio de partículas inmunomagnéticas en suspensión, así como una molécula de agente bloqueante. Una vez que se han obtenido los complejos de microorganismo-partículas magnéticas, se lleva a cabo una reacción entre dichos complejos y sustratos para desarrollar la señal, usando una enzima que actúa como un marcador. Al contrario de las enseñanzas de dicha divulgación, el presente método no necesita ningún agente bloqueante o ninguna enzima para producir una señal analítica y para ser selectiva, rápida y sólida; el dispositivo para llevar a cabo el método reivindicado también presenta características relevantes diferentes del sistema de D1, tales como el uso de uno o más imanes en el fondo de la cámara de reacción así como en el fondo de la cámara de detección.

La presente invención es también más rápida y más simple que el método del documento US2009232852, estando dicha divulgación basada en el uso de partículas magnéticas recubiertas con moléculas de anticuerpos específicos de OmpA. A pesar de las similitudes, es evidente que la naturaleza de las muestras analizadas en esta última es completamente diferente del presente caso (fluidos corporales frente a muestras del ambiente de producción y procesamiento de alimentos), no siendo evidente para cualquier experto en la materia cualquier parecido entre las divulgaciones.

El objetivo general de esta invención es aprovechar esta posibilidad y desarrollar nuevos procesos e instrumentos que permitan a los operadores del negocio alimentario, así como a otras industrias, mejorar el análisis y control de los ambientes de producción y la evaluación de los procesos de limpieza, con un enfoque particular sobre microorganismos de deterioro y patógenos tales como Listeria monocytogenes. De hecho, a diferencia de la técnica anterior más cercana citada, el presente método y dispositivo permite identificar y detectar de manera simultánea diferentes microorganismos presentes en una muestra.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un método y un dispositivo, tal como se desvela en las reivindicaciones 1 y 8, respectivamente, para la identificación y detección de microorganismos en una muestra, más específicamente patógenos, o en otras palabras, un microorganismo que es patógeno. El patógeno es cualquier microorganismo diana (elegido, seleccionado) que pueda afectar a la salud humana, y cuya identificación y cuantificación pueda ser de especial interés, por ejemplo debido a que deterioren productos tales como alimentos, agua, y cosméticos. El microorganismo (o microorganismos) diana puede seleccionarse del grupo que consiste en bacterias, hongos y levaduras. El método está diseñado para la detección de cualquier patógeno de interés, tal como Listeria monocytogenes, Salmonella, Campylobacter, Staphylococcus, o Aspergillus, entre otros. La muestra puede ser una muestra sólida, líquida o semisólida tomada de una superficie, o puede ser cualquier muestra tomada de alimentos, líquidos, cosméticos, agua o incluso del ambiente. En el caso más adecuado, la muestra está en forma líquida.

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También en el caso más adecuado, la muestra se toma y recupera a partir de una superficie dura, a pesar del hecho de que dicho método para la detección puede usarse para cualquier otro lugar en el que crezcan microorganismos.

El método esencial para la identificación y detección de microorganismos en una muestra comprende, tal como se define en la reivindicación 1:

- llevar a cabo al menos una reacción de inmunoensayo sobre una muestra previamente recogida, para aislar y separar al menos un analito diana seleccionado que es un microorganismo susceptible de estar contenido en ésta, incubando la muestra con uno o más reactivos que son anticuerpos, siendo cada uno específico para un microorganismo diana o especie bacteriana, conjugado con una partícula magnética de tal modo que el microorganismo diana se acopla a dicho anticuerpo magnético específico durante la etapa de incubación y a continuación se separe del resto de la muestra por medio de magnetismo;

- llevar a cabo una segunda reacción de inmunoensayo (consecutiva) sobre la muestra sometida previamente a la primera reacción de inmunoensayo, para marcar los microorganismos acoplados previamente al anticuerpo específico conjugado con la partícula magnética, antes de la cuantificación de la misma, incubando la muestra con al menos un segundo reactivo, que es un anticuerpo específico para el microorganismo o especie bacteriana diana y conjugado con un marcador fluorescente; y

- detectar y cuantificar la cantidad del microorganismo o microorganismos separados acoplados previamente a los anticuerpos iluminando los mismos y midiendo la fluorescencia emitida.

Entonces, después de las dos incubaciones del inmunoensayo, el(los) microorganismo(s) separado(s) y marcado(s) se ilumina(n), y se cuantifica la cantidad de dicho microorganismo midiendo la fluorescencia emitida.

De la descripción anterior obviamente se deriva que el método puede aplicarse para detectar ya sea un solo tipo de microorganismos o más de un tipo de microorganismos a la vez. De este modo, en una realización es posible usar más de un anticuerpo a la vez, cada uno de ellos para un microorganismo específico, para llevar a cabo la reacción de inmunoensayo, con el objetivo de aislar y separar los distintos microorganismos del resto de la muestra. Cada anticuerpo debe ser un anticuerpo específico para un microorganismo diana en particular. En el presente método, uno de los anticuerpos es preferentemente un anticuerpo específico para Listeria monocytogenes, y se denomina mAb2B3 (véase los ejemplos).

La presente invención también se refiere a un dispositivo, tal como se desvela en la reivindicación 8, para la identificación y detección de microorganismos en una muestra configurada para llevar a cabo los métodos definidos anteriormente, que tiene un sistema de detección que comprende:

- una unidad de reacción, que tiene

o una cámara de reacción en forma de depósito en el que la muestra tomada se introduce por una primera entrada y almacena, y donde tiene lugar la primera y la segunda reacción de inmunoensayo para separar y marcar el microorganismo diana añadiendo los anticuerpos específicos como reactivos por una segunda entrada, por medio de un autómata programado; y

o un imán (o más, preferentemente dos) situado en el fondo de la cámara de reacción para retener el microorganismo diana conjugado con el anticuerpo que comprende una partícula magnética mediante magnetismo durante la reacción de incubación; conectado a

- una unidad de detección, que tiene

o una cámara de detección a la que se transporta el microorganismo separado y marcado después de completarse las reacciones de inmunoensayo, para cuantificar la cantidad del mismo; y o un imán situado en el fondo de la cámara de detección para retener el microorganismo separado y marcado mediante magnetismo durante la etapa de cuantificación;

- una fuente de luz dirigida a la cámara de detección, y

- al menos un sensor (detector) para recoger y medir la fluorescencia emitida por los marcadores cuando se excitan en la cámara de detección.

