CN114981658A - 用于病毒载体分离、分析、表征和定量的毛细管电泳方法 - Google Patents

用于病毒载体分离、分析、表征和定量的毛细管电泳方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了分析腺相关病毒(AAV)载体的方法。更具体地说，本公开涉及毛细管电泳方法，用于分离、表征和定量AAV载体为具有全长外源多核苷酸、具有外源多核苷酸片段或缺乏任何外源多核苷酸。在一个方法中，分析在足以基于每个病毒载体的等电点(pI)分离病毒载体的条件下和持续时间，对包含含有外源多核苷酸的病毒载体的样品使用毛细管等电聚焦(cIEF)。

Description

用于病毒载体分离、分析、表征和定量的毛细管电泳方法
相关美国申请
本申请要求于2020年1月13日提交的美国临时申请序列号62/960,282的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明背景
病毒载体，如腺相关病毒(AAV)载体，是用于基因递送的常见分子生物学工具，在基因疗法和其他应用中显示出良好的前景。该技术的一个限制是合成载体(例如AAV)通常产生异质样品，其中一些载体将仅包含靶标转基因的片段(“部分载体”)或完全缺乏靶标转基因(“空载体”)。部分和空载体被视为杂质(例如，“污染”载体)，通过与适当包装的载体(即具有完全封装的转基因的载体)竞争靶细胞上的载体结合位点，可对下游病毒转导产生负面影响。此外，这些污染载体可增加病毒载体产物的免疫原性。
因此，在病毒载体研究和开发过程中，识别这些污染载体是有利的。识别全和空载体的技术包括分析超速离心、电子显微镜、分光光度法和阴离子交换HPLC，提供最低的分辨率和灵敏度，例如无法确定部分载体，且再现性差。这些技术也很耗时，并且需要大的样品体积。
本文描述了用于分离、表征和定量全、部分和空病毒载体的新型毛细管电泳技术，克服了其他分析技术的缺点。
发明概要
本公开一般地提供了一种基于外源多核苷酸含量分离病毒载体的方法。在一个方面，本公开提供了一种分离样品中的病毒载体的方法，通过(a)在足以基于每个病毒载体的等电点(pI)分离病毒载体的条件下和持续时间，对包含含有外源多核苷酸的病毒载体的样品执行毛细管等电聚焦(cIEF)；(b)生成cIEF结果的读取结果；和(c)分析读取结果以基于外源多核苷酸含量来识别病毒载体。该方法将病毒载体表征为具有全长外源多核苷酸、外源多核苷酸片段或缺乏任何外源多核苷酸。在一个方面中，相对于具有外源多核苷酸片段的病毒载体或缺乏任何外源多核苷酸的病毒载体，具有全长外源多核苷酸的病毒载体具有替代的pI。
在一些方面，外源多核苷酸包含转基因、启动子和ITR序列。在一些方面，病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)。
在一些方面，cIEF结果的读取结果是电泳图或分离扫描，其采用允许对cIEF过程进行实时成像的全柱成像检测(WCID)技术。
在一些方面，cIEF方法包括(a)将包含病毒载体的样品加载到通道或毛细管中；(b)将通道或毛细管的第一端与酸性溶液流体连接；(c)将通道或毛细管的第二端与碱性溶液流体连接；和(d)向通道或毛细管施加电压，以在通道或毛细管中诱导/形成pH梯度。在某些方面，通道或毛细管装载(即，完全填充)有样品，在一些实施方案中，样品包含2-4μL的病毒载体，取决于浓度。因此，根据一些示例实施方案，样品可包含一个或多个病毒载体，并进一步包含凝胶或凝胶基质、增溶剂(例如尿素、甘油等)、载体两性电解质、阳极稳定剂、阴极稳定剂和pI标志物。
本公开还提供了一种通过分离物类(species)并测量电泳图中相应峰的峰面积，基于外源多核苷酸含量来定量病毒载体的方法。该方法可包括(a)在足以基于每个病毒载体的等电点(pI)分离病毒载体的条件下和持续时间，对包含含有外源多核苷酸的病毒载体的样品执行毛细管等电聚焦(cIEF)；(b)生成cIEF结果的读取结果；和(c)分析读取结果以基于外源多核苷酸含量来识别病毒载体。该方法将病毒载体表征为具有全长外源多核苷酸、具有外源多核苷酸片段或缺乏任何外源多核苷酸。在一个方面，相对于具有外源多核苷酸片段的病毒载体或缺乏任何外源多核苷酸的病毒载体，具有全长外源多核苷酸的病毒载体具有替代/不同的pI(更低或更高)。
