KR20100014250A - 마이코박테리아 유사 미생물의 포획 - Google Patents

마이코박테리아 유사 미생물의 포획 Download PDF

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스튜어트 마크 윌슨
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마이크로센스 메드텍 리미티드
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Abstract

마이코박테리움 투베르쿨로시스를 포함하는 마이코박테리아와 같은 소수성 표면을 갖는 미생물의 샘플을 포획하는 방법은, 소수성 상호작용에 의해 상기 미생물을 결합시키는 소수성 특성과 극성 특성 모두를 갖는 pDADMAC와 같은 포획제로 미생물을 접촉시켜 상기 미생물을 산성 표면에 포획하는 것을 포함한다.

Description

마이코박테리아 유사 미생물의 포획{CAPTURE OF MYCOBACTERIA LIKE MICRO-ORGANISMS}
본 발명은 마이코박테리아와 같은 소수성 미생물의 표면을 포획하고, 그 존재 또는 동정을 위한 분석과 같은 이후의 공정에 관한 것이다.
병원성 마이코박테리아는 인간 및 동물에서 몇가지 심각한 감염성 질병의 원인이다. 마이코박테리아는 마이콜산 또는 유사 화합물을 포함하는 소수성, 왁스성 코트에 의해 특정된다. 마이콜산은 복잡한 히드록시화 분지 사슬 지방산으로서, 전형적으로는 C77 -80 범위 사슬 길이의 탄화수소 사슬을 가지며, 이는 샘플의 취급에 심각한 문제를 초래하여, 상기 박테리아가 응집하여 코드(cord)를 형성하고, 액체의 표면에 부유하며, 원심분리에 저항하도록 한다. 상기 탄화수소 사슬은 히드록시, 메톡시, 케토 또는 카르복시와 같은 산재하는 산소화기를 갖거나, 갖지 않을 수 있다. 병원성 마이코박테리아는 결핵의 원인 물질인 마이코박테리움 투베르쿨로시스, AIDS 환자의 기회감염(opportunistic) 병원균인 MAC 콤플렉스의 마이코박 테리아(1차적으로 M. 아비움 및 M. 인트라셀룰라레), 창자의 염증을 일으키는 M. 파라투베르쿨로시스, 나병을 일으키는 M. 레프라에, M. 칸사시이, M. 마리눔, M. 포르투이툼 콤플렉스, 및 다수의 다른 것들을 포함한다. 또한, 마이콜라타 과의 다른 일원들도 유사한 소수성 코트 성분을 갖는다. 몇몇은 마이코박테리아보다 소수성 지방산의 사슬 길이가 약 50 탄소 원자, 다른 것들은 약 30 탄소 원자만큼 짧다.
결핵과 같은 마이코박테리아 감염을 진단하기 위하여, 상기 미생물의 존재가 검경(microscopy), 배양 또는 PCR과 같은 분자적 방법에 의해 입증되어야 한다. 생물학적 샘플로부터 직접 검경이 수행될 수도 있지만, 분석 전에 먼저 상기 생물학적 검체로부터 마이코박테리아를 단리 및 농축하는 것이 보다 일반적이다. 생물학적 샘플은 타액, 소변, 혈액, 기관지 세척액 등을 포함할 수 있다. 진단을 위해 운반되는 가장 일반적인 검체 타입 중 하나는 타액이다. 타액은 세균학에서의 독특한 문제를 제공한다. 타액은 본질상 외생적(heterogenous)이며, 혈액성, 화농성 및 점성일 수 있다. 또한, 예컨대 슈도모나스 미생물로 오염될 수 있다.
일반적으로, 타액은 묽으며, 동시에 다양한 전처리를 사용함으로써 정화될 수 있다. 이들 전처리에는 N-아세틸 L-시스테인, 나트륨 도데실 설페이트, 옥살산 또는 트리나트륨 포스페이트와 함께 또는 이들 없이 0.25-0.5 M의 수산화나트륨을 사용하는 것을 포함한다. 처리 시간은 20-120분일 수 있다. 상기 처리는 타액을 묽히고, 오염 생물의 대부분을 죽이도록 디자인된다. 마이코박테리아는 두꺼운 왁스성 코트를 가지며, 이러한 처리에 보다 저항성이 있다. 그렇더라도, 상기 처리 에 의해 60%까지의 마이코박테리움 투베르쿨로시스가 죽거나 살아있지 않게 되는 것으로 추정된다. 아울러, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 및 상기 과의 다른 일원들은 매우 느리게 자라기 때문에, 상기 처리에 의해 죽지 않은 오염 생물의 성장은 빨리 자라는 상기 오염물에 의해 높은 백분율의 배지가 과성장되어 여전히 문제이다.
가혹한(harsh) 정화제물로 처리한 후, 상기 샘플은 원심분리되어 마이코박테리아를 농축하고, 이후 검경, 배양 또는 분자 증폭에 의해 분석된다. 상기 원심분리 단계는 원심분리 동안에 균열되거나 부서진 임의의 튜브의 내용물이 분무되어 환경을 오염시킬 수 있기 때문에 실험실 근무자에게 감염 위험을 제공한다. 원심분리는 또한 제한된 수의 샘플만이 임의의 시간에 원심분리될 수 있기 때문에 샘플 가공시에 병목이 생긴다. 아울러, 원심분리는 상기 가혹한 정화 절차에 의해 변성 및 불용화된 모든 물질을 펠렛화하여 매우 큰 펠렛이 얻어지기 때문에, 검경 또는 분자 방법에 문제를 일으킬 수 있다.
현재의 정화 및 농축 접근법이 갖는 전술한 문제들 때문에, 마이코박테리아가 생물학적 샘플로부터 직접 포획될 수 있다면 매우 유용할 것이다. 상기 절차가 오염 생물의 일부 또는 모두를 제거하여 상기 화학적 정화가 필요하지 않거나 덜 가혹한 조건으로 수행될 수 있다면 도움이 될 것이다. 이는 또한 정제된 마이코박테리아의 생존을 개선하고, 이후 검사의 민감도를 증가시킬 것이다.
샘플 가공과 별개인 다른 적용분야에서도, 마이코박테리아를 고형 표면에 결합시켜 예컨대 파지(phage) 용액으로부터 마이코박테리아를 포획 및 세척하여 상기 생물을 용이하게 농축 또는 취급하여 외인성(exogenous) 비감염 파지를 제거하거나, 마이코박테리아를 한 용액에서 다른 용액으로 포획 및 전달하도록 하는 것이 유용할 것이다.
고형 표면에 마이코박테리아를 포획하는 방법은 종래 제안되어 있으며, 결합 파지 또는 비드에 고정되어 있고 포획제로 작용하는 파지 유래의 결합 펩티드를 사용하는 것을 포함하고(Stratmann et al; J Clin Microbiol. 2002 November; 40(11): 4244-4250), 항체 코팅된 비드를 이용하여 우유로부터 M. 파라투베르쿨로시스를 단리하는 것을 포함한다(Grant I.R. et al; Appl Environ Microbiol. 1998 Sep; 64(9): 3153-8). 그러나, 이러한 방법은 특히 저개발 국가에서 광범위하게 사용하기에는 너무 고가일 수 있고, 너무 특이적이어서 원하는 모든 박테리아가 포획되지 않을 수 있으며, 프로테아제, 변성 및 가혹한 화학물질에 민감한 단백질계 분자를 포함한다.
Hetland G. 등에 따르면, 라텍스 마이크로비드를 배양 및 분리된 박테리아와 배양함으로써 상기 비드를 BCG로 코팅할 수 있다(Immunology 1994, 82, 445-449). 그러나, 이는 다른 소수성 생물 또는 물질을 포함하는 생물학적 샘플로부터 이러한 박테리아를 효과적으로 포획하기에는 효과적이지 않다.
본 발명자들은 폴리 디알릴디메틸 암모늄 클로라이드(p-DADMAC)가 마이코박테리아를 카르복시산 마이크로비드에 결합시키는 것을 관찰하였다. 하기 이론에 속박되지 않으면서, 본 발명자들은 p-DADMAC의 골격 사슬이 마이코박테리아의 왁스성 코트와 소수성 상호작용하고, p-DADMAC 골격에 있는 양전하 또한 마이코박테리 아 표면상의 음전하와 상호작용할 수 있으며, 이후 상기 p-DADMAC는 그에 달려있는(pendant) 4차 암모늄기를 통해 마이크로비드의 카르복시산과 이온적으로 상호작용하는 것으로 생각한다. 본 발명자들은 또한 플라스틱 및 유리와 같은 p-DADMAC 코팅된 표면이 마이코박테리아를 직접 결합시킬 수 있다는 것을 관찰하였다.
따라서, 마이코박테리아는 p-DADMAC 코팅된 표면에 직접 포획되거나, 또는 표면에 간접적으로 포획될 수 있다.