Descripción detallada de la invención

En una realización preferida, la partícula magnética comprende un núcleo magnético y una capa reactiva que permite su suspensión en agua y su unión a anticuerpos. Preferentemente, la partícula magnética es una partícula magnética de óxido de hierro que está funcionalizada. Las partículas magnéticas tienen preferentemente un tamaño en escala nanométrica (teniendo preferentemente un tamaño menor o igual a 50 nm), que es una característica importante para permitir la reacción de un modo adecuado, y están recubiertas preferentemente por una capa que permite su conjugación con el anticuerpo, siendo más preferentemente una capa polimérica que contiene grupos reactivos (por ejemplo, grupos carboxílicos) que facilitan las uniones con otros compuestos (en este caso, el anticuerpo específico). El reactivo usado generalmente es el anticuerpo específico ya conjugado con la partícula

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magnética (aunque es posible añadir al método una etapa previa para conjugar el anticuerpo con la partícula magnética). Por ejemplo, la conjugación de un anticuerpo específico a la partícula nanomagnética preferentemente tiene lugar mediante reacción de un grupo carboxílico en el recubrimiento polimérico de la partícula nanomagnética con un grupo amino del anticuerpo. El conjugado anticuerpo-partícula magnética se puede añadir después al medio de reacción que contiene los microorganismos para permitir la unión de los anticuerpos a las células bacterianas.

En el caso más preferido, las partículas magnéticas unidas al anticuerpo específico son partículas que comprenden un núcleo de óxido de hierro con dimensiones a escala nanométrica, preferentemente de 2 a 50 nm de diámetro. El núcleo metálico está recubierto con un recubrimiento anfífilico que permite la suspensión de las partículas magnéticas en agua. Este recubrimiento normalmente consiste en una capa polimérica con grupos carboxílicos en su superficie externa y un espesor de 2 a 5 nm. Un ejemplo de este tipo de partículas magnéticas puede encontrarse en Yang et al.: “Ultrasensitive detection and molecular imaging with magnetic nanoparticles”, Analyst (2008), 133, 154-160. La conjugación de anticuerpos con estas partículas magnéticas se logra mediante una reacción de un grupo carboxílico del recubrimiento de la partícula y un grupo amino del anticuerpo.

En una realización particular, el segundo anticuerpo específico o anticuerpos son diferentes de aquellos usados en la primera reacción de inmunoensayo. En otra realización distinta, el segundo anticuerpo específico para un microorganismo diana es el mismo que el usado para la reacción de separación del inmunoensayo, de tal forma que dicho anticuerpo no está unido a una partícula magnética pero sí a un marcador; este es un caso más preferido para el presente método. Por lo tanto, en una realización más particular, el método de identificación y detección comprende:

- llevar a cabo una primera reacción de inmunoensayo en una muestra previamente recogida, para separar uno o más microorganismos diana incubando dicha muestra con al menos un anticuerpo específico conjugado con una partícula magnética;

- llevar a cabo una segunda reacción de inmunoensayo en la muestra, para marcar los microorganismos diana acoplados previamente a los primeros anticuerpos específicos incubando la muestra con los mismos anticuerpos específicos para los microorganismos diana, pero conjugados con un marcador fluorescente (y no con partículas magnéticas); y

- detectar y cuantificar la cantidad de microorganismos diana acoplados previamente a los anticuerpos iluminando a los mismos y midiendo la fluorescencia emitida.

Preferentemente, el anticuerpo está unido a biotina para facilitar su conjugación con el marcador fluorescente. Por ejemplo, puede someterse al anticuerpo a un proceso previo de biotinilación, que consiste en anclar el anticuerpo a la biotina.

Debe tenerse en cuenta que, de acuerdo con la descripción de la invención esencial, el segundo reactivo que es un anticuerpo específico ya está conjugado con el marcador fluorescente antes de que el microorganismo se acople a dicho anticuerpo. Sin embargo, dicha divulgación comprende dos posibilidades: En una realización particular, la segunda reacción de inmunoensayo se lleva a cabo añadiendo uno o más anticuerpos específicos ya conjugados con los marcadores fluorescentes. En otra realización particular, la segunda reacción de inmunoensayo se lleva a cabo añadiendo simultáneamente un reactivo que es el anticuerpo (o anticuerpos), y un reactivo que es el marcador o marcadores fluorescentes, de manera que durante la reacción de inmunoensayo el anticuerpo inicialmente se acopla al marcador fluorescente y después se acopla al microorganismo. En esta última realización, el anticuerpo se enlaza preferentemente a biotina.

Los marcadores fluorescentes son preferentemente puntos cuánticos (tales como Qdots®).

La detección se realiza preferentemente mediante la medición de la señal óptica emitida después de la excitación de la muestra, de tal forma que el microorganismo separado y marcado se ilumina después con luz de una longitud de onda específica para excitar a los marcadores fluorescentes empleados, y después se recoge y mide la fluorescencia emitida por un sensor. Básicamente, el método finalmente requiere calcular los valores de intensidad de fluorescencia y correlacionarlos con una concentración de microorganismos en la muestra.