在一些方面，外源多核苷酸包含转基因、启动子或ITR序列。在一些方面，病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)。
在一些方面，cIEF结果的读取结果是电泳图或分离扫描。
在一些方面，cIEF方法包括(a)将包含病毒载体的样品加载到通道或毛细管中；(b)将通道或毛细管的第一端与酸性溶液流体连接；(c)将通道或毛细管的第二端与碱性溶液流体连接；和(d)向通道或毛细管施加电压，以使通道或毛细管中形成pH梯度。在某些方面中，通道或毛细管装载有2-4μL载体材料，其包含至少样品的一部分。
在另一方面，本发明提供了一种分离样品中的病毒载体的方法，通过(a)在足以基于每个病毒载体的电荷异质性或等电点(pI)分离病毒载体的条件下和持续时间，对包含含有外源多核苷酸的病毒载体的样品执行毛细管电泳(CE)；(b)生成CE结果的读取结果；和(c)分析读取结果以基于外源多核苷酸含量来识别病毒载体。该方法将病毒载体表征为具有全长外源多核苷酸、具有外源多核苷酸片段或缺乏任何外源多核苷酸。
在一些方面，外源多核苷酸包含转基因。在一些方面，病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)。
在某些方面，CE结果的读取结果是电泳图或分离扫描。
在一些方面，CE方法包括(a)将包含病毒载体的样品加载到通道或毛细管中；(b)将通道或毛细管的第一端流体连接至阳极末端；(c)将通道或毛细管的第二端流体连接至阴极末端；和(d)向通道或毛细管施加电压。CE方法可包括但不限于毛细管等电聚焦(cIEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳、胶束电动毛细管色谱和毛细管电动色谱。在一些实施方案中，阳极末端可包含酸性溶液。在一些实施方案中，阴极末端可包含碱性溶液。
本公开还提供了一种基于外源多核苷酸含量来定量病毒载体的方法。该方法可包括(a)在足以基于每个病毒载体的电荷异质性或等电点(pI)分离病毒载体的条件下和持续时间，对包含含有外源多核苷酸的病毒载体的样品执行毛细管电泳(CE)；(b)生成CE结果的读取结果；和(c)分析读取结果以基于外源多核苷酸含量来识别病毒载体。该方法将病毒载体表征为具有全长外源多核苷酸、具有外源多核苷酸片段或缺乏任何外源多核苷酸。
在一些方面，外源多核苷酸包含转基因、启动子和ITR序列。在一些方面，病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)。
在某些方面，CE结果的读取结果是电泳图或分离扫描。
在一些方面，CE方法包括(a)将包含病毒载体的样品加载到通道或毛细管中；(b)将通道或毛细管的第一端流体连接至阳极末端；(c)将通道或毛细管的第二端流体连接至阴极末端；和(d)向通道或毛细管施加电压。CE方法可包括但不限于毛细管等电聚焦(cIEF)、毛细管区带电泳(CZE)和毛细管凝胶电泳(CGE)。在一些方面，阳极末端可包含酸性溶液。在一些实施方案中，阴极末端可包含碱性溶液。
本文还公开了用于执行上述方法的系统。
附图简述
图1示出了具有全外源多核苷酸的病毒衣壳、空病毒衣壳和包含外源多核苷酸片段或污染片段的病毒衣壳的示例。
图2示出了分离病毒载体的系统的示例性实施方案。
图3A描绘了根据本公开一些实施方案的cIEF方法的初始仪器参数。
图3B描绘了根据本公开一些实施方案的cIEF方法的初始UV检测器参数。
图3C描绘了根据本公开一些实施方案的cIEF方法的仪器调节参数。
图3D描绘了根据本公开一些实施方案的cIEF方法的仪器分离参数。
图3E描绘了根据本公开一些实施方案的cIEF方法的仪器关机参数。
