BRPI0719425A2 - Métodos para a captura de uma amostra de microrganismos tendo uma superfície hidrofóbica, e para a detecção de um microorganismo, e, kit de ensaio de microrganismo - Google Patents
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Description
“MÉTODOS PARA A CAPTURA DE UMA AMOSTRA DE MICRORGANISMOS TENDO UMA SUPERFÍCIE HIDROFÓBICA, E PARA A DETECÇÃO DE UM MICRORGANISMO, E5 KIT DE ENSAIO DE MICRORGANISMO”
A presente invenção diz respeito à captura para uma superfície de microrganismos hidrofóbicos, tal como micobactéria, e ao subsequente processamento, tais como ensaios para sua presença ou identificação.
Micobactérias patogênicas são responsáveis por várias doenças infecciosas severas em humanos e animais. As micobactérias são caracterizadas por um revestimento hidrofóbico, ceroso compreendendo ácido micólico ou compostos relacionados. Ácidos micólicos são ácidos graxos de cadeia ramificada hidroxilados complexos, tipicamente tendo cadeias de hidrocarboneto com um comprimento de cadeia na faixa de C77-80, que causa problemas severos no manuseio da amostra, fazendo com que as bactérias se agreguem formando fios e bóiem na superfície de líquidos e sejam resistentes à centrifugação. As cadeias de hidrocarboneto podem ou não conter grupos oxigenados espaçados, tais como hidroxila, metóxi, ceto ou carboxila. Micobactérias patogênicas incluem Mycobacterium tuberculosis, que é agente causativo do complexo MAC (principalmente M. avium e M. intracellulare) que são patógenos oportunistas em pacientes com AIDS, M. paratuberculosis, que causa inflamação no intestino, M. Ieprae que causa lepra, M. kansasii, M. marinum, complexo M. fortuitum e muitos outros. Também existem muitas outras micobactérias não patogênicas, incluindo M. smegmatis. Também, outros membros da família Mycolata têm componentes de revestimento hidrofóbicos similares. Em alguns, o comprimento de cadeia dos ácidos graxos hidrofóbicos é menor que nas micobactérias, em tomo de 50 átomos de carbono, e em outros em tomo de 30.
De maneira a diagnosticar infecções micobacterianas, tal como tuberculose, a presença do organismo deve ser demonstrada por microscopia, cultura ou métodos moleculares, tal como PCR. Embora a microscopia possa ser feita diretamente a partir da amostra biológica, é mais normal primeiramente isolar e concentrar as micobactérias dos corpos de prova biológicos antes da análise. Amostras biológicas podem incluir perdigoto, 5 urina, sangue, lavagem bronquial etc. Um dos tipos de corpos de prova mais comuns distribuídos para diagnose é perdigoto. Perdigoto apresenta problemas únicos para bacteriologia. Perdigoto é de natureza heterogênea e pode ser com sangue, purulento e viscoso. Ele também pode ser contaminado com outros microrganismos, por exemplo, Pseudomonas.
Comumente, perdigoto é diluído e ao mesmo tempo
descontaminado pelo uso de vários pré-tratamentos. Estes tratamentos incluem o uso de hidróxido de sódio 0,25-0,5 M com ou sem N-acetil L- cisteína, dodecilssulfato de sódio, ácido oxálico ou fosfato de trissódio. Tempos de tratamento podem ser 20-120 minutos. Estes tratamentos são 15 projetados para diluir o perdigoto e matar a maioria dos organismos contaminantes. Micobactérias têm um revestimento ceroso espesso e são mais resistentes a tais tratamentos. Ainda, estima-se que até 60% de Mycobacterium tuberculosis são mortos ou se tomaram não viáveis por este tratamento. Além do mais, em virtude de o Myeobaeterium tuberculosis e 20 outros membros da família crescerem muito lentamente, o crescimento de organismos contaminantes que não são mortos por este tratamento ainda é um problema com uma alta porcentagem de culturas sendo sobre-crescida por contaminantes de rápido crescimento.
Depois do tratamento com os descontaminantes severos a 25 amostra é centrifugada para concentrar as micobactérias que são então analisadas por microscopia, cultura ou amplificação molecular. Esta etapa de centrifugação introduz um risco de infecção ao pessoal do laboratório, uma vez que os conteúdos de qualquer tubo que quebra ou rompe durante a centrifugação podem ser aerossolizados e contaminar o ambiente. A centrifugação também introduz um pescoço de garrafa no processamento da amostra, uma vez que somente um número limitado de amostras pode ser centrifugado em qualquer tempo. Além do mais, a centrifugação comprime todo o material que se tomou desnaturado e insolúvel pelo procedimento de descontaminação severo e prensados muito grandes podem ser obtidos o que sugere problemas para microscopia ou métodos moleculares.
Em virtude dos problemas listados anteriormente as atuais abordagens de descontaminação e concentração seriam extremamente usadas se as micobactérias pudessem ser capturadas diretamente da amostra biológica. Seria proveitoso se este procedimento removesse algum ou todos os organismos contaminantes, de maneira tal que a descontaminação química não fosse necessária ou pudesse ser realizada com condições menos severas. Isto também melhoraria a sobrevivência das micobactérias purificadas e aumentaria a sensibilidade dos testes subsequentes.
Em outras aplicações distintas do processamento da amostra também pode-se usar ligar as micobactérias a uma superfície sólida para permitir fácil concentração ou manipulação dos organismos, por exemplo, captura e lavagem das micobactérias a partir de uma solução de fago para remover fago não infeccioso exógeno ou captura e transferência das micobactérias a partir de uma solução para uma outra.
Métodos de capturar micobactérias para superfícies sólidas foram propostos, incluindo o uso de fago ligado ou fago derivado que liga peptídeos imobilizados em contas e agem como agentes de captura (Stratmann et al; J Clin Microbiol. Novembro de 2002; 40(11): 4244-4250) e incluindo isolamento de M. paratuberculosis do leite pelo uso de contas revestidos com anticorpo (Grant I. R. et al; Appl Environ Microbiol. 1998 Sep; 64(9):3153-8). Entretanto, um método como este pode ser muito caro para uso extensivo, especialmente em países menos desenvolvidos, e pode ser sobre específico em que nem toda bactéria desejada será capturada e envolve moléculas a base de proteína que são suscetíveis a proteases, desnaturação e produtos químicos severos.
De acordo com Hetland G. et al., Immunology 1994, 82, 445- 449, é possível revestir microcontas de látex com BCG por incubação dos 5 contas com bactérias cultivadas e separadas. Entretanto, isto é improvável de ser efetivo para capturar eficientemente tais bactérias de uma amostra biológica contendo outros organismos ou materiais hidrofóbicos.
Observou-se que cloreto de poli dialildimetil amônio (p- DADMAC) liga micobactérias a microcontas de ácido carboxílico. Sem ficar 10 preso á seguinte teoria, acredita-se que a cadeia da espinha dorsal do p- DADMAC hidrofobicamente interage com o revestimento ceroso das micobactérias e a carga positiva na espinha dorsal de p- DADMAC também podem interagir com cargas negativas na superfície das micobactérias, o p- DADMAC então interage ionicamente por meio de seus grupos de amônio 15 quaternário pendentes com os ácidos carboxílicos das microcontas. Também observou-se que superfícies revestidas com p-DADMAC, tais como plásticos e vidros podem ligar micobactérias diretamente.
Assim, micobactérias podem ser tanto capturadas diretamente para superfícies revestidas com p- DADMAC quanto ser capturadas para uma superfície indiretamente.
A presente invenção agora, desta forma, fornece em um primeiro aspecto um método para a captura de uma amostra de microrganismos tendo uma superfície hidrofóbica, cujo método compreende colocar os microrganismos em contato com um reagente de captura, cujo 25 reagente de captura tem tanto um caráter hidrofóbico em que o reagente de captura liga os ditos microrganismos por interação hidrofóbica nele quanto um caráter polar, o dito reagente de captura estando tanto presente em uma superfície e capturando os ditos microrganismos nele, quando estando presente na solução, o dito método então adicionalmente compreendendo capturar os ditos microrganismos para uma superfície pela ligação ao dito reagente de captura à dita superfície por interação polar entre a dita superfície e o dito reagente de captura. Preferivelmente, o método anterior é conduzido usando o agente de captura em solução, de maneira tal que o método 5 compreenda colocar os microrganismos em contato com um reagente de captura em solução cujo reagente de captura tem tanto um caráter hidrofóbico em que o reagente de captura, liga os ditos microrganismos por interação hidrofóbica nele e um caráter polar, por exemplo, caráter poli-iônico, e capturar os ditos microrganismos a uma superfície ligando o dito reagente de 10 captura à dita superfície por interação polar entre a dita superfície e o dito reagente de captura.