Preferentemente, se lava la muestra después de cada reacción de inmunoensayo, de manera que el método comprende entonces las siguientes etapas:

- llevar a cabo una primera reacción de inmunoensayo en una muestra previamente recogida, para separar uno o más microorganismos diana incubando y acoplando dichos microorganismos al anticuerpo o anticuerpos específicos unidos a partículas magnéticas;

- retener dichos microorganismos acoplados a los anticuerpos magnéticos por medio de magnetismo, activando uno o más imanes;

- lavar la muestra para aislar y separar los microorganismos conjugados con anticuerpos;

- llevar a cabo una segunda reacción de inmunoensayo, para marcar los microorganismos acoplados a anticuerpos magnéticos mediante incubación y acoplamiento de los mismos a un segundo anticuerpo o anticuerpos específicos, que pueden ser preferentemente los mismos que los primeros anticuerpos, pero

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conjugados con un marcador fluorescente;

- retener dichos microorganismos marcados por medio de magnetismo, activando un imán;

- lavar la muestra para separar los microorganismos aislados conjugados con los anticuerpos; y

- detectar y cuantificar la cantidad de los microorganismos marcados iluminando a los mismos y midiendo la fluorescencia emitida.

Aunque el método descrito anteriormente puede aplicarse para una muestra tomada sin importar cómo y preferentemente presentada en forma líquida, dicho método puede también comprender una etapa previa de tomar al menos una muestra, para recuperar y recoger uno o más tipos de microorganismos contenidos en ésta. Por lo tanto, un método preferente completo comprende las siguientes etapas previas a la(s) reacción(es) de inmunoensayo:

a) tomar una o más muestras (para recuperar microorganismos);

b) separar/aislar mediante magnetismo uno o más microorganismos diana de especies concretas por medio de técnicas de inmunoensayo que incluyen acoplar los microorganismos a anticuerpos conjugados con partículas magnéticas;

c) marcar los microorganismos diana mediante técnicas de inmunoensayo que incluyen el acoplamiento de los microorganismos separados a anticuerpos conjugados con marcadores fluorescentes; y

d) detectar y cuantificar la cantidad de microorganismos separados/aislados.

Preferentemente, la muestra se toma y recupera inyectando aire a presión con agua en condiciones de vacío para expeler la muestra de su lugar de origen. Después, la muestra expelida se puede recoger en un líquido tal como una muestra líquida, antes de llevar a cabo las reacciones de inmunoensayo. La muestra se puede seleccionar y tomar de un único punto de muestreo, o se puede tomar de una zona de muestreo definida por más de un punto de muestreo.

Con respecto al dispositivo objeto de la invención descrita anteriormente, la fuente de luz para excitar al microorganismo marcado es preferentemente un LED de longitud de onda específica, seleccionándose dicha longitud de onda dependiendo del marcador fluorescente Preferentemente, el sensor se selecciona del grupo que consiste en un sensor CCD, un sensor fotomultiplicador de silicio, y ambos.

Por otra parte, el sensor comprende preferentemente al menos un filtro, que es atravesado por la luz emitida una vez que el microorganismo marcado se excita. El sensor también puede contener un segundo filtro, que es atravesado por la luz de excitación y que bloquea la luz de longitudes de onda distintas a la de excitación del marcador fluorescente. Dichos filtros son filtros ópticos y se seleccionan de acuerdo con las longitudes de onda de excitación y emisión. Los filtros se pueden localizar preferentemente en un cubo, y pueden ser por tanto los siguientes tres filtros: un filtro de excitación, un divisor de haz dicroico que refleja la luz de excitación y transmite la luz emitida desde la muestra, y un filtro de emisión que permite únicamente la longitud de onda hacia el detector.

Además, en el caso más preferente, el dispositivo puede acoplarse a un subsistema de muestreo conectado al subsistema de detección (pero que funciona de manera independiente), más específicamente a la entrada de la cámara de reacción, que actúa por medio de aire y agua a presión en condiciones de vacío y comprende:

- una punta de muestreo, que se une al sitio (por ejemplo una superficie dura) del que se toma la muestra, y contiene

- una cavidad principal que define el área de ensayo y en la que el aire y agua a presión se aplican para expeler y extraer la muestra, teniendo dicha cavidad

- una abertura de entrada para inyectar el aire y agua a presión dentro de la cavidad, y

- una abertura de salida para expeler y extraer la muestra tomada con el agua inyectada.

Cuando el dispositivo de identificación y detección comprende las dos partes desveladas, los subsistemas de muestreo y detección, entonces el agua que contiene la muestra expelida por el primero se transporta y recoge en la cámara de reacción del último. Preferentemente, la punta de muestreo se ensambla o acopla al sitio del que se toma la muestra mediante vacío. En este caso, las condiciones de vacío se logran mediante una segunda cavidad que rodea la superficie externa del área de ensayo definida por la cavidad principal, estando dicha segunda cavidad conectada a medios adicionales para crear el vacío en ésta.

La invención descrita consiste en un método y un aparato para llevar a cabo dicho método, el cual comprende dos etapas y subsistemas distintos, respectivamente: etapas/subsistemas de muestreo y detección. Ambos pueden operar de manera independiente o se integran preferentemente para operar de manera coordinada.

El subsistema de detección más preferido está comprendido en sí mismo de una unidad de reacción y una unidad de detector, de acuerdo con lo anterior, y se describe a continuación. La unidad de reacción contiene una cámara de reacción o depósito donde se recoge la muestra y tiene lugar la reacción de inmunoensayo. También contiene los circuitos para el transporte de fluidos desde el subsistema de muestreo y a la unidad de detección. La unidad de reacción aloja un contenedor para cada reactivo distinto usado en el inmunoensayo y circuitos para conectar estos

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contenedores con la cámara principal de reacción. La cámara de reacción presenta una abertura en su parte superior que permite la introducción de la muestra desde el subsistema de muestreo y los reactivos de los contenedores de reactivos. La cámara de reacción presenta una abertura regulada por válvulas en su parte inferior, conectada a la unidad de detección. El transporte de fluidos se regula por un sistema de válvulas y bombas peristálticas controladas por un autómata programable. Además, un imán se localiza en el fondo de la cámara de reacción. Dicho imán puede cambiar entre dos posiciones, una separada de la cámara de reacción y otra en contacto con las paredes de la cámara de reacción. El cambio del imán se realiza mediante inyección de aire a presión y puede controlarse desde el autómata.

