CN105283762B - 用于使用多种染料评估分子链片段长度的方法 - Google Patents

Abstract

用于可视化并区分布置在共同电泳凝胶通路中的样品中的未知长度的DNA/RNA片段和已知长度的内部标记物的方法。该方法包括将DNA/RNA片段用第一染料标记并将内部标记物用第二染料标记。该第一和第二染料具有分离的荧光发射光谱，其可以用于在视觉上区分DNA/RNA片段和内部标记物。

Description

用于使用多种染料评估分子链片段长度的方法

背景技术

基于片段长度电泳分离核酸(DNA/RNA)链(借助凝胶或毛细管)是实验室遗传学中广泛使用的工具。该方法用于评估DNA/RNA样品中片段长度的分布。电泳分离之后的DNA/RNA可视化依赖于将一种或多种染料分子附着于DNA/RNA。可以使染料分子激发荧光以确定DNA/RNA在凝胶柱、通道或其他通路(除非另外表明，在下文中统称“通路”)中的位置，DNA/RNA沿该凝胶柱、通道或其他通路穿过电泳。DNA/RNA片段长度分布的解释一般依赖于与至少一个尺寸参照物，且优选地多个尺寸参照物之间的比较，该尺寸参照物是由分离的、已知尺寸的DNA/RNA(“标记物”)组成的。标记物可以以不同的形式实现，但常用的优化尺寸准确度的方法是使标记物包括在与片段化DNA/RNA相同的电泳通路中。

一个目前用于使用电泳评估DNA/RNA片段的尺寸的优选方法包括，在开始电泳将已知的标记物包括在这种片段的样品内，即使用内部标记物。然而，由于DNA/RNA样品和标记物通常均结合有相同的染料以便使其在通路内可视化，因而如果存在大浓度的与标记物同样尺寸且具有相同长度的DNA/RNA片段，则可能难以或不能区分这二者。在这种情形下，来自附着至DNA/RNA样品片段的染料的荧光将经常掩蔽标记物染料的荧光。该后果导致对DNA/RNA片段长度的不准确尺寸估计，以致于不能区分内部标记物以提供用于对比的参照。

掩蔽内部标记物的荧光信号的问题可以通过选择允许它们区别于样品的尺寸的内部标记物，而在很大程度上得以避免。例如，Bioanalyzer 2100毛细管电泳系统(AgilentTechnologies)利用具有一种非常小(～15-50bp)且另一种非常大(～1.5-17kbp)的两种内部标记物的系统以自动评估DNA/RNA的片段长度分布。通过选择不同长度的内部标记物，在统计上最小化了样品DNA/RNA和标记物之间片段长度显著重叠的可能性。

虽然使用不同长度的内部标记物可以绕过上述掩蔽的问题，但当内部标记物为更近似样品的尺寸时，片段长度估计的结果会改善：可以通过使用更适合尺寸的内部标记物提供更准确的DNA/RNA片段长度估计，然而，这样做增加了不希望的荧光掩蔽的可能。

另一种用于使用电泳估计DNA/RNA片段尺寸的途径包括使用外部标记物，即将标记物引入与加载有DNA/RNA样品的通路(泳道，laneway)相邻的通路中。在电泳完成后，可以通过将它们与外部标记物通路比较，估计样品通路中的片段长度。

可以适当选择外部标记物片段的尺寸以匹配样品片段的尺寸范围；它们之间没有任何重叠或荧光饱和的可能性(机会)。然而，由于外部标记物和DNA/RNA样品之间施加的电流和通路(泳道，laneway)基质组成(matrix composition)的差异可以混淆尺寸的估算，因此该比较不是最佳的。此外，实际的样品成分可以影响片段的移动性，因而通道之间相同分子的迁移速度可以取决于剩余的样品组成而不同。为了消除(解决，account for)差异并改善片段长度估计，最好将标记物与DNA/RNA样品包括在同一通路中。

最后，另一种用于评估片段长度的方法包括将具有独特的激发/发射光谱的荧光染料的内部标记物标记在DNA/RNA分子的末端。然而该方法具有局限性。因为仅将染料分子附着于内部标记物的末端，由这种标记物分子发出的任何信号都非常小，且仅可由高灵敏度的、高成本的，不与凝胶电泳相兼容的探测器(检测器，detector)探测。此外，较大的标记物(即大于2500bp)具有过高的DNA/RNA片段/染料分子比例。并且，因为可以加载的标记物的绝对质量具有实际的上限，该比例阻止了使用大的内部标记物，即使是用于具有高灵敏度探测器的分析系统(即毛细管系统)。