图4示出了富含空病毒衣壳的第一AAV样品和富含全病毒衣壳的第二AAV样品的cIEF分离结果。
图5A示出了第三AAV样品的cIEF和AEX-HPLC分离结果。
图5B是图5A所示结果的放大图。
图6A示出了富含空病毒衣壳的第四AAV样品和富含全病毒衣壳的第五AAV样品的cIEF分离结果。
图6B是图6A所示结果的放大图。
图7示出了使用宽范围和窄范围pH两性电解质(ampholyte)的混合物或仅使用宽范围pH两性电解质的第六AAV样品的cIEF分离结果。
图8示出了来自第六AAV样品五次运行的cIEF分离结果。
图9示出了CZE分离结果。
图10示出了CZE分离结果。
发明详述
本文描述了使用毛细管电泳(CE)基于其外源多核苷酸含量来分离和/或定量病毒载体的方法。“毛细管电泳”或“CE”是指一系列相关技术，这些技术利用毛细管根据大小和电荷，通过其在电场中的不同迁移速率来分离大分子和小分子。CE技术包括毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等电聚焦(cIEF)、毛细管凝胶电泳(CGE)、等速电泳、胶束电动毛细管色谱和毛细管电动色谱。如本文所用，术语“毛细管”是指能够支持一定体积的分离介质以执行电泳的通道、管或其他结构。毛细管几何形状可以变化，包括具有圆形、矩形或方形横截面、通道、凹槽、板等的结构，这些结构可以通过本领域已知的技术制造。本公开的毛细管可以由诸如但不限于二氧化硅、熔融石英、石英、基于硅酸盐的玻璃(例如硼硅酸盐玻璃、磷酸盐玻璃或含氧化铝的玻璃)以及其他类似二氧化硅的材料制成。在一些实施方案中，所述方法可在任何通常已知的电泳平台中进行调整和使用，例如，电泳设备包括单个或多个微流控通道、蚀刻微流毛细管以及平板凝胶和薄板凝胶电泳。
如本文所用，“病毒载体”是指病毒构建体(例如，包含一种或多种DNA、RNA或蛋白质的病毒分子)，用作载体，将外源遗传材料(即外源多核苷酸)装载或携带到另一细胞中，在该细胞中可以复制和/或表达。示范性病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和经基因修饰以具有多于一种载体的特性的杂交病毒。
一般而言，CE，尤其是cIEF，使用带有光学观察窗的毛细管、高压电源、两个电极组件、两个缓冲剂储库和检测器。一个缓冲剂储库含有向毛细管中提供H+离子的酸性溶液，而一个缓冲剂储库含有向毛细管中提供OH-离子的碱性溶液。毛细管的第一端与碱性溶液流体连接，而第二端与酸性溶液流体连接。在一些实施方案中，只要两个储库中的一个能够用作阳极末端，而另一个能够用作阴极末端，就可以在两个缓冲剂储库中的每一个中使用相同类型的缓冲剂。样品或分析物可通过电注入或压力注入而注入毛细管。在一些实施方案中，毛细管装载有2-4μL载体材料，该载体材料包含正在进行分析的样品的一部分。在一些实施方案中，缓冲剂溶液不必可替代地是酸性或碱性溶液。在一些情况下，只要能够提供H+和OH-离子，就可以向毛细管的第一和第二端提供相同的缓冲剂溶液。通常，分析过程中消耗小于5uL的低样品量。
通过施加电场来启动样品迁移，电场由电源供应至电极组件。目标样品组分或分析物在由于电渗流及其电泳迁移率而迁移时分离，形成分离组分或分析物的梯度，随后在毛细管出口端附近检测。检测器输出由积分器、微处理器或计算机处理。产生的CE分离数据显示为电泳图，电泳图以时间的函数报告探测器响应。在一些方面，CE读取结果是电泳图或分离扫描。合适的CE检测器包括但不限于紫外(UV)、UV可见光(UV-Vis)、激光诱导的荧光、天然荧光、二极管阵列、折射率、电化学、表面等离子体共振、拉曼散射和质谱。合适的CE光学探测器包括但不限于CCD阵列和光电倍增管。
在一个特定方面，本公开涉及一种方法，用于执行CE以分离和表征病毒载体为具有全长外源多核苷酸(“全病毒载体”)、外源多核苷酸片段(“部分病毒载体”)或缺乏任何外源多核苷酸(“空病毒载体”)。该方法还可以区分和定量包含病毒载体的样品或制备物中的全、部分和空病毒载体的相对丰度。在一些实施方案中，本文公开的方法可用于分离和表征脂质纳米粒、脂质体、病毒体和碳纳米管。
