IT202100005363A1 - Metodo per la determinazione della presenza di un microorganismo bersaglio in un campione biologico - Google Patents
Metodo per la determinazione della presenza di un microorganismo bersaglio in un campione biologico Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo:
?METODO PER LA DETERMINAZIONE DELLA PRESENZA DI UN MICROORGANISMO BERSAGLIO IN UN CAMPIONE BIOLOGICO?
La presente invenzione ? relativa a metodi per la determinazione della presenza di un microorganismo bersaglio in un campione biologico.
A causa della maggiore aspettativa di vita, il numero di sostituzioni protesiche continua a crescere a un ritmo significativo, con diversi milioni di articolazioni protesiche impiantate ogni anno in tutto il mondo. La maggior parte delle volte, questa tipologia di procedura chirurgica ha riscontri positivi con un miglioramento della funzione articolare e sollievo dal dolore. Tuttavia, una delle complicanze che si pu? verificare ? l?infezione periprotesica (PJI) che ha un'incidenza variabile dal 2,0% al 2,4% per gli interventi protesici primari, ma aumenta fino al 20% per le procedure di revisione protesica.
Questa alta incidenza porta ad un vero e proprio onere economico per i servizi sanitari mondiali, poich? i costi del trattamento di una PJI sono molto alti.
Tale evento crea rilevanti problemi sia di carattere clinico che di carattere economico a causa degli elevati costi associati. Infatti, a seguito dell?insorgenza di una PJI, i pazienti vengono trattati con un complesso iter clinico che pu? durare pi? di un anno per i casi pi? gravi e che prevede:
- Espianto della protesi e prelievo bioptico (eradicazione chirurgica);
- Diagnosi dell?agente infettivo sul prelievo bioptico (coltura batterica ? circa 2 settimane);
- Impianto protesi temporanea (spaziatore antibiotato);
- Trattamento terapeutico (1-3 mesi);
- Impianto protesi finale da revisione a negativizzazione dei parametri bioumorali e dopo una biopsia con antibiogramma negativa.
Qualora i parametri non si normalizzassero, inoltre, si ripete la procedura chirurgica di pulizia e ricambio dello spaziatore fino ad eradicazione dell?infezione.
Tale iter oltre a rappresentare un oneroso percorso clinico per il paziente, induce anche conseguenti ripercussioni negative per le sue ricadute emotive, nonch? sulla spesa sanitaria includendo onerosi costi di ospedalizzazione, di diagnostica, di antibiotico terapia, di trattamento e materiale protesico aggiuntivo, tutti derivanti dalla complicanza settica delle protesi.
Tale scenario ? una conseguenza del fatto che non esistono attualmente sul mercato mezzi diagnostici specifici che consentano diagnosi precoci, rapide e a costi ridotti.
Relativamente alla parte diagnostica, essa prevede procedure complesse e non sempre decisive che includono prelievi bioptici, analisi cliniche del sangue e imaging avanzato con risonanza magnetica. Colture, biopsie, marcatori sierologici di infiammazione e tecniche di imaging presentano tutti dei vantaggi e degli svantaggi. Ad esempio il dosaggio della proteina C-reattiva (PCR), la velocit? di sedimentazione eritrocitaria (VES) e la conta leucocitaria non sono sensibili o sufficientemente specifici per rilevare o escludere un?infezione periprotesica (PJI). L'aspirazione articolare (artrocentesi) comporta un rischio di infezione e la sua sensibilit? ? molto variabile.
In generale, per una diagnosi di un?infezione periprotesica ? necessaria una combinazione di analisi cliniche, di laboratorio, microbiologiche e di imaging eseguite in base dell'esperienza personale del clinico e alle tecniche disponibili e alle disponibilit? economiche di ogni singolo presidio ospedaliero.
US2009286225 descrive un metodo per il rilevamento di batteri in un campione mediante l?uso di batteriofagi.
I batteriofagi sono organismi che si sono evoluti in natura per sfruttare i batteri per replicarsi. In particolare, il fago si attacca al batterio e inietta in questo il proprio DNA inducendolo a replicare il fago centinaia di volte. Alcuni batteriofagi, al termine della replicazione causano anche la lisi del batterio per poter infettare nuovi batteri. Il tempo stimato per l?attacco del fago, la sua incubazione, replicazione e amplificazione pu? richiedere anche diverse ore.
Pertanto, il metodo di US2009286225, che richiede l?amplificazione del batteriofago tramite incubazione, richiede tempi elevati prima di poter eseguire il rilevamento dell?eventuale presenza di batteri. Pertanto, tale processo non ? adatto per un suo utilizzo in sala operatoria durante la procedura chirurgica.