发明内容

考虑到上述与现有技术相关的不足，本发明致力于，用于使共用电泳通路中的DNA/RNA样品与内部标记物分开地可视化的方法，以辅助估计样品内的DNA/RNA片段长度。因此，可以选择一种或多种内部标记物，为了最大的比较值，可以将其在估计DNA/RNA样品的片段长度分布过程中嵌入(nest)DNA/RNA样品片段的分布内。有利地，消除了由DNA/RNA片段的(荧光信号所致的)内部标记物荧光信号掩蔽的历史问题，而内部标记物的荧光信号强度仍足以在即使是较不灵敏的电泳装置中使用，诸如使用CCD或MOSFET显像硬件(例如，传统数字照相机技术)和/或非相干照射硬件(non-coherent illumination hardware)(例如，传统LED技术)的那些。

本发明包括使用用于样品中的DNA/RNA样品片段以及至少一种内部标记物的多种荧光染料，以在电泳装置中实现并发荧光(concurrent fluorescence)并产生非竞争性(non-competing)发射光谱，和/或实现顺序荧光以类似地产生非竞争性发射光谱(但在时间上是分开的)。

如果期望增强的片段长度分辨率，相对于单染料标记物组合，根据本发明可以使用多个内部标记物和/或染料。因此，根据本发明的方法包括在内部标记物的整个长度中，将任何内部标记物使用至少一种，并且优选地多于一种的独特(unique)染料分子标记。这使得尺寸估计方式与经常同凝胶电泳使用的低成本探测器方式(例如，光学照相机)相兼容。其也实现了上文中的多种染料方法对较大的内部标记物(例如，>～2500bp)的利用。

除了增加的灵敏度和片段长度选择性，在实施各种发明实施方式时使内部标记物独立地(排他地，exclusively)可视化的能力，排除了加载内部标记物的绝对质量的需要，在其他情况下其将从研究中的(所关注的)DNA/RNA的荧光信号中可靠地区分。因此，通常小于10％的原始内部标记物对达到期望的说明(阐释，elucidation)是必需的，在其他情况下在不使用根据本发明的多染料方案下其将是必需的。相对于现有技术单染料方案的这种减少预计可节省大于50％的运行成本，此外在实施本发明的双染料实施方式时，增加DNA/RNA片段评估的准确度。不言自明，技术人员不再需要具有对于，DNA/RNA样品中潜在的过量的片段长度(其可能掩蔽来自所选择的内部标记物的信号)的详细预知。因此根据本发明的多种染料方法还将减少进行片段长度分布评估过所需的时间。

在一系列的发明实施方式中，第一染料在由第一激发方式，诸如受限波长光源激发荧光时具有第一发射光谱，其关联至至少一种标记物，并且第二染料在由第二激发方式，诸如不同于第一激发方式的受限波长光源激发荧光时，具有不同于第一染料的第二发射光谱，其关联至多个DNA/RNA样品片段，其中将该DNA/RNA样品片段和至少一种标记物置于共同的凝胶电泳通路中。同时由第一和第二激发方式激发至少一部分的通路，从而使两种染料同时发荧光，和/或使染料顺序地发荧光。此方法的结果是，可以选择具有可能预期与过量的片段长度重叠的尺寸的一种或多种内部标记物(称为适体(adaptermer))，其可以存在于被表征的DNA/RNA样品中。这种重叠允许标记物和DNA/RNA样品片段之间的高精度比较，其对于估计一组称为miRNA的生物学重要的核酸分子的片段长度分布发现了特定的功用。

用于实现上述染料关联(association)的方法包括，将一种染料共价键合(结合，bond)至至少一种，并且优选地多种DNA/RNA样品片段的多个部位上，并且在另一种染料和至少一种，并且优选地多种标记物片段上的多个部位上之间实现较低强度的键合。因此，染料分子和包含其的化合物，诸如Cy5、Alexa Fluor 647，和DyLight 650可以用于首先建立标记物的标记，同时染料分子和包含其的化合物诸如SYBR Gold、SYBR Green、溴化乙锭，和Pico Green可以用于此后建立DNA/RNA样品片段的标记。

