JP2023510841A

JP2023510841A - ウイルスベクター分離、分析、特徴付けおよび定量のためのキャピラリー電気泳動法

Info

Publication number: JP2023510841A
Application number: JP2022542695A
Authority: JP
Inventors: ティンティンリー，; ファンワン，; ハンディヨワント，
Original assignee: ディーエイチテクノロジーズデベロップメントプライベートリミテッド
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2023-03-15
Also published as: US20230065606A1; CN114981658A; EP4090977A1; WO2021144719A1

Abstract

本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを分析するための方法を提供する。より詳細には、本開示は、全長外因性ポリヌクレオチドを有するか、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するか、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くとして、ＡＡＶベクターを分離し、特徴づけ、定量するためのキャピラリー電気泳動法に関する。１つの方法では、この分析は、各ウイルスベクターの等電点に基づきウイルスベクターを分離する為に十分な条件下かつ継続時間の間、外因性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含むサンプルについてのキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を使用する。

Description

関連米国出願
本出願は、２０２０年１月１３日出願の米国仮出願第６２／９６０，２８２号（その内容全体は、本明細書に参考として）の優先権の利益を主張する。

背景
ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）は、遺伝子送達のための一般的な分子生物学ツールであり、他の適用の中でも遺伝子治療において有望さを示す。この技術の限界は、ベクター（例えば、ＡＡＶ）の合成が、代表的には、いくらかのベクターが、標的導入遺伝子のフラグメントのみ（「部分的なベクター（ｐａｒｔｉａｌｖｅｃｔｏｒ）」）または全体的に標的導入遺伝子を欠いている（「空のベクター（ｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒ）」）を含む、不均一サンプルを生じることである。部分的なベクターおよび空のベクターは、適切なパッケージされたベクター（すなわち、導入遺伝子が完全に被包されたベクター）と標的細胞上のベクター結合部位に関して競合することによって、下流のウイルス形質導入に負の影響を与え得る不純物と考えられる（例えば、「夾雑（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ）」ベクター）。さらに、これらの夾雑するベクターは、ウイルスベクター生成物の免疫原性を増大させ得る。

従って、ウイルスベクター研究および開発の間に、これらの夾雑ベクターを同定することは有利である。分析用の超遠心分離、電子顕微鏡検査法、分光光度法およびアニオン交換ＨＰＬＣを含む、完全なベクターおよび空のベクターを同定する技術は、最小の解像度および感度を提供するに過ぎない（例えば、部分的なベクターを決定することができず、再現性に乏しい）。これらの技術はまた、時間浪費型であり、大きなサンプル容積を必要とする。

本明細書で記載されるのは、完全な、部分的な、および空のウイルスベクターを分離、特徴付け、および定量するための、他の分析技術の欠点を克服する新規なキャピラリー電気泳動技術である。

開示の要旨
本開示は概して、ウイルスベクターを、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいて分離する方法を提供する。一局面において、本開示は、サンプル中のウイルスベクターを分離する方法であって、上記方法は、（ａ）各ウイルスベクターの等電点（ｐＩ）に基づいて、上記ウイルスベクターを分離するために十分な条件下でかつ継続時間にわたって、外因性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含むサンプルに対してキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を行う工程；（ｂ）ｃＩＥＦ結果のリードアウトを生成する工程；および（ｃ）上記リードアウトを分析する工程であって、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいてウイルスベクターを同定する工程による方法を提供する。上記方法は、上記ウイルスベクターを、全長外因性ポリヌクレオチド、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するか、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くとして特徴付ける。１つの局面において、上記全長外因性ポリヌクレオチドを有するウイルスベクターは、上記外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するウイルスベクターまたはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くウイルスベクターに対して代わりのｐＩを有する。

いくつかの局面において、上記外因性ポリヌクレオチドは、導入遺伝子、プロモーターおよびＩＴＲ配列を含む。いくつかの局面において、上記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。

いくつかの局面において、上記ｃＩＥＦ結果のリードアウトは、電気泳動図またはｃＩＥＦプロセスがリアルタイムで画像化されることを可能にする全カラム画像化検出（ｗｈｏｌｅ－ｃｏｌｕｍｎｉｍａｇｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（ＷＣＩＤ）技術を使用する分離スキャンである。

いくつかの局面において、上記ｃＩＥＦ方法は、（ａ）ウイルスベクターを含むサンプルを、チャネルまたはキャピラリーに装填する工程；（ｂ）上記チャネルまたはキャピラリーの第１の端部を酸性溶液へと流体接続する工程；（ｃ）上記チャネルまたはキャピラリーの第２の端部を塩基性溶液へと流体接続する工程；および（ｄ）上記チャネルまたはキャピラリーに電圧を印加して、上記チャネルまたはキャピラリーの中にｐＨ勾配を誘導／形成する工程を包含する。ある特定の局面において、上記チャネルまたはキャピラリーは、いくつかの実施形態において、濃度に依存して、２～４μＬのウイルスベクターを含むサンプルが装填され（すなわち、完全に満たされ）る。従って、いくつかの例示の実施形態によれば、上記サンプルは、１またはこれより多くのウイルスベクターを含んでいてもよく、ゲルもしくはゲルマトリクス、可溶化剤（例えば、尿素、グリセロールなど）、キャリア両性電解質、アノード安定化剤（ａｎｏｄｉｃｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）、カソード安定化剤（ｃａｔｈｏｄｉｃｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）、およびｐＩマーカーをさらに含む。