E? dunque sentita nell?arte l?esigenza di nuovi metodi diagnostici per le infezioni da microorganismi che siano rapidi ed economici che siano privi degli svantaggi dell?arte nota.
Tale scopo della presente invenzione ? raggiunto mediante metodi per la determinazione della presenza di un microorganismo bersaglio secondo la rivendicazione 1, 2 e 3.
In particolare, secondo un primo aspetto dell?invenzione viene fornito un metodo per la determinazione della presenza di un microorganismo bersaglio in un campione biologico comprendente le fasi di:
- mettere in contatto con detto campione biologico un fago che espone un peptide selettivo per detto microorganismo, detto fago essendo legato ad un marcatore per formare un complesso fago-marcatore;
- lasciare reagire detto fago con detto campione biologico in modo da consentire, se presente detto microorganismo, il legame di detto fago a detto microorganismo bersaglio per ottenere un campione comprendente un complesso microorganismo-fago marcato;
- filtrare detto campione comprendente un complesso microorganismo-fago marcato su un filtro in grado di ritenere detto complesso microorganismo-fago marcato;
- rilevare detto complesso microorganismo-fago marcato. Vantaggiosamente l?utilizzo di marcatori consente di eseguire la fase di rilevamento della presenza del microorganismo senza necessitare della replicazione e amplificazione del batteriofago.
Infatti, dopo la filtrazione, il complesso microorganismo-fago marcato trattenuto emette un segnale rivelabile direttamente sul filtro.
In un secondo aspetto dell?invenzione viene fornito inoltre un metodo per la determinazione della presenza di un microorganismo bersaglio in un campione biologico comprendente le fasi di:
- mettere in contatto un marcatore con detto campione biologico per ottenere, se presente detto microorganismo, un complesso microorganismo bersaglio-marcatore;
- fornire una striscia in materiale poroso, detta striscia presentando almeno una zona di fissaggio su cui ? fissato almeno un fago che espone un peptide selettivo per detto microorganismo e una zona di deposizione, separata da detta zona di fissaggio e destinata ad accogliere una porzione del complesso microorganismo bersaglio-marcatore;
- mettere in contatto detto complesso microorganismo bersaglio-marcatore con detta striscia su detta zona di deposizione ed eluire detto complesso attraverso detta striscia in modo che detto complesso raggiunga detta zona di fissaggio per formare un complesso fago-microorganismo bersaglio-marcatore;
- rilevare detto complesso fago-microorganismo bersaglio-marcatore.
In una forma di realizzazione, quando il marcatore ? utilizzato per marcare il fago ? selezionato nel gruppo costituito da marcatori fluorescenti, come ad esempio rodamina, isotiocianato di fluorescina, 4',6-diamidin-2-fenilindolo, Cyto9, Cyto5, marcatori colorimetrici, marcatori elettrochimici come ad esempio ferrocene, e marcatori magnetici, come ad esempio nanoparticelle di ossido ferrico (Fe2O3) o biossido di cromo (CrO2). Preferibilmente, il marcatore ? un colorante cellulare come 4',6-diamidin-2-fenilindolo (DAPI), Cyto9, Cyto5. Quando il marcatore ? utilizzato per marcare il microorganismo ? selezionato nel gruppo costituito da sistemi molecolari fluorescenti come DAPI (4',6-diamidin-2-fenilindolo), Cyto9, Cyto5, rodamina, isotiocianato di fluorescina, opzionalmente coniugati con nanoparticelle magnetiche come ad esempio nanoparticelle di ossido ferrico (Fe2O3) o biossido di cromo (CrO2), sistemi molecolari elettrochimici come ad esempio ferrocene.
Secondo un terzo aspetto dell?invenzione viene infine fornito un metodo per la determinazione della presenza di un microorganismo bersaglio in un campione biologico comprendente le fasi di:
- fornire una striscia in materiale poroso, detta striscia presentando almeno una zona di fissaggio su cui ? fissato almeno un fago che espone un peptide selettivo per detto microorganismo e una zona di deposizione, separata da detta zona di fissaggio e destinata ad accogliere una porzione del campione biologico, detto fago essendo legato ad un marcatore in forma disattivata;
- mettere in contatto detto campione biologico con detta striscia su detta zona di deposizione ed eluire, se presente, detto microorganismo attraverso detta striscia in modo che detto microorganismo raggiunga detta zona di fissaggio per formare un complesso fago-microorganismo bersaglio e rilasciare detto marcatore in forma attivata;
- rilevare detto marcatore in forma attivata.