La unidad de detección preferida se basa en el concepto de fluorescencia. La muestra a medir contiene puntos cuánticos fluorescentes como marcadores fluorescentes unidos a anticuerpos específicos de patógenos. La muestra se excita dentro de la cámara de detección a una longitud de onda específica usando la fuente de luz, y la fluorescencia emitida se captura a su vez usando el sensor/detector. Los filtros ópticos y divisores de haz se montan en un cubo y se colocan para filtrar el avance adicional y recoger solo la longitud de onda deseada, cuya intensidad se mide.

Preferentemente, la unidad de detección comprende una caja oscura de medida que se divide en dos compartimentos. Cada compartimento encierra una fuente de luz de excitación y un detector 1 y 2, respectivamente. Se alterna un cubo de filtro óptico entre ambos compartimentos. Ambos compartimentos son independientes entre sí y son capaces de funcionar como unidades de detección por separado. El uso de dos detectores es para proporcionar verificación y seguridad de los resultados adquiridos. La fuente de luz de excitación es preferentemente un LED de longitud de onda específica. La longitud de onda de la fuente se puede seleccionar basándose en el punto cuántico fluorescente usado en el inmunoensayo durante la preparación de la muestra. El cubo de filtro óptico contiene filtros ópticos que se pueden seleccionar de acuerdo con las longitudes de onda de excitación y emisión. Se alojan tres filtros distintos en el cubo: un filtro de excitación que filtra únicamente la longitud de onda de excitación entrante, un divisor de haz dicroico que refleja la luz de excitación y transmite la luz emitida desde la muestra, y finalmente un filtro de emisión que permite únicamente la longitud de onda de emisión hacia el detector.

De este modo, es posible detectar cualquier patógeno procedente de alimentos cambiando únicamente los filtros con respecto a las características de excitación y emisión de los marcadores fluorescentes (puntos cuánticos) usados en el inmunoensayo. El detector 1 es un módulo de detector SiPM : Los fotomultiplicadores de silicio están disponibles en una amplia gama sensible a distintas longitudes de onda y en distintos tamaños. El módulo de detector encierra un fotomultiplicador de silicio que es sensible a la longitud de onda de emisión con electrónica de apoyo. Se usa una lente para ajustar el foco. El usuario inicia la medida presionando un botón, tras lo cual la luz recogida de la muestra se analiza y se muestra en una pantalla LCD en forma de cuentas y un diagnóstico PASA o FALLA indicativo de la ausencia o presencia del patógeno en la muestra. El análisis detallado del registro de datos se puede hacer conectándolo a un ordenador. El detector 2 es una cámara CCD: El segundo compartimento de la unidad de detección tiene una cámara CCD con una lente para enfocar que se controla por un programa informático. El usuario puede introducir un tiempo de integración necesario para el cual el sensor recoge luz de la muestra y se muestra la imagen capturada en pantalla. La intensidad de la imagen es indicativa de la presencia o ausencia del patógeno de estudio.

El sistema de separación magnética, hecho de un termoplástico de ingeniería, está diseñado para ser una parte de un sistema de flujo PLC que transfiere la muestra recogida al subsistema de detección en un método semiautomatizado. El conjunto se coloca dentro de la unidad de detección con tubos de entrada y salida conectándolo al sistema de flujo. El objetivo del sistema de separación magnética es separar y concentrar únicamente el patógeno de estudio en el soporte de la muestra mientras que se lavan todos los puntos cuánticos no unidos. La separación se logra mediante el movimiento de un disco de imán acercándose y alejándose del soporte de la muestra. El imán se coloca en un brazo que está unido a un solenoide rotativo. También se encierra en el sistema de separación un pequeño PCB de control para dirigir el solenoide y alimentado por el módulo detector de SiPM. La pulsación del solenoide proporciona un movimiento de 45 grados del brazo con el imán atrapando así únicamente el patógeno unido a las partículas magnéticas para la medición. Mediante el uso de la combinación de inmunoensayo ideal, filtros ópticos y fotomultiplicador de silicio, la unidad de detección puede usarse para una detección rápida de cualquier microorganismo de interés.

Un subsistema de muestreo preferido que se puede acoplar al subsistema de la presente invención de acuerdo con la descripción anterior se muestra en la Figura 1 del presente documento (1.a). El subsistema de muestreo consiste específicamente en una punta de muestreo que aloja una cavidad cuya forma define el área de ensayo sobre una superficie. Un circuito conecta al menos una abertura de entrada al interior de la cavidad principal y está configurado para proyectar (inyectar para el presente dispositivo) al menos un fluido al área a ensayar, tal como agua y aire en el caso de la presente invención. Se conecta un segundo circuito a al menos una abertura de salida al interior de la cavidad principal y se configura para recuperar al menos una porción de al menos uno de los fluidos proyectados (expelidos) que contienen elementos retirados del área de ensayo. Para crear las condiciones de vacío al tomar la muestra, la carcasa incluye una cavidad adicional que tiene una abertura rodeando a la superficie exterior del área de tratamiento, comprendiendo el sistema de muestreo además una unidad adicional conectada a la cavidad y configurada para crear un vacío en la cavidad adicional. Gracias al vacío efectuado en la cavidad adicional, se

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puede mantener el dispositivo adherido contra la superficie sin la intervención de un operador externo. Además, el dispositivo puede usarse para eliminar contaminantes en una superficie con pendiente, incluso cuando el orificio de entrada de la cavidad principal se localiza por debajo de la superficie. El subsistema de muestreo comprende un primer circuito hidráulico para la circulación de un líquido conectado a al menos una entrada. Por tanto, al proyectar un líquido dentro de la cavidad principal, se pueden separar los contaminantes de la superficie de ensayo. Un segundo circuito se conecta a la salida de la cavidad principal, que deja circular una porción del fluido proyectado y lo recoge en un contenedor de recuperación. Un ejemplo de este tipo de configuración para el subsistema de muestreo se desvela en la solicitud de patente FR14/01251.