A amostra pode ser uma amostra fluida, tais como perdigoto, urina, sangue, lavagem bronquial, etc. ou pode ser uma amostra sólida, tal como uma biópsia de tecido, por exemplo, uma amostra de pele, que preferivelmente é tratada para extrair ou dispersar microrganismos em um líquido para produzir uma amostra de fluido.
Opcionalmente, o dito reagente de captura compreende uma cadeia de hidrocarboneto longa que carrega múltiplos sítios polares, por exemplo, iônicos. Os ditos sítios polares ou iônicos podem ser localizados 20 juntos em uma porção, por exemplo, uma porção da extremidade, da dita cadeia ou podem ser espaçados ao longo da dita cadeia, uma vez que eles estão em p-DADMAC.
O reagente de captura pode ser aniônico, mas preferivelmente é catiônico, como no caso de p-DADMAC e preferivelmente é cloreto de 25 poli- dialildimetil amônio (DADMAC) em si. Uma vez que a maioria das células bacterianas são negativamente carregadas o efeito de p- DADMAC ligando ao revestimento ceroso micobacteriano é que as células são convertidas a uma carga positiva de rede. Isto é vantajoso, uma vez que garante que outros organismos contaminantes que não se ligam a p- DADMAC permaneçam negativamente carregados e então não se tomem ligados às microcontas.
Além do mais, em modalidades de captura direta, organismos que não são suficientemente hidrofóbicos não se ligarão às superfícies revestidas com p- DADMAC na presença de detergentes, dando assim um grau de seletividade do tipo de organismo capturado. Outros reagentes de captura que podem ser considerados incluem polilisina ou polietileniimina. Uma opção seria um copolímero aleatório ou bloco de um aminoácido hidrofóbico, tais como triptofano, leucina, valina, metionina, isoleucina, cisteína, ou fenilalanina e um aminoácido polar, tal como lisina.
O reagente de captura preferivelmente deve ser suficientemente hidrofóbico no caráter para ligar hidrofobicamente a plásticos, por exemplo, às microplacas de poliestireno normalmente empregadas para ligar proteínas, ou alternativamente pode ser capaz de ligar a vidro ou uma superfície tipo vidro, tanto pela interação polar quanto sendo suficientemente hidrofóbico no caráter para ligar hidrofobicamente à superfície, que pode adequadamente ser tal como deve ser encontrado em lâminas de microscópio ou lâminas de cobertura. Mas deve ser suficientemente hidrofílico no caráter que será solúvel em água ou em meio aquoso tamponado, pelo menos na presença de um sistema detergente adequado ou uma quantidade tolerável de um co-solvente orgânico, tal como DMSO. Desta forma, ele é solúvel na mistura com a amostra e quaisquer outros materiais usados.
Independente da teoria anterior, a invenção fornece em um segundo, independente aspecto, um método para a captura de uma amostra fluida de microrganismos tendo uma superfície hidrofóbica, cujo método compreende colocar os microrganismos em contato com um reagente de captura solúvel que compreende poli-DADMAC em que o reagente de captura liga os ditos microrganismos, e captura os ditos microrganismos para uma superfície ligando o dito reagente de captura à dita superfície. Em ambos aspectos da invenção, a dita superfície é adequadamente fornecida por contas. Estes podem ser de dimensões micro ou nano. Adequadamente eles são paramagnéticos para fácil separação do meio líquido. Eles podem ter uma superfície de polímero de ácido carboxílico ou uma superfície caracterizada por grupos sulfato ou fosfato.
O peso molecular do poli-DADMAC pode ser na faixa de menos que 100.000 (muito baixo), 100.000 - 200.000 (baixo), 200.000 - 400.000 ou 500.000 (médio) ou acima de 500.000 (alto). Preferivelmente, a amostra é colocada em contato com o reagente de captura na presença de um sistema detergente de um ou mais detergentes que melhora a seletividade da ligação dos microrganismos desejados. Desejavelmente, os microrganismos são ligados sem ligação a algum ou todos os materiais hidrofóbicos contaminantes presentes na amostra ou sem ligação a algum ou todos os microrganismos na amostra que não são os cuja captura é desejada.
O sistema detergente pode compreende uma amida de aminoácido de um ácido graxo que é preferivelmente N-Iauroil sarcosina. O sistema detergente pode alternativamente ou adicionalmente compreender um detergente Triton X, preferivelmente Triton X-100.
Para a maioria das amostras, o reagente de captura é preferivelmente fornecido em um tampão de captura, adequadamente tendo um pH de 7- 10, mais preferivelmente 7-9, por exemplo, de 8-9 ou 8,2-8,6, tal como um tampão de fosfato ou um tampão Tris. Com amostras muito densas de perdigoto mucóide que contêm grandes quantidades de mucopolissacarídeos que têm muitos grupos de ácido carboxílico um pH inferior para capturar pode ser benéfico. Em um pH suficientemente baixo grupos carboxila são neutralizados e não interferem com pDADMAC ou outros grupos sulfato ou fosfato que apresentam ligação de superfície das micobactérias e a subsequente captura do pDADMAC ou outras superfície. Tais condições, embora projetadas para tratar com amostras altamente mucóides podem ser empregadas com todas as amostras. Adequadamente, o pH do reagente de captura neste caso é de 0 a 4, o pH de 4 sendo baixo suficiente ainda para protonar grupos de ácido carboxílico. Assim, 5 dependendo da escolha da superfície sólida, o pH do reagente de captura pode ser pelo menos de 0 a 10.
O processamento da amostra pode, certamente, incluir um estágio de descontaminação em que a amostra, ou a superfície que carrega os microrganismos capturado é tratada para apresentar microrganismos não 10 viáveis a não ser os de interesse. Isto pode ser realizado com materiais conhecidos como hidróxido de sódio com ou sem N-acetil cisteína, ou com N- acetil cisteína sozinho. O objetivo, certamente, é deixar os microrganismos capturados de interesse em um estado viável. O microrganismo capturado pode, em particular, ser uma micobactéria, que pode ser qualquer uma das 15 referidas anteriormente. A invenção inclui um método para a detecção de um microrganismo, compreendendo capturar o dito microrganismo para uma superfície por um método descrito, lavar o dito microrganismo capturado, e detectar o dito microrganismo capturado na dita superfície ou depois da remoção deste.
O método de detecção usado pode ser qualquer um apropriado
ao microrganismo em questão. Para micobactérias em geral e M. tuberculosis em particular, este incluirá cultivo e detecção microscópica, por exemplo, por coloração, reação em cadeia de polimerase PCR, amplificação mediada por transcrição TMA, ensaio de deslocamento de fita SDA, ou outras 25 metodologias de amplificação e detecção direcionadas aos ácidos nucleicos do organismo em si, e métodos a base de fago incluindo FASTPlaqueTB onde o fago que infecta micobactéria é adicionado e permitido entrar nas células, o fago que é deixado for a das células é morto e depois de adicional incubação para liberar fago das células, a presença do fago liberado é detectada infectando um microrganismo adicional.