In questo caso il marcatore ? selezionato nel gruppo costituito da carbon dots, nanoparticelle di semiconduttore come SeC o sistemi molecolari fluorofori come il fenilbutazone.
Secondo la presente invenzione, il termine ?fago? include un batteriofago ingegnerizzato non litico si riferisce ad un virus che pu? attaccare un batterio vitale o altri organismi microscopici e li utilizza per replicarsi.
I metodi dell?invenzione, non richiedendo la replicazione e l?amplificazione del fago per poter passare alla fase di rilevamento, sono particolarmente rapidi e adatti ad essere utilizzati per l?identificazione della presenza di batteri in un campione gi? in sala operatoria durante la procedura chirurgica di applicazione della protesi. Inoltre, grazie all?uso di fagi che espongono sequenze selettive per uno specifico microrganismo bersaglio, sono metodi particolarmente precisi nell?identificare la specifica infezione.
I metodi dell?invenzione sono particolarmente utili nell?identificazione in un campione biologico di microorganismi bersaglio scelti nel gruppo costituito da Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus, Escherichia coli e Staphilococcus epidermidis.
Inoltre, il peptide selettivo per il microorganismo ? preferibilmente scelto tra peptidi avente sequenza peptidica scelta nel gruppo costituito da SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3 e SEQ ID No.4.
In particolare, ? stato identificato che fagi che espongono la sequenza peptidica identificata come SEQ ID No.
1 sono selettivi per la Pseudomonas aeruginosa, fagi che espongono la sequenza peptidica identificata come SEQ ID No.
2 sono selettivi per lo Staphilococcus aureus, fagi che espongono la sequenza peptidica identificata come SEQ ID No.
3 sono selettivi per l?Escherichia coli e fagi che espongono la sequenza peptidica identificata come SEQ ID No. 4 sono selettivi per lo Staphilococcus epidermidis.
L?invenzione verr? ora descritta con riferimento alle figure in cui:
- la figura 1 mostra un primo metodo secondo l?invenzione;
- la figura 2 mostra un secondo metodo secondo l?invenzione;
- la figura 3 mostra un terzo metodo secondo l?invenzione;
- la figura 4 mostra lo spettro di emissione ottenuto con il rilevamento di P.aeruginosa secondo l?esempio 3.
Con riferimento alla figura 1, viene indicato con 1 un campione biologico comprendente microorganismi 2, ad esempio Staphilococcus aureus. Tale campione, in forma di soluzione, viene messo in contatto con complesso 6 contenente un fago 4 che espone un peptide 3 selettivo per lo S. aureus, ad esempio un fago che espone un peptide avente sequenza peptidica SEQID No.2, e legato ad un marcatore 5. In una forma di realizzazione, il marcatore 5 ? costituito da un fluorocromo come ad esempio rodamina, isotiocianato di fluorescina, 4',6-diamidin-2-fenilindolo, o marcatore elettrochimico come ad esempio ferrocene o marcatore magnetico come ad esempio nanoparticelle di ossido ferrico (Fe2O3) o biossido di cromo (CrO2). Si forma cos? un complesso microorganismo-fago marcato 7 (fig. 1b) che presenta dimensioni tali da poter essere trattenuto da un filtro 8 avente pori di dimensioni da 0.22 a 0.45 micron. Una volta filtrato, il complesso microorganismo-fago marcato 7 presente sul filtro 8 (fig. 1c) viene rilevato con metodi noti di rilevamento ottico, ad esempio microscopia a fluorescenza o sistemi ottici che leggono la fluorescenza composti da un emettitore di luce (LED) e da un rilevatore come ad esempio un fotodiodo, di rilevamento elettrochimico come dispositivi a 3 elettrodi, di rilevamento magnetico come dispositivi lettura magnetica.
In una forma alternativa dell?invenzione, raffigurata in figura 2, il campione biologico 1, in forma di soluzione, comprendente microorganismi 2 (Fig. 2a), ad esempio S. aureus, viene esso in contatto con un marcatore 5 per creare un complesso microorganismo bersaglio-marcatore 9 (Fig. 2b). In questo metodo, il rilevamento del microorganismo 2 eventualmente presente nel campione biologico 1 viene effettuato su una striscia 10 di materiale poroso, ad esempio realizzato con carta porosa, polimeri microstrutturati o polimeri sinterizzati. Questi dispositivi sono comunemente noti nell?arte come dispositivi a flusso laterale e sono in grado di trasportare fluidi spontaneamente.