Debe tenerse en cuenta que en una realización preferida, el dispositivo descrito anteriormente puede comprender más de una unidad de reacción, permitiendo por tanto realizar más de una primera reacción de inmunoensayo a la vez, y por tanto analizando más de una muestra a la vez. En esta realización preferida, se pueden recoger varias muestras del subsistema de muestreo y se pueden procesar en compartimentos distintos que contienen cada uno de ellos una cámara de reacción, los imanes correspondientes y el circuito para la introducción de la muestra y los reactivos y una salida para la conducción de la muestra al sistema de detección. Las distintas muestras se pueden transferir a la unidad de detección de manera secuencial después de completar las reacciones de inmunoensayo en cada unidad de reacción. Después, la detección y cuantificación de los niveles de microorganismos se realiza del modo descrito anteriormente.

De acuerdo con la presente invención, el método para la identificación, recolección y detección de microorganismos de superficies se puede llevar a cabo con el dispositivo descrito siguiendo estas etapas:

- seleccionar puntos de muestreo para definir un área de muestreo;

- cubrir el área de muestreo con la cavidad abierta de la punta de muestreo;

- aplicar vacío en la cavidad adicional para adherir la punta de muestreo a la superficie;

- inyectar una mezcla de aire y agua a presión en la cavidad principal de la punta de muestreo;

- recoger el líquido que contiene contaminantes (la muestra) en el interior de la cámara de reacción que es un depósito;

- añadir anticuerpos unidos a partículas magnéticas al depósito de reacción e incubar la mezcla;

- activar el imán y posteriormente lavar la cámara de reacción;

- añadir el mismo tipo de anticuerpos pero esta vez unidos a marcadores fluorescentes, e incubar la mezcla mientras el imán está desactivado;

- activar el imán y lavar la cámara de reacción;

- desactivar el imán y lavar las células unidas a anticuerpos hacia el detector;

- activar el imán y el detector para fijar las células unidas a anticuerpos;

- iluminar el microorganismo marcado dentro de la cámara de detección con luz de una longitud de onda específica; y

- medir la intensidad de luz emitida.

La invención describe un método que permite una detección altamente eficaz, rápida y sensible de microorganismos específicos. El presente método se basa en una reacción de inmunoensayo que captura y aísla el microorganismo a ensayar, acoplado a un método de detección basado en la excitación de la muestra y la medida de la luz emitida. Algunas de las características de la realización únicas para el presente método se enumeran a continuación:

• Los anticuerpos pueden seleccionarse para una elevada selectividad, asegurando así que se detecten y reaccionen únicamente las especies o cepas bacterianas deseadas.

• Se pueden identificar de manera simultánea distintos microorganismos usando anticuerpos específicos para dichos microorganismos.

• La reacción de inmunoensayo tarda normalmente de 30 minutos a 2 horas en completarse. Por tanto, los tiempos de reacción son rápidos en comparación con los métodos de incubación que requieren de al menos 24 horas.

• El método de detección es rápido, sólido y altamente sensible ya que las longitudes de onda de excitación y emisión se aíslan usando filtros apropiados.

Además, la invención describe un aparato para realizar el muestreo y la detección de microorganismos basándose en el método de la invención. Hay características únicas de la realización para este dispositivo, que son las siguientes:

• El dispositivo puede realizar las operaciones de detección y muestreo de manera independiente, o todas las operaciones desde el muestreo a la detección, negando por tanto en este último caso la necesidad de materiales de microbiología especializados o de instalaciones.

• Todas las operaciones se pueden programar usando actuadores, minimizando por tanto la necesidad de intervención de personal.

• La punta de muestreo citada permite elevadas tasas de recuperación de microorganismos de las superficies. Los ensayos realizados demuestran que las tasas de recuperación son normalmente mayores del 90 %, mientras que los hisopos, placas y toallitas generalmente usadas para el muestreo de superficies normalmente recuperan

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entre un 4 y un 10 % de los microorganismos sobre la superficie.

• La viabilidad celular no se ve afectada por el método de recuperación usando la punta de muestreo. Esto permite una incubación adicional y crecimiento de las células recuperadas en caso de que se desee.

La invención proporciona una metodología y las herramientas necesarias para llevar a cabo solo una o todas las etapas involucradas en el diagnóstico de la presencia de microorganismos indeseados en lugares tales como superficies, o sobre alimentos, bebidas, el ambiente, etc. desde el muestreo hasta el aislamiento y la medida de los niveles de contaminación microbiana. En este sentido, la invención sustituye las metodologías tradicionales para el control de microorganismos que requieren varias etapas para realizar el mismo proceso. Potencialmente, cualquier microorganismo de interés se puede detectar con la presente invención, tal como Listeria monocytogenes, Salmonella, Campylobacter, Staphylococcus, Aspergillus, etc., usando los anticuerpos adecuados para realizar el inmunoensayo.

La invención es de aplicación para el control de la presencia de microorganismos en sitios, preferentemente superficies sólidas, que es especialmente relevante en industrias como la de producción de alimentos, farmacéutica, hospitalaria, de control ambiental, etc. Además, debido a la capacidad de los subsistemas de muestreo y detección para operar de manera independiente, la invención puede encontrar aplicación en el muestreo mejorado de superficies para el control microbiano usando técnicas tradicionales, o para el análisis microbiano de otros tipos de muestras tales como alimentos, líquidos, productos cosméticos, agua, muestras ambientales, etc. usando únicamente el subsistema de detección.

El instrumento desarrollado, eventualmente se dirige a proporcionar a las compañías usuarias, tales como industrias alimentarias, varias ventajas para la detección de patógenos, especialmente sobre superficies. En primer lugar, la fácil interconexión de ambas etapas de muestreo y medida, que están interconectadas y automatizadas. Esto permite a las compañías llevar a cabo sus programas de control de contaminación por microorganismos de una manera más rápida, eficaz y segura que con las herramientas actuales. Sin embargo y a pesar de esto, el subsistema de medida se ha desarrollado de manera independiente al subsistema de muestreo. Esto permite su uso por separado y podría dar lugar a una mayor flexibilidad del sistema y método en conjunto. Además, el enfoque en el diseño y funcionamiento del sistema puede ajustarse desde una perspectiva general para asegurar una fácil aplicación para la detección de otros patógenos importantes así como para la detección de Listeria monocytogenes en otros sectores, como el clínico o el ambiental.