따라서, 본 발명은 제1 측면에서 소수성 표면을 갖는 미생물 샘플을 포획하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 미생물을 포획제와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 포획제는 소수성 작용에 의해 상기 포획제가 상기 미생물에 결합하도록 하는 소수성 특성 및 극성 특성 모두를 갖고, 상기 포획제는 표면상에 존재하여 상기 미생물을 포획하거나, 용액 내에 존재할 수 있으며, 이후 상기 방법은 상기 표면과 상기 포획제 사이의 극성 상호작용에 의해 상기 포획제를 상기 표면에 결합시킴으로써 상기 미생물을 표면에 포획하는 것을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 상기 방법은 용액 내의 포획제를 이용하여 수행되어서, 상기 방법은 용액 내에서 미생물을 포획제와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 포획제는 소수성 상호작용에 의해 상기 포획제가 상기 미생물에 결합하도록 하는 소수성 특성 및 예컨대 폴리이온 특성과 같은 극성 특성 모두를 갖고, 상기 표면과 상기 포획제 사이의 극성 상호작용에 의해 상기 포획제를 상기 표면에 결합시킴으로써 상기 미생물을 표면에 포획하는 것을 포함하도록 한다.
상기 샘플은 타액, 소변, 혈액, 기관지세척액 등과 같은 유체 샘플이거나, 바람직하게는 미생물을 추출 또는 액체 내애 분산시키기 위해 유체 샘플을 생산하는 것이 바람직한, 예컨대 피부 샘플의 조직 생검과 같은 고형 샘플일 수 있다.
선택적으로, 상기 포획제는 다중 극성(multiple polar), 예컨대 이온성 부위를 갖는 긴 탄화수소 사슬을 포함한다. 상기 다중 극성 또는 이온성 부위는 p-DADMAC 내에서 상기 사슬의 말단 영역과 같은 하나의 영역에 함께 위치하거나, 상기 사슬을 따라 간격을 두고 위치할 수 있다.
상기 포획제는 음이온성일 수 있지만, 바람직하게는 p-DADMAc의 경우와 같이 양이온성이고, 바람직하게는 폴리-디알릴디메틸 암모늄 클로라이드(DADMAC) 자신이다. 대부분의 박테리아 세포가 음전하를 띄므로, 상기 마이코박테리아 왁스성 코트에 결합하는 p-DADMAC의 효과는 상기 세포가 총 양전하로 변환된다는 것이다. 이는 p-DADMAC에 결합하지 않는 다른 오염 생물들이 음전하인 채로 남아 있어서, 상기 마이크로비드에 결합하지 않게 되기 때문에 이점이 있다.
아울러, 직접 포획 구현예에서, 충분히 소수성이지 않은 생물은 세제의 존재하에 p-DADMAC 코팅된 표면에 결합하지 않을 것이고, 따라서 포획되는 생물의 타입에 어느 정도 선택성을 제공한다.
고려될 수 있는 다른 포획제는 폴리라이신 또는 폴리에틸렌이민을 포함한다. 한 선택사항은 트립토판, 루이신, 발린, 메티오닌, 이소루이신, 시스테인 또는 페닐알라닌과 같은 소수성 아미노산 및 라이신과 같은 극성 아미노산의 랜덤 또는 블록 코폴리머일 것이다.
상기 포획제는 특성상 충분히 소수성이어서 플라스틱, 예컨대 단백질을 결합시키기 위해 통상 도입되는 폴리스티렌 마이크로플레이트에 소수성 결합하는 것이 바람직할 것이고, 또는 선택적으로 극성 상호작용에 의해 또는 특성상 충분히 소수성이어서, 적합하게는 현미경 슬라이드 또는 커버 슬립에서 발견되는 것과 같은 것일 수 있는 표면에 소수성 결합함으로써 유리 또는 유리같은 표면에 결합할 수 있을 것이다. 그러나, 포획제는 특성상 충분히 친수성이어서, 적어도 적합한 세제 시스템 또는 DMSO와 같은 허용량의 유기 공용매의 존재하에 물 또는 완충 수용성 배지에 녹을 수 있을 것이다. 따라서, 상기 샘플과 사용된 임의의 다른 물질의 혼합물에서 녹을 수 있다.
상기 이론에 관계없이, 본 발명은 2번째로 독립된 측면에서, 소수성 표면을 갖는 미생물의 유체 샘플로부터 포획하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 미생물을 폴리-DADMAC를 포함하는 가용성 포획제와 접촉시켜 상기 포획제가 상기 미생물에 결합하고, 상기 포획제를 상기 표면에 결합시킴으로써 상기 미생물을 상기 표면에 포획하는 것을 포함한다.
본 발명의 상기 측면들 중 하나에서, 상기 표면은 비드에 의해 적합하게 제공된다. 비드는 마이크로 또는 나노 치수일 수 있다. 적합하게는, 비드는 액체 배지로부터 용이하게 분리하기 위해 상자성(paramagnetic)이다. 비드는 카르복시산 폴리머 표면 또는 설페이트 또는 포스페이트기에 의해 특정되는 표면을 가질 수 있다.
상기 폴리-DADMAC의 분자량은 100,000 이하(매우 낮음), 100,000-200,000(낮음), 200,000-400,000 또는 500,000(중간) 또는 500,000 이상(높음)의 범위일 수 있다.
바람직하게는, 상기 샘플은 원하는 미생물 결합의 선택성을 개선시키는 하나 이상 세제의 세제 시스템의 존재하에 상기 포획제와 접촉된다. 바람직하게는, 상기 미생물은 샘플 내에 존재하는 오염된 소수성 물질의 일부 또는 전부와 결합하지 않은 채로, 또는 포획을 원하지 않는 샘플 내의 미생물의 일부 또는 전부와 결합하지 않은 채로 결합된다.
상기 세제 시스템은 바람직하게는 N-라우로일 사르코신인 지방산의 아미노산 아미드를 포함할 수 있다. 상기 세제 시스템은 선택적으로 또는 추가로 트리톤 X 세제, 바람직하게는 트리톤 X-100을 포함할 수 있다.
대부분의 샘플의 경우, 상기 포획제는 포스페이트 완충액 또는 트리스 완충액과 같이 적합하게는 7-10, 보다 바람직하게는 7-9, 예컨대 8-9 또는 8.2-8.6의 pH를 갖는 포획 완충액으로 제공되는 것이 바람직하다. 많은 카르복시산 기를 갖는 많은 양의 뮤코폴리사카라이드를 포함하는 매우 농후하고 점액성인 타액 샘플에서는 낮은 pH가 포획에 이점이 있을 수 있다. 충분히 낮은 pH에서, 상기 카르복시기는 중화되고, 마이코박테리아의 표면 결합 및 이후의 pDADMAC 또는 다른 표면의 포획을 제공하는 pDADMAC 또는 다른 설페이트 또는 포스페이트기와 충돌하지 않는다. 이러한 조건은, 비록 매우 점성인 샘플을 다루기 위해 디자인되었지만, 모든 샘플에 도입될 수 있다. 적합하게는, 이 경우에 포획제의 pH는 0 내지 4이며, pH 4는 카르복시산 기를 양자화(protonate)하기에 여전히 충분히 낮다. 따라서, 선택된 고형 표면에 따라, 상기 포획제의 pH는 적어도 0 내지 10일 수 있다.
물론, 상기 샘플의 가공은 상기 샘플 또는 포획된 미생물을 갖는 표면을 처리하여 관심있는 것 이외의 살아있지 않은 미생물을 제거하는 정화 단계를 포함할 수 있다. 이는 N-아세틸 시스테인을 갖거나 갖지 않는, 또는 N-아세틸 시스텐인을 단독으로 갖는 수산화나트륨과 같은 상기 목적을 위해 알려진 물질과 함께 수행될 수 있다. 상기 목적은 물론 관심있는 포획된 미생물을 살아있는 상태로 남겨둔다.
포획된 미생물은 특히 마이코박테리아일 수 있으며, 전술한 것들 중 임의의 것일 수 있다.
본 발명은 전술한 방법에 의해 상기 미생물을 표면에 포획하는 단계, 상기 포획된 미생물을 세척하는 단계, 및 상기 포획된 미생물을 상기 표면상에서, 또는 표면으로부터 제거한 후에 검출하는 것을 포함하는 미생물의 검출 방법을 포함한다.
사용된 검출 방법은 관심있는 미생물에 적합한 임의의 것일 수 있다. 일반적으로 마이코박테리아, 특히 M. 투베르쿨로시스에 있어서, 상기 방법은 배양 및 예컨대 염색에 의한 현미경적 검출, PCR-중합효소 연쇄 반응, TMA-전사 매개성 증폭, SDA(strand displacement assay)-가닥 배치 분석, 또는 상기 생물 자체의 핵산에 대한 다른 증폭 및 검출 방법론, 및 마이코박테리아 감염 파지가 첨가되어 세포에 들어가도록 하고, 세포 밖에 남아 있는 파지는 죽이며, 추가로 배양한 후 세포로부터 파지를 방출하고, 상기 방출된 파지의 존재는 다른 미생물에 감염시킴으로써 검출되는 FASTPlaqueTB를 포함하는 파지에 기초한 방법을 포함할 것이다.