La striscia 10 ? provvista di una zona di deposizione 11, definente un area di deposizione, destinata ad accogliere una porzione del complesso microorganismo bersagliomarcatore 9, preferibilmente posta ad una estremit? della striscia 10, e una zona di fissaggio 12, separata dalla zona di deposizione 11 e definente un area di fissaggio, sulla quale vengono immobilizzati dei fagi 4 selettivi per lo S. aureus, ad esempio un fago 4 che espone un peptide 3 avente sequenza peptidica SEQID No.2.
L?immobilizzazione del fago nella zona di fissaggio 12, avviene tramite metodi noti, ad esempio per deposizione e asciugatura a temperatura ambiente.
La striscia 10 viene quindi posta in contatto con la soluzione contenente il complesso microorganismo bersagliomarcatore 9. La soluzione quindi scorre lungo la striscia 10 in direzione della freccia (fig. 2c) fino a raggiungere la zona di fissaggio 12, dove il complesso microorganismo bersaglio-marcatore 9 reagisce con il fago 4 selettivo per tale complesso, ad esempio un fago che espone un peptide 3 avente sequenza peptidica SEQID No.2, per formare un complesso fago-microorganismo bersaglio-marcatore 13.
Successivamente, si procede con il rilevamento del complesso fago-microorganismo bersaglio-marcatore 13.
In una forma di realizzazione la striscia 10 pu? comprendere pi? zone di fissaggio 12 su ciascuna delle quali vengono fissati fagi selettivi per un diverso microorganismo. In questo modo ? possibile rilevare la presenza di pi? microorganismi diversi in uno stesso campione biologico.
In una forma di realizzazione, il marcatore 5 ? costituito da sistemi molecolari fluorescenti come DAPI (4',6-diamidin-2-fenilindolo), Cyto9, Cyto5, rodamina, isotiocianato di fluorescina, opzionalmente coniugati con nanoparticelle magnetiche come ad esempio nanoparticelle di ossido ferrico (Fe2O3) o biossido di cromo (CrO2), sistemi molecolari elettrochimici come ad esempio ferrocene che marcano il microrganismo. Il complesso fago-microorganismo bersaglio-marcatore 13 viene rilevato con metodi noti di rilevamento ottico, ad esempio microscopia ottica o a fluorescenza o sistemi ottici che leggono la fluorescenza composti da un emettitore di luce (LED) e da un rilevatore come ad esempio un fotodiodo, di rilevamento elettrochimico come dispositivi a 3 elettrodi, di rilevamento magnetico come dispositivi lettura magnetica.
In una forma alternativa dell?invenzione, riportata in figura 3, invece di ricorrere alla marcatura del microorganismo 2 eventualmente presente nel campione biologico 1, viene utilizzato un marcatore 14 che, una volta legato al fago 4 immobilizzato sulla striscia 10, viene disattivato. Esempi di tali marcatori 14 sono ad esempio i carbon dots. Marcatori alternativi ai carbon dots sono nanoparticelle di semiconduttore come SeC o sistemi molecolari fluorofori la cui fluorescenza viene spenta tramite processi di trasferimento di energia o di elettroni mediante il contatto col peptide specifico espresso dal fago, come il fenilbutazone (PB). In particolare, per ?marcatore disattivato? o ?marcatore in forma disattivata? si intende un marcatore che, a seguito del sua legame con il fago perde la propria capacit? di emettere un segnale rilevabile dalla comune strumentazione. Al contrario con il termine ?marcatore attivato? o ?marcatore in forma attivata? si intende un marcatore in grado di emettere un segnale rilevabile dalla comune strumentazione.
Una volta che il microorganismo bersaglio 2, eventualmente presente nel campione biologico 1, raggiunge la zona di fissaggio, esso lega il fago 4 causando la formazione del complesso fago-microorganismo bersaglio 15 e la rottura del legame tra il fago 4 e il marcatore 14. Tale rottura causa l?attivazione del marcatore 14? che potr? essere rilevato con la comune strumentazione.
Alternativamente, il fago legato al marcatore disattivato pu? essere immobilizzato su beads magnetiche. Il microorganismo bersaglio, eventualmente presente nel campione biologico, messo a contatto con il complesso fagomarcatore disattivato beads, lega il fago causando il distacco del marcatore e la sua attivazione.
Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno dalla descrizione che segue di alcuni esempi meramente illustrativi e non limitativi.