Os materiais, ou materiais chave selecionados, necessários para a prática dos métodos de detecção do microrganismo descritos anteriormente podem ser fornecidos na forma de kit. Desta maneira, a 5 invenção inclui um kit de ensaio de microrganismo compreendendo um reagente de captura solúvel tendo tanto um caráter hidrofóbico em que o reagente de captura é capaz de ligar um microrganismo para ser detectado pela interação hidrofóbica nele quanto um caráter poli-iônico, um substrato tendo uma superfície para capturar os ditos microrganismos na dita superfície 10 ligando o dito reagente de captura à dita superfície pela interação polar entre a dita superfície e o dito reagente de captura, e pelo menos um de:
- fago capaz de infectar o dito microrganismo;
- iniciadores para realizar uma amplificação do ácido nucleico genômico do dito microrganismo ou dito fago;
- um meio de cultura para cultivar o dito microrganismo;
- um corante para visualização do dito microrganismo para inspeção microscópica;
- um anticorpo (seja como um anticorpo completo ou como uma porção deste tendo afinidade de ligação seletiva) para ligação do dito
microrganismo; ou
- um reagente de detecção para uso na detecção de um metabólito produzido mediante cultura do dito microrganismo.
De acordo com a invenção descrita anteriormente, a amostra também pode ser gasosa, por exemplo, ar amostra tendo microrganismos aprisionados nela. Uma amostra como esta pode ser borbulhada na solução do reagente de captura para ligar os microrganismos ao reagente de captura.
Alternativamente, a invenção inclui um kit de ensaio de microrganismo compreendendo um reagente de captura revestido e assim imobilizado em uma superfície sólida, o dito reagente de captura tendo tanto um caráter hidrofóbico quanto poli-iônico em que o reagente de captura é capaz de ligar um microrganismo a ser detectado, e pelo menos um de:
- fago capaz de infectar o dito microrganismo;
- iniciadores para realizar uma amplificação de ácido nucleico genômico do dito microrganismo ou dito fago; um meio de cultura para
cultivar o dito microrganismo;
- um corante para visualizar o dito microrganismo para inspeção microscópica;
- um anticorpo (seja como um anticorpo completo ou como uma porção deste tendo afinidade de ligação seletiva) para ligação do dito
microrganismo; ou
- um reagente de detecção para uso na detecção de um metabólito produzido mediante cultura do dito microrganismo.
A superfície sólida pode ser uma lâmina de microscópio.
Preferivelmente, as micobactérias capturadas, capturadas tanto
direta quanto indiretamente, não são nocivas por esta captura e permanecem viáveis. Assim, a invenção pode ser usada para teste de suscetibilidade à droga do organismo. Em um aspecto, as micobactérias podem ser expostas a uma droga de uma maneira tal que permita que a droga afete o organismo. 20 Subsequentemente, as micobactérias podem ser capturadas em qualquer uma das maneiras aqui descritas e então podem ser investigadas parar viabilidade usando qualquer número de métodos previamente descritos que devem incluir microscopia usando corantes de viabilidade, métodos a base de fago, métodos a base de cultura ou métodos a base de PCR. Em um outro aspecto, as 25 micobactérias podem ser primeiramente capturadas de qualquer uma das maneiras aqui descritas então subsequentemente expostas a uma droga de uma maneira tal que permita que a droga afete o organismo. Subsequentemente, as micobactérias podem então ser investigadas para viabilidade usando qualquer número de métodos descritos que devem incluir microscopia usando corantes de viabilidade, métodos a base de fago, métodos a base de cultura ou métodos a base de PCR. As drogas usadas podem incluir os comumente usadas para tratar tuberculose, tais como rifampicina, estreptomicina, isoniazida, etambutol, pirazinamida, e ciprofloxacina.
Os materiais, ou materiais chave selecionados, necessários
para a prática dos métodos de suscetibilidade à droga do microrganismo descritos anteriormente podem ser fornecidos na forma de um kit. Desta maneira, a invenção inclui um kit de ensaio de suscetibilidade à droga do microrganismo compreendendo um reagente de captura solúvel tendo tanto 10 um caráter hidrofóbico em que o reagente de captura é capaz de ligar um microrganismo a ser detectado pela interação hidrofóbica nele e um caráter poli-iônico, um substrato tendo uma superfície para capturar os ditos microrganismos para a dita superfície ligando o dito reagente de captura para a dita superfície pela interação polar entre a dita superfície e o dito reagente 15 de captura, e um ou ambos de:
- uma ou mais drogas a serem testadas; e
- meios para determinar se microrganismos capturados são viáveis, que podem ser um ou mais de:
- um corante que indica viabilidade para visualizar o dito microrganismo para inspeção microscópica;
- fago capaz de infectar o dito microrganismo;
- um reagente de detecção para uso na detecção de um metabólito produzido mediante cultura do dito microrganismo;
e opcionalmente um ou mais dos seguintes se não já presentes: - fago capaz de infectar o dito microrganismo;
- iniciadores para realizar uma amplificação de ácido nucleico genômico do dito microrganismo ou dito fago;
- um meio de cultura para cultivar o dito microrganismo;
- um corante para visualizar o dito microrganismo para inspeção microscópica; - um anticorpo (seja como um anticorpo completo ou como uma porção deste tendo afinidade de ligação seletiva) para ligação do dito microrganismo; ou
- um reagente de detecção para uso na detecção de um metabólito produzido mediante cultura do dito microrganismo.
Alternativamente, a invenção inclui um kit de ensaio de suscetibilidade à droga do microrganismo compreendendo um reagente de captura revestido e assim imobilizado mediante uma superfície sólida, o dito reagente de captura tendo tanto um caráter hidrofóbico quanto poli-iônico em que o reagente de captura é capaz de ligar um microrganismo a ser detectado, e um ou ambos de:
- uma ou mais drogas a serem testadas; e
- meios para determinar se microrganismos capturados são viáveis, que podem ser um ou mais de:
- um corante que indica viabilidade para visualizar o dito microrganismo para inspeção microscópica;
- fago capaz de infectar o dito microrganismo;
- um reagente de detecção para uso na detecção de um metabólito produzido mediante cultura do dito microrganismo; e
opcionalmente um ou mais dos seguintes se não já presentes:
- uma ou mais drogas a serem testadas
- fago capaz de infectar o dito microrganismo;
- iniciadores para realizar uma amplificação de ácido nucleico genômico do dito microrganismo ou dito fago;
- um meio de cultura para cultivar o dito microrganismo;
- um corante para visualizar o dito microrganismo para inspeção microscópica;
- um anticorpo (seja como um anticorpo completo ou como uma porção deste tendo afinidade de ligação seletiva) para ligação do dito microrganismo; ou
- um reagente de detecção para uso na detecção de um metabólito produzido mediante cultura do dito microrganismo.
A superfície sólida pode ser uma lâmina de microscópio.
M. tuberculosis é carregado em partículas carregadas pelo ar, os núcleos das gotículas, que são gerados quando sujeitos infectados que têm tosse, espirro ou berro de doença TB pulmonar ou laringeal. As partículas são aproximadamente 1-5 μηι e podem permanecer suspensas no ar por várias horas, garantindo que elas podem ser espalhadas em todo um quarto ou prédio. Infecção ocorre quando uma pessoa suscetível inala o núcleo da gotícula contendo M. tuberculosis, que então atravessa a boca ou passagem nasal, trato respiratório superior e brônquio para atingir os alvéolos. MDR M tuberculosis também é classificado por CDC como um agente de categoria C de terrorismo biológico e o mecanismo de distribuição é igualmente para ser a geração de um aerossol suspenso no ar.
r
E desejável proteger a saúde dos trabalhadores, outras pessoas na vicinidade do sujeito infectado e pessoal militar do perigo da infecção por inalação. Além do mais, trabalhadores do laboratório que são trabalham com amostras infectadas com TB, culturas de TB e amostras contendo outras micobactérias patogênicas (tal como M. paratuberculosis em fezes) também estão em risco de infecção. Atualmente, a saúde dos trabalhadores e do pessoal do laboratório tentam prevenir a infecção usando máscaras faciais, ou um respirador de filtro particulado mais sofisticado.