La presente invención representa una etapa disruptiva en el desarrollo de biosensores para análisis de seguridad alimentaria microbiológica, ya que tiene el potencial de:

• Superar la gran limitación en los métodos de muestreo de superficies actuales debido a sus bajas tasas de recuperación.

• Omitir las etapas de pre-enriquecimiento de las muestras dando lugar por tanto a tiempos de ensayo más cortos.

• Lograr una mayor sensibilidad que los bioensayos actuales.

Los aspectos innovadores de la invención se resumen en la Tabla 2.

Tabla 1. Resumen de las características innovadoras de la invención.

Métodos

Situación actual Presente método/dispositivo

Etapa de detección

Necesidad de preenriquecimiento de muestras. Manipulación manual de muestras. Sin necesidad de preenriquecimiento Procesos automatizados.

Etapa de muestreo

■ Bajas tasas de recuperación (hasta el 10 %). ■ Pueden muestrearse áreas de hasta 1 m. Elevadas tasas de recuperación (por encima del 90 %). No hay restricción en cuanto al contorno y tamaño del área a muestrear.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1. La Figura 1 muestra un esquema de una realización preferida del aparato de la invención que tiene tanto un subsistema de muestreo (1.a) y un subsistema de detección (2), para la identificación y detección de microorganismos en una muestra de acuerdo con el método mostrado en la Figura 2. El dispositivo completo 1 contiene múltiples elementos para permitir el muestreo y detección de microorganismos sobre superficies, y teniendo por tanto un subsistema de muestreo (1.a) y un subsistema de detección (1.b). Para la recuperación de microorganismos, se coloca sobre una superficie sólida 4 una punta de muestreo 2 que presenta una cavidad principal 3. Se mejora la adherencia de la punta de muestreo a la superficie mediante una cavidad concéntrica 5 en la que se aplica vacío mediante un generador de vacío 7. La cavidad principal 3 recupera microorganismos de

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un punto contaminado 6. La punta de muestreo contiene un tubo 8 que proyecta una mezcla de aire y agua a presión 9 al interior de la cavidad principal. El agua y aire a presión se suministran por un depósito de agua 10 y un compresor de aire 11. A medida que 9 impacta sobre 6, se desprenden los microorganismos y abandonan la cavidad principal a través de un tubo 12 que termina dentro del subsistema de detección (1.b), más específicamente dentro de la cámara de reacción 13. Una segunda entrada 14 inyecta reactivos al interior de la cámara de reacción desde los depósitos 15, 16 y 17, que contienen anticuerpos preincubados conjugados con partículas magnéticas, anticuerpos unidos preferentemente a biotina para facilitar la conjugación del anticuerpo con los marcadores fluorescentes, y marcadores fluorescentes (tales como puntos cuánticos Qdots®-), respectivamente. Se sitúan dos imanes 18 en el fondo de la cámara de reacción 13, rodeando a un tubo 19 que dirige fluido desde la cámara de reacción 13 hacia un contenedor de desechos o hacia la cámara de detección 20. Se localiza un imán 21 para la retención de microorganismos unidos a anticuerpos magnéticos por debajo de la cámara de detección 20. La detección de los microorganismos se logra mediante la iluminación de la muestra en la cámara de detección 20 con una fuente de luz 22. Los anticuerpos fluorescentes excitados en la cámara de reacción 20 emiten luz que pasa a través del filtro 23 y se recoge y se mide por un detector 24.

FIG. 2. La Figura 2 muestra el método para la identificación y detección de microorganismos en una superficie (sólida) descrito en la presente invención en una realización preferida, tal como un diagrama de flujo. Este esquema muestra un método que comprende las tres fases principales implicadas en el control de microorganismos; a) recuperación de una muestra, b) reacción de inmunoensayo y c) detección, así como las etapas individuales implicadas en estas tres fases. La reacción de inmunoensayo da como resultado la unión de anticuerpos específicos al microorganismo de interés.

a) Toma de muestras (recuperación de microorganismos de las superficies):

a.1) unión por vacío de la punta de muestreo a la superficie;

a.2) inyección de aire y agua a presión mezclados; y

a. 3) recolección de una muestra que contiene microorganismos;

b) Reacciones de inmunoensayo:

b. 1) adición de anticuerpos unidos a partículas magnéticas;

b.2) activación del imán y lavado;

b.3) incubación con anticuerpos unidos a marcadores fluorescentes; y

b. 4) activación del imán y lavado;

c) Detección de microorganismos

c. 1) transporte de células a la cámara de detección;

c.2) iluminación de células; y

c.3) cuantificación de la intensidad de fluorescencia.

FIG. 3. La Figura 3 muestra un esquema detallado de los anticuerpos que llevan diferentes conjugados y acoplados a un microorganismo diana recuperado de una muestra. Aquí, una célula bacteriana 25 se acopla a un primer anticuerpo específico 26 que lleva un conjugado que es una partícula magnética 27, y a un segundo anticuerpo específico 26', que es preferentemente el mismo que 26, que lleva un conjugado que es un marcador fluorescente 27'.

FIG. 4. Medida de la intensidad de fluorescencia a 655 nm después de la excitación de muestras que contienen diferentes concentraciones de L. monocytogenes unidas a anticuerpos fluorescentes y magnéticos con luz de 405 nm de acuerdo con el Ejemplo 2.

Ejemplos

Ejemplo 1. Determinación de las tasas de recuperación de microorganismos en una muestra tomada con el fin del presente método y dispositivo.