本開示は、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいて、種を分離し、電気泳動図におけるその相当するピークのピーク面積を測定することによってウイルスベクターを定量する方法をさらに提供する。上記方法は、（ａ）各ウイルスベクターの等電点（ｐＩ）に基づいて、上記ウイルスベクターを分離するために十分な条件下でかつ継続時間にわたって、外因性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含むサンプルに対してキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を行う工程；（ｂ）ｃＩＥＦ結果のリードアウトを生成する工程；および（ｃ）上記リードアウトを分析する工程であって、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいてウイルスベクターを同定する工程を包含し得る。上記方法は、上記ウイルスベクターを、全長外因性ポリヌクレオチド、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するか、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くとして、特徴づける。１つの局面において、上記外因性ポリヌクレオチドを有するウイルスベクターは、上記外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するウイルスベクターまたはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くウイルスベクターに対して、代替の／異なるｐＩ（低いかまたは高いかのいずれか）を有する。

いくつかの局面において、上記外因性ポリヌクレオチドは、導入遺伝子、プロモーターまたはＩＴＲ配列を含む。いくつかの局面において、上記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。

いくつかの局面において、上記ｃＩＥＦ結果のリードアウトは、電気泳動図または分離スキャンである。

いくつかの局面において、上記ｃＩＥＦ法は、（ａ）ウイルスベクターを含むサンプルを、チャネルまたはキャピラリーに装填する工程；（ｂ）上記チャネルまたはキャピラリーの第１の端部を酸性溶液へと流体接続する工程；（ｃ）上記チャネルまたはキャピラリーの第２の端部を塩基性溶液へと流体接続する工程；および（ｄ）上記チャネルまたはキャピラリーに電圧を印加して、上記チャネルまたは上記キャピラリーの中にｐＨ勾配の形成を引きおこす工程を包含する。ある特定の局面において、上記チャネルまたはキャピラリーは、上記サンプルのうちの少なくとも一部を構成する２～４μＬのベクター物質が装填される。

別の局面において、本開示は、（ａ）各ウイルスベクターの電荷不均一性または等電点（ｐＩ）に基づいて、上記ウイルスベクターを分離するために十分な条件下でかつ継続時間にわたって、外因性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含むサンプルのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を行う工程；（ｂ）ＣＥ結果のリードアウトを生成する工程；および（ｃ）上記リードアウトを分析する工程であって、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいてウイルスベクターを同定する工程によるサンプル中のウイルスベクターを分離する方法を提供する。上記方法は、上記ウイルスベクターを、全長外因性ポリヌクレオチド、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するか、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くとして、特徴づける。

いくつかの局面において、上記外因性ポリヌクレオチドは、導入遺伝子を含む。いくつかの局面において、上記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。

いくつかの局面において、上記ＣＥ結果のリードアウトは、電気泳動図または分離スキャンである。

いくつかの局面において、上記ＣＥ法は、（ａ）ウイルスベクターを含むサンプルを、チャネルまたはキャピラリーに装填する工程；（ｂ）上記チャネルまたはキャピラリーの第１の端部をアノード端子へと流体接続する工程；（ｃ）上記チャネルまたはキャピラリーの第２の端部をカソード端子へと流体接続する工程；および（ｄ）上記チャネルまたはキャピラリーに電圧を印加する工程を包含する。上記ＣＥ法としては、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等速電気泳動、ミセル動電キャピラリークロマトグラフィーおよびキャピラリー動電クロマトグラフィーが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記アノード端子は、酸性溶液を含み得る。いくつかの実施形態において、上記カソード端子は、塩基性溶液を含み得る。

本開示は、ウイルスベクターを、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいて定量する方法をさらに提供する。上記方法は、（ａ）各ウイルスベクターの電荷不均一性または等電点（ｐＩ）に基づいて、上記ウイルスベクターを分離するために十分な条件下でかつ継続時間にわたって、外因性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含むサンプルのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を行う工程；（ｂ）ＣＥ結果のリードアウトを生成する工程；および（ｃ）上記リードアウトを分析する工程であって、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいてウイルスベクターを同定する工程を包含し得る。上記方法は、上記ウイルスベクターを、全長外因性ポリヌクレオチド、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するか、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くとして、特徴づける。

いくつかの局面において、上記ＣＥ法は、（ａ）ウイルスベクターを含むサンプルを、チャネルまたはキャピラリーに装填する工程；（ｂ）上記チャネルまたはキャピラリーの第１の端部をアノード端子へと流体接続する工程；（ｃ）上記チャネルまたはキャピラリーの第２の端部をカソード端子へと流体接続する工程；および（ｄ）上記チャネルまたはキャピラリーに電圧を印加する工程を包含する。上記ＣＥ法としては、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの局面において、上記アノード端子は、酸性溶液を含み得る。いくつかの実施形態において、上記カソード端子は、塩基性溶液を含み得る。

上記の方法を行うシステムがまた、本明細書で開示される。

図１は、完全外因性ポリヌクレオチドを有するウイルスカプシド、空のウイルスカプシド、および外因性ポリヌクレオチドフラグメントまたは夾雑フラグメントを含むウイルスカプシドの例を図示する。