O CDC recomenda que um respirador com filtro particulado certificado por National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) (por exemplo, N95, N99, ou Nl00) deve ser usado, com a capacidade de eficientemente filtrar as menores partículas na faixa de 1-5 μηι. Máscaras faciais são geralmente compostas de materiais de te4cido simples ou não tecido; elas podem ter várias camadas e podem ter uma especificação que indica um tamanho de poro definido. Entretanto, a maioria das máscaras não são certificadas pela NIOSH como respiradores, não protegem o usuário adequadamente da exposição ao TB e não satisfazem os requerimentos do 5 OSHA para proteção respiratória. Um estudo mostrou que o uso de proteção respiratória é estimado para reduzir o risco de infecção em trabalhadores de cuidado com a saúde pelas seguintes proporções (comparado a nenhuma proteção): máscara facial cirúrgica, 2,4-vezes; máscara que filtra ar particulado de alta eficiência (HEPA) descartável, pó, fumo ou névoa 10 descartável, 17,5-vezes; respirador de cartucho HEPA elastomérico, 45,5- vezes; ou respirador que purifica o ar empoeirado (PAPR), 238-vezes. (J Occup EnvironMed. 1997 Sep;39 (9):849-54).
Embora o respirador de filtro particulado forneça um alto nível de proteção ele tem a desvantagem de alto custo e é restrito no uso. Existe 15 uma necessidade de uma máscara facial melhor, descartável que fornece melhor proteção ao usuário da infecção por micobactérias suspensas no ar em situações onde o respirador não é disponível ou é inapropriado para uso. Esta é a situação nos países em desenvolvimento e também em laboratórios. O é necessário é uma máscara e/ou filtro facial que fornece um método específico 20 e eficiente de ligar aerossóis contendo micobactéria gerados pelos sujeitos infectados e acidentalmente gerados no laboratório, então enormemente melhorando o padrão de proteção do usuário.
A invenção, desta maneira, fornece um filtro para filtrar uma corrente gasosa para remover microrganismos aprisionados nela, o dito filtro 25 compreendendo uma superfície polar e um reagente de captura na superfície polar ou à montante dela, cujo reagente de captura tem tanto um caráter hidrofóbico em que ele é capaz de ligar bactérias revestidas hidrofobicamente pela interação hidrofóbica quanto um caráter polar, por exemplo um caráter poli-iônico, em que ele é ligado ou adaptado para ligar a dita superfície polar. O filtro pode ter a forma de uma máscara facial para proteger um usuário ou pode ser uma unidade de filtro anexada a uma máscara facial ou capacete. Ele pode ser um filtro instalado ou para instalação em um duto de fornecimento de ar.
Em um aspecto preferido da invenção, para fornecer melhor proteção, uma máscara facial pode ser fornecida que é impregnada com um reagente de captura solúvel tendo tanto um caráter hidrofóbico em que o reagente de captura se liga às micobactérias pela interação hidrofóbica e um caráter polar, por exemplo, caráter poli-iônico, em que o reagente de captura se liga à superfície iônica pela interação polar.
O agente de captura solúvel pode ser aspergido em um material de máscara de fase sólida adequado, tal como o material de filtro da máscara facial e então seco antes do empacotamento do produto. Quando em uso, a máscara facial se tomará úmida em virtude da respiração exalada do usuário e o agente de captura então se tomará solubilizado na camada da umidade na superfície do material da máscara. O impacto dos aerossóis contendo micobactérias a esta superfície resultará em rápida ligação do reagente de captura solúvel às células das micobactérias. O uso de um material de fase sólida na máscara que é poli-iônico levará a imobilização da micobactéria na fase sólida. Isto eliminará qualquer possibilidade da geração adicional de um aerossol infeccioso da superfície durante a inalação e fornecerá um alto nível de proteção para o operador.
Neste primeiro exemplo o reagente de captura solúvel ficará ligado ao material de fase sólida poli-iônico da máscara na umectação e antes do impacto do aerossol. Isto pode ter o efeito de reduzir a eficiência de captura das micobactérias, uma vez que a superfície pode se tomar saturada com o reagente de captura e então não se ligará ao complexo de células da micobactéria/reagente de captura solúvel nos aerossóis de impacto. Alternativamente, o reagente de captura ligado pode ter uma menor afinidade ou avidez para os microrganismos em virtude da interferência da superfície sólida.
Esta desvantagem pode ser sobreposta usando uma máscara facial de duas camadas que tem uma primeira camada externa impregnada 5 com o reagente de captura solúvel em um material neutral, não carregado. Aerossóis de impacto resultarão na formação de um complexo micobactéria/reagente de captura solúvel que então se toma firmemente ligado pelo material poli-iônico na segunda camada interna da estrutura da máscara facial.
Desta maneira, a invenção inclui um filtro descrito
inicialmente, em que o dito reagente de captura é fornecido em uma superfície sólida tendo baixa afinidade de ligação para o reagente de captura à montante da dita superfície polar.
Nos desenhos em anexo:
A figura 1 mostra visualização microscópica de corante de
Ziehl Neelson de Mycobacterium bovis no exemplo 10 na etapa 5 (painel da mão esquerda) e depois da etapa 6 (painel da mão direita);
A figura 2 mostra em maior (painel do topo) e menor (painel da base) amplificação os microrganismos isolados das contas na etapa 6 do exemplo 10;
A figura 3 mostra revestido (esquerda) e não revestido (direita) processado no exemplo 11; e
A figura 4 mostra micobactérias capturadas no exemplo 12 e coradas para demonstrar a viabilidade.
A invenção será ainda descrita e ilustrada pelos seguintes
exemplos. Nestes exemplos, como M. smegmatis compartilha muitas propriedades em comuns com M tuberculosis, mas não é infeccioso, ele foi usado como um organismo modelo representativo para o gênero de micobactéria. EXEMPLOS Exemplo 1. Titulação de ligante pDADMAC e contas de captura
Fundamento. Este experimento foi realizado de maneira a determinar a quantidade ideal de ligante e contas para usar para captura da micobactéria. A quantidade de micobactéria capturada foi analisada por PCR do genoma da micobactéria.
Método
1. Replicatas de 1 μί de uma cultura de Mycobacterium smegmatis foram preparadas em 1 mL de meio de cultura 7H9 OADC (meio 7H9 suplementado com 10% de OADC, Difco).
2. 250 μΕ de 5 x Tampão de captura (Tris 250 mM pH 8,3, 5% (p/v) de N-Iauroil sarcosina, 5% (v/v) de Triton X-100, 5% (p/v) de BSA) foram adicionados e misturados.
3. Várias quantidades de pDADMAC (Sigma Aldrich, peso molecular médio, 400.000 a 500.000) diluídas em água foram adicionadas, misturadas e incubadas por 15 min.
4. Contas paramagnéticos de ácido carboxílico foram adicionados em uma razão de volume de 10:1 comparado ao volume inicial de pDADMAC, misturados e incubados por 15 minutos. Os contas foram capturados por meio de um plataforma magnética e lavados em I mL de PB S.
6. 20 \iL de NaOH 100 mM, 0,05% (v/v) de Triton X-100 foram adicionados e os contas ressuspensos e aquecidos a 950C por 5 minutos.
7. 10 μι de HCl 200 mM foram adicionados e 2 μΕ do eluato foram analisados por PCR quantitativo para Myeobacterium smegmatis. Análise de PCR.
Uma máquina de cromo 4 MJ Research Inc. (Hercules, Califórnia) foi usada. Kits Sybr Green (Eurogentec, Seraing, Bélgica) foram usadas que possibilitam que produto PCR seja monitorado por meio de fluorescência do intercalador da fita dupla de DNA. Parâmetros de PCR usados incluíram, aquecimento a 950C por 10 segundos, iniciadores de têmpera a 65°C por 15 segundos e extensão a 72°C por 15 segundos. Iniciadores de PCR 5' TCA GGC CCT CGA AAG CCG ACT GGG 3', 5' 5 CCA GGA CTC GGT ACA AGA CTC TGC 3’ específicos para o genoma de M. smegmatis foram usados.
Resultados
quantidade de quantidade de ciclo no qual o PCR ciclo no qual o PCR pDADMAC contas usados foi positivo. M. foi positivo. Nenhum usado smegmatis presente controle de M. smegmatis 5 μΙ, de 0,01% 50 μΕ 25,2 34,1 (v/v) 2 μι de 0,01% 20 μΕ 27,2 permaneceu negativo (v/v) 5 μι de 0,004% 10 μΕ 26,5 37,1 (v/v) 2,5 μΐ, de 0,004% 2,5 μΐ, 28,7 35,7 (v/v) Conclusão
5 μι de pDADMAC 0,01% funcionaram bem, dando um sinal no ciclo 25 comparado ao ciclo 34 para nenhum controle de bacilo (fundo PCR iniciador-dímero). Diluições de pDADMAC e contas deu uma recuperação progressivamente menor de M smegmatis.