Se cultivaron biopelículas de L. monocytogenes sobre cupones de acero inoxidable de acuerdo con los procedimientos convencionales. Se muestrearon los materiales contaminados por medio del subsistema de muestreo de la invención y de técnicas convencionales (hisopos y placas RODAC). El muestreo con el subsistema de muestreo incluyó las siguientes etapas:

1. Aire comprimido + agua durante 1 minuto a 300 kPa y 50 lpm (litros por minuto).

2. Aire comprimido durante 1 minuto a 300 kPa y 50 lpm.

Los resultados de los ensayos de muestreo con la invención y con técnicas convencionales se muestran en la Tabla 3 y en la Tabla 4:

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Tabla 3. Resultados de muestreo de biopelículas de L. monocytogenes cultivadas sobre cupones de acero

inoxidable con la invención.

L. monocytogenes (log UFC/superficie)

Microorganismos recuperados (log UFC) n=3 Tasa de separación

5,58

4,58 82,08 %

5,64

4,69 83,16 %

5,64

5,06 89,71 %

5,35

4,56 85,23 %

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4,58 91,60 %

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4,73 94,6 %

Tabla 4. Resultados de muestreo de biopelículas de L. monocytogenes cultivadas sobre cupones de acero

inoxidable con técnicas convencionales.

Inóculo teórico

hisopo placa Rodac

(log UFC/muestra)

(log UFC/muestra)

(log UFC/muestra)

4,67

3,48 >2,18

5,43

2,95 >2,18

6,05

3,88 >2,18

El muestreo con la invención produjo tasas de recuperación de entre el 82 y el 95 %. Las tasas de recuperación usando técnicas convencionales fueron por debajo del 4 %. De una manera más precisa, fueron del 3,43% usando hisopos y del 1,26% usando placas Rodac. Esto se debió al hecho de que el límite de cuantificación de esta última era de 2,18 log UFC/muestra (150 UFC/muestra). Aunque esto representó una limitación particular de las placas Rodac, la conclusión principal fue que el muestreo con las técnicas convencionales puede llevar a subestimar los niveles reales de contaminación en industrias.

Ejemplo 2. Validación por inmunoensayo del método y dispositivo de acuerdo con la presente invención.

Se prepararon diluciones seriadas de L. monocytogenes en solución salina con peptona y se sembraron en medio selectivo para calcular las tasas re recuperación de control. Posteriormente, se prepararon soluciones de trabajo en el intervalo 1E7 - 1E4 UFC/ml en agua estéril.

El protocolo de detección con el inmunosensor incluyó las siguientes etapas:

1. Incubar las perlas recubiertas con el conjugado mAb2B3-partícula nanomagnética (0,5 pg/ml, 100 ul) con la muestra de L. monocytogenes (1 ml) a 21 °C durante 10 minutos.

2. Inyectar el fluido de células usando una tasa de flujo de 1 ml/min asegurándose de que el imán está en su sitio.

3. Lavar la muestra con 10 ml de H2O destilada a una tasa de flujo de 5 ml/min.

4. Inyectar mAb2B3 (200 ng/ml, 1 ml) a una tasa de flujo de 1 ml/min al fluido de células con el imán en su sitio.

5. Incubar a 21 °C durante 10 minutos. Lavar el anticuerpo no unido con 10 ml de H2O destilada a una tasa de flujo de 5 ml/min con el imán en su sitio.

6. Inyectar Qdot® marcado con estreptavidina (0,02 pM, 1 ml) a una tasa de flujo de 1 ml/min al fluido de células con el imán en su sitio.

7. Incubar a 21 °C durante 10 minutos. Lavar el anticuerpo no unido con 10 ml de H2O destilada a una tasa de flujo de 5 ml/min con el imán en su sitio.

8. Medir la fluorescencia.

Las etapas descritas anteriormente se ejecutaron automáticamente en secuencia usando el dispositivo de la invención, y el proceso completo duró aproximadamente 40 minutos. La Figura 4 muestra los valores de fluorescencia obtenidos después de la excitación de muestras que contienen distintas concentraciones de L. monocytogenes. La intensidad de señal aumenta con concentraciones en aumento de células, y puede detectarse una diferencia frente a la señal de partida a partir de valores de 100 UFC/ml.

Ejemplo 3. Detección de células marcadas

Las muestras que contienen distintas concentraciones de células de L. monocytogenes unidas a anticuerpos magnéticos y fluorescentes se colocaron en la unidad de detección del dispositivo descrito por la presente invención. La Tabla 5 muestra los valores expresados por el detector en su versión de fotomultiplicador de silicio. El volumen de la cámara de detección es de 1 ml, por tanto, el contenido de las muestras puede expresarse como número de células. Los resultados obtenidos demuestran que el detector puede proporcionar un valor positivo a partir de un contenido de 10 células, confirmando por tanto la elevada sensibilidad del presente método.

Tabla 5. Valores expresados por la versión de fotomultiplicador de silicio del subsistema de detección después de la excitación de muestras que contienen distintas concentraciones de L. monocytogenes unidas a anticuerpos _______________fluorescentes y magnéticos con luz de 450 nm._______________

MUESTRA

SEÑAL RUIDO RESULTADO

CÁMARA VACÍA

636 598 41

AGUA DEL GRIFO

642 598 43

ISOPROPANOL

669 597 71

10 células

717 601 71

10e2 células

811 598 213

10e3 células

1633 605 1027

10e4 células

14822 594 14227

10e5 células

15223 602 14620

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

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   REIVINDICACIONES

   1. Un método para la identificación y detección de microorganismos en una muestra, caracterizado por que comprende:

   - llevar a cabo al menos una reacción de inmunoensayo en una muestra previamente recogida, para aislar y separar al menos un analito diana seleccionado que es un microorganismo susceptible de estar contenido en esta, incubando la muestra con uno o más reactivos que son anticuerpos, siendo cada uno específico para un microorganismo diana, conjugado con una partícula magnética, de tal modo que el microorganismo diana se acopla al anticuerpo magnético específico durante la incubación y posteriormente se separa del resto de la muestra por medio de magnetismo;

   - llevar a cabo una segunda reacción de inmunoensayo en la muestra sometida previamente a la primera reacción de inmunoensayo, para marcar el microorganismo acoplado previamente al anticuerpo específico conjugado con la partícula magnética antes de la cuantificación del mismo, incubando la muestra con al menos un segundo reactivo, que es un anticuerpo específico para el microorganismo diana y conjugado con un marcador fluorescente; y