図２は、ウイルスベクターを分離するシステムの例示的実施形態を図示する。

図３Ａは、本開示のいくつかの実施形態に従うｃＩＥＦ法の初期機器パラメーターを示す。

図３Ｂは、本開示のいくつかの実施形態に従うｃＩＥＦ法の初期ＵＶ検出器パラメーターを示す。

図３Ｃは、本開示のいくつかの実施形態に従うｃＩＥＦ法の機器調整パラメーターを示す。

図３Ｄは、本開示のいくつかの実施形態に従うｃＩＥＦ法の機器分離パラメーターを示す。

図３Ｅは、本開示のいくつかの実施形態に従うｃＩＥＦ法の機器シャットダウンパラメーターを示す。

図４は、空のウイルスカプシドを富化した第１のＡＡＶサンプルおよび完全ウイルスカプシドを富化した第２のＡＡＶサンプルのｃＩＥＦ分離結果を図示する。

図５Ａは、第３のＡＡＶサンプルのｃＩＥＦ分離結果およびＡＥＸ－ＨＰＬＣ分離結果を図示する。

図５Ｂは、図５Ａに示される結果の拡大図である。

図６Ａは、空のウイルスカプシドを富化した第４のＡＡＶサンプルおよび完全ウイルスカプシドを富化した第５のＡＡＶサンプルのｃＩＥＦ分離結果を図示する。

図６Ｂは、図６Ａに示される結果の拡大図である。

図７は、広い範囲および狭い範囲のｐＨ両性電解質の混合物、または広い範囲のｐＨ両性電解質のみを使用する第６のＡＡＶサンプルのｃＩＥＦ分離結果を図示する。

図８は、第６のＡＡＶサンプルの５回の泳動からのｃＩＥＦ分離結果を図示する。

図９は、ＣＺＥ分離結果を図示する。

図１０は、ＣＺＥ分離結果を図示する。

詳細な説明
ウイルスベクターを、それらの外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいて、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用して分離および／または定量する方法が、本明細書で開示される。「キャピラリー電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」または「ＣＥ」とは、大きな分子および小さな分子を、サイズおよび電荷に基づいて、電場におけるそれらの異なる移動速度によって分離する、キャピラリーを使用する関連技術のファミリーをいう。ＣＥ技術としては、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、等速電気泳動、ミセル動電キャピラリークロマトグラフィーおよびキャピラリー電気クロマトグラフィーが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「キャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）」とは、電気泳動を行うための分離媒体のある容積を支持し得るチャネル、チューブ、または他の構造体に言及する。キャピラリーの外形（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）は変動し得、円形、矩形、または四角形の断面を有する構造、チャネル、溝、プレートなどを含み、これらは、当該分野で公知の技術によって製作され得る。本開示のキャピラリーは、例えば、シリカ、溶融シリカ、石英、シリケートベースのガラス（例えば、ホウケイ酸ガラス、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラス、および他のシリカ様物質）のような物質が挙げられるが、これらに限定されない物質から作製され得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、適合され得、任意の概して公知の電気泳動プラットフォーム（例えば、単一のもしくは多数の微小流体チャネルを含む電気泳動デバイス、エッチングされた微小流体キャピラリー、ならびにスラブゲルおよび薄板ゲル電気泳動（ｔｈｉｎ－ｐｌａｔｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）のような）において使用され得る。

本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ）」とは、外来の遺伝物質（すなわち、外因性ポリヌクレオチド）を保っているかまたはそれが複製および／もしくは発現され得る別の細胞へと運ぶビヒクルとして使用されるウイルス構築物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質のうちの１またはこれより多くを含むウイルス分子）をいう。例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および１より多くのベクターの性質を有するように遺伝的に改変されたハイブリッドが挙げられる。

一般に、ＣＥおよび特にｃＩＥＦは、光学的のぞき窓（ｏｐｔｉｃａｌｖｉｅｗｉｎｇｗｉｎｄｏｗ）、高電圧電源、２つの電極アセンブリ、２つの緩衝液リザーバー、および検出器とともに、キャピラリーを利用する。一方の緩衝液リザーバーは、Ｈ^＋イオンをキャピラリーに提供する酸性溶液を含む一方で、一方の緩衝液リザーバーは、ＯＨ^－イオンをキャピラリーに提供する塩基性溶液を含む。上記キャピラリーの第１の端部は、上記塩基性溶液に流体接続される一方で、上記第２の端部は、上記酸性溶液に流体接続される。いくつかの実施形態において、同じタイプの緩衝液が、一方のリザーバーがアノード端子として機能し得、かつ上記２つのリザーバーのうちの他方がカソード端子として機能し得る限り、上記２つの緩衝液リザーバーの各々の中で利用され得る。サンプルまたは分析物は、電子注入または圧力注入を介して上記キャピラリーに注入され得る。いくつかの実施形態において、キャピラリーは、分析を受けるサンプルのうちの一部を含む２～４μＬのベクター物質が装填される。いくつかの実施形態において、上記緩衝溶液は、二者択一的に酸性溶液または塩基性溶液である必要はない。場合によっては、同じ緩衝溶液が、これがＨ^＋イオンおよびＯＨ^－イオンを提供し得る限り、上記キャピラリーの第１のおよび第２の端部に提供され得る。概して、５μＬ未満の低いサンプル容積が、分析において消費される。

サンプル移動は、電源から電極アセンブリへと供給される電場を印加することによって開始される。目的のサンプル構成要素または分析物は、電気浸透流およびそれらの電気泳動移動度に起因してそれらが移動するにつれて分離し、分離した構成要素または分析物の勾配を形成し、その後、上記キャピラリーの出口端部近くで検出される。検出器出力は、インテグレーター、マイクロプロセッサー、またはコンピューターによって処理される。その得られるＣＥ分離データは、電気泳動図としてディスプレイされ、これは、検出器応答を時間の関数として報告する。いくつかの局面において、上記ＣＥリードアウトは、電気泳動図または分離スキャンである。適切なＣＥ検出器としては、紫外線（ＵＶ）、紫外線－可視（ＵＶ－Ｖｉｓ）、レーザー誘起蛍光、自然蛍光（ｎａｔｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、ダイオードアレイ、屈折率、電気化学的、表面プラズモン共鳴、ラマン散乱、および質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。適切なＣＥ光学検出器としては、ＣＣＤアレイおよび光電子倍増管が挙げられるが、これらに限定されない。

特定の局面において、本開示は、ＣＥを行って、ウイルスベクターを分離し、全長外因性ポリヌクレオチド（「完全ウイルスベクター（ｆｕｌｌｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ）」）、外因性ポリヌクレオチドフラグメント（「部分的なウイルスベクター（ｐａｒｔｉａｌｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ）」）を有するか、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠く（「空のウイルスベクター（ｅｍｐｔｙｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ）」）として特徴づけるための方法に関する。この方法はまた、ウイルスベクターを含むサンプルまたは調製物中の完全な、部分的な、および空のウイルスベクターを識別し、その相対的存在量を定量し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、脂質ナノ粒子、リポソーム、ビロソーム、およびカーボンナノチューブを分離し、特徴付けるために使用され得る。