전술한 미생물 검출 방법의 실행에 필요한 물질 또는 선택된 주요 물질은 키트 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 포획제가 미생물에 결합하여 소수성 상호작용에 의해 검출될 수 있는 소수성 특성 및 폴리이온 특성 모두를 갖는 가용성 포획제, 상기 표면과 상기 포획제 사이의 극성 상호작용에 의해 상기 포획제를 상기 표면에 결합시킴으로써 상기 표면에 상기 미생물을 포획하기 위한 표면을 갖는 기질, 및
- 상기 미생물을 감염시킬 수 있는 파지;
- 상기 미생물 또는 상기 파지의 게놈 핵산 증폭을 수행하기 위한 프라이머;
- 상기 미생물을 배양하기 위한 배양 배지;
- 현미경 검사를 위해 상기 미생물을 시각화하기 위한 염료;
- 상기 미생물에 결합하기 위한 항체(전체적으로 항체 또는 그 일부가 선택적인 결합 친화도를 가짐); 또는
- 상기 미생물의 배양시에 생성되는 대사물 검출에 사용하기 위한 검출제 중 적어도 하나를 포함하는 미생물 분석 키트를 포함한다.
전술한 본 발명에 따르면, 상기 샘플은 또한 미생물이 그 내부에 동반되어 있는, 예컨대 공기와 같은 가스성 샘플일 수 있다. 이러한 샘플은 상기 포획제 용액 내로 기포화되어 상기 미생물을 포획제에 결합하도록 할 수 있다.
다른 한편으로, 본 발명은 고형 표면 위에 코팅되어서 고정화되고, 소수성 및 폴리이온 특성 모두를 가지며, 검출되는 미생물에 결합할 수 있는 포획제, 및
- 상기 미생물을 감염시킬 수 있는 파지;
- 상기 미생물 또는 상기 파지의 게놈 핵산 증폭을 수행하기 위한 프라이머;
- 상기 미생물을 배양하기 위한 배양 배지;
- 현미경 검사를 위해 상기 미생물을 시각화하기 위한 염료;
- 상기 미생물에 결합하기 위한 항체(전체적으로 항체 또는 그 일부가 선택적인 결합 친화도를 가짐); 또는
- 상기 미생물의 배양시에 생성되는 대사물 검출에 사용하기 위한 검출제 중 적어도 하나를 포함하는 미생물 분석 키트를 포함한다.
상기 고형 표면은 현미경 슬라이드일 수 있다.
바람직하게는, 직접적 또는 간접적으로, 포획된 마이코박테리아는 상기 포획에 의해 해를 입지 않고 살아있는 채로 남아 있다. 따라서, 본 발명은 상기 생물의 약물 내성 검사를 위해 사용될 수 있다. 한 측면에서, 상기 마이코박테리아는 약물이 생물에 영향을 미치도록 하는 방식으로 상기 약물에 노출될 수 있다. 이어서, 상기 마이코박테리아는 본 명세서에 개시된 임의의 방식으로 포획될 수 있고, 이후 생존력 염료를 이용한 검경, 파지에 기초한 방법, 배양에 기초한 방법 또는 PCR에 기초한 방법을 포함할 수 있는 임의의 수의 전술한 방법을 이용하여 생존력에 대해 조사할 수 있다. 다른 측면에서, 상기 마이코박테리아는 먼저 본 명세서에서 개시된 임의의 방법으로 포획되고, 이어서 약물이 생물에 영향을 미치도록 하는 방식으로 상기 약물에 노출될 수 있다. 그 다음에, 상기 마이코박테리아는 이후 생존력 염료를 이용한 검경, 파지에 기초한 방법, 배양에 기초한 방법 또는 PCR에 기초한 방법을 포함할 수 있는 임의의 수의 개시된 방법을 이용하여 생존력에 대해 조사할 수 있다. 사용된 약물은 리팜피신, 스트렙토마이신, 이소니아지드, 에탐부톨, 피라진아미드 및 사이프로플록사신과 같이 결핵을 치료하기 위해 일반적으로 사용되는 것들을 포함할 수 있다.
전술한 미생물 약물 내성 방법의 실행에 필요한 물질 또는 선택된 주요 물질은 키트 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 포획제가 미생물에 결합하여 소수성 상호작용에 의해 검출되는 소수성 특성 및 폴리이온 특성 모두를 갖는 가용성 포획제, 상기 표면과 상기 포획제 사이의 극성 상호작용에 의해 상기 포획제를 상기 표면에 결합시킴으로써 상기 표면에 상기 미생물을 포획하기 위한 표면을 갖는 기질, 및
- 시험되는 하나 이상의 약물; 및
- 포획된 미생물이 살아있는지 여부를 결정하기 위한 수단 중 하나 또는 이들 모두를 포함하는 미생물 약물 내성 분석 키트를 포함하며, 상기 수단은
- 현미경 검사를 위해 상기 미생물을 시각화하기 위한 생존력 지시 염료;
- 상기 미생물을 감염시킬 수 있는 파지;
- 상기 미생물의 배양시에 생성되는 대사물 검출에 사용하기 위한 검출제; 및
선택적으로는, 이미 존재하지 않는다면, 하나 이상의 아래 성분
- 상기 미생물을 감염시킬 수 있는 파지;
- 상기 미생물 또는 상기 파지의 게놈 핵산 증폭을 수행하기 위한 프라이머;
- 상기 미생물을 배양하기 위한 배양 배지;
- 현미경 검사를 위해 상기 미생물을 시각화하기 위한 염료;
- 상기 미생물에 결합하기 위한 항체(전체적으로 항체 또는 그 일부가 선택적인 결합 친화도를 가짐); 또는
- 상기 미생물의 배양시에 생성되는 대사물 검출에 사용하기 위한 검출제 중 하나 이상일 수 있다.
다른 한편으로, 본 발명은
다른 한편으로, 본 발명은 고형 표면 위에 코팅되어서 고정화되고, 소수성 및 폴리이온 특성 모두를 가지며, 검출되는 미생물에 결합할 수 있는 포획제, 및
- 시험되는 하나 이상의 약물; 및
- 포획된 미생물이 살아있는지 여부를 결정하기 위한 수단 중 하나 또는 이들 모두를 포함하는 미생물 약물 내성 분석 키트를 포함하며, 상기 수단은
- 현미경 검사를 위해 상기 미생물을 시각화하기 위한 생존력 지시 염료;
- 상기 미생물을 감염시킬 수 있는 파지;
- 상기 미생물의 배양시에 생성되는 대사물 검출에 사용하기 위한 검출제; 및
선택적으로는, 이미 존재하지 않는다면, 하나 이상의 아래 성분
- 상기 미생물을 감염시킬 수 있는 파지;
- 상기 미생물 또는 상기 파지의 게놈 핵산 증폭을 수행하기 위한 프라이머;
- 상기 미생물을 배양하기 위한 배양 배지;
- 현미경 검사를 위해 상기 미생물을 시각화하기 위한 염료;
- 상기 미생물에 결합하기 위한 항체(전체적으로 항체 또는 그 일부가 선택적인 결합 친화도를 가짐); 또는
- 상기 미생물의 배양시에 생성되는 대사물 검출에 사용하기 위한 검출제 중 하나 이상일 수 있다.
상기 고형 표면은 현미경 슬라이드일 수 있다.
M. 투베르쿨로시스는 폐 또는 후두 결핵 질병을 갖는 감염 대상이 기침, 재채기 또는 소리칠 때 생성되는 풍매(airborne) 입자, 방울 핵(droplet nuclei)으로 운반된다. 상기 입자는 대략 1-5 ㎛이며, 수시간 동안 풍매로 남아 있어서 방 또는 빌딩을 통해 전파될 수 있도록 할 수 있다. 감염은 감염되기 쉬운 사람이 M. 투베르쿨로시스를 포함하는 방울 핵을 흡입하고, 입 또는 비로(nasal passage), 상부 호흡관 및 기관지를 거쳐 폐포에 도달할 때 일어난다. MDR M. 투베르쿨로시스는 또한 CDC에 의해 생물학적 테러리즘의 카테고리 C 제제로 분류되며, 운반 메카니즘은 풍매 에어로졸(aerosol)의 생성과 유사하다.
건강한 노동자, 감염된 대상 근처에 있는 다른 사람들 및 군인을 흡입에 의한 감염의 위험으로부터 보호하는 것이 바람직하다. 아울러, 결핵에 감염된 샘플, 결핵 배양 및 다른 병원성 마이코박테리아(예컨대, 분변 내의 M. 파라투베르쿨로시스)를 포함하는 샘플을 이용하여 작업하는 실험실 직원 또한 감염 위험이 있다. 현재 건강한 노동자 및 실험실 직원은 안면 마스크, 또는 보다 정교한 미립자-필터 호흡장치를 이용하여 감염을 방지한다.
