JP4668123B2 - ゲルの染脱色方法、ゲルの電気泳動脱色装置及びゲルの染脱色キット - Google Patents

Description

本発明は、ゲルの染脱色方法、ゲルの電気泳動脱色装置及びゲルの染脱色キットに関する。

ゲルを用いた電気泳動(ｇｅｌ ｓｉｅｖｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ)は、タンパク質や核酸の分離・分析に汎用されている技術である。タンパク質に対しては、ポリアクリルアミドゲルの架橋度を、例えば、４〜２０％としたポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)が最も多用されている。さらに、変性剤としてドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を添加したポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)は、タンパク質の分離能が極めて高く、タンパク質の分子量測定や精製工程の管理に使用されている。従来、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のタンパク質の染色には、代表的には、色素染色法、銀染色法、蛍光染色法の３つが利用されている。これらの中でも、最も一般的な染色方法は、色素染色法であって、その中でも、クーマシーブリリアントブルー(Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ：以下、ＣＢＢともいう)という色素を用いた方法が最も主流である。このＣＢＢ染色法は、ＣＢＢとタンパク質との分子間相互作用によりタンパク質にＣＢＢを付着させ、可視化するという染色法である。一般的なＣＢＢ染色法のプロトコールは、電気泳動終了後のゲルを、ＣＢＢ、メタノール及び酢酸を含むＣＢＢ染色溶液を用いて、約３０分程度かけて固定及び染色し、その後、メタノール及び酢酸を含む脱色液を用いて、約２〜１６時間かけて脱色するというものである。最大検出感度は、銀染色法等に劣るものの、ＣＢＢ染色法は、作業の簡便性と、高い定量性及び再現性とを備え（特許文献１参照）、医学、薬学、生物学、バイオサイエンス等における研究・開発分野において、非常に重要な実験手法である。

前記ＣＢＢ染色法の問題点としては、作業時間が挙げられる。すなわち、固定・染色・脱色工程が、ゲル中に染色剤等の試薬を浸透・拡散させることにより行われるため、根本的に時間がかかり、前述のとおり、通常約２〜１６時間を要するのである。特に、ＣＢＢ Ｒ−２５０やＣＢＢ Ｇ−２５０を色素として使用する場合には、ゲルの脱色が問題となる。例えば、脱色時間が短く、脱色が不十分であると、ゲルのバックグラウンドが高くなり、タンパク質のバンドやスポットが見にくくなってしまう。反対に、例えば、オーバーナイトで脱色したりすると、タンパク質のバンドやスポットまでも脱色してしまい、再度の染色が必要となる場合もある。また、ＣＢＢ染脱色が短時間でできる試薬が市販されているが、これらの試薬では、染色度が弱いために、微量のタンパク質のバンドやスポットが見にくくなるという問題がある。

一方、色素染色法により染色したゲルを、電気泳動を利用して脱色するという脱色法は、ＣＢＢよりも染色感度が劣るアミドブラックを用いて染色したゲルの脱色法として提案されたことがある（非特許文献１参照）。
特開２００３−２９３０４号公報 Ｋａｔｌｓｃｈｉｍｄｔ，Ｅ．＆ Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．（１９７０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６ ｐ４０１−４１２

しかしながら、この方法は、アミドブラックに限って有効であり、従来のＣＢＢ染色法で染色されたゲルでは効率よくＣＢＢを脱色できないという問題があった。そして、現在に至るまで、電気泳動を利用したＣＢＢの脱色法は実用レベルで確立されていない。そこで、本発明は、ゲル中の色素を電気泳動により脱色することを含むゲルの染脱色方法の提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明のゲルの染脱色方法は、色素を含み、アルコールを含まない酸性の水溶液を用いてゲルを染色する染色工程と、アルコールを含まない酸性の水溶液中に配置した前記ゲルに電圧を印加し、電気泳動により前記色素を脱色する脱色工程とを含むゲルの染脱色方法である。