例示的実施形態において、上記ウイルスベクターは、ＡＡＶを含み、本明細書で開示される方法は、完全な導入遺伝子、プロモーターおよびＩＴＲ配列、導入遺伝子フラグメントを有するか、または導入遺伝子を欠くとして、ＡＡＶカプシド、粒子、またはベクターを分離および特徴づける（図１）。いくつかの局面において、上記方法はまた、夾雑物またはそのフラグメントを有するＡＡＶカプシド、粒子、またはベクターを識別し得る。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」とは、別の生物のゲノムへと人工的に導入される外来のもしくは改変された遺伝子またはポリヌクレオチド配列をいう。「アデノ随伴ウイルスカプシド、粒子、またはベクター（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｃａｐｓｉｄ，ｐａｒｔｉｃｌｅ，ｏｒｖｅｃｔｏｒ）」または「ＡＡＶカプシド、粒子、またはベクター」とは、ウイルスタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むウイルスカプシドの中にパッケージされた導入遺伝子に言及する。ＡＡＶベクター生成のための技術および方法は、当該分野で公知である。一般に、ＡＡＶベクター生成は、（ａ）カプシド形成および複製のためのＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド；（ｂ）アデノウイルスヘルパー遺伝子を含むプラスミド；（ｃ）逆方向末端反復が隣接した標的導入遺伝子を含むカセット；ならびに（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞のようなウイルスパッケージング細胞株を利用する。当業者が認識するように、本明細書で開示される方法および適用は、それらを生成するために使用される技術、方法、材料、およびプロトコールにもかかわらず、任意のＡＡＶに適用され得る。

さらなる局面において、本開示は、ｃＩＥＦを行って、完全なウイルスベクター、部分的なウイルスベクター、および空のウイルスベクターを分離および特徴づけるための方法に関する。具体的な実施形態において、ｃＩＥＦ法は、ＡＡＶカプシド、粒子、またはベクターを、完全な導入遺伝子およびプロモーター、導入遺伝子フラグメントを有するか、または導入遺伝子を欠くとして、分離および特徴づけるために使用される。ｃＩＥＦは、双性イオン性キャリア両性電解質を利用して、上記キャピラリー内にｐＨ勾配を作り出す。キャリア両性電解質は、広い範囲（例えば、ｐＨ３～１０）、狭い範囲（例えば、ｐＨ６～８）、またはこれらの組み合わせであり得るが、ｐＨ３～１０またはｐＨ７～１０のような他の範囲がまた、使用され得る。ＣＥと同様に、上記キャピラリーの第１の端部は、塩基性溶液に流体接続される一方で、第２の端部は、酸性溶液に流体接続される。

図２は、アノード溶液（ａｎｏｌｙｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）１、アノード２、アノード安定化剤３、カソード安定化剤４、カソード５、検出ウインドウ６、およびカソード溶液（ｃａｔｈｏｌｙｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）７を含むｃＩＥＦ設定の例示的実施形態を図示する。電圧が上記キャピラリーに印加されるにつれて、ｐＨ勾配が、アノード溶液１から供給されるヒドロニウムイオンから、およびカソード溶液２から供給されるヒドロキシルイオンから形成される。ｃＩＥＦフォーカシングの間に、カソード安定化剤４は、カソード５に向かって移動する一方で、アノード安定化剤３は、アノード２に向かって移動する（Ｃｒｕｚａｄｏ－Ｐａｒｋ，Ｉ．Ｄ．，Ｍａｃｋ，Ｓ．，ａｎｄＲａｔｎａｙａｋｅ，Ｃ．Ｋ．，ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔｉｎＡ－１１６３４Ａ：ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｙｓｔｅｍＰａｒａｍｅｔｅｒｓＣｒｉｔｉｃａｌｆｏｒＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｃＩＥＦ，ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，２００８（その全体において本明細書に参考として援用される））。フォーカシングは、両方のキャピラリー端部で形成するｐＨ勾配を有する２方向性であり、連続するｐＨ勾配が作り出されるように、上記キャピラリーの中心に向かって進む（Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｓ．，Ｌｉａｏ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄＹａｏ，Ｋ．Ｑ．，ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ，Ｖｏｌｕｍｅ３８７，ｐｐ１２７，１９８７（その全体において本明細書に参考として援用される））。目的のサンプル構成要素または分析物は、それらの等電点（ｐＩ）に基づいて、そのｐＨ勾配中を移動し、分離する。分析物が正味のゼロ電荷をいったん達成すると、それは移動を止める。

ｐＨ勾配形成およびサンプル分析物のフォーカシングの後、動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が起こる。ｃＩＥＦ動員の間に、ｐＩ標準またはマーカー、および目的のフォーカスされた分析物が検出される。動員は、カソード方向またはアノード方向のいずれかにおいて達成され得る。カソード動員に関しては、カソードリザーバーは、酢酸のような動員溶液または水酸化ナトリウムおよび塩化ナトリウムの溶液で満たされる（Ｍａｎａｂｅ，Ｔ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｈ．，ａｎｄＩｗａｓａｋｉ，Ａ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ１８，ｐｐ９２，１９９７およびＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔｉｎＡ－１２０１５Ａ：ＡＲｏｂｕｓｔｃＩＥＦＭｅｔｈｏｄ：ＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅＰｒｅｃｉｓｉｏｎｆｏｒｔｈｅｐＨ５－７Ｒａｎｇｅ，ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，２００８（それらの全体において本明細書に参考として援用される））。アノード動員に関しては、アノードリザーバーは、塩化ナトリウムのような動員溶液で満たされる。カソード動員の間に電圧が印加される場合、ヒドロニウムイオンは、キャピラリーへとアノード液から導入される一方で、酢酸イオンは、カソード側から導入される。他の実施形態において、塩化物イオンおよび水酸化物イオンが導入される。これは、塩基性から酸性へのｐＨ勾配の滴定を生じ、分離された分析物は、それらが正電荷を得てカソードに向かって移動するにつれて検出される。検出波長は、検出器に基づいて選択される。いくつかの実施形態において、ＵＶ検出器および２８０ｎｍフィルターが使用される。