ESEMPIO 1
Fase 1: Liberazione dei microrganismi presenti da un campione di tessuto o liquido sinoviale
Condizioni:
Aggiungere almeno 1 ml di soluzione fisiologica sterile (coprire almeno il 90% del campione).
Agitare in vortex il contenitore con il campione per 30?.
Sonicare a 40 KHx 0,22 /- 0,4 VVcm<2 >per 5 minuti.
Agitare in vortex per 30?.
Fase 2: Marcatura del batterio
Si preleva un volume di liquido sonicato e si aggiunge il colorante 4',6-diamidin-2-fenilindolo (DAPI) per le cellule batteriche.
Condizioni:
Aggiungere ad 1 ml del campione trattato 10 ?L di soluzione stock DAPI (Sigma ? Aldrich, Germania) (0,1 ?g/mL in PBS). I campioni sono incubati al buio a 30?C per 10-20 minuti sotto leggera agitazione.
Fase 3: Preparazione del dispositivo a flusso laterale - Descrizione del probe fagico
Per l?esempio riportato, sono state utilizzate due librerie di peptidi fagici M13 (pVIII-9aa e pVIII-12aa) attraverso la selezione per affinit? di seguito descritta. Queste librerie sono costituite da fagi filamentosi M13 che espongono peptidi casuali di 9 o 12mer, rispettivamente, fusi alla proteina principale del rivestimento (pVIII). Le librerie di nonapeptidi e dodecapeptidi sono state costruite nel vettore pC89 (Felici et al., 1991), clonando un inserto random DNA tra il terzo e il quinto codone che codificano la pVIII matura (Luzzago e Felici, 1998).
- Selezione del peptide fago
Lo screening della libreria ? stato eseguito utilizzando quattro cicli di selezione per affinit?. La selezione contro le cellule intere di P. aeruginosa ? stata eseguita incubando 10<12 >particelle fagiche con cellule di P. aeruginosa (OD660 0,5) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, tampone fosfato 10 mM, pH 7,4; 1 ml) per 60 min a temperatura ambiente con leggera agitazione. Batteri e fagi sono stati precipitati mediante centrifugazione per 5 min a 16.000 ? g, e i fagi non legati sono stati separati mediante una serie di 10 fasi di lavaggio e centrifugazione (16.000 ? g, 5 min) con 1 ml Tampone TBS / Tween (Tris ? HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,05% (v/v) Tween 20). I fagi legati alle cellule di P. aerugonosa sono stati pellettati con le cellule e infine eluiti con 200 nl di glicina-HCl 0,2M (pH 2,2) in agitazione delicata a temperatura ambiente per 20 min, seguita da neutralizzazione con 150 nl di 1M Tris?HCl (pH 9.1). I fagi eluiti dall?ultimo ciclo di selezione di affinit? contro P. aeruginosa sono stati utilizzati per infettare le cellule di E. coli TG1. Le colonie batteriche, ciascuna contenenti fagi da un singolo clone della libreria, sono casualmente selezionate e propagate per successive analisi di affinit? e specificit?. Dalle singole colonie di batteri infetti veniva estratto il DNA fagico, utilizzato per la PCR ed il sequenziamento. I primer di sequenziamento M13-40 reverse (5 -GTTTTCCCAGTCACGAC-3, SEQ ID No. 5) e E24 forward (5 GCTACCCTCGTTCCGATGCTGTC-3, SEQ ID No. 6). Le sequenze di DNA sono state tradotte in amminoacidi utilizzando il programma "translate" sul server di proteomica del Sistema esperto di analisi delle proteine dell'Istituto Svizzero di bioinformatica (ExPASy, http://www.expasy.ch/)
Il clone fagico, indicato come P9b che mostrava la migliore capacit? e specificit? di legame esponeva un peptide con la seguente sequenza peptidica: QRKLAAKLT, SEQ ID No. 1 - Substrato del dispositivo da flusso laterale: nitrocellulosa - bio-Rad nitrocellulose membrane (0.2 ?m pore)
- Metodo di immobilizzazione
Sulla striscia reattiva, la zona di fissaggio ? larga circa 1 cm, e la quantit? di reagente di cattura (fago P9b) che ? stata legata ? di 0,05-?g. Il fago ? stato legato per asciugatura a temperatura ambiente.
Fase 4: rilevamento
La soluzione contenente il batterio marcato con DAPI viene messa a contatto col dispositivo a flusso laterale nella zona di deposizione. La soluzione fluisce fino a raggiungere la zona di fissaggio dove ? stato immobilizzato in fase di preparazione del dispositivo il probe fagico specifico per il microrganismo: se ? presente, questo viene catturato dal probe specifico e nella specifica zona viene rilevato un segnale di trasduzione della presenza di tale microorganismo.