Exemplo 2. Investigação da eficiência de captura
A eficiência de captura de M smegmatis encravado no meio foi investigada comparado à mesma quantidade de M smegmatis extraída por aquecimento de álcali e detectada por PCR diretamente.
Método
1. Diluições de uma cultura de Myeobaeterium smegmatis foram preparadas em 1 mL de meio de cultura 7H9 OADC (meio 7H9
suplementado com 10% de OADC, Difco).
2. 250 μί de 5x Tampão de captura (Tris 250 mM pH 8,3, 5% (p/v) de N-Iauroil sarcosina, 5% (v/v) de Triton X-100, 5% (p/v) de BSA) foram adicionados e misturados.
3. 10 μΐ, de 0,01% (v/v) de pDADMAC (Sigma Aldrich, peso molecular médio, 400.000 a 500.000) foram adicionados, misturados e incubados por 15 minutos.
4. 50 pL de contas paramagnéticas de ácido carboxílico
MyOne foram adicionados, misturados e incubados por 15 minutos.
5. As contas foram capturadas por meio de um plataforma magnética e lavadas em 1 mL de PB S.
6. 20 JiL de NaOH 100 mM, 0,05% (v/v) de Triton X-100 foram adicionados e as contas ressuspensas e aquecidas a 95°C por 5 minutos.
7. 10 μΤ de HCl 200 mM foram adicionados e 2 μΐ, do eluato foram analisados por PRC quantitativo para Mycobacterium smegmatis.
8. Além do mais, 1 \\L da mesma cultura de M smegmatis foi tratado diretamente com álcali, da forma descrita nas etapas 6-7 anteriores e
analisado por PCR da mesma maneira.
Análise de PCR.
O PCR é descrito no exemplo 1.
Resultados
Diluição de M. smegmatis Aproximação do número de ciclo no qual o PCR foi bacilos positivo IO'3 100.000 26,7 ío·4 10.000 32,0 10’5 1.000 37,3 nenhum controle de M. 0 35,6 smegmatis 1 μι de M. smegmatis 100.000 26,5 tratado diretamente Conclusão
A eficiência de captura dos bacilos foi muito alta com um sinal
similar gerado da mesma quantidade de bacilos espetados e recuperados analisados diretamente. Poucos bacilos como 10.000 espetados no mL do meio podem ser recuperados e detectados. Exemplo 3. Investigação do requerimento para tampão de captura Fundamento. M. smegmatis espetado no meio foi recuperado na presença ou ausência de tampão de captura.
Método.
O método foi da forma descrita no exemplo 1 exceto que em
uma amostra nenhum tampão de captura foi adicionado. Resultados
tampão de captura presente ciclo no qual o PCR foi positivo nenhum tampão de captura 25,5 tampão de captura usado 23,0 Conclusão
O tampão de captura melhorou a recuperação dos bacilos em
2,5 ciclos ou cerca de 6-vezes em termos de genomas do bacilo e bacilo. Isto é provavelmente em virtude da ação dos detergentes no meio e menor interferência por elementos inibitórios que inibem a ligação do M. smegmatis ao reagente de captura.
Exemplo 4. Demonstração da utilidade da captura do ligante de M. smesmatis em um ensaio a base de fago
Fundamento. Micobactérias podem ser testadas para viabilidade por meio da capacidade da bactéria de hospedar infecção por bacteriófago. Um dos problemas desta abordagem é separar o bacilo infectado do bacteriófago não infectante exógeno. Uma vez separado do fago exógeno o bacilo pode ser lisador e investigado para bacteriófago infectante endógeno.
Método. 100 pL de M. smegmatis foram adicionados a 10 mL de meio 7H9 OADC e incubados por 3 horas a 37°C. Um controle negativo sem bacilo também foi preparado. 100 μΕ (cerca de IO10 pfus) de D29 micobacteriófago foram adicionados a ambos os tubos e as amostras colocadas de volta no incubador. 1 mL de alíquotas foram removidas em vários pontos de tempo pós-infecção e os M smegmatis capturados do meio da forma descrita no exemplo 1, exceto que três lavagens adicionais foram realizadas em PB S. Os bacilos capturados foram lisados da forma descrita e investigados para a presença de genoma de fago infectante endógeno por PCR. O PCR foi da forma descrita previamente exceto que iniciadores específicos do genoma do fago 5' CCT CGG GCT AAA AAC CAC CTC 5 TGA CC 3', 5' CTG GGA GAA TGT GAC ACG CCG ACC 3' foram usados. Resultados
tempo pós-infecção M. smegmatis presente ciclo no qual o PCR foi positivo 15 minutos sim permaneceu negativo 15 minutos não 39,8 30 minutos sim 27 30 minutos não permaneceu negativo 60 minutos sim 30 60 minutos não permaneceu negativo 90 minutos sim permaneceu negativo 90 minutos não permaneceu negativo 120 minutos sim 31 120 minutos não permaneceu negativo Conclusão
A capacidade de capturar M. smegmatis do meio permitiu que o bacilo fosse lavado e o fago exógeno fosse removido. O único fago que foi subsequentemente detectado foi o que tinha infectado o bacilo. Neste exemplo, o processo foi usado para monitorar o processo infeccioso. 15 minutos depois da adição do fago não houve nenhum sinal detectado do bacilo. O fago ainda tem que infectar e o genoma do fago não é replicado. O genoma do fago endógeno aparece em 30 minutos no bacilo, mas declina no ponto de tempo de 60 minutos, desaparecendo completamente no ponto de tempo de 90 minutos, a medida em que o fago replica e lisa o bacilo. O sinal reaparece a 120 minutos a medida em que o fago replicado de segunda geração liberado se submete a uma outra rodada de infecção e replicação. Exemplo 5. Demonstração da captura das micobactérias de perdigoto Fundamento. Perdigoto é uma matriz complexa e viscosa. O
experimento foi realizado para mostrar que esta matriz não interfere com a captura das micobactérias. Método
Um grupo de 5 amostras de perdigoto foi preparado e aliquotado em um volume de I mL. 10 μΕ de cultura de M. smegmatis foi adicionado à metade das alíquotas. 100 μΕ de NaOH 5 M, 2,5% de N-acetil 5 cisteína foram adicionados e incubados por 15 minutos para diluir e descontaminar o perdigoto. 100 μΐ^ de HCl 5 M foram adicionados seguido por 250 μι de 5 x Tampão de captura (da forma descrita previamente). O M smegmatis foi então capturado do perdigoto e quantificado por PCR da forma descrita no exemplo 2, etapas 3-8.
Resultados
A amostra com M. smegmatis foi positiva no ciclo 20 do PCR. A amostra sem bacilo (isto é, de fundo) foi positiva no ciclo
36,3 do PCR.
Conclusão
O método de extração usando pDADMAC e captura de conta
não foi inibido pela matriz da amostra (perdigoto) e M. smegmatis foi recuperado com êxito da amostra.
Exemplo 6. Demonstração da captura de micobactérias do perdigoto sem a necessidade de diluição e descontaminação com álcali Fundamento. Perdigoto é uma matriz complexa e viscosa.
Tratamento com álcali dilui e descontamina o perdigoto, mas também pode danificar as micobactérias. Este experimento foi realizado para mostrar que o procedimento de extração pode ser usado sem tratamento com álcali anterior. Novamente, M. smegmatis foi usado como um organismo modelo para o gênero de micobactérias.
Método
Um grupo de 5 amostras de perdigoto foi preparado e aliquotado em volume de 1 mL.
10 μι de cultura de M. smegmatis foram adicionados a metade das alíquotas. 250 μι de 5 x Tampão de captura (da forma descrita previamente) foram adicionados e misturados.
O M. smegmatis foi então capturado do perdigoto e quantificado por PCR da forma descrita no exemplo 2, etapas 3-8.
Resultados
A amostra com M. smegmatis foi positiva no ciclo 24,7 do
PCR.
A amostra sem bacilo (isto é, de fundo) permaneceu negativa.