１つの局面において、本明細書で開示される方法は、ウイルスベクターを、全長外因性ポリヌクレオチドを有するか、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するか、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くとして、各ウイルスベクターの電荷不均一性またはｐＩに基づいて分離および識別し得る。具体的には、ＣＥ（ｃＩＥＦを含む）からのリードアウトまたは結果は、外因性ポリヌクレオチドシグナチャーによってウイルスベクターを同定するために使用され得る。これは、移動パターンおよび生じる電気泳動図ピークによって決定される。

別の局面において、本明細書で開示されるｃＩＥＦ法は、ウイルスベクターを、全長外因性ポリヌクレオチドを有するか、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するか、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くとして、各ウイルスベクターのｐＩに基づいて分離および識別し得る。具体的には、生じるｃＩＥＦ電気泳動図または分離スキャン（例えば、全カラム画像化検出（ＷＣＩＤ））において、ピークは、完全な、部分的な、および空のウイルスベクターを表す。空のウイルスベクターは、代わりのｐＩにおいて移動する一方で、完全なウイルスベクターは、より低いｐＩで移動し得る。「空の」ベクターと「完全な」ベクターとの間のピークは、部分的なウイルスベクター（すなわち、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを含むもの）を示す。この点において、ｃＩＥＦ法は、上記ウイルスベクターのｐＩを決定し得る。これはその後、完全な、部分的な、および空のベクターを同定するために使用され得る。

さらなる局面において、本明細書で開示されるｃＩＥＦ法は、ＡＡＶカプシド、粒子、またはベクターを、導入遺伝子およびプロモーターを有する完全なゲノム、導入遺伝子フラグメントを有するか、または導入遺伝子を欠くとして、各ＡＡＶカプシドのｐＩに基づいて分離および識別し得る。空のＡＡＶカプシドのｃＩＥＦ移動ピークは、外因性ポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントを有するウイルスベクター、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くウイルスベクターに対して代わりのｐＩで起こる一方で、いくつかの実施形態において、完全なＡＡＶカプシドの移動ピークは、より低いｐＩにおいて空のカプシドに対して起こり得、部分的なＡＡＶベクターの移動ピークは、その間に入る。代表的には、完全なＡＡＶカプシドは、ウイルスカプシド内に被包される外因性ポリヌクレオチドの負電荷に起因して低いｐＩを有する。

いくつかの実施形態において、完全な外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子を含むＡＡＶカプシドのｐＩは、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子を欠いているＡＡＶカプシドより約０．３～０．５ｐＩ単位低い。いくつかの実施形態において、ｐＩの差異は、０．１ｐＨ単位未満であり得、このような実施形態において、上記両性電解質は、ｐＩにおいて小さな差異を有するカプシドの解像度を改善するために、改変され得る（例えば、狭いｐＨ範囲を有する両性電解質）。

さらに別の局面において、多数のウイルスベクターを含むサンプル中の完全な、部分的な、および空のウイルスベクターの相対的存在量は、ピーク面積の定量を介して決定され得る。例えば、空のウイルスベクターが富化されたサンプルは、「空の」ウイルスベクターｐＩでより大きなピーク面積を有する一方で、完全なウイルスベクターが富化されたサンプルは、「完全な」ウイルスベクターｐＩでより大きなピーク面積を有する。

さらに別の局面において、多数のＡＡＶカプシドを含むサンプル中の完全な、部分的な、および空のＡＡＶカプシド、粒子、またはベクターの相対的存在量は、ピーク面積の定量を介して決定され得る。空のＡＡＶカプシドが富化されたサンプルは、「空の」ＡＡＶカプシドｐＩでより大きなピーク面積を有する一方で、完全なＡＡＶカプシドが富化されたサンプルは、「完全な」ＡＡＶカプシドｐＩでより大きなピーク面積を有する。部分的なＡＡＶカプシドは、空のＡＡＶカプシドピークと完全なＡＡＶカプシドピークとの間のピーク面積から計算され得る。

開示される方法の利点としては、分析用の超遠心分離（ＡＵＣ）および電子顕微鏡検査法（ＥＭ）と比較して、比較的短時間（例えば、１時間）内でのハイスループット分離および自動化データ分析、ならびにＨＰＬＣ、ＡＵＣ、およびＥＭと比較して、最小のサンプル容積（例えば、２～４μＬのベクター物質）が挙げられる。さらに、上記方法は、アニオン交換ＨＰＬＣ（ＡＥＸ－ＨＰＬＣ）およびＥＭと比較して、優れた分離および解像度を提供し、ＡＡＶ研究および開発の種々のステージで実行され得る。

ｃＩＥＦは、任意の適切なＣＥデバイス（例えば、ＵＶ検出器および２１４ｎｍフィルターを有するＳｃｉｅｘＰＡ８００Ｐｌｕｓ機器）で行われ得る。利用されるキャピラリーは、３０ｃｍＮ－ＣＨＯ被覆キャピラリーであり得る。分離電圧は、１０ｋＶ逆極性であり得る。ＵＶ検出は、２１４ｎｍで行われる。緩衝溶液は、ｐＨ８．０の５０ｍＭホウ酸ナトリウムであり、注入は９０秒間、０．５ｐｓｉにおいて行われる。

実施例
実施例１：ｃＩＥＦ溶液の調製
ｃＩＥＦの溶液を、以下のように調製した：

アノード溶液：２００ｍＭリン酸を調製するために、０．６８５ｍＬ８５％リン酸を、５０ｍＬの全容積になるように脱イオン（ＤＩ）水とともに添加した。

カソード溶液：３００ｍＭ水酸化マグネシウムを調製するために、１５ｍＬ１ＭＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃７２０８２０）を、全容積５０ｍＬになるようにＤＩ水とともに添加した。