A seconda della marcatura del tipo di marcatura effettuata sul microorganismo, il segnale ? ottico di emissione o assorbimento.
ESEMPIO 2
A) Campione di Partenza: Tessuto o liquido sinoviale Fase 1: Liberazione dei microrganismi presenti da un campione di tessuto
Il tessuto prelevato dal chirurgo viene sonicato per poter liberare gli eventuali microrganismi presenti.
Condizioni:
Aggiungere almeno 1 ml di soluzione fisiologica sterile (coprire almeno il 90% del campione).
Agitare in vortex il contenitore con il campione per 30?.
Sonicare a 40 KHx 0,22 /- 0,4 VVcm<2 >per 5 minuti.
Agitare in vortex per 30?.
Fase 2: Marcatura del Batterio
Si preleva un volume di liquido sonicato e si aggiunge una soluzione contenente il fago specifico marcato per il riconoscimento delmicroorganismo bersaglio.
- Descrizione del probe fagico
Il probe fagico ? lo stesso dell?esempio precedente. Il clone fagico, indicato come P9b che espone un peptide con la sequenza peptidica QRKLAAKLT (SEQ ID No.1), in grado di legare in maniera specifica P.aeruginosa ? stato marcato con isotiocianato di fluorescina secondo il metodo sotto descritto.
- Marcatura del fago con FITC
5 ? 10<10 >PFU del fago P9b ? stato risospeso in 200 ml Na2CO3/Tampone NaHCO3 (pH 9.2) con 5 ml di fluoresceina isotiocianato (FITC 5 mg / ml). I fagi sono stati incubati per 2 h al buio su tamburo rotante a temperatura ambiente per consentire la reazione con fluorocromo. Il campione ? stato incubato a 4?C per 12 ore con 200 ml di PEG / NaCl e quindi centrifugato per due volte a 15.300 ? ga 4?C per 1 h. Il surnatante ? stato scartato e il pellet ? stato risospeso in 100 ?l di soluzione tampone Tris [TBS (7,88 g / l Tris-HCl, 8,77 g / l NaCl)]. Dopo marcatura i fagi sono stati dializzati progressivamente contro 2 l di una miscela di TBS (1: 1) per 24 h. I fagi marcati sono stati conservati al buio a 4?C fino al momento dell'utilizzo.
Fase 3: Rilevamento mediante filtrazione
La soluzione contenente il complesso fago marcato microorganismo, lasciata a reagire per 30? al buio, si fa passare su un filtro (policarbonato nero 0,45 n) che trattiene solo gli aggregati pi? grandi (complesso fago marcato microorganismo) e lascia passare quelli pi? piccoli (fago marcato). Come conseguenza i complessi cos? ottenuti possono essere visualizzati sul filtro.
ESEMPIO 3
Fase 1: immobilizzazione del fago su beads magnetiche I. Funzionalizzazione di Dynabeads M-280 tosilattivate con il clone fagico-pVIII Li2 (specifico nel legare P. aeruginosa ATCC 27853)
50 ?l di Dynabeads M-280 tosilattivate (Invitrogen cat.
142.03) vengono poste in eppendorf a fondo tondo e lavate 2 volte come segue: con 500 ?l di Buffer Borato (0.1 M Buffer Borato pH 9.5), per 5? in agitazione gentile su ruota e 10? sul magnete prima di scartare il surnatante. Le beads vengono separate sul dispositivo magnetico per 10?, scartato il tampone e risospese in 50 ?l di Buffer Borato. Aggiunti 3x10<6 >cloni fagici Li2, ossia 30 ?l dallo stock 1x10<12 >TU/ml in buffer borato, quindi aggiunti 60?l Buffer Borato e 60?l di solfato d?ammonio buffer (3M pH 7.4). La provetta ? stata incubata per 24h a 37?C in agitazione gentile su ruota inclinata.
Le beads sono state separate sul dispositivo magnetico per 10?, scartato il surnatante e lavate 2 volte con 500 ?l di Buffer PBS pH 7.4 1% BSA per 5?in ruota. Quindi aggiunti 500 ?l di Blocking Buffer (PBS pH 7.4 4% BSA) lasciato in ruota per 2h a RT. Le beads sono state separate sul dispositivo magnetico per 10?, scartato il surnatante e lavate 2 volte con 500 ?l di Buffer PBS pH 7.4 1% BSA per 5? in ruota. Infine le beads sono risospese in 200 ?l di PBS e lasciate a 4?C.