Conclusão
O método extração que usa pDADMAC e captura de conta não requereu tratamento anterior do perdigoto com álcali. Observou-se que a adição de tampão de captura foi suficiente para causar a decomposição e diluição do perdigoto que subsequentemente deixado para a recuperação de M. smegmatis da amostra.
Exemplo 7. Demonstração da necessidade do ligante pDADMAC no sistema de captura
Fundamento. Este experimento foi realizado de maneira a demonstrar que o reagente de captura, exemplificado aqui por pDADMAC, é crucial para captura de micobactérias e que as micobactérias não se ligam à cabeça carboxila na ausência de reagente de captura.
Método
0,5 mL de alíquotas de uma cultura de fase estacionária de M smegmatis foram centrifugados para precipitar o organismo, então os organismos ressuspensos em tampão de captura (Tris 50 mM pH 8,3, 1% (p/v) de N-Iauroil sarcosina, 1% (v/v) de Triton X-IOO, 1% (p/v) de BSA). A uma alíquota 10 pL de 0,01% de pDADMAC foram adicionados, misturados e incubados por 15 minutos. Uma alíquota idêntica não tinha nenhum pDADMAC adicionado e foi deixada por 15 minutos. 50 μΐ. de contas paramagnéticas de ácido carboxílico MyOne (lavadas x 3 antes do uso em dH20 e ressuspensas no volume original de dH20) foram então adicionadas a cada alíquota e incubadas 15 minutos. As alíquotas foram então colocadas em um ímã e qualquer clareamento da 5 suspensão turva dos organismos estimada pelo olho. Os sobrenadantes foram então removidos e mantidos. As contas foram então lavadas em x 1 de tampão de captura e x 2 em meio 7H9 OADC e ressuspensas em 1 mL deste meio. Um equivalente de 0, 1 \xL do sobrenadante e a suspensão de contas foram plaqueados em placas de ágar 7H9 OADC e incubados por 2 dias a 37°C 10 depois de cujo tempo o número de colônias em cada placa foi contado. Resultados
Depois da adição das contas magnéticas e disposição das alíquotas em um ímã houve o clareamento substancial da alíquota que foi incubada com o reagente de captura pDADMAC. Isto foi devido à captura da 15 maioria dos organismos na suspensão nas partículas magnéticas. A alíquota que não tinha o reagente de captura adicionado permaneceu turva, uma vez que os organismos permaneceram em suspensão. Inúmeros bacilos capturados e não capturados na presença e ausência de reagente de captura foram contados das culturas de placa de ágar e tabuladas (ver tabela a seguir).
número de colônias contadas número de colônias contadas na ausência de reagente de com reagente de captura captura pDADMAC pDADMAC adicionado sobrenadante maior que 1.000 490 conta capturada 359 maior que 1.000 Conclusão
A captura das micobactérias, determinada por meio de turbidez visual, por meio das contas de ácido carboxílico foi dependente da presença de pDADMAC. Esta observação visual foi confirmada por quantificação microbiológica. Na presença de reagente de captura a vasta maioria das 25 micobactérias foram capturadas, enquanto que na ausência de reagente de captura houve mínima adsorção às contas. Exemplo 8. Demonstração da seletividade da captura do ligante para micobactérias
Fundamento. Este experimento foi realizado de maneira a demonstrar que o pDADMAC reagente de captura se liga especificamente às micobactérias e não se liga aos outros organismos testados, incluindo organismos representativos gram negativos e gram positivos, que também podem contaminar corpos de prova biológicos relevantes.
Método
0,5 mL de alíquotas de cultura de fase estacionárias de M 10 smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia eoli foram centrifugadas para precipitar os organismos, então os organismos foram ressuspensos em tampão de captura (Tris 50 mM pH 8,3, 1% (p/v) de N-Iauroil sarcosina, 1% (v/v) de Triton X-100, 1% (p/v) de BSA). A cada alíquota de cada organismo 10 μί de 0,01% de pDADMAC foram 15 adicionados, misturados e incubados por 15 minutos.
50 \\L de contas paramagnéticas de ácido carboxílico MyOne (lavadas x 3 antes do uso em dH20 e ressuspensas no volume original de dH20) foram então adicionados a cada alíquota e incubados 15 minutos. As alíquotas foram então colocadas em um ímã e qualquer clareamento da 20 suspensão turva dos organismos estimada pelos olhos. Os sobrenadantes foram então removidos e mantidos. As contas foram então lavadas em x 1 de tampão de captura. As alíquotas de M. smegmatis foram então lavadas x 2 em meio 7H9 OADC e ressuspensas em 1 mL deste meio. Os outros organismos foram lavados da mesma maneira em meio Mueller Hinton e ressuspensos em 25 1 mL deste meio.
Um equivalente de 0,1 \xL do sobrenadante e a suspensão de contas foram plaqueados tanto em placas de ágar 7H9 OADC para M smegmatis quanto placas de ágar Mueller Hinton para os outros organismos e incubados a 37°C até que as colônias bacterianas aparecessem depois de cujo tempo as inúmeras colônias em cada placa foram contadas. Resultados
Conforma anteriormente, a suspensão de M. smegmatis foi clareada quando colocada no ímã que demonstra que o organismo foi capturado da solução. As suspensões de todos os outros organismos testados permaneceram muito turvas demonstrando que os organismos não foram capturados e permaneceram em suspensão. Inúmeros bacilos capturados e não capturados foram contados das culturas de placa de ágar e tabulados.
Organismo Número de colônias do Número de colônias das sobrenadante contas M. smegmatis 221 maior que 1.000 P. aeroginosa maior que 10.000 12 S. aureus maior que 1.000 8 E. coli maior que 10.000 22 Conclusão
O reagente de captura pDADMAC permitiu a captura
específica da micobactéria M. smegmatis. Os outros organismos testados não se ligaram a este reagente de captura e não foram capturados.
Exemplo 9. Investigação da composição do tampão de captura requerido para captura específica
Fundamento. Este experimento foi realizado de maneira a investigar os componentes do tampão de captura que são importantes na ligação específica de pDADMAC a micobactérias.
Método
0,5 mL de alíquotas de cultura de fase estacionárias de M smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Eseherichia eoli foram centrifugadas para precipitar os organismos, então os organismos foram ressuspensos em várias partes do componente do tampão de captura, a cada alíquota de cada organismo 10 |iL de 0,01% de pDADMAC foram adicionados, misturados e incubados por 15 minutos. A uma outra alíquota de cada organismo, nenhum reagente de captura foi adicionado como um controle para observação da captura mediada pelo reagente de captura. 50 μΐ. de contas paramagnéticas de ácido carboxílico MyOne (lavadas x3 antes do uso em dH20 e ressuspensas no volume original de dH20) foram então adicionadas a cada alíquota e incubadas 15 minutos.
As alíquotas foram então colocadas em um ímã e qualquer clareamento da suspensão turva de organismos estimada pelos olhos. Resultados
Os resultados foram registrados e apresentados na tabela a seguir. Os organismos não micobactérias não foram capturados pelas contas na ausência ou presença de reagente de captura em quaisquer condições IO tampão. A captura das micobactérias foi dependente da presença do reagente de captura pDADMAC e a captura foi observada em todas as condições de tampão estudadas. O uso de um tampão contendo N-Iauroil sarcosina somente pareceu parcialmente inibir a captura. Quando sarcosina foi usada em combinação com Triton-Xl00, entretanto a eficiência de captura foi restaurada. Se N-Iauroil sarcosina não estivesse presente no tampão de captura as contas seriam muito agrupadas depois da ressuspensão depois da captura micobacteriana. A inclusão de N-Iauroil sarcosina preveniu este agrupamento pós-captura e auxiliou a manipulação das contas que seriam importantes para subsequente lavagem da conta e processamento e análise pós-captura.