在示例性实施方案中，病毒载体包含AAV，并且本文所公开的方法分离并表征AAV衣壳、颗粒或载体为具有全转基因、启动子和ITR序列、转基因片段或缺乏转基因(图1)。在一些方面，方法还可以区分具有污染物或其片段的AAV衣壳、颗粒或载体。如本文所用，“转基因”是指人工引入另一生物体基因组中的外源的或者经修饰的基因或多核苷酸序列。“腺相关病毒衣壳、颗粒或载体”或“AAV衣壳、颗粒或载体”是指包装在包含病毒蛋白VP1、VP2和VP3的病毒衣壳中的转基因。本领域已知用于AAV载体生成的技术和方法。通常，AAV载体生产利用(a)包含AAV rep和cap基因的质粒用于衣壳形成和复制；(b)包含腺病毒辅助基因的质粒；(c)包含靶标转基因侧接反向末端重复序列的盒；和(d)病毒包装细胞系，如HEK293细胞。正如普通技术人员将理解的那样，本文公开的方法和应用可应用于任何AAV，而不管用于生成它们的技术、方法、材料和方案。
在另一方面，本公开涉及一种用于执行cIEF以分离和表征全病毒载体、部分病毒载体和空病毒载体的方法。在特定实施方案中，cIEF方法用于分离和表征AAV衣壳、颗粒或载体为具有全转基因和启动子、转基因片段或缺乏转基因。cIEF利用两性离子运载体两性电解质在毛细管内形成pH梯度。运载体两性电解质可以是宽范围(例如pH 3-10)、窄范围(例如pH 6-8)或其组合，但也可以使用其他范围，例如pH 3-10或pH 7-10。与CE一样，毛细管的第一端与碱性溶液流体连接，而第二端与酸性溶液流体连接。
图2示出了cIEF设置的示例性实施方案，该设置包括阳极溶液1、阳极2、阳极稳定剂3、阴极稳定剂4、阴极5、检测窗口6和阴极溶液7。当向毛细管施加电压时，从阳极溶液1提供的氢离子和从阴极溶液2提供的羟基离子形成pH梯度。在cIEF聚焦期间，阴极稳定剂4向阴极5迁移，而阳极稳定剂3向阳极2迁移(Cruzado-Park,I.D.,Mack,S.,和Ratnayake,C.K.,Application Information Bulletin A-11634A:Identification of SystemParameters Critical for High Performance cIEF,Beckman Coulter,Inc.,Fullerton,CA,2008,通过引用全部并入本文)。聚焦是双向的，其中pH梯度在毛细管两端形成，并向毛细管的中心推进，从而形成连续的pH梯度(Hjerten,S.,Liao,J.L.,和Yao,K.Q.,JChromatogr,Volume 387,pp 127,1987,通过引用全部并入本文)。目标样品成分或分析物根据其等电点(pI)在pH梯度中迁移和分离。一旦分析物达到零净电荷，它就会停止迁移。
pH梯度形成和样品分析物聚焦后，发生动员(mobilization)。在cIEF动员期间，检测pI标准或标志物以及聚焦的目标分析物。动员可以在阴极或阳极方向完成。对于阴极动员，阴极储库中填充有动员溶液，如醋酸或者氢氧化钠和氯化钠溶液(Manabe,T.,Miyamoto,H.,和Iwasaki,A.,Electrophoresis,Volume 18,pp 92,1997和ApplicationInformation Bulletin A-12015A:A Robust cIEF Method:Intermediate Precision forthe pH 5-7Range,Beckman Coulter,Inc.,Fullerton,CA,2008，通过引用全部并入本文)。对于阳极动员，阳极储库中填充有动员溶液(如氯化钠)。当在阴极动员过程中施加电压时，氢离子从阳极液引入到毛细管中，而醋酸盐离子从阴极侧引入。在其他实施方案中，引入氯化物和氢氧化物离子。这导致从碱性到酸性的pH梯度滴定，并且在分离的分析物获得正电荷并向阴极迁移时检测分离的分析物。根据检测器选择检测波长。在一些实施方案中，使用UV检测器和280nm滤波器。