상기 CDC는 미국 국립 직업 안전 및 보건 연구소(National Institute for Occupational Safety and Health, NIOSH)에서 인증한 1-5 ㎛ 범위의 가장 작은 입자를 효과적으로 여과할 수 있는 능력을 갖는 미립자-필터 호흡장치(예컨대, N95, N99 또는 N100)를 사용할 것을 권고한다. 안면 마스크는 일반적으로 단순한 직물 또는 부직물 재료로 이루어져 있다; 이들은 다수 층을 가질 수 있고, 정의된 기공 크기를 나타내는 설명서를 가질 수 있다. 그러나, 대부분의 마스크는 호흡장치로서 NIOSH에서 인증하지 않았고, 사용자를 결핵의 노출로부터 적절하게 보호하지 않으며, 호흡 보호를 위한 OSHA 요구사항을 만족시키지 않는다. 한 연구에서는 호흡 보호를 이용하게 되면 건강 관리 노동자에서의 감염 위험을 (보호하지 않은 경우에 비해) 다음의 비율로 감소시키는 것으로 추정된다는 것을 보여준다: 수술용 안면 마스크, 2.4배; 1회용 먼지, 연기, 안개, 또는 1회용 고효율 미립자 공기 필터링(high-efficiency particulate air filtering, HEPA) 마스크 , 17.5배; 탄성 HEPA 카트리지 호흡장치, 45.5배; 또는 분말형 공기 정화 호흡장치(powered air-purifying respirator, PAPR), 238배(J Occup Environ Med. 1997 Sep; 39(9): 849-54).
상기 미립자-필터 호흡장치는 높은 수준의 보호를 제공하지만, 고비용인 단점이 있고, 용도에 제한이 있다. 상기 호흡장치가 가용하지 않거나, 사용하기에 적절하지 않은 상황에서 풍매 마이코박테리아 감염으로부터 사용자를 더 잘 보호하기 위한 개선된 1회용 안면 마스크에 대한 필요성이 있다. 이는 개발도상국 및 실험실 세팅에서의 상황이다. 감염된 대상에 의해 생성되거나 실험실에서 우연히 생성된 마이코박테리아-함유 에어로졸에 특이적이고 효율적으로 결합하는 방법을 제공하여 사용자 보호 기준을 대폭 개선한 안면 마스크 및/또는 필터가 요구된다.
따라서, 본 발명은 가스 흐름을 여과하여 그 안에 동반된 미생물을 제거하기 위한 필터를 제공하고, 상기 필터는 극성 표면 및 상기 극성 표면 위 또는 그 상류(upstream)의 포획제를 포함하며, 상기 포획제는 소수성 코팅된 박테리아와 소수성 상호작용에 의해 결합할 수 있는 소수성 특성 및 예컨대 폴리이온 특성과 같은 극성 특성 모두를 갖고, 상기 극성 표면에 결합하거나 결합하도록 개조된다.
상기 필터는 착용자를 보호하기 위한 안면 마스크의 형태를 취할 수 있고, 안면 마스크 또는 헬멧에 부착된 필터 단위일 수 있다. 공기 공급관에 설치된 또는 설치되기 위한 필터일 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 개선된 보호를 제공하기 위하여, 안면 마스크는 포획제가 소수성 상호작용에 의해 마이코박테리아와 결합하는 소수성 특성 및, 예컨대 폴리이온 특성과 같이, 포획제가 극성 상호작용에 의해 이온성 표면에 결합하는 극성 특성 모두를 갖는 가용성 포획제가 주입되어 제공될 수 있다.
상기 가용성 포획제는 상기 안면 마스크의 필터 물질과 같은 적합한 고형상 마스크 물질 위에 분무되고, 이후 제품을 포장하기 전에 건조될 수 있다. 사용시 상기 안면 마스크는 사용자의 내쉬는 숨으로 인해 축축하게 될 것이며, 이후 상기 포획제는 마스크 물질 표면상의 수분층 내에 용해될 것이다. 마이코박테리아-함유 에어로졸이 상기 표면에 부딪치면, 결과적으로 상기 가용성 포획제가 마이코박테리아 세포에 신속하게 결합하게 된다. 마스크에서 폴리이온성인 고형상 물질을 사용하는 것은 상기 마이코박테리아가 상기 고형상에 고정되도록 할 것이다. 이것은 흡입 동안 상기 표면으로부터 감염성 에어로졸이 추가로 생성될 가능성을 제거할 것이고, 작업자에게 높은 수준의 보호를 제공할 것이다.
상기 제1 실시예에서, 상기 가용성 포획제는 에어로졸에 부딪치기 전에 젖어있는 마스크의 폴리이온성 고형상 물질에 결합할 것이다. 이것은 상기 표면이 상기 포획제로 포화될 수 있고, 그렇게 함으로써 상기 마이코박테리아 세포/가용성 포획제 콤플렉스가 상기 부딪치는 에어로졸에 결합하지 않을 것이기 때문에 상기 마이코박테리아 포획의 감소 효능 효과를 가질 것이다. 다른 한편으로, 상기 결합된 포획제는 상기 고형 표면으로부터의 간섭 때문에 상기 미생물에 대해 감소된 친화도(affinity) 또는 접착도(avidity)를 가질 수 있다.
이러한 단점은 상기 가용성 포획제가 중성의 비전하 물질 위에 주입된 제1 외부층을 갖는 2층 안면 마스크를 이용함으로써 극복될 수 있다. 에어로졸이 부딪치면 결과적으로 마이코박테리아/가용성 포획제 콤플렉스가 형성되고, 이후 상기 안면 마스크 구조의 제2 내부층 내의 폴리이온성 물질에 의해 단단히 결합될 것이다.
따라서, 본 발명은 상기 포획제가 상기 극성 표면 상류의 포획제에 대해 낮은 결합 친화도를 갖는 고형 표면에 제공되는, 처음 개시한 것과 같은 필터를 포함한다.
도 1은 실시예 10의 단계 5(좌측 패널)에서 및 단계 6(우측 패널) 후의 마이코박테리움 보비스의 지엘 닐슨(Ziehl Neelson) 염색의 현미경 시각화를 보여준다.
도 2는 실시예 10의 단계 6에서 비드로부터 단리된 미생물의 고배율(상측 패널) 및 저배율(하측 패널) 확대를 보여준다.
도 3은 실시예 11에서 가공된 코팅된(좌측) 또는 코팅되지 않은(우측) 것을 보여준다.
도 4는 실시예 12에서 포획되어 생존력을 나타내기 위해 염색된 마이코박테리아를 보여준다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 개시 및 설명될 것이다. 이들 실시예에서, M. 스메그마티스는 M. 투베르쿨로시스와 많은 공통적인 특성을 공유하지만 감염성은 아니기 때문에, 마이코박테리움 속의 대표적인 모델 생물로 사용되었다.
실시예 1. pDADMAC 리간드 및 포획 비드의 적정
원리. 본 실험은 마이코박테리아를 포획하기 위해 사용되는 리간드 및 비드의 최적량을 결정하기 위하여 수행되었다. 포획된 마이코박테리아의 양은 마이코박테리아 게놈의 PCR에 의해 분석되었다.
방법.
1. 1 ㎕의 마이코박테리움 스메그마티스 배양액의 복제물을 1 ㎖ 7H9 OADC (10% OADC가 보충된 7H9 배지, Difco) 배양 배지로 만들었다.
2. 250 ㎕의 5× 포획 완충액(250 mM 트리스 pH 8.3, 5%(w/v) N-라우로일 사르코신, 5%(v/v) 트리톤 X-100, 5%(w/v) BSA)을 첨가하고 혼합하였다.
3. 물에 희석된 다양한 양의 pDADMAC(시그마알드리치, 중간 분자량, 400,000 내지 500,000)를 첨가하여 혼합하고, 15분간 배양하였다.
4. MyOne 카르복시산 상자성 비드를 pDADMAC 처음 부피에 대해 10:1의 부피비로 첨가하여 혼합하고, 15분간 배양하였다.
5. 상기 비드를 자석 스탠드를 통해 포획하고, 1 ㎖ PBS로 세척하였다.
6. 20 ㎕ 100 mM NaOH, 0.05%(v/v) 트리톤 X-100을 첨가하고, 상기 비드를 부유시켜 95℃에서 5분간 가열하였다.
7. 10 ㎕의 200 mM HCl을 첨가하고, 2 ㎕의 용출액을 마이코박테리움 스메그마티스에 대한 정량 PCR에 의해 분석하였다.
PCR 분석
MJ 리서치사(Hercules, California)의 크로모 4 장치를 사용하였다. DNA 이중 가닥 인터컬레이터(intercalator)의 형광을 통해 PCR 산물을 모니터할 수 있도록 하는 사이버그린 키트(Eurogentec, Seraing, Belgium)를 사용하였다. 사용된 PCR 파라미터는 95℃에서 10초간 가열, 65℃에서 15초간 프라이머 어닐링(annealing), 72℃에서 15초간 연장(extension)을 포함하였다. M. 스메그마티스 게놈에 대해 특이적인 PCR 프라이머 5' TCA GGC CCT CGA AAG CCG ACT GGG 3', 5' CCA GGA CTC GGT ACA AGA CTC TGC 3'을 사용하였다.
결과
사용된 pDADMAC의 양 사용된 비드의 양 PCR이 양성일 때의 사이클 M. 스메그마티스 존재 PCR이 양성일 때의 사이클 M. 스메그마티스 부재 대조군
5 ㎕ 0.01% (v/v) 50 ㎕ 25.2 34.1
2 ㎕ 0.01% (v/v) 20 ㎕ 27.2 음성으로 남음
5 ㎕ 0.004% (v/v) 10 ㎕ 26.5 37.1
2.5 ㎕ 0.004% (v/v) 2.5 ㎕ 28.7 35.7
결론
5 ㎕의 0.01% pDADMAC가 가장 잘 작동하였으며, 바실러스가 없는 대조군(PCR 프라이머-다이머 백그라운드)의 34 사이클에 비해 25 사이클에서 신호가 나타났다. pDADMAC 및 비드를 희석하면 M. 스메그마티스의 회수가 점진적으로 감소하였다.