Conclusão
Da forma demonstrada previamente, organismos não micobacterianos não foram capturados para as contas na presença ou ausência de reagente de captura em quaisquer condições testadas. A captura das 25 micobactérias foi dependente da presença do reagente de captura e pode ser demonstrada em todas as condições testadas. A inclusão de N-Iauroil sarcosina no tampão de captura foi crucial para a manipulação pós-captura e análise do material capturado. Exemplo 9: tabela de resultados Organismo usado Tampão de P. aeruginosa P. aeruginosa S. aureus com S. aureus sem E. coli com E. coli sem M smegmatis M. smegmatis captura usado com reagente de sem reagente de reagente de reagente de reagente de reagente de com reagente de sem reagente de captura captura captura captura captura captura captura captura Tris 50 mM turbidez turbidez turbidez turbidez turbidez turbidez claro turbidez pH 8,4 de 1% permanece permanece permanece permanece permanece permanece permanece de N-Iauroil sarcosina 1% (v/v) Triton X- 100 Tris 50 mM turbidez turbidez turbidez turbidez turbidez turbidez ligeiramente turbidez pH 8,4 de 1% permanece permanece permanece permanece permanece permanece turvo permanece de N-Iauroil sarcosina Tris 50 mM turbidez turbidez turbidez turbidez turbidez turbidez claro turbidez pH 8,4 de 1% permanece permanece permanece permanece permanece permanece permanece (v/v) de Triton X-IOO Tris 50 mM turbidez turbidez turbidez turbidez turbidez turbidez claro turbidez pH 8,4 permanece permanece permanece permanece permanece permanece permanece Exemplo 10. Deteccão de micobactérias por captura de ligante e microscopia rápida ácida
Mycobacterium bovis foi capturada da solução e corada tanto por corante de Ziehl Neelsen rápido ácido quanto por corante auramina fenol fluorescente diretamente na conta ou depois da eluição.
Método
1. 250 pL de 5x tampão de captura (Tris 250 mM pH 8,3, 5% (v/v) de Triton X-100, 5% Zwittergente [3-(N,N-dimetilmiristilamônia) - propanossulfonato] ) foi adicionado a 1 mL de meio 7H9 contendo uma suspensão de Micobactéria bovis.
2. 10 |iL de 0,01% (v/v) de pDADMAC foram adicionados, misturados e incubados por 15 minutos.
3. 50 μι de contas paramagnéticas de ácido carboxílico MyOne foram adicionados, misturados e incubados por 15 minutos.
4. As contas foram capturadas por meio de um plataforma magnética e lavadas em I mL de PB S.
5. Metade do volume das contas foi manchado em uma lâmina de microscópio, seco e fixado a quente antes da coloração de Ziehl Neelsen. No painel esquerdo da figura 1, micobactérias capturadas são vistas antes da eluição do ligante/contas. As contas magnéticas são indicadas pela seta inferior. Micobactérias rápidas ácidas altamente agregadas capturadas por contas são indicadas pela seta superior e podem ser vistas rodeadas de contas.
6. As contas remanescentes foram ressuspensas em 100 μι de dH20 e 10 pL de clorofórmio foram adicionados. Depois de vortexar a mistura de clorofórmio com a acamada aquosa, as contas foram arrastadas para o lado do tubo com um ímã e o sobrenadante manchado em um lado, seco, fixado a quente e corado tanto por corante de Ziehl Neelsen quanto corante auramina fenol. Todas as colorações foram realizadas da forma descrita em Medicai Microbiology, a Practical Approach, Eds., Peter Hawkey and Deidre Lewis, Oxford University Press. Na figura 1, painel da direita, as micobactérias capturadas são vistas depois de eluição do ligante/contas. A eluição dispersou as micobactérias rápidas ácidas (seta inferior). Algumas contas ainda estão presentes (seta superior). A figura 2 mostra os 5 microrganismos capturados das contas. Em alta amplificação no painel superior um agregado de micobactérias fluorescentes capturadas com ligante pode ser visto e no painel inferior em menos amplificação a “estrelada” típica de fluorescência micobacteriana típica pode ser vista.
Resultados
As micobactérias são capturadas pelo ligante/contas
paramagnéticas e, sem eluição, depois da coloração de Ziehl Neelsen podem ser vistas como um material rosa altamente agregado rodeado por contas. Depois da eluição, as micobactérias são separadas das contas e são dispersas (ver figuras 1 e 2).
Conclusão
As micobactérias podem ser capturadas pelo TB-Iigante e podem ser visualizadas por coloração rápida ácida e microscopia.
Depois da eluição, as micobactérias são isoladas das contas e são dispersas. Experimentos adicionais demonstraram que a captura do ligante e protocolo de coloração funcionam bem para amostras de TB clínicas em perdigoto e que microscopia fluorescente pode ser usada para uma detecção mais sensível.
Exemplo 11. Captura direta de micobactérias em superfície sólida revestida com ligante com coloração e detecção in situ dos organismos capturados por microscopia
Fundamento. Este experimento foi realizado de maneira a demonstrar a captura de micobactérias para lâminas revestidas com p- DADMAC visualizadas por coloração e microscopia in situ.
Método. Uma lâmina de microscópio foi revestida com p- DADMAC inundando a lâmina com 2% (v/v) de p-DADMAC (diluído de um estoque de 20% em água destilada) e permitindo evaporasse até secura. Uma lâmina não revestida foi usada como um controle. As lâminas foram então lavadas em grandes quantidades de água destilada e secas. 100 μΐ^ de cultura de M. smegmatis foram adicionados a 800 μι de dH20 e 100 μι de tampão de captura (10%(p/v) de Zwittergente [3-(n,N-dimetilmiristilamônia) - propanossulfonato], 10% (v/v) de Triton X-10, Tris 500 mM pH 8,3) e manchados nas lâminas. Depois da incubação por 10 minutos as lâminas foram lavadas em água destilada e coradas para gram da forma descrita em Medicai Microbiology, a Practical Approach, Eds., Peter Hawkey and Deidre Lewis, Oxford University Press.
Resultados
Micobactérias gram positivas podem ser observadas por microscopia capturadas em grandes números na lâmina revestida com p- DADMAC (ver figura 3), enquanto que muito poucas (se presentes) micobactérias foram capturadas na lâmina não revestida.
Conclusão
Isto demonstra que micobactérias podem ser capturadas pela lâmina revestida com p- DADMAC e que estas micobactérias podem ser coradas in situ e observadas por microscopia. Resultados similares também foram obtidos de culturas de BCG e corando por corante de Ziehl Neelsen rápido ácido e corante auramina fenol fluorescente.
Exemplo 12. Captura direta de micobactérias em superfície sólida revestida com ligante com coloração de viabilidade in situ e detecção pode microscopia
Fundamento. Este experimento foi realizado de maneira a demonstrar que as micobactérias capturadas para lâminas revestidas com p- DADMAC permanecem viáveis e podem ser visualizadas por corantes de viabilidade in situ seguido por microscopia. Método
Uma lâmina de microscópio foi revestida com p-DADMAC inundando a lâmina com 2% (v/v) de p-DADMAC (diluído de um estoque de 20% em água destilada) e permitindo que evapore até secura. Uma lâmina não 5 revestida foi usada como um controle. As lâminas foram então lavadas em grandes quantidades de água destilada e secas. 100 jjL de cultura de M smegmatis foram adicionados a 800 |jL de dH20 e 100 μι de tampão de captura (10%(p/v) de Zwittergente [3-(n,N-dimetilmiristilamônia) propanossulfonato], 10% (v/v) de Triton X-100, Tris 500 mM pH 8,3) e
manchados nas lâminas. Depois da incubação por 10 minutos as lâminas foram lavadas em água destilada e 1 mg/mL de brometo de tiazolil azul tetrazólio (MTT) em meio 7H9, OADC adicionados e incubados por 30 minutos a temperatura ambiente. Depois da lavagem em água destilada a micobactérias viáveis foram observadas por microscopia.
Resultados
O corante MTT é depositado como um corante azul/preto insolúvel nos organismos viáveis capturados na lâmina revestida com p- DADMAC permitindo que os organismos viáveis sejam detectados por microscopia (ver figura 4).
Conclusão
Isto demonstra que as micobactérias podem ser capturadas pela lâmina revestida com p- DADMAC e que estas micobactérias capturadas permanecem viáveis e podem ser coradas por corantes de viabilidade, tal como MTT.