在一个方面，本文所公开的方法可以基于每个病毒载体的电荷异质性或pI来分离和区分病毒载体为具有全长外源多核苷酸、具有外源多核苷酸片段或缺乏任何外源多核苷酸。具体而言，来自CE(包括cIEF)的读取结果或结果可用于通过外源多核苷酸特征来识别病毒载体，其通过迁移模式和产生的电泳图峰值决定。
在另一方面，本文公开的cIEF方法可以基于每个病毒载体的pI来分离和区分病毒载体为具有全长外源多核苷酸、具有外源多核苷酸片段或缺乏任何外源多核苷酸。具体而言，在产生的cIEF电泳图或分离扫描(例如，全柱成像检测(WCID))中，峰值代表全、部分和空病毒载体。空病毒载体在替代pI迁移，而全病毒载体可以在较低pI迁移。“空”和“全”载体之间的峰值表示部分病毒载体(即含有外源多核苷酸片段的载体)。在这方面，cIEF方法可确定病毒载体的pI，随后可用于识别全、部分和空载体。
在另一方面，本文公开的cIEF方法可基于每个AAV衣壳的pI来分离和区分AAV衣壳、颗粒或载体为具有带转基因和启动子的全基因组、转基因片段或缺乏转基因。空AAV衣壳的cIEF迁移峰出现在相对于具有外源多核苷酸或其片段的病毒载体或缺乏任何外源多核苷酸的病毒载体的替代pI处，而在一些实施方案中，相对于空衣壳，全AAV衣壳的迁移峰可出现在较低pI处，部分AAV载体的迁移峰落在之间。通常，由于封装在病毒衣壳内的外源多核苷酸带负电荷，全AAV衣壳具有较低的pI。
在一些实施方案中，含有全外源多核苷酸或转基因的AAV衣壳的pI比缺乏外源多核苷酸或转基因的AAV衣壳低约0.3–0.5pI单位。在一些实施方案中，pI的差异可以小于0.1pH单位，并且在这些实施方案中，可以修改两性电解质(例如，具有窄pH范围的两性电解质)以改善pI差异小的衣壳的分辨率。
在另一方面，可通过对峰面积的定量来确定包含多个病毒载体的样品中全、部分和空病毒载体的相对丰度。例如，富含空病毒载体的样品将在“空”病毒载体pI处具有较大的峰面积，而富含全病毒载体的样品将在“全”病毒载体pI处具有较大的峰面积。
在另一个方面，可通过对峰面积的定量来确定含有多个AAV衣壳的样品中全、部分和空AAV衣壳、颗粒或载体的相对丰度。富含空AAV衣壳的样品将在“空”AAV衣壳pI处具有较大的峰面积，而富含全AAV衣壳的样品将在“全”AAV衣壳pI处具有较大的峰面积。可从空和全AAV衣壳峰之间的峰面积计算部分AAV衣壳。
所公开方法的优点包括在相对短的时间内(例如一小时)进行高通量分离，与分析超速离心(AUC)和电子显微镜(EM)相比进行自动数据分析，以及与HPLC、AUC和EM相比最小的样品体积(例如2-4μL载体材料)。此外，与阴离子交换HPLC(AEX-HPLC)和EM相比，所述方法提供了优越的分离和分辨率，可在AAV研发的各个阶段实施。
cIEF可以在任何合适的CE设备上执行，例如带有UV检测器和214nm滤波器的SciexPA800 Plus仪器。使用的毛细管可以是30cm N-CHO涂层的毛细管。分离电压可为10kV反极性(reverse polarity)。在214nm处进行UV检测。缓冲溶液为pH值为8.0的50mM硼酸钠，在0.5psi下注入90s。
实施例
实施例1：cIEF溶液的制备
用于cIEF的溶液如下进行制备：
阳极液溶液：为了制备200mM磷酸，将0.685mL 85％磷酸添加到去离子(DI)水中至总体积为50mL。
阴极液溶液：为了制备300mM氢氧化钠，将15mL 1M NaOH(Sigma，Cat#720820)添加到DI水中至总体积为50mL。
化学动员剂溶液：为了制备350mM乙酸，将1mL冰乙酸添加到DI水中至总体积为50mL。
阴极稳定剂溶液：为了制备500mM L-精氨酸，将0.87g的98％L-精氨酸(Sigma，Cat#A5006)溶解在8mL DI水中，并混合15min以实现完全溶解。将所得溶液放大至总体积为10mL DI水。
阳极稳定剂溶液：为了制备200mM亚氨基二乙酸(IDA)，将0.27g的98％IDA(Sigma，Cat#220000)溶解在8mL DI水中，并混合15min以实现完全溶解。将所得溶液放大至总体积为10mL DI水。