실시예 2. 포획 효율의 조사
배지에 스파이크된 M. 스메그마티스의 포획 효율을 알칼리 가열에 의해 추출되고 PCR에 의해 직접 검출된 동일한 양의 M. 스메그마티스와 비교하여 조사하였다.
방법.
1. 마이코박테리움 스메그마티스 배양액의 희석액은 1 ㎖ 7H9 OADC (10% OADC가 보충된 7H9 배지, Difco) 배양 배지로 만들었다.
2. 250 ㎕의 5× 포획 완충액(250 mM 트리스 pH 8.3, 5%(w/v) N-라우로일 사르코신, 5%(v/v) 트리톤 X-100, 5%(w/v) BSA)을 첨가하고 혼합하였다.
3. 10 ㎕의 0.01%(v/v) pDADMAC(시그마알드리치, 중간 분자량, 400,000 내지 500,000)를 첨가하여 혼합하고, 15분간 배양하였다.
4. 50 ㎕의 MyOne 카르복시산 상자성 비드를 첨가하여 혼합하고, 15분간 배양하였다.
5. 상기 비드를 자석 스탠드를 통해 포획하고, 1 ㎖ PBS로 세척하였다.
6. 20 ㎕ 100 mM NaOH, 0.05%(v/v) 트리톤 X-100을 첨가하고, 상기 비드를 재부유시켜 95℃에서 5분간 가열하였다.
7. 10 ㎕의 200 mM HCl을 첨가하고, 2 ㎕의 용출액을 마이코박테리움 스메그마티스에 대한 정량 PCR에 의해 분석하였다.
8. 아울러, 1 ㎕의 동일한 M. 스메그마티스 배양액을 상기 단계 6-7에서 개시된 것과 같이 알칼리로 직접 처리하고, 동일한 방식으로 PCR에 의해 분석하였다.
PCR 분석.
상기 PCR은 실시예 1에 개시되어 있다.
결과
M. 스메그마티스의 희석 대략적인 바실러서의 수 PCR이 양성일 때의 사이클
10-3 100,000 26.7
10-4 10,000 32.0
10-5 1,000 37.3
M. 스메그마티스 없음 대조군 0 35.6
1 ㎕의 M. 스메그마티스 직접 처리 100,000 26.5
결론
바실러스의 포획 효율은 직접 분석된 것과 같이 스파이크 및 회수된 동일한 양의 바실러스로부터 생성된 유사한 시그널을 가지면서 매우 높았다. 1 ㎖의 배지에 스파이크된 10,000만큼 적은 바실러스가 회수 및 검출되었다.
실시예 3. 포획 완충액에 대한 요구사항의 조사
원리. 배지에 스파이크된 M. 스메그마티스를 포획 완충액의 존재 또는 부재시에 회수하였다.
방법.
상기 방법은 한 샘플에는 포획 완충액을 첨가하지 않은 것 이외에는 실시예 1에 개시된 것과 동일하다.
결과
포획 완충액의 존재 PCR이 양성일 때의 사이클
포획 완충액 부재 25.5
포획 완충액 사용 23.0
결론
포획 완충액은 바실러스 게놈 및 바실러스의 측면에서 2.5 사이클 또는 약 6배만큼 바실러스의 회수를 개선시켰다. 이는 아마도 배지 상의 세제의 작용 및 M. 스메그마티스가 포획제에 결합하는 것을 억제하는 억제 요소에 의한 감소된 간섭때문일 것이다.
실시예 4. 파지에 기초한 분석에서의 M. 스메그마티스의 리간드 포획 이용의 입증
원리. 마이코박테리아는 숙주 박테리오파지 감염에 대한 박테리아의 능력을 통해 생존력을 테스트할 수 있다. 이런 접근법의 한 문제점은 외인성 비감염 박테리오파지로부터 감염된 바실러스를 분리하는 것이다. 일단 외인성 파지로부터 분리되면, 상기 바실러스는 용해되어 내인성(endogenous) 감염 박테리오파지에 대해 조사할 수 있다.
방법.
100 ㎕의 M. 스메그마티스를 10 ㎖의 7H9 OADC 배지에 첨가하고 37℃에서 3시간 배양하였다. 바실러스가 없는 음성 대조군 또한 준비하였다.
100 ㎕(약 1010 pfu)의 D29 마이코박테리오파지를 양 튜브에 첨가하였고, 샘플을 배양기에 도로 위치시켰다.
1 ㎖ 분취액을 감염 후 다양한 시점에서 제거하였고, PBS로 3회 추가로 세척을 수행한 것을 제외하고는 실시예 1에 개시된 바와 같이 M. 스메그마티스를 배지로부터 포획하였다.
포획된 바실러스는 전술한 바와 같이 용해하였고, PCR에 의해 내인성 감염 파지 게놈의 존재를 조사하였다. PCR은 파지 게놈 특이적 프라이머인 5' CCT CGG GCT AAA AAC CAC CTC TGA CC 3', 5' CTG GGA GAA TGT GAC ACG CCG ACC 3'를 사용한 것을 제외하고는 전술한 바와 같다.
결과
감염후 시간 M. 스메그마티스의 존재 PCR이 양성일 때의 사이클
15분 존재 음성으로 남음
15분 부재 39.8
30분 존재 27
30분 부재 음성으로 남음
60분 존재 30
60분 부재 음성으로 남음
90분 존재 음성으로 남음
90분 부재 음성으로 남음
120분 존재 31
120분 부재 음성으로 남음
결론
배지로부터 M. 스메그마티스를 포획하는 능력은 상기 바실러스를 세척하고 외인성 파지가 제거되도록 하였다. 이후에 검출된 유일한 파지는 상기 바실러스를 감염했던 파지였다. 본 실시예에서, 감염 과정을 모니터하기 위하여 상기 공정을 사용하였다. 파지 첨가후 15분에는 바실러스로부터 어떤 시그널도 관찰되지 않았다. 파지는 아직 감염되지 않고, 파지 게놈은 복제되지 않는다. 내인성 파지 게놈은 30분에 바실러스에서 나타나지만 60분 시점에서는 감소하고, 90분 시점에서는 파지가 복제하여 바실러스를 용해하기 때문에 완전히 사라진다. 상기 시그널은 방출된 2세대 복제 파지가 또 다른 감염 및 복제 라운드에 들어가기 때문에 120분에 다시 나타난다.
실시예 5. 타액으로부터의 마이코박테리아 포획의 입증
원리. 타액은 복잡하고 점성이 있는 매트릭스이다. 본 실험은 상기 매트릭스가 마이코박테리아 포획을 간섭할 수 있는지를 보기 위해 수행되었다.
방법.
5 타액 샘플의 풀(pool)을 준비하고 1 ㎖ 부피로 분취하였다.
10 ㎕의 M. 스메그마티스 배양액을 상기 분취액 절반에 첨가하였다.
100 ㎕의 5 M NaOH, 2.5% N-아세틸 시스테인을 첨가하고, 15분간 배양하여 상기 타액을 묽히고 정화하였다.
100 ㎕의 5 M HCl과, 이후 250 ㎕의 5× 포획 완충액(전술한 바와 같음)을 첨가하였다.
이후 M. 스메그마티스를 타액으로부터 포획하고, 실시예 2의 단계 3-8에 개시된 바와 같이 PCR에 의해 정량하였다.
결과
M. 스메그마티스가 있는 샘플은 PCR 사이클 20에서 양성이었다.
바실러스가 없는 샘플(즉, 백그라운드)은 PCR 사이클 36.3에서 양성이었다.
결론
pDADMAC 및 비드 포획을 이용한 추출 방법은 샘플 매트릭스(타액)에 의해 억제되지 않았고, M. 스메그마티스는 상기 샘플로부터 성공적으로 회수되었다.
실시예 6. 알칼리를 이용한 묽힘 및 정화에 대한 요구없이 타액으로부터의 마이코박테리아 포획의 입증
원리. 타액은 복잡하고 점성인 매트릭스이다. 알칼리 처리는 타액을 묽히고 정화시키지만, 마이코박테리아를 손상시킬 수도 있다. 본 실험은 상기 추출 절차가 알칼리의 전처리 없이도 사용될 수 있음을 보이기 위해 수행되었다. 다시, M. 스메그마티스를 마이코박테리아 속에 대한 모델 생물로 사용하였다.
방법.
5 타액 샘플의 풀을 준비하고 1 ㎖ 부피로 분취하였다.
10 ㎕의 M. 스메그마티스 배양액을 상기 분취액 절반에 첨가하였다.
250 ㎕의 5× 포획 완충액(전술한 바와 같음)을 첨가하고 혼합하였다.
이후 M. 스메그마티스를 타액으로부터 포획하고, 실시예 2의 단계 3-8에 개시된 바와 같이 PCR에 의해 정량하였다.