化学的動員溶液：３５０ｍＭ酢酸を調製するために、１ｍＬ氷酢酸を全容積５０ｍＬになるようにＤＩ水に添加した。

カソード安定化剤溶液：５００ｍＭＬ－アルギニンを調製するために、０．８７ｇの９８％Ｌ－アルギニン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ａ５００６）を、８ｍＬＤＩ水に溶解し、完全な溶媒和のために１５分間混合した。その得られた溶液を、全容積１０ｍＬまでＤＩ水で増量した。

アノード安定化剤溶液：２００ｍＭのイミノ二酢酸（ＩＤＡ）を調製するために、０．２７ｇの９８％ＩＤＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃２２００００）を８ｍＬＤＩ水中に溶解し、完全な溶媒和のために１５分間混合した。その得られた溶液を、全容積１０ｍＬまでＤＩ水で増量した。

ｃＩＥＦゲル溶液（Ｕ－ゲル）：３Ｍ尿素ｃＩＥＦゲル溶液を調製するために、１．８ｇの尿素（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ｕ１２５０）を、７ｍＬｃＩＥＦゲル（ＳＣＩＥＸ，Ｃａｔ＃４７７４９７）に溶解させた。一旦溶解した後、その溶液を、全容積１０ｍＬまでｃＩＥＦゲルで増量し、１５分間混合し、５μｍシリンジフィルターを使用して濾過した。その３Ｍ尿素－ｃＩＥＦゲル溶液を、２０００ＲＣＦにおいてＡｌｌｅｇｒａＸ－１５Ｒ遠心分離機（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｃａｔ＃３９２９３３）で脱気し、２～８℃で貯蔵した。

実施例２：サンプル調製
マスターミックス溶液を、２００μＬの３Ｍ尿素－ｃＩＥＦゲル溶液、１２μＬの両性電解質、２０μＬのカソード安定化剤、２μＬアノード安定化剤、２μＬの各ｐＩマーカーを混合することによって調製した。サンプルを、表１および２に従って調製した。血清型１および２を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ０．５ｍＬＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒｓ（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ＃ＵＦＣ５０１０９６）を使用して、２ｍｇ／ｍＬへと濃縮した。サンプル１～３に関するマスターミックスを、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０キャリア両性電解質（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ＃１７０４５６０１）を使用して調製した。サンプル４～６に関するマスターミックスを、４：２の比でのＰｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０キャリア両性電解質およびＳｅｒｖａｌｙｔｅ６－８キャリア両性電解質（Ｓｅｒｖａ，Ｃａｔ＃４２９０６．０４）の両性電解質混合物を使用して調製した。サンプル６をまた、広い範囲のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０キャリア両性電解質のみを使用して分析した。

実施例３：サンプル分析
各調製したサンプルを、ｎａｎｏＶｉａｌ（ＳＣＩＥＸ，Ｃａｔ＃５０４３４６７）に移した。ｃＩＥＦ分析を、ＵＶ検出器および２８０ｎｍフィルター（ＳＣＩＥＸ，Ｃａｔ＃９６９１３６）ならびに３０．２ｃｍＮ－ＣＨＯキャピラリー（ＳＣＩＥＸ，Ｃａｔ＃４７７６０１）を装備したＰＡ８００ＰＡＰｌｕｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（ＳＣＩＥＸ）を使用して行った。ｃＩＥＦ法の機器パラメーターは、図３Ａ～３Eに図示される。キャピラリー温度を、全ての分離において２０℃に維持した。データを集め、３２ＫａｒａｔＳｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。

実施例４：完全な、空の、および部分的なＡＡＶカプシドのｃＩＥＦ解像度
図４は、ｐＩマーカー７．０と１０．０との間にあるサンプル１（空のＡＡＶカプシドを富化）およびサンプル２（完全なＡＡＶカプシドを富化）のｃＩＥＦプロフィールを図示する。上記空のカプシドピークは、より高いｐＩに移動した一方で、完全なカプシドピークは、より低いｐＩ値に移動した。「空の」カプシドピークと「完全な」カプシドピークとの間のピークは、部分的なカプシドを示す。予測されるように、サンプル２は、より高い強度の完全なカプシドピークを示した一方で、サンプル１は、より高い強度の空のカプシドピークを示した。これらのｃＩＥＦプロフィールは、分析用の超遠心分離によって得られたプロフィールと一致した（データは示さず）。図４中のピーク１～５のｐＩを、表３に示す。上記ＡＡＶカプシドピークのｐＩ値を、内部ｐＩマーカーの較正曲線に基づいて決定した。

図５Ａは、サンプル３のｃＩＥＦプロフィールおよびＡＥＸ－ＨＰＬＣプロフィール（図５Ａ中の挿入図）を図示する。図５Ｂは、図５Ａのサンプルピークの拡大図である。サンプル１およびサンプル２（上記で考察）と一致して、空のカプシドピークは、完全なカプシドピークと比較して、より高いｐＩに移動した。ＡＥＸ－ＨＰＬＣ分離と比較した場合、ｃＩＥＦ分離は、空のカプシドピークおよび完全なカプシドピークの改善された分離度を生じた。さらに、ｃＩＥＦは、部分的カプシドを分離した一方で、ＡＥＸ－ＨＰＬＣは、分離しなかった。ｃＩＥＦまたはＡＥＸ－ＨＰＬＣ分離の後の完全な、空の、および部分的なカプシドの定量を、表４に示す。ＡＥＸ－ＨＰＬＣは、部分的なカプシドを分離できなかったことから、ｃＩＥＦ分析における完全なおよび部分的なカプシドピーク面積の和を、ＡＥＸ－ＨＰＬＣの完全なカプシドピーク面積と比較した。これらのデータは、ｃＩＥＦによって決定された完全なおよび空のカプシドのパーセンテージが、ＡＥＸ－ＨＰＬＣによって決定されたものに匹敵することを示す。