cIEF凝胶溶液(U-凝胶)：为了制备3M尿素cIEF凝胶溶液，将1.8g的尿素(Sigma，Cat#U1250)溶解在7mL cIEF凝胶(SCIEX，Cat#477497)中。溶解后，使用cIEF凝胶将溶液的总体积放大至10mL，混合15min，并使用5μm注射器过滤器进行过滤。使用Allegra X-15R离心机(Beckman Coulter，Cat#392933)以2000RCF对3M尿素cIEF凝胶溶液进行脱气，并储存在2-8℃。
实施例2：样品制备
通过混合200μL的3M尿素cIEF凝胶溶液、12μL的两性电解质、20μL的阴极稳定剂、2μL的阳极稳定剂、2μL的每种pI标志物来制备主混合溶液。根据表1和表2制备样品。使用Amicon Ultra 0.5mL离心过滤器(EMD Millipore，Cat#UFC501096)将血清型1和2浓缩至2mg/mL。使用Pharmalyte 3-10运载体两性电解质(GE Healthcare Life Sciences，Cat#17045601)制备用于样品1-3的主混合物。以4:2的比例使用Pharmalyte 3-10运载体两性电解质和Servalyte 6-8运载体两性电解质(Serva，Cat#42906.04)的两性电解质混合物制备用于样品4-6的主混合物。还仅使用宽范围的Pharmalyte 3-10运载体两性电解质分析样品6。
表1
Figure BDA0003740894430000111
Figure BDA0003740894430000121
表2
样品 血清型体积(μL) 主混合物体积(μL)
1 10 240
2 10 240
3 3 24
4 3 24
5 3 24
6 3 24
实施例3：样品分析
将每个制备的样品转移到纳米瓶(SCIEX，Cat#5043467)中。使用PA 800PA Plus药物分析系统(SCIEX)进行cIEF分析，该系统配有UV检测器和280nm过滤器(SCIEX，Cat#969136)和30.2cm N-CHO毛细管(SCIEX，Cat#477601)。cIEF方法的仪器参数如图3A-3E所示。在所有分离中，毛细管温度保持在20℃。使用32Karat软件收集和分析数据。
实施例4：全、空和部分AAV衣壳的cIEF分辨率
图4示出了pI标志物7.0和10.0之间，样品1(富含空AAV衣壳)和样品2(富含全AAV衣壳)的cIEF谱。空衣壳峰在较高的pI处迁移，而全衣壳峰在较低的pI值处迁移。“空”和“全”衣壳峰值之间的峰值指示部分衣壳。正如预期，样品2显示出更高强度的全衣壳峰，而样品1显示出更高强度的空衣壳峰。这些cIEF谱与通过分析超速离心获得的谱(数据未显示)一致。图4中峰1-5的pI如表3所示。根据内部pI标志物的校准曲线确定AAV衣壳峰的pI值。
表3:样品1和2中分离峰的pI
Figure BDA0003740894430000131
图5A示出了样品3的cIEF谱以及AEX-HPLC谱(图5A中的插图)。图5B是来自图5A的样品峰的放大图。与样品1和2(上文讨论)一致，与全衣壳峰相比，空衣壳峰在更高的pI处迁移。当与AEX-HPLC分离相比，cIEF分离产生空衣壳峰和全衣壳峰的改善分辨率。此外，cIEF分离了部分衣壳，而AEX-HPLC没有分离。cIEF或AEX-HPLC分离后的全、空和部分衣壳的定量如表4所示。由于AEX-HPLC无法解析部分衣壳，因此将cIEF分析中的全和部分衣壳峰面积之和与AEX-HPLC中的全衣壳峰面积进行比较。这些数据表明，通过cIEF测定的全和空衣壳的百分比与通过AEX-HPLC测定的相当。
表4：通过cIEF和AEX-HPLC分离测定的样品3全和空衣壳的峰面积百分比比较
分离方法 空衣壳(％面积) 全衣壳(％面积)
cIEF 33 67(全+部分)
AEX-HPLC 31 69(全)