결과
M. 스메그마티스가 있는 샘플은 PCR 사이클 24.7에서 양성이었다.
바실러스가 없는 샘플(즉, 백그라운드)은 음성으로 남아 있었다..
결론
pDADMAC 및 비드 포획을 이용한 추출 방법은 알칼리를 이용한 타액의 전처리가 필요하지 않았다. 포획 완충액의 첨가는 타액의 붕괴(breakdown) 및 묽힘을 일으키고, 이어서 상기 샘플로부터 M. 스메그마티스를 회수하도록 하기에 충분하다는 것을 관찰하였다.
실시예 7. 포획 시스템에서 pDADMAC 리간드에 대한 요구의 입증
원리. 본 실험은 본 명세서에서 pDADMAC로 예시한 포획제가 마이코박테리아의 포획에 결정적이고, 상기 마이코박테리아는 포획제없이 카르복시 비드에 결합하지 않는다는 것을 입증하기 위해 수행되었다.
방법.
M. 스메그마티스 고정상 배양액의 0.5 ㎖ 분취액을 원심분리하여 상기 생물을 펠렛화한 후, 상기 생물을 포획 완충액(50 mM 트리스 pH 8.3, 1%(w/v) N-라우로일 사르코신, 1%(v/v) 트리톤 X-100, 1%(w/v) BSA)에 재부유시켰다.
분취액 10 ㎕에 0.01% pDADMAC를 첨가하여 혼합하고, 15분간 배양하였다. 동일한 분취액을 pDADMAC를 첨가하지 않고 15분간 방치하였다.
이후, 50 ㎕ MyOne 카르복시산 상자성 비드(dH2O에서 사용되기 전에 ×3 세척하고, 원래 부피의 dH2O에 재부유시킴)를 각 분취액에 첨가하고, 15분간 배양하였다.
이후 상기 분취액을 자석 위에 위치시키고, 생물의 탁한 부유물이 맑아지는 정도를 눈으로 평가하였다.
이후, 상등액을 제거하고 보관하였다.
이후, 비드를 ×1 포획 완충액 및 ×2 7H9 OADC 배지로 세척하고, 1 ㎖의 상기 배지에 재부유시켰다.
0.1 ㎕의 동등한 상등액 및 비드 부유물을 7H9 OACD 아가 플레이트 위에 위치시키고, 37℃에서 2일간 배양한 후, 각 플레이트 상의 콜로니 수를 계수하였다.
결과
자성 비드를 첨가하고 분취액을 자석 위에 위치시킨 후, pDADMAC 포획제로 배양되었던 분취액이 상당히 맑아졌다. 이것은 부유물 내의 생물의 대부분이 상기 자성 입자에 포획되었기 때문이다. 포획제가 첨가되지 않았던 분취액은 생물이 부유물 내에 존재하기 때문에 탁한 채로 남아 있었다. 포획제의 존재 및 부재시에 포획 및 비포획된 바실러스의 수를 아가 플레이트 배양으로부터 계수하고 표로 나타내었다(하기 표 참조).
계수된 콜로니의 수 pDADMAC 포획제 부재 계수된 콜로니의 수 pDADMAC 포획제 첨가
상등액 1,000 이상 490
포획된 비드 359 1,000 이상
결론
시각적인 탁함을 통해 결정한 바와 같이, 카르복시산 비드를 통한 마이코박테리아의 포획은 pDADMAC의 존재에 의존하였다. 상기 시각적인 관찰은 미생물학적 정량에 의해 확인되었다. 포획제의 존재시 대부분의 마이코박테리아가 포획된 반면, 포획제 부재시 비드에 최소한으로 흡착되었다.
실시예 8. 마이코박테리아에 대한 리간드 포획 선택성의 입증
원리. 본 실험은 상기 pDADMAC 포획제가 마이코박테리아에 특이적으로 결합하고, 대표적인 그람 음성 및 그람 양성 생물을 포함하는 다른 시험 생물에 결합하지 않으며, 또한 관련된 생물학적 검체를 오염시킬 수 있다는 것을 입증하기 위해 수행되었다.
방법.
M. 스메그마티스, 슈도모나스 아에루기노사, 스타필로코커스 아우레우스 및 에스케리치아 콜라이의 고정상 배양액의 0.5 ㎖ 분취액을 원심분리하여 상기 생물 을 펠렛화한 후, 상기 생물을 포획 완충액(50 mM 트리스 pH 8.3, 1%(w/v) N-라우로일 사르코신, 1%(v/v) 트리톤 X-100, 1%(w/v) BSA)에 재부유시켰다.
각 생물의 각 분취액에 10 ㎕ 0.01% pDADMAC를 첨가하여 혼합하고, 15분간 배양하였다.
이후, 50 ㎕ MyOne 카르복시산 상자성 비드(dH2O에서 사용되기 전에 ×3 세척하고, 원래 부피의 dH2O에 재부유시킴)를 각 분취액에 첨가하고, 15분간 배양하였다.
이후, 상기 분취액을 자석 위에 위치시키고, 생물의 탁한 부유물이 맑아지는 정도를 눈으로 평가하였다.
이후, 상등액을 제거하고 보관하였다.
이후, 비드를 ×1 포획 완충액으로 세척하였다. 이후, M. 스메그마티스 분취액을 ×2 7H9 OADC 배지에서 세척하고, 1 ㎖의 상기 배지에 재부유시켰다. 다른 생물들은 뮐러 힌톤(Mueller Hinton) 배지에서 동일한 방식으로 세척하고, 1 ㎖의 상기 배지에 재부유시켰다.
0.1 ㎕의 동등한 상등액 및 비드 부유물을 M. 스메그마티스의 경우 7H9 OACD 아가 플레이트 위에 위치시키거나, 다른 생물의 경우 뮐러 힌톤 아가 플레이트 위에 위치시켜 37℃에서 박테리아 콜로니가 나타날 때까지 배양한 후, 각 플레이트 상의 콜로니 수를 계수하였다.
결과
이전과 마찬가지로, M. 스메그마티스의 부유물은 자석 위에 위치할 때 맑아졌는데, 이는 상기 생물이 용액으로부터 포획되었음을 입증한다. 테스트된 다른 모든 생물의 부유물은 매우 탁한 채로 남아 있었는데, 이는 상기 생물이 포획되지 않고 부유물 내에 남아 있음을 입증한다. 포획 및 비포획된 바실러스의 수를 아가 플레이트 배양으로부터 계수하고 표로 나타내었다.
생물 상등액 유래 콜로니의 수 비드 유래 콜로니의 수
M. 스메그마티스 221 1,000 이상
P. 아에루기노사 10,000 이상 12
S. 아우레우스 1,000 이상 8
E. 콜라이 10,000 이상 22
결론
pDADMAC 포획제는 마이코박테리아 M. 스메그마티스를 특이적으로 포획하도록 하였다. 테스트된 다른 생물은 상기 포획제에 결합하지 않고 포획되지 않았다.
실시예 9. 특이적 포획에 요구되는 포획 완충액 조성의 조사
원리. 본 실험은 pDADMAC가 마이코박테리아에 특이적으로 결합하는데 중요한 포획 완충액의 조성을 조사하기 위하여 수행되었다.
방법.
M. 스메그마티스, 슈도모나스 아에루기노사, 스타필로코커스 아우레우스 및 에스케리치아 콜라이의 고정상 배양액의 0.5 ㎖ 분취액을 원심분리하여 상기 생물을 펠렛화한 후, 상기 생물을 다양한 조성부의 포획 완충액에 재부유시켰다.
각 생물의 각 분취액에 10 ㎕ 0.01% pDADMAC를 첨가하여 혼합하고, 15분간 배양하였다. 포획제 매개성 포획을 관찰하기 위하여 각 생물의 다른 분취액에 대조군으로 포획제를 첨가하지 않았다.
이후, 50 ㎕ MyOne 카르복시산 상자성 비드(dH2O에서 사용되기 전에 ×3 세척하고, 원래 부피의 dH2O에 재부유시킴)를 각 분취액에 첨가하고, 15분간 배양하였다.
이후, 상기 분취액을 자석 위에 위치시키고, 생물의 탁한 부유물이 맑아지는 정도를 눈으로 평가하였다.
결과
상기 결과는 하기 표에 기록하여 제공하였다. 비-마이코박테리아 생물은 임의의 완충액 조성하에 포획제의 존재 또는 부재시 상기 비드에 포획되지 않았다. 마이코박테리아의 포획은 pDADMAC 포획제의 존재에 의존적이며, 포획은 연구된 모든 완충액 조성하에 관찰되었다. N-라우로일 사르코신만을 포함하는 완충액을 사용하면 상기 포획을 부분적으로 억제하는 것으로 나타났다. 그러나, 사르코신이 트리톤-X100과 조합되어 사용되면 포획 효율이 회복되었다. N-라우로일 사르코신이 포획 완충액 내에 존재하지 않으면, 비드는 마이코박테리아 포획 후 재부유 후에 많이 응집하였다. N-라우로일 사르코신을 포함시키면 이러한 포획후 응집을 방지하여 비드를 조작하는데 도움을 주며, 이것은 이후의 비드 세척 및 포획후 가공과 분석에 중요할 것이다.