应注意的是，在参照上文的实施例中，将非共价键合的染料分子分开关联是不必要的。由标记的标记物和未标记的DNR/RNA片段同时暴露于非共价键合的染料分子，已经获得适合的结果。虽然标记物上可能仍然存在可用的键合(结合，bond)位点，标记物已经具有多个共价键合至其的染料分子的事实使可用的键合位点最小化，且染料之间独特的荧光特征在随后的试验步骤过程中实现了适当的位置替换。因此及如上文总体所述，当使用一种独特的染料独立地标记至少一种标记物或DNA/RNA样品片段时，所述各种发明实施方式是可充分实现的。

鉴于片段长度确定的灵敏度、选择性的增加，用作内部标记物的DNA/RNA片段的尺寸的选择，以及运行成本和时间的减少，如以其各种实施方式举例说明的本发明，相对于在使用具有染料辅助的可视化机会的内部标记物的凝胶类介质中的电泳领域的现有技术努力而言，显示出显著的进步。

附图说明

图1A示出用蓝色光和红色光的组合激发后的包含标记的DNA和标记的内部标记物的电泳通路的第一图像，以及电泳通路的第一图像的示意图。

图1B示出仅用红色光激发的在图1A中描绘的包含标记的DNA和标记的内部标记物的电泳通路的第二图像，以及电泳通路的第二图像的示意图。

图2示出可以用于本发明的双染料实施方式的两种候选染料分子的典型激发/发射光谱。

具体实施方式

总体参照图1A和1B，如在本领域中公知的，将DNA/RNA沿通路电泳(见电泳通路示意图)，致使较小的片段以比较大的片段更快的速率穿过介质，从而，通过片段长度分开样品。由于DNA/RNA和内部标记物二者一起运行，可以在电泳过程中将它们一起可视化。在图1A中，双链DNA样品已使用第一染料(染料分子#1)标记，且当由蓝色LED激发时发射绿光。内部标记物已使用第二染料(染料分子#2)标记，且当由红色LED激发时发射红光。照相机获取电泳通路的第一图像并传送该数据至软件图像分析包。

在图1B中，立即将蓝色LED关闭以熄灭染料分子#1的激发并消除绿光发射。使用红色LED继续激发染料分子#2，将内部标记物独立地可视化。然后照相机获取电泳通路的第二图像并将其传送至软件图像分析包。然后所述包比较两个图像，并且已知内部标记物的尺寸，估算组成样品DNA的周围片段长度的尺寸。应注意，在该方法的另一个实施方式中，可以仅在蓝色LED仅正要可视化样品DNA时获取电泳通路的第一图像。这确保内部标记物和样品DNA的可视化可以相互独立。

接下来参照图2，示出了可以用于双染料系统的两种候选染料分子的典型激发/发射光谱。染料分子#1占据的激发/发射波长范围与染料分子#2的足够不同，以实现二者之间的区分。

Claims (5)

1.一种用于将至少一种DNA样品片段或至少一种RNA样品片段与在包含其的样品中并且处于共同的凝胶电泳通路中的至少一种具有至少2500碱基对的长度的内部标记物分开地可视化以辅助评估DNA样品片段或RNA样品片段长度的方法，并且所述至少一种内部标记物的长度是已知的，所述方法包括：

-用独立地标记所述至少一种内部标记物的第一染料来标记所述至少一种具有至少2500碱基对的长度的内部标记物，所述第一染料在由第一激发方式激发荧光时具有第一发射光谱；以及

-将所述至少一种DNA样品片段或至少一种RNA样品片段用第二染料标记，所述第二染料在由第二激发方式激发荧光时具有第二发射光谱，所述第二发射光谱与所述第一发射光谱不同；

其中所述至少一种内部标记物中的每一种用多个第一染料分子标记，其中通过将所述多个第一染料分子共价键合至所述至少一种内部标记物来标记所述多个第一染料分子，且其中所述至少一种内部标记物在其整个长度上用所述第一染料标记；并且

其中，在所述至少一种DNA样品片段或至少一种RNA样品片段上的多个位点处，用所述第二染料标记所述至少一种DNA样品片段或至少一种RNA样品片段中的每一个。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述通路由所述第一激发方式和所述第二激发方式同时激发。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述通路由所述第一激发方式和所述第二激发方式顺序激发。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述第二染料选自SYBR Gold、SYBR Green、溴化乙锭和Pico Green。

5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述第一染料选自Cy5、Alexa Fluor 647和DyLight 650。