II. ELISA per verificare la funzionalizzazione delle Dynabeads con Li2
Per verificare che dopo questo trattamento ci fossero fagi sulle beads si ? proceduto con un test ELISA. 20 ?l di beads sono lavate 2 volte con 500 ?l di Washing Buffer (PBS pH 7.4 0.5 % Tween 20) per 5? in ruota. Le beads sono state risospese in 100 ?l di anticorpo anti-M13 HPR (1:2500 in PBS 0.1% BSA 0.5% di Tween 20) incubate in ruota a 37?C per 1h. Quindi effettuati 5 lavaggi in 500 ?l di PBS Tween 0.5%. Nell?ultimo passaggio le beads sono state risospese in 250 ?l di TMB e incubate per 20? in ruota a RT al buio. Dopo lo sviluppo completo, la reazione ? stata bloccata con 31 ?l di H2SO4 6N. Le beads sono state poste sul magnete per 10?, quindi 200 ?l della soluzione in toto e di una diluizione 1:10 sono state lette a 450 nm. I risultati ottenuti sono riportati nella tabella 1.
Tabella 1
Fase 2: complessazione con nanosistemi fluorescenti (es. C-Dots - CD)
III. Funzionalizzazione Dynabeads-Li2 con CarbonDots (1.08 mg/mL)
CarbonDots estratti secondo il metodo riportato in Sawalha, S.; Silvestri, A.; Criado, A.; Bettini, S.; Prato, M.; Valli, L. Tailoring the sensing abilities of carbon nanodots obtained from olive solid wastes. Carbon, 2020, 167, 696-708, sono stati utilizzati in un processo di funzionalizzazione con le Dynabeads-Li2.
Effettuate prove con condizioni in H2O:
20?l di Dynabeads-Li2 (circa 2 x10<7 >beads-Li2) preparate come descritto sopra, sono lavate due volte in ruota per 5? con 500?l di PBS. Quindi sono poste sul magnete 10? e, scartato il surnatante, sono risospese in 200?l di H2O. Sono quindi aggiunti 800?l di CarbonDots (1.08 mg/mL).
I campioni sono posti per 2 ore in ruota inclinata a 37?C. I complessi Dynabeads-Li2-CDots cos? formati sono stati separati sul magnete per 10?. Quindi, i surnatanti post-funzionalizzazione sono recuperati, mentre i complessi Dynabeads-Li2-CDots risospesi rispettivamente in 1mL di H2O.
I surnatanti post-funzionalizzazione ed i complessi Dynabeads-Li2-CDots sono stati analizzati in UV-vis e mediante analisi di emissione di fluorescenza.
Fase 3: Rilevamento del microorganismo target - Cattura di P. aeruginosa mediante Dynabeads-Li2-Cdots
In presenza del target, la molecola fluorescente che viene spenta dall?interazione col complesso fago, viene scalzata in soluzione e la fluorescenza riappare.
Condizioni sperimentali:
E? stata preparata una coltura o.n. di P. aeruginosa ATCC 27853 da isolamento su piastra Cetrimide agar in 5 ml di LB. I batteri sono stati raccolti per centrifugazione a 8000xg per 10?, risospesi in un isovolume di PBS.
I batteri cos? preparati sono stati utilizzati per ottenere uno stock batterico in PBS di OD600 di 0.29 (pari a 10<8 >cellule/ml). I complessi Dynabeads-Li2-Cdots (precedentemente analizzato in UV-Vi e fluorescenza quindi diluite in un volume complessivo di circa 3mL) sono stati recuperati attraverso l?ausilio del magnete, quindi risospesi in 1mL di 10<6 >cellule/ml in PBS. I campioni sono stati posti per 30? in ruota inclinata a 37?C.
I campioni sono prima analizzati tal quali in UV-Vis e Fluorescenza.
Quindi poi i complessi Dynabeads-Li2-CDots-P. aeruginosa sono separati sul dispositivo magnetico per 10?, il surnatante raccolto ? stato centrifugato per togliere i batteri residui, quindi il surnatante post-cattura recuperato. Entrambi i campioni, nelle due parti, complessi Dynabeads-Li2-CDots-P. aeruginosa e surnatante post-cattura, sono quindi analizzati in UV-Vis e fluorescenza. I risultati sono illustrati in figura 4.