   - detectar y cuantificar la cantidad del microorganismo separado acoplado previamente a los anticuerpos iluminando al mismo y midiendo la fluorescencia emitida.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde la partícula magnética tiene un tamaño a escala nanométrica, y comprende un núcleo magnético recubierto con una capa reactiva que permite su suspensión en agua y su conjugación con el anticuerpo.
3. 3. El método según la reivindicación 2, en donde la partícula magnética es una partícula de óxido de hierro magnético.
4. 4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, en donde el al menos un segundo anticuerpo es distinto del anticuerpo usado en la primera reacción de inmunoensayo, o el al menos un segundo anticuerpo es el mismo que el anticuerpo usado en la primera reacción de inmunoensayo, pero unido a un marcador fluorescente.
5. 5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde comprende las siguientes etapas:

   - llevar a cabo una primera reacción de inmunoensayo en una muestra previamente recogida, para separar al menos un microorganismo diana incubando y acoplando dicho microorganismo a al menos un anticuerpo específico unido a una partícula magnética;

   - retener dichos microorganismos acoplados a los anticuerpos magnéticos por medio de magnetismo, activando uno o más imanes;

   - lavar la muestra para aislar y separar los microorganismos conjugados con los anticuerpos;

   - llevar a cabo una segunda reacción de inmunoensayo, para marcar los microorganismos acoplados a los

   anticuerpos magnéticos incubando y acoplar los mismos a al menos un segundo anticuerpo específico que es del mismo tipo que aquel usado en la primera reacción de inmunoensayo pero conjugado a un marcador fluorescente;

   - retener dichos microorganismos marcados por medio de magnetismo, activando un imán;

   - lavar la muestra para separar los microorganismos aislados conjugados con los anticuerpos; y

   - detectar y cuantificar la cantidad de los microorganismos marcados iluminando a los mismos y midiendo la fluorescencia emitida.
6. 6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las reacciones de

   inmunoensayo se llevan a cabo usando más de un anticuerpo, siendo cada uno de ellos específico de un

   microorganismo concreto, permitiendo por tanto la detección simultánea de diferentes microorganismos.
7. 7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra se toma y recupera previamente inyectando aire a presión con agua en condiciones de vacío para expeler la muestra de su lugar de origen y recogerla en un líquido para la reacción de inmunoensayo.
8. 8. Un dispositivo para la identificación y la detección de microorganismos en una muestra configurado para llevar a cabo el método descrito en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que tiene un subsistema de detección que comprende:

   - una unidad de reacción, que tiene

   o una cámara de reacción en forma de depósito en el que la muestra tomada se introduce por una primera entrada y se recoge, y donde tienen lugar la primera y la segunda reacción de inmunoensayo para separar y marcar el microorganismo diana añadiendo los anticuerpos específicos como reactivos por una segunda

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   entrada, mediante un autómata programado; y

   o uno o más imanes situados en la parte inferior de la cámara de reacción para retener el microorganismo diana conjugado con el anticuerpo que comprende una partícula magnética mediante magnetismo durante la reacción de incubación; conectado a

   - una unidad de detección, que tiene

   o una cámara de detección a la que se transporta el microorganismo separado y marcado después de completarse las reacciones de inmunoensayo, para cuantificar la cantidad del mismo; y o un imán localizado en la parte inferior de la cámara de detección para retener el microorganismo separado y marcado mediante magnetismo durante la etapa de cuantificación;

   - una fuente de luz dirigida a la cámara de detección, y

   - al menos un sensor para recoger y medir la fluorescencia emitida por los marcadores cuando se excitan en la cámara de detección.
9. 9. El dispositivo según la reivindicación 8, donde la fuente de luz para excitar el microorganismo marcado es un LED de una longitud de onda correspondiente al marcador fluorescente, y el sensor se selecciona del grupo que consiste en un sensor CCD, un sensor fotomultiplicador de silicio, y ambos.
10. 10. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde el sensor comprende al menos un filtro óptico, para el aislamiento de las longitudes de onda de excitación y emisión.
11. 11. El dispositivo según la reivindicación 10, que comprende tres filtros localizados en un cubo con un divisor de haz, y son: un filtro de excitación; un divisor de haz dicroico que refleja la luz de excitación y transmite la luz emitida desde la muestra; y un filtro de emisión que permite únicamente la longitud de onda hacia el sensor.
12. 12. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende un subsistema de muestreo acoplado y conectado a la cámara de reacción del subsistema de detección, que actúa por medio de aire y agua a presión y comprende:

    - una punta de muestreo, que se une al sitio de donde se toma la muestra, y contiene

    - una cavidad principal que define el área de ensayo y en la que el aire y el agua a presión se aplican para

    expeler y extraer la muestra; teniendo dicha cavidad

    - una abertura de entrada para inyectar el aire y agua a presión dentro de la cavidad;

    - una abertura de salida para expeler y extraer la muestra tomada con el agua inyectada; y

    - una segunda cavidad que rodea a la superficie externa del área de ensayo y que aplica vacío para adherir la punta de muestreo a la superficie.
13. 13. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde la unidad de reacción contiene:

    - circuitos para el transporte de fluidos desde el subsistema de muestreo y a la unidad de detección;

    - un contenedor para cada reactivo distinto usado en la reacción de inmunoensayo; y

    - circuitos para conectar estos contenedores con la cámara de reacción;

    - y presentando la cámara de reacción:

    - una abertura en su parte superior que permite la introducción de la muestra desde el subsistema de muestreo y los reactivos de los contenedores de reactivos;

    - una abertura regulada por válvulas en su parte inferior, conectada a la unidad de detección;

    y en donde el transporte de fluidos se regula mediante un sistema de válvulas y bombas peristálticas controladas por un autómata programable.
14. 14. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, que comprende más de una unidad de reacción para llevar a cabo más de una primera reacción de inmunoensayo al mismo tiempo, y analizar más de una muestra al mismo tiempo.