결론
전술한 바와 같이, 테스트된 임의의 조건하에 포획제의 존재 또는 부재시 비-마이코박테리아 생물은 비드에 포획되지 않았다. 마이코박테리아의 포획은 포획제의 존재에 의존적이며, 테스트된 모든 조건에서 입증될 수 있다. 포획 완충액에 N-라우로일 사르코신을 포함시키는 것은 포획후 조작 및 포획된 물질의 분석을 위해 중요하였다.
실시예 9: 결과 표
Figure 112009032572057-PCT00001
실시예 10. 리간드 포획 및 산-고속 검경에 의한 마이코박테리아의 검출
마이코박테리움 보비스를 용액으로부터 포획하고, 비드 위에 직접 또는 용출 후에 항산성(acid fast) 지엘 닐슨 발색 염료 및 오라민 페놀 형광 염료 모두에 의해 염색하였다.
방법.
1. 250 ㎕의 5× 포획 완충액(250 mM 트리스 pH 8.3, 5%(v/v) 트리톤 X-100, 5% Zwittergent [3-(n,N-디메틸미리스틸암모니아)-프로판설포네이트])을 마이코박테리움 보비스 부유물을 포함하는 1 ㎖의 7H9 배지에 첨가하였다.
2. 10 ㎕의 0.01%(v/v) pDADMAC를 첨가하여 혼합하고, 15분간 배양하였다.
3. 50 ㎕ MyOne 카르복시산 상자성 비드를 첨가하여 혼합하고, 15분간 배양하였다.
4. 상기 비드를 자성 스탠드를 통해 포획하고, 1 ㎖ PBS로 세척하였다.
5. 비드 부피의 절반을 현미경 슬라이드 위에 점찍고, 건조한 후, 지엘 닐센 염색 전에 건조하고 열고정시켰다. 도 1의 좌측 패널에서, 포획된 마이코박테리아는 상기 리간드/비드로부터 용출되기 전에 보인다. 상기 자성 비드는 아래쪽 화살표로 표시되어 있다. 비드-포획된 매우 응집된 항산성 마이코박테리아는 위쪽 화살표로 표시되어 있고, 비드에 둘러싸인 것으로 보여진다.
6. 남아 있는 비드를 100 ㎕ dH2O에 재부유시키고, 10 ㎕의 클로로포름을 첨 가한다. 와동(vortex)하여 클로로포름을 상기 수층과 혼합한 후, 상기 비드를 자석으로 튜브의 측면으로 당기고, 상등액을 슬라이드 위에 점찍고, 건조하고, 열고정하고, 지엘 닐슨 염색 및 오라민 페놀 모두로 염색하였다. 모든 염색은 문헌(Medical Microbiology, a Practical Approach, Eds., Peter Hawkey and Deidre Lewis, Oxford University Press)에 개시된 대로 수행하였다. 도 1의 우측 패널에서, 포획된 마이코박테리아는 리간드/비드 용출 후에 보인다. 상기 용출은 항산성 마이코박테리아를 분산시켰다(아래쪽 화살표). 몇몇 비드가 여전히 존재한다(위쪽 화살표). 도 2는 비드로부터 포획된 미생물을 보여준다. 고배율에서 위쪽 패널에 리간드-포획된 형광 마이코박테리아의 응집을 볼 수 있으며, 저배율에서 아래쪽 패널에 분산된 마이코박테리아 형광의 전형적인 "별밤(starry night)"을 볼 수 있다.
결과
마이코박테리아는 리간드/상자성 비드에 의해 포획되며, 용출 없이, 지엘 닐슨 염색 후 비드에 둘러싸인 매우 응집된 분홍색 물질을 볼 수 있다. 용출 후, 상기 마이코박테리아는 비드로부터 분리되어 분산된다(도 1 및 도 2 참조).
결론
마이코박테리아는 결핵-리간드에 의해 포획될 수 있으며, 항산성 염색 및 검경에 의해 시각화될 수 있다. 용출 후, 마이코박테리아는 비드로부터 단리되고 분산된다. 추가 실험 결과 상기 리간드 포획 및 염색 프로토콜은 타액 내의 임상 결핵 샘플에 대해 잘 작동하며, 보다 민감한 검출을 위해 형광 검경이 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 11. 인 시투 ( in situ ) 염색을 이용한 리간드 코팅된 고형 표면 위의 마이코박테리아의 직접 포획 및 검경에 의한 포획된 생물의 검출
원리. 본 실험은 인 시투 염색 및 검경에 의해 시각화된 p-DADMAC 코팅된 슬라이드에 마이코박테리아가 포획되는 것을 입증하기 위해 수행된다.
방법.
현미경 슬라이드를 2%(v/v) p-DADMAC(20% 스톡(stock)을 증류수로 희석함)로 넘치게 하고, 증발하여 건조시킴으로써 상기 슬라이드를 p-DADMAC로 코팅하였다. 코팅되지 않은 슬라이드를 대조군으로 사용하였다. 이후, 상기 슬라이드를 풍부한 양의 증류수로 세척한 후, 건조하였다. 100 ㎕의 M. 스메그마티스 배양액을 800 ㎕의 dH2O 및 100 ㎕의 포획 완충액(10%(w/v), Zwittergent [3-(n,N-디메틸미리스틸암모니아)-프로판설포네이트], 10%(v/v) 트리톤 X-100, 500 mM 트리스 pH 8.3)에 첨가하고, 상기 슬라이드에 점찍었다. 10분간 배양한 후, 상기 슬라이드를 증류수로 세척하고, 문헌(Medical Microbiology, a Practical Approach, Eds., Peter Hawkey and Deidre Lewis, Oxford University Press)에 개시된 대로 그람 염색하였다.
결과
그람 양성인 마이코박테리아는 p-DADMAC 코팅된 슬라이드 위에 많은 수가 포획된 것이 현미경에 의해 관찰된 반면, 매우 적은(있다고 하더라도) 마이코박테리 아가 코팅되지 않은 슬라이드 위에 포획된 것을 관찰할 수 있었다.
결론
이는 마이코박테리아가 p-DADMAC 코팅된 슬라이드에 의해 포획될 수 있고, 상기 마이코박테리아가 인 시투 염색되어 현미경에 의해 관찰될 수 있음을 입증한다. 또한, BCG 배양 및 항산성 지엘 닐슨 염색 및 형광 오라민 페놀 염색으로부터도 유사한 결과가 얻어졌다.
실시예 12. 인 시투 생존성 염색을 이용한 리간드 코팅된 고형 표면 위의 마이코박테리아의 직접 포획 및 검경에 의한 검출
원리. 본 실험은 p-DADMAC 코팅된 슬라이드에 포획된 마이코박테리아가 산 채로 남아 있고, 인 시투 생존성 염색에 이은 검경에 의해 시각화될 수 있음을 입증하기 위해 수행되었다.
방법.
현미경 슬라이드를 2%(v/v) p-DADMAC(20% 스톡을 증류수로 희석함)로 넘치게 하고, 증발하여 건조시킴으로써 상기 슬라이드를 p-DADMAC로 코팅하였다. 코팅되지 않은 슬라이드를 대조군으로 사용하였다. 이후, 상기 슬라이드를 풍부한 양의 증류수로 세척한 후, 건조하였다. 100 ㎕의 M. 스메그마티스 배양액을 800 ㎕의 dH2O 및 100 ㎕의 포획 완충액(10%(w/v), Zwittergent [3-(n,N-디메틸미리스틸암모니아)-프로판설포네이트], 10%(v/v) 트리톤 X-100, 500 mM 트리스 pH 8.3)에 첨가 하고, 상기 슬라이드에 점찍었다. 10분간 배양한 후, 상기 슬라이드를 증류수로 세척하고, 7H9, OADC 배지 내의 1 ㎎/㎖ 티아졸릴 블루 테트라졸리움 브로마이드(MTT)를 첨가한 후 실온에서 30분간 배양하였다. 증류수로 세척한 후, 살아있는 마이코박테리아를 검경에 의해 관찰하였다.
결과
MTT 염색은 p-DADMAC 코팅된 슬라이드 위에 포획된 살아있는 생물 내의 불용성 푸른/검정 염색으로 침전되어서, 상기 살아있는 생물이 검경에 의해 검출되도록 한다.
결론
이는 마이코박테리아가 p-DADMAC 코팅된 슬라이드에 의해 포획될 수 있고, 상기 포획된 마이코박테리아가 산채로 남아 있고, MTT와 같은 생존성 염색에 의해 염색될 수 있음을 입증한다.