图6A示出了样品4(富含空AAV衣壳)和样品5(富含全AAV衣壳)的cIEF谱。图6B是来自图6A的样品峰的放大图。正如预期，样品5显示出更高强度的全衣壳峰，而样品4显示出更高强度的空衣壳峰。经计算，样品4和5的pI差值在全和空衣壳峰之间约为0.1pH单位，并且窄pH范围两性电解质提供了AAV峰的优异基线分辨率。样品4的pI值约为7.1(数据未显示)。cIEF分离后全、空和部分衣壳的定量如表5所示。从在cIEF电泳图中的分离的衣壳峰的校正峰面积计算这些百分比。
表5：通过cIEF测定的样品4和5中全和空衣壳的峰面积百分比比较
样品 空衣壳(％面积) 全衣壳(％面积)
4 57 43
5 22 78
实施例5：使用宽范围和窄范围pH两性电解质对AAV衣壳的cIEF分辨率
图7使用宽范围和窄范围pH两性电解质(上图)和宽范围pH两性电解质的混合物(下图)比较了样品6的cIEF谱。宽范围的pH两性电解质在pI 7.3和7.5处产生更差解析的峰，而pH两性电解质的混合物提供了增强的样品分辨率，如pI 7.3和7.6之间的峰所示。这些数据证明使用窄范围或窄范围和宽范围pH两性电解质改善了AAV样品中部分衣壳变体的分辨率。
实施例6:AAV衣壳的cIEF分析的再现性
图8显示了用于AAV样品的cIEF分离的再现性。对样品6进行五次cIEF。峰面积的相对标准偏差(RSD)％为≤5％，pI值的％RSD为≤2％。这些数据证明AAV衣壳的cIEF分析具有高度的再现性。
总的来说，上述示例性数据证明cIEF分析可用于区分和鉴定AAV衣壳。具体而言，cIEF能够识别和定量具有全转基因、具有部分转基因或缺乏转基因的衣壳。在异质AAV样品中，cIEF能够确定样品内的全、空和部分衣壳的分布。
实施例7：全和空AAV衣壳的CZE分辨率
图9示出了样品A(富含空AAV衣壳)、样品B(富含全AAV衣壳)和样品C(样品A和B的比例为1:1)的CZE谱。样品在收到时使用。用移液管将10uL的原始样品移到纳米小瓶中，并加载到仪器上。将样品引入配备有UV检测器和214nm过滤器的PA800 Plus仪器。运行参数：毛细管：30cm N-CHO涂层的毛细管，分离：10kV反极性，UV检测：214nm缓冲剂：50mM硼酸钠pH8.0，注入：0.5psi持续90s。叠加图是对3种不同混合物的AAV血清型9样品的CZE分析，其中一种样品已经富含空衣壳，一种样品已经富含全衣壳，另一种样品以1:1的比例混合全衣壳和空衣壳。如所示，在约10.4分钟有一个明显的峰，空衣壳样品的峰比全衣壳样品的峰值更明显。
图10示出了纯化前后AAV样品的CZE谱。样品在收到时使用。使用电动注入将样品引入CE仪器(PA 800Plus，配备有PDA检测器)。注入条件为0.5psi持续90s，运行缓冲剂为50mM硼酸钠缓冲剂，pH值为8.5。毛细管为裸熔融石英毛细管，50um ID和30cm长度，入口至检测窗之间的长度为20cm。分离条件为10kV反极性。叠加踪迹(overlaid trace)是在每个纯化步骤对AAV样品进行CZE分析，以便在上游开发过程中监测产品的纯度以及全衣壳和空衣壳的比率。在纯化过程的每个阶段，观察到较少的杂质峰。

Claims (28)

1.一种分离样品中的病毒载体的方法，该方法包括：
在足以基于每个病毒载体的等电点(pI)分离病毒载体的条件下和持续时间，对包含含有外源多核苷酸的病毒载体的样品执行毛细管等电聚焦(cIEF)；
生成cIEF结果的读取结果；和
分析读取结果以根据外源多核苷酸含量来鉴定病毒载体。
2.权利要求1所述的方法，其中所述分析将病毒载体表征为具有包含全长外源多核苷酸、外源多核苷酸片段的外源多核苷酸或缺乏任何外源多核苷酸，其中相对于具有外源多核苷酸片段的病毒载体和缺乏任何外源多核苷酸的病毒载体相比，具有全长外源多核苷酸的病毒载体具有较低的pI。
3.权利要求1或2所述的方法，其中外源多核苷酸包括转基因、启动子和ITR序列。
4.权利要求1所述的方法，其中病毒载体是腺相关病毒载体。
5.权利要求1所述的方法，其中cIEF结果的读取结果是电泳图或分离扫描。
6.权利要求1所述的方法，其中执行cIEF包括以下步骤：
将包含病毒载体的样品加载到包含pH梯度的通道或毛细管中；
将通道或毛细管的第一端与酸性溶液流体连接；