Exemplo 13. Método para uso com perdigoto mucóide
Fundamento. Algumas amostras de perdigoto podem ser muito espessas e mucóides com uma alta concentração de mucopolissacarídeos que são altamente reticulados por pontes de sulfeto covalentes e altamente carregados com muitos grupos carboxila. O uso de agentes de redução, tais como ditiotreitol e N-acetil cisteína para romper as ligações de dissulfeto foram discutidas, mas os mucopolissacarídeos, em alta concentração, ainda podem interferir com a captura das micobactérias por meio da interação dos grupos carboxila carregados negativamente com o pDADMAC carregado 5 positivamente. De maneira a reduzir esta inibição pode ser desejável realizar a captura em um baixo pH - em um pH no qual os grupos carboxila são neutralizados, mas o pDADMAC permaneça carregado. Em pHs baixos como este não seria possível capturar o pDADMAC em contas de carboxila, uma vez que estas também teriam perda de sua carga, assim, em pH baixo contas
de carboxila devem ser substituídas por contas de sulfato que permanecem negativamente carregadas em condições que contas de carboxila se tomam neutras. Estas condições foram testadas para a captura de Mycobacterium tuberculosis de perdigoto fornecido pelo banco de perdigoto da World Health Organization.
Método
1. Contas de amina BioMag (BM546, Bangs Laboratories Inc., US) foram primeiramente revestidas em 5% (v/v) de pDADMAC (alto peso molecular) em dH20 por 1 hora então, depois da lavagem em dH20 sobre- revestidas com 10 mg/mL de sulfato de dextrano (500.000 mwt) por 1 hora
em ClH2O. Depois da lavagem em dH20 as contas foram ressuspensas no volume original de dH20 e foram então lidas para uso.
2. 0,5 mL de amostras de perdigoto purulento (tanto microscopia positiva quanto microscopia negativa para micobactérias) foram tratadas por 20 minutos com 2% (p/v) final de ditiotreitol. Como um controle
positivo algumas amostras de perdigoto também foram espetadas com BCG cultivado antes do tratamento.
3. Depois deste tratamento, 50 μί de 10% (v/v) de Triton X- 100, EDTA 10 mM, 20 μί, de 0,004% (v/v) de pDADMAC (500.000 mwt) e 50 μί de HCl 2,5 M foram adicionados e incubados por 10 minutos. Espera- se que o pH neste estágio seja aproximadamente 0,6.
4. 20 jjL de contas paramagnéticas revestidas com sulfato de dextrano foram então adicionados e incubados por 10 minutos.
5. As contas foram coletadas por ímã, lavadas em 1 mL de dH20 (esta etapa de lavagem não deve normalmente ser requerida, mas foi
realizada de maneira a demonstrar captura ativa das micobactérias), ressuspensos em 10 μί de dH20 e manchados em uma lâmina de microscópio.
As lâminas foram processadas para microscopia auramina fenol fluorescente de micobactérias da forma descrita no exemplo 10.
Resultados
Dez amostras de perdigoto registradas pelo banco de perdigoto WHO como negativas para Mycobacterium tuberculosis foram negativas depois da captura e microscopia. Dez amostras de perdigoto registradas pelo 15 banco de perdigoto WHO como positivas foram claramente positivas como os controles espetados com BCG. Além disso, as amostras de controle indicaram que houve uma alta eficiência de recuperação das micobactérias do perdigoto da forma estimada por microscopia comparativa que 90-95% das micobactérias espetadas foram recuperadas.
Conclusão
Para amostras mucóides espessas a captura de micobactérias funcionou bem em um pH que foi baixo suficiente para produzir os grupos de ácido carboxílico nos mucopolissacarídeos neutros.
Neste pedido de patente, a menos que expressamente indicado 25 de outra maneira, a palavra “ou” é usada no mesmo sentido de um operador que retoma um valor verdadeiro quando qualquer uma ou ambas as condições estabelecidas são atendidas, da forma oposta ao operador “exclusivo ou” que requer que somente uma das condições seja atendida. A palavra “compreendendo” é usada no sentido de “incluindo” em vez de significar “que consiste em”. Todos os conhecimentos preceituados anteriormente estão aqui incorporados pela referência. Nenhum conhecimento de nenhum documento publicado anteriormente deve ser tomado para ser uma admissão ou representação que o preceito deste foi conhecimento geral comum na Austrália ou em outro lugar até hoje.
Claims (19)
1. Método para a captura de uma amostra de microrganismos tendo uma superfície hidrofóbica, caracterizado pelo fato de que compreende colocar os microrganismos em contato com um reagente de captura, cujo reagente de captura tem tanto um caráter hidrofóbico em que o reagente de captura se liga aos ditos microrganismos pela interação hidrofóbica nele quanto um caráter polar, o dito reagente de captura tanto estando presente em uma superfície e capturando os ditos microrganismos na mesma, quanto estando presente em solução, o dito método então adicionalmente compreendendo capturar os ditos microrganismos para uma superfície ligando o dito reagente de captura para a dita superfície pela interação polar entre a dita superfície e o dito reagente de captura.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito reagente de captura compreende uma cadeia de hidrocarboneto longa que carrega múltiplos sítios polares.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os ditos múltiplos sítios polares são espaçados ao longo da dita cadeia.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito reagente de captura é catiônico.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito reagente de captura é cloreto de poli- dialildimetil amônio (DADMAC).
6. Método para a captura de uma amostra fluida de microrganismos tendo uma superfície hidrofóbica, caracterizado pelo fato de que compreende colocar os microrganismos em contato com um reagente de captura solúvel que compreende poli-DADMAC em que o reagente de captura se liga aos ditos microrganismos, e capturar os ditos microrganismos para uma superfície ligando o dito reagente de captura para a dita superfície.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita superfície é fornecida por contas.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra é colocada em contato com o reagente de captura na presença de um detergente que melhora a seletividade da ligação dos microrganismos desejados.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o detergente compreende uma amida de aminoácido de um ácido graxo.
10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o detergente compreende N-Iauroil sarcosina.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o detergente compreende um detergente de Triton X.
12. Método para a detecção de um microrganismo, caracterizado pelo fato de que compreende capturar o dito microrganismo para uma superfície por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, lavar o dito microrganismo capturado, e detectar o dito microrganismo capturado na dita superfície ou depois da remoção dela.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a viabilidade do microrganismo capturado é determinada.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o microrganismo capturado é tratado com uma droga e a viabilidade do microrganismo é determinada para estabelecer se a droga afeta a viabilidade do microrganismo.
15. Kit de ensaio de microrganismo, caracterizado pelo fato de que compreende tanto (a) um reagente de captura solúvel tendo tanto um caráter hidrofóbico em que o reagente de captura é capaz de ligar um microrganismo a ser detectado pela interação hidrofóbica nele e um caráter poli-iônico, um substrato tendo uma superfície para capturar os ditos microrganismos para a dita superfície ligando o dito reagente de captura para a dita superfície pela interação polar entre a dita superfície e o dito reagente de captura, ou (b) um reagente de captura revestido e assim imobilizado em uma superfície sólida, o dito reagente de captura tendo um caráter tanto hidrofóbico quanto poli-iônico em que o reagente de captura é capaz de ligar um microrganismo a ser detectado, e pelo menos um de: - fago capaz de infectar o dito microrganismo; - iniciadores para realizar uma amplificação de ácido nucleico genômico do dito microrganismo ou dito fago; - um meio de cultura para cultivar o dito microrganismo; - um corante para visualizar o dito microrganismo para inspeção microscópica; - um anticorpo para ligação do dito microrganismo; ou - um reagente de detecção para uso na detecção de um metabólito produzido mediante cultura do dito microrganismo.
16. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito reagente de captura é poli-DADMAC.
17. Kit de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o dito fago, os ditos iniciadores, o dito anticorpo ou o dito agente de detecção é específico para a identificação de complexo de M tuberculosis, M. avium, M. intracellulars, M. paratuberculosis, M. leprae, M. kansasii, M. marinum, ou M. fortuitum.
18. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende um agente de detecção específico para microrganismos viáveis.
19. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que o kit compreende uma ou mais drogas potencialmente capazes de afetar a viabilidade do dito microrganismo. <table>table see original document page 40</column></row><table>
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