Claims (10)
1.- Metodo per la determinazione della presenza di un microorganismo bersaglio (2) in un campione biologico (1) comprendente le fasi di:
- fornire una striscia (10) in materiale poroso, detta striscia (10) presentando almeno una zona di fissaggio (12) su cui ? fissato almeno un fago (4) che espone un peptide (3) selettivo per detto microorganismo (2) e una zona di deposizione (11), separata da detta zona di fissaggio (12) e destinata ad accogliere una porzione del campione biologico (1), detto fago (4) essendo legato ad un marcatore (14) in forma disattivata;
- mettere in contatto detto campione biologico (1) con detta striscia (10) su detta zona di deposizione (11) ed eluire, se presente, detto microorganismo (2) attraverso detta striscia (10) in modo che detto microorganismo (2) raggiunga detta zona di fissaggio (12) per formare un complesso fago-microorganismo bersaglio (15) e rilasciare detto marcatore (14?) in forma attivata;
- rilevare detto marcatore (14?) in forma attivata.
2.- Metodo per la determinazione della presenza di un microorganismo bersaglio (2) in un campione biologico (1) comprendente le fasi di:
- mettere in contatto un marcatore (5) con detto campione biologico (1) per ottenere, se presente detto microorganismo (2), un complesso microorganismo bersagliomarcatore (9);
- fornire una striscia (10) in materiale poroso, detta striscia (10) presentando almeno una zona di fissaggio (12) su cui ? fissato almeno un fago (4) che espone un peptide (3) selettivo per detto microorganismo (2) e una zona di deposizione (11), separata da detta zona di fissaggio (12) e destinata ad accogliere una porzione del complesso microorganismo bersaglio-marcatore (9);
- mettere in contatto detto complesso microorganismo bersaglio-marcatore (9) con detta striscia (10) su detta zona di deposizione (11) ed eluire detto complesso (9) attraverso detta striscia (10) in modo che detto complesso (9) raggiunga detta zona di fissaggio (12) per formare un complesso fago-microorganismo bersaglio-marcatore (13);
- rilevare detto complesso fago-microorganismo bersaglio-marcatore (13).
3.- Metodo per la determinazione della presenza di un microorganismo bersaglio (2) in un campione biologico (1) comprendente le fasi di:
- mettere in contatto con detto campione biologico (1) un fago (4) che espone un peptide (3) selettivo per detto microorganismo (2), detto fago (4) essendo legato ad un marcatore (5) per formare un complesso fago-marcatore (6);
- lasciare reagire detto fago (4) con detto campione biologico (1) in modo da consentire, se presente detto microorganismo (2), il legame di detto fago (4) a detto microorganismo bersaglio (2) per ottenere un campione comprendente un complesso microorganismo-fago marcato (7);
- filtrare detto campione comprendente un complesso microorganismo-fago marcato (7) su un filtro (8) in grado di ritenere detto complesso microorganismo-fago marcato (7);
- rilevare detto complesso microorganismo-fago marcato (7).
4.- Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detto marcatore (13) ? costituito da carbon dots, nanoparticelle di semiconduttore come SeC o sistemi molecolari fluorofori come il fenilbutazone.
5.- Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 3, caratterizzato dal fatto che detto marcatore (5) ? selezionato nel gruppo costituito da marcatori fluorescenti, marcatori colorimetrici, marcatori elettrochimici e marcatori magnetici.
6.- Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto marcatore (5) ? selezionato nel gruppo costituito da rodamina, isotiocianato di fluorescina, 4',6-diamidin-2-fenilindolo, Cyto9, Cyto5, ferrocene, nanoparticelle di ossido ferrico e nanoparticelle biossido di cromo.
7.- Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto marcatore (5) ? selezionato nel gruppo costituito da rodamina, isotiocianato di fluorescina, 4',6-diamidin-2-fenilindolo, Cyto9, Cyto5 opzionalmente legati con nanoparticelle magnetiche come ad esempio nanoparticelle di ossido ferrico (Fe2O3) o biossido di cromo (CrO2), sistemi molecolari elettrochimici come ad esempio ferrocene.
8.- Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 caratterizzato dal fatto che detta striscia (10) presenta pi? zone di fissaggio (12) su ciascuna delle quali ? fissato un fago (4) che espone un peptide (3) selettivo per un microorganismo (2).
9.- Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che detto microorganismo bersaglio (2) ? scelto nel gruppo costituito da Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus, Escherichia coli e Staphilococcus epidermidis.
10.- Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che detto peptide (3) ? un peptide avente sequenza peptidica scelta nel gruppo costituito da SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3 e SEQ ID No.4.
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