図６Ａは、サンプル４（空のＡＡＶカプシドを富化）およびサンプル５（完全なＡＡＶカプシドを富化）のｃＩＥＦプロフィールを図示する。図６Ｂは、図６Ａのサンプルピークの拡大図である。予測されるように、サンプル５は、より高い強度の完全なカプシドピークを示した一方で、サンプル４は、より高い強度の空のカプシドピークを示した。サンプル４および５のｐＩ差は、完全なカプシドピークと空のカプシドピークとの間で約０．１ｐＨ単位であると計算され、狭いｐＨ範囲の両性電解質は、ＡＡＶピークの優れたベースライン分離度を提供した。サンプル４のｐＩ値は、およそ７．１であった（データは示さず）。ｃＩＥＦ分離後の完全な、空の、および部分的なカプシドの定量を、表５に示す。これらのパーセンテージを、ｃＩＥＦ電気泳動図中の分離したカプシドピークの較正済みピーク面積から計算した。

実施例５：広い範囲および狭い範囲のｐＨ両性電解質を使用するＡＡＶカプシドのｃＩＥＦ分離
図７は、広い範囲および狭い範囲のｐＨ両性電解質の混合物（上のグラフ）、ならびに広い範囲のｐＨ両性電解質（下のグラフ）を使用するサンプル６のｃＩＥＦプロフィールを比較する。広い範囲のｐＨ両性電解質は、ｐＩ７．３および７．５において、より小さく分離したピークを生じた一方で、ｐＨ両性電解質の混合物は、ｐＩ７．３と７．６との間のピークにおいて認められるように、増強されたサンプル分離度を提供した。これらのデータは、狭い範囲の、または狭い範囲および広い範囲のｐＨ両性電解質の使用が、ＡＡＶサンプル中の部分的なカプシド改変体の分離度を改善することを示す。

実施例６：ＡＡＶカプシドのｃＩＥＦ分析の再現性
図８は、ＡＡＶサンプルのｃＩＥＦ分離の再現性を示す。ｃＩＥＦの５回の泳動を、サンプル６に対して行った。ピーク面積の％相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、≦５％であり、ｐＩ値の％ＲＳＤは、≦２％であった。これらのデータは、ＡＡＶカプシドのｃＩＥＦ分析が、高い再現性の程度を有することを示す。

まとめると、上記の例示的データは、ｃＩＥＦ分析が、ＡＡＶカプシドの区別および同定のために使用され得ることを示す。具体的には、ｃＩＥＦは、完全な導入遺伝子を有するか、部分的な導入遺伝子を有するか、または導入遺伝子を欠くカプシドを同定および定量し得る。不均一ＡＡＶサンプルにおいて、ｃＩＥＦは、サンプル内の完全な、空の、および部分的なカプシドの分布を決定し得る。

実施例７：完全なおよび空のＡＡＶカプシドのＣＺＥ分離度
図９は、サンプルＡ（空のＡＡＶカプシドを富化）、サンプルＢ（完全なＡＡＶカプシドを富化）、およびサンプルＣ（サンプルＡおよびＢが１：１比）のＣＺＥプロフィールを図示する。上記サンプルを、受け取ったまま使用した。元のサンプルのうちの１０μＬを、ピペットでＮａｎｏＶｉａｌへと移し、機器に装填した。サンプルを、ＵＶ検出器および２１４ｎｍフィルターを有するＰＡ８００Ｐｌｕｓ機器に導入した。泳動パラメーター：キャピラリー：３０ｃｍＮ－ＣＨＯ被覆キャピラリー、分離：１０ｋＶ逆極性、ＵＶ検出：２１４ｎｍ、緩衝液：５０ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨ８．０、注入：９０秒間、０．５ｐｓｉ。重ねた図は、３種の異なる混合物（１つは空のカプシドを富化したサンプル、１つは完全なカプシドを富化したサンプル、１つは、完全なおよび空のカプシドを１：１の比で混合したサンプル）のＡＡＶ血清型９サンプルのＣＺＥ分析である。示されるように、１０．４分あたりに非常に明確なピークが存在し、それは、完全なカプシドサンプルにおけるものより、空のカプシドサンプルにおいてより顕著である。

図１０は、精製前後のＡＡＶサンプルのＣＺＥプロフィールを図示する。サンプルを、受け取ったまま使用した。動電学的注入を使用して、そのサンプルをＣＥ機器（ＰＤＡ検出器を有するＰＡ８００Ｐｌｕｓ）に導入した。その注入条件は、９０秒間、０．５ｐｓｉであり、泳動緩衝液は、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５であった。キャピラリーは、５０ｕｍＩＤおよび３０ｃｍ長を有する剥き出しの溶融キャピラリーであり、入り口から検出ウインドウまでの間の長さは２０ｃｍである。分離条件は、１０ｋＶ逆極性である。その重ねた軌跡は、上記生成物の純度を、ならびに上流の開発プロセスの間に完全なおよび空のカプシドの比率をモニターするために、各精製工程でのＡＡＶサンプルのＣＺＥ分析である。精製プロセスの各ステージに伴って、より低い不純物ピークが観察される。