将通道或毛细管的第二端与碱性溶液流体连接；和
向通道或毛细管施加电压。
7.权利要求6所述的方法，其中通道或毛细管装载有2-4μL的包含所述样品的载体材料。
8.一种定量样品中病毒载体的方法，该方法包括：
在足以基于每个病毒载体的等电点(pI)分离病毒载体的条件下和持续时间，对包含含有外源多核苷酸的病毒载体的样品执行毛细管等电聚焦(cIEF)；
生成cIEF结果的读取结果；和
分析读取结果以根据外源多核苷酸含量来鉴定病毒载体。
9.权利要求8所述的方法，其中分析包括从读取结果中定量具有全长外源多核苷酸的病毒载体、具有外源多核苷酸片段的病毒载体或缺乏任何外源多核苷酸的病毒载体的相对丰度，其中相对于具有外源多核苷酸片段的病毒载体和缺乏任何外源多核苷酸的病毒载体，具有全长外源多核苷酸的病毒载体具有替代的pI。
10.权利要求8或9所述的方法，其中外源多核苷酸包括转基因、启动子和ITR序列。
11.权利要求8所述的方法，其中病毒载体是腺相关病毒载体。
12.权利要求8所述的方法，其中cIEF结果的读取结果是电泳图或分离扫描。
13.权利要求8所述的方法，其中执行cIEF包括以下步骤：
将包含病毒载体的样品加载到包含pH梯度的通道或毛细管中；
将通道或毛细管的第一端与酸性溶液流体连接；
将通道或毛细管的第二端与碱性溶液流体连接；和
向通道或毛细管施加电压。
14.权利要求13所述的方法，其中通道或毛细管装载有包含2-4μL载体材料的样品。
15.一种分离样品中的病毒载体的方法，该方法包括：
在足以基于每个病毒载体的电荷异质性或等电点(pI)分离病毒载体的条件下和持续时间，对包含含有外源多核苷酸的病毒载体的样品执行毛细管电泳(CE)；
生成CE结果的读取结果；和
分析读取结果以根据外源多核苷酸含量来鉴定病毒载体。
16.权利要求15所述的方法，其中分析将病毒载体表征为具有包含全长外源多核苷酸、外源多核苷酸片段的外源多核苷酸或缺乏任何外源多核苷酸。
17.权利要求15或16所述的方法，其中外源多核苷酸包括转基因、启动子和ITR序列。
18.权利要求15所述的方法，其中病毒载体是腺相关病毒载体。
19.权利要求15所述的方法，其中CE结果的读取结果是电泳图或分离扫描。
20.权利要求15所述的方法，其中执行CE包括以下步骤：
将包含病毒载体的样品装载到通道或毛细管中；
将通道或毛细管的第一端与酸性溶液流体连接；
将通道或毛细管的第二端与碱性溶液流体连接；和
向通道或毛细管施加电压。
21.权利要求20所述的方法，其中CE选自毛细管等电聚焦(cIEF)、毛细管区带电泳(CZE)和毛细管凝胶电泳(CGE)。
22.一种定量样品中病毒载体的方法，该方法包括：
在足以基于每个病毒载体的电荷异质性或等电点(pI)分离病毒载体的条件下和持续时间，对包含含有外源多核苷酸的病毒载体的样品执行毛细管电泳(CE)；
生成CE结果的读取结果；和
分析读取结果以根据外源多核苷酸含量来鉴定病毒载体。
23.权利要求22所述的方法，其中分析包括从读取结果中定量具有包含全长外源多核苷酸的外源多核苷酸的病毒载体、具有外源多核苷酸片段的病毒载体或缺乏任何外源多核苷酸的病毒载体的相对丰度。
24.权利要求22或23所述的方法，其中外源多核苷酸包括转基因、启动子和ITR序列。
25.权利要求22所述的方法，其中病毒载体是腺相关病毒载体。
26.权利要求22所述的方法，其中CE结果的读取结果是电泳图或分离扫描。
27.权利要求22所述的方法，其中执行CE包括以下步骤：
将包含病毒载体的样品装载到通道或毛细管中；
将通道或毛细管的第一端与酸性溶液流体连接；
将通道或毛细管的第二端与碱性溶液流体连接；和
向通道或毛细管施加电压。
28.权利要求27所述的方法，其中CE选自毛细管等电聚焦(cIEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)和毛细管等速电泳、胶束电动毛细管色谱和毛细管电动色谱。
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