실시예 13. 점액성 타액을 사용하기 위한 방법
원리. 일부 타액 샘플은 공유결합성 설파이드 브리지로 많이 가교되고 많은 카르복시기를 가져 고전하인 고농도의 뮤코폴리사카라이드를 갖는 매우 농후하고 점액성일 수 있다. 상기 디설파이드 결합을 깨기 위하여 디티오트레이톨 및 N-아세틸 시스테인과 같은 환원제를 사용하는 것이 논의되어 왔지만, 상기 뮤코폴리사카라이드는 고농도에서 음전하성 카르복시기와 양전하성 pDADMAC의 상호작용을 통해 마이코박테리아의 포획을 여전히 간섭할 수 있다. 이러한 억제를 감소시키기 위하여, 낮은 pH - 상기 카르복시기는 중화되지만 pDADMAC는 전하를 가진 채로 남아 있는 pH - 에서 포획을 수행하는 것을 권할 수 있다. 이러한 낮은 pH에서는 이들의 전하 역시 손실될 것이기 때문에 상기 pDADMAC를 카르복시 비드상에 포획하는 것이 불가능할 것이고, 따라서 낮은 pH에서는 카르복시 비드는 카르복시 비드가 중성으로 되는 조건하에 음전하로 남아 있는 설페이트 비드로 교체되어야만 한다. 이러한 조건을 세계보건기구 타액 뱅크에 의해 공급된 타액으로부터 마이코박테리움 투베르쿨로시스를 포획하기 위해 테스트하였다.
방법.
1. 먼저, BioMag 아민 비드(BM546, Bangs Laboratories Inc., US)를 dH2O 내의 5%(v/v) pDADMAC(고분자량)로 1시간 코팅하고, dH2O로 세척한 후, dH2O에서 10 ㎎/㎖ 덱스트란 설페이트(500,000 중간 분자량(mwt))로 1시간동안 과코팅하였다. dH2O에서 세척한 후, 상기 비드를 처음 부피의 dH2O로 재부유시켜 사용 준비하였다.
2. 0.5 ㎖의 화농성 타액 샘플(마이코박테리아에 대해 검경 양성 또는 검경 음성)을 2%(w/v) 최종 디티오트레이톨로 20분간 처리하였다. 양성 대조군으로 일부 타액 샘플은 또한 처리전에 배양된 BCG로 스파이크하였다.
3. 상기 처리 후, 50 ㎕의 10%(v/v) 트리톤 X-100, 10 mM EDTA, 20 ㎕의 0.004%(v/v) pDADMAC(500,000 mwt) 및 50 ㎕의 2.5 M HCl을 첨가하고, 10분간 배양하였다. 본 단계에서의 pH는 대략 0.6인 것으로 예상된다.
4. 이후, 20 ㎕의 덱스트란 설페이트 코팅된 상자성 비드를 첨가하고, 10분 간 배양하였다.
5. 상기 비드를 자석으로 수집하고, 1 ㎖의 dH2O로 세척한 후(본 세척 단계는 보통 필요하지 않을 것이지만, 상기 마이코박테리아의 능동적인 포획을 입증하기 위해 수행하였음), 10 ㎕의 dH2O에 재부유시키고, 현미경 슬라이드 위에 점찍었다.
상기 슬라이드는 실시예 10에 개시된 바와 같이 마이코박테리아의 오라민 페놀 형광 검경을 위해 가공되었다.
결과
WHO 타액 은행에 의해 마이코박테리움 투베르쿨로시스에 대해 음성인 것으로 보고된 10개의 타액 샘플은 포획 및 검경 후 음성이었다. WHO 타액 은행에 의해 양성인 것으로 보고된 10개의 타액 샘플은 BCG로 스파이크된 대조군과 마찬가지로 명확하게 양성이었다. 아울러, 상기 대조군 샘플은 90-95%의 스파이크된 마이코박테리아가 회수된 것으로 비교 검경에 의해 평가되었기 때문에, 타액으로부터의 마이코박테리아의 회수가 매우 효율적임을 나타내었다.
결론
농후하고 점액성인 샘플의 경우, 마이코박테리아 포획은 뮤코폴리사카라이드 상의 카르복시산 기를 중성으로 하기에 충분히 낮은 pH에서 잘 작동하였다.
본 명세서에서, 달리 나타내지 않는다면, '또는'이란 단어는 작성자의 의미 로는 언급된 조건의 한쪽 또는 양쪽 모두를 충족할 때 참 값을 반환하는 것으로 사용되며, 단지 하나의 조건만이 충족되는 것을 요구하는 '배타적인 또는(exclusive or)'은 작성자에게서 반대이다. '포함하는(comprising)'이란 단어는 '구성되는(consisting of)'을 의미하기 보다는 '포함하는(including)'의 의미로 사용된다. 상기에서 인정된 모든 종래기술은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에서 인정되지 않은 임의의 선행 문헌들은 그 기술이 본 명세서 작성 당시에 오스트레일리아 등에서 보통의 일반적인 지식이라는 것을 승인 또는 나타내는 것으로 간주될 것이다.
<110> Microsens Medtech Limited Stuart Mark Wilson Christopher John Stanley <120> Capture of Mycobacteria like Micro-Organisms <130> 2009-fpa-3474 <150> GB0623866.1 <151> 2006-11-29 <150> GB0710977.0 <151> 2007-06-07 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 1 tcaggccctc gaaagccgac tggg 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 2 ccaggactcg gtacaagact ctgc 24 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 3 cctcgggcta aaaaccacct ctgacc 26 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 4 ctgggagaat gtgacacgcc gacc 24

Claims (19)

  1. 소수성 표면을 갖는 미생물 샘플을 포획하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 미생물을 포획제와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 포획제는 소수성 상호작용에 의해 상기 포획제가 상기 미생물에 결합하도록 하는 소수성 특성 및 극성 특성 모두를 갖고, 상기 포획제는 표면상에 존재하여 상기 미생물을 포획하거나, 용액 내에 존재할 수 있으며, 이후 상기 방법은 상기 표면과 상기 포획제 사이의 극성 상호작용에 의해 상기 포획제를 상기 표면에 결합시킴으로써 상기 미생물을 표면에 포획하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 포획제는 다중 극성 부위(multiple polar site)를 갖는 긴 탄화수소 사슬을 포함하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 다중 극성 부위는 상기 사슬을 따라 간격을 두고 위치하는 방법.
  4. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포획제는 양이온성인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 포획제는 폴리-디알릴디메틸 암모늄 클로라이드(DADMAC)인 방법.
  6. 소수성 표면을 갖는 미생물의 유체 샘플로부터 포획하는 방법으로서, 상기 미생물을 폴리-DADMAC를 포함하는 가용성 포획제와 접촉시켜 상기 포획제가 상기 미생물에 결합하고, 상기 포획제를 상기 표면에 결합시킴으로써 상기 미생물을 상기 표면에 포획하는 것을 포함하는 방법.
  7. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표면은 비드에 의해 제공되는 방법.
  8. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플은 원하는 미생물 결합의 선택성을 개선시키는 세제의 존재하에 상기 포획제와 접촉하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 세제는 지방산의 아미노산 아미드를 포함하는 방법.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 세제는 N-라우로일 사르코신을 포함하는 방법.
  11. 청구항 8 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세제는 트리톤 X 세제를 포함하는 방법.
  12. 선행하는 청구항 중 어느 한 항의 방법에 의해 미생물을 표면에 포획하는 단계, 상기 포획된 미생물을 세척하는 단계, 및 상기 포획된 미생물을 상기 표면 상에서 또는 표면으로부터 제거한 후 검출하는 단계를 포함하는 미생물의 검출 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 포획된 미생물의 생존력이 결정되는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 포획된 미생물은 약물로 처리되고, 상기 미생물의 생존력을 결정하여 상기 약물이 상기 미생물의 생존력에 영향을 미치는지 여부를 입증하는 방법.
  15. (a) 포획제가 미생물에 결합하여 소수성 상호작용에 의해 검출될 수 있는 소수성 특성 및 폴리이온 특성 모두를 갖는 가용성 포획제, 상기 표면과 상기 포획제 사이의 극성 상호작용에 의해 상기 포획제를 상기 표면에 결합시킴으로써 상기 표면에 상기 미생물을 포획하기 위한 표면을 갖는 기질, 또는 (b) 고형 표면 위에 코팅되어서 고정화되고, 소수성 및 폴리이온 특성 모두를 가지며, 검출되는 미생물에 결합할 수 있는 포획제, 및
    - 상기 미생물을 감염시킬 수 있는 파지;
    - 상기 미생물 또는 상기 파지의 게놈 핵산 증폭을 수행하기 위한 프라이머;
    - 상기 미생물을 배양하기 위한 배양 배지;
    - 현미경 검사를 위해 상기 미생물을 시각화하기 위한 염료;
    - 상기 미생물에 결합하기 위한 항체; 또는
    - 상기 미생물의 배양시에 생성되는 대사물 검출에 사용하기 위한 검출제 중 적어도 하나를 포함하는 미생물 분석 키트.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 포획제는 폴리-DADMAC인 키트.
  17. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    상기 파지, 상기 프라이머, 상기 항체 또는 상기 검출제는 M. 투베르쿨로시스, M. 아비움, M. 인트라셀룰라레, M. 파라투베르쿨로시스, M. 레프라에, M. 칸사시이, M. 마리눔, 또는 M. 포르투이툼 콤플렉스의 동정에 특이적인 키트.
  18. 청구항 15 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트는 살아있는 미생물에 특이적인 검출제를 포함하는 키트.
  19. 청구항 15 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트는 잠재적으로 상기 미생물의 생존력에 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 약물을 포함하는 키트.
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