Claims

サンプル中のウイルスベクターを分離する方法であって、前記方法は、
各ウイルスベクターの等電点（ｐＩ）に基づいて、前記ウイルスベクターを分離するために十分な条件下でかつ継続時間にわたって、外因性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含むサンプルに対してキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を行う工程；
ｃＩＥＦ結果のリードアウトを生成する工程；および
前記リードアウトを分析する工程であって、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいてウイルスベクターを同定する工程、
を包含する方法。
前記分析する工程は、前記ウイルスベクターを、全長外因性ポリヌクレオチド、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを含む外因性ポリヌクレオチドを有するか、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くとして特徴付け、ここで前記全長外因性ポリヌクレオチドを有する前記ウイルスベクターは、前記外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有する前記ウイルスベクターおよびいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠く前記ウイルスベクターに対して低いｐＩを有する、請求項１に記載の方法。
前記外因性ポリヌクレオチドは、導入遺伝子、プロモーターおよびＩＴＲ配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
ｃＩＥＦ結果の前記リードアウトは、電気泳動図または分離スキャンである、請求項１に記載の方法。
ｃＩＥＦを行う工程は、
前記ウイルスベクターを含むサンプルを、ｐＨ勾配を含むチャネルまたはキャピラリーに装填する工程；
前記チャネルまたはキャピラリーの第１の端部を酸性溶液へと流体接続する工程；
前記チャネルまたはキャピラリーの第２の端部を塩基性溶液へと流体接続する工程；および
前記チャネルまたはキャピラリーに電圧を印加する工程、
を包含する、請求項１に記載の方法。
前記チャネルまたはキャピラリーは、前記サンプルを含む２～４μＬのベクター物質が装填される、請求項６に記載の方法。
サンプル中のウイルスベクターを定量する方法であって、前記方法は、
各ウイルスベクターの等電点（ｐＩ）に基づいて、前記ウイルスベクターを分離するために十分な条件下でかつ継続時間にわたって、外因性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含むサンプルに対してキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を行う工程；
ｃＩＥＦ結果のリードアウトを生成する工程；および
前記リードアウトを分析する工程であって、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいてウイルスベクターを同定する工程、
を包含する方法。
前記分析する工程は、前記リードアウトから、全長外因性ポリヌクレオチドを有するウイルスベクター、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するウイルスベクター、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くウイルスベクターの相対的存在量を定量する工程を包含し、ここで前記全長外因性ポリヌクレオチドを有するウイルスベクターは、前記外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有する前記ウイルスベクターおよびいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠く前記ウイルスベクターに対して変化したｐＩを有する、請求項８に記載の方法。
前記外因性ポリヌクレオチドは、導入遺伝子、プロモーターおよびＩＴＲ配列を含む、請求項８または９に記載の方法。
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項８に記載の方法。
前記ｃＩＥＦ結果のリードアウトは、電気泳動図または分離スキャンである、請求項８に記載の方法。
ｃＩＥＦを行う工程は、
前記ウイルスベクターを含むサンプルを、ｐＨ勾配を含むチャネルまたはキャピラリーに装填すること；
前記チャネルまたはキャピラリーの第１の端部を酸性溶液へと流体接続すること；
前記チャネルまたはキャピラリーの第２の端部を塩基性溶液へと流体接続する工程こと；および
前記チャネルまたはキャピラリーに電圧を印加すること、
を包含する、請求項８に記載の方法。
前記チャネルまたはキャピラリーは、２～４μＬのベクター物質を含むサンプルが装填される、請求項１３に記載の方法。
サンプル中のウイルスベクターを分離する方法であって、前記方法は、
各各ウイルスベクターの電荷不均一性または等電点（ｐＩ）に基づいて、前記ウイルスベクターを分離するために十分な条件下でかつ継続時間にわたって、外因性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含むサンプルのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を行う工程；
ＣＥ結果のリードアウトを生成する工程；および
前記リードアウトを分析する工程であって、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいてウイルスベクターを同定する工程、
を包含する方法。
前記分析する工程は、前記ウイルスベクターを、全長外因性ポリヌクレオチド、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを含む外因性ポリヌクレオチドを有するか、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くとして特徴付ける、請求項１５に記載の方法。
前記外因性ポリヌクレオチドは、導入遺伝子、プロモーターおよびＩＴＲ配列を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１５に記載の方法。
前記ＣＥ結果のリードアウトは、電気泳動図または分離スキャンである、請求項１５に記載の方法。
ＣＥを行う工程は、
前記ウイルスベクターを含むサンプルを、チャネルまたはキャピラリーに装填すること；
前記チャネルまたはキャピラリーの第１の端部を酸性溶液へと流体接続すること；
前記チャネルまたはキャピラリーの第２の端部を塩基性溶液へと流体接続すること；および
前記チャネルまたはキャピラリーに電圧を印加すること、
を包含する、請求項１５に記載の方法。
ＣＥは、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
サンプル中のウイルスベクターを定量する方法であって、前記方法は、
各ウイルスベクターの電荷不均一性または等電点（ｐＩ）に基づいて、前記ウイルスベクターを分離するために十分な条件下でかつ継続時間にわたって、外因性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含むサンプルのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を行う工程；
ＣＥ結果のリードアウトを生成する工程；および
前記リードアウトを分析する工程であって、外因性ポリヌクレオチド含有量に基づいてウイルスベクターを同定する工程、
を包含する方法。
前記分析する工程は、前記リードアウトから、全長外因性ポリヌクレオチドを含む外因性ポリヌクレオチドを有するウイルスベクター、外因性ポリヌクレオチドフラグメントを有するウイルスベクター、またはいかなる外因性ポリヌクレオチドをも欠くウイルスベクターの相対的存在量を定量する工程を包含する、請求項２２に記載の方法。
前記外因性ポリヌクレオチドは、導入遺伝子、プロモーターおよびＩＴＲ配列を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
前記ＣＥ結果のリードアウトは、電気泳動図または分離スキャンである、請求項２２に記載の方法。
ＣＥを行う工程は、
前記ウイルスベクターを含むサンプルを、チャネルまたはキャピラリーに装填すること；
前記チャネルまたはキャピラリーの第１の端部を酸性溶液へと流体接続すること；
前記チャネルまたはキャピラリーの第２の端部を塩基性溶液へと流体接続すること；および
前記チャネルまたはキャピラリーに電圧を印加すること、
を包含する、請求項２２に記載の方法。
ＣＥは、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）およびキャピラリー等速電気泳動、ミセル動電キャピラリークロマトグラフィーおよびキャピラリー動電クロマトグラフィーからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。