ＣＢＢが電気泳動できないことについて、本発明者は、従来のＣＢＢ染脱色法では染色及び脱色を酸性溶液で行うため、この酸性溶液下でＣＢＢがチャージを失い電気泳動されないという理由を見出した。そして、電気泳動を中性又は塩基性の溶液で行うことで、ＣＢＢの電気泳動を可能とした。しかしながら、このような条件で電気泳動を行うと、タンパク質に付着したＣＢＢも付着していないＣＢＢも区別なくゲルから泳動されてしまうため、タンパク質の検出ができなくなるという新たな問題に直面した。この問題を解決するため本発明者は鋭意研究を重ねた結果、下記２つ原因を見出し、本発明に到達した。

まず、第１の原因として、本発明者は、タンパク質とＣＢＢとの結合が、塩基性下で不安定になることを見出した。そこで、従来どおり、染色及び脱色は、酸性溶液を用いて行い、脱色の前に、一旦、ゲルを中性又は塩基性溶液に浸漬してＣＢＢにチャージを持たせることで、酸性溶液中であってもＣＢＢを電気泳動可能とした。しかし、この方法では、酸性溶液を用いた電気泳動は可能となるが、依然として、タンパク質への付着の有無に関わらずＣＢＢが電気泳動されてしまうという問題は解決されなかった。そこで、本発明者は、さらに研究を重ね、第２の原因として、メタノールやエタノール等のアルコールはタンパク質を固定するが、タンパク質とＣＢＢとの結合を不安定にすることを見出した。そして、染色から脱色までのすべての工程からアルコールの使用を排除することで、タンパク質とＣＢＢとの結合を安定化し、タンパク質への付着の有無によるＣＢＢの電気泳動の差別化、すなわち、タンパク質に付着したＣＢＢは電気泳動せず、タンパク質に付着してないＣＢＢのみを電気泳動して脱色することを実現した。

従来のＣＢＢ染色及び脱色においてメタノール等のアルコールを用いることは、バイオテクノロジーの技術常識であった。なぜなら、メタノール等の使用は、染色及び脱色効率を向上し、また、タンパク質をゲル中に固定できるという利点があるからである。しかし、本発明のゲルの染脱色方法では、この技術常識に反してメタノール等のアルコールの使用を排除することで、電気泳動による脱色時間の大幅な短縮という優れた効果を実現した。また、メタノール等のアルコールを使用しなくても、本発明のゲルの染脱色方法では、例えば、酢酸等を含む染色液を使用することで、タンパク質の固定や染色度に関して、従来法と遜色のないレベルを維持できる。すなわち、このような条件において色素自身がアルコールの代わりにタンパク質を固定できる。

本発明のゲルの染脱色方法によれば、簡単な操作と試薬により、例えば、従来どおりの高い染色度を維持しつつ、大幅に迅速化され、ランニングコストが抑えられたゲルの染脱色が可能である。

本発明のゲルの染脱色方法は、前記染色工程と前記脱色工程との間に、さらに、脱色促進工程を含み、前記脱色促進工程が、前記染色工程後のゲルを、ｐＨ７を超え、アルコールを含まない水溶液に浸漬する工程であることが好ましい。

本発明のゲルの染脱色方法において、前記染色工程及び前記脱色工程における水溶液が、酢酸を含むことが好ましく、また、前記ゲルが、ポリアクリルアミドゲルであることが好ましい。さらに、前記ゲルが、タンパク質を含み、前記色素が、クーマシーブリリアントブルーＧ２５０及びＲ２５０、アミドブラック１０Ｂ、ポンソー３Ｒ、ニグロシン、並びに電荷をもつ色素からなる群から選択される色素であることが好ましい。また、前記脱色工程は、さらに、前記水溶液を撹拌することを含むことが好ましい。

本発明のゲルの電気泳動脱色装置は、ゲルの染脱色方法に使用する装置であって、本体容器と、一対の電極と、ゲルコンテナとを含み、前記一対の電極が、前記本体容器の内部に配置され、前記ゲルコンテナが、ゲルを挟持する支持体を含み、前記本体容器内部の前記一対の電極間に、着脱自在に配置されるゲルの電気泳動脱色装置である。

本発明のゲルの電気泳動脱色装置は、前記一対の電極及び前記ゲルコンテナが、電圧の向きとゲル表面法線とがほぼ平行になるように配置されることが好ましい。

本発明のゲルの染脱色キットは、本発明のゲルの染脱色方法のためのキットであって、各工程で使用する水溶液、それらの濃縮物、及び、それら成分の粉末からなる群から選択される試薬を含むことが好ましい。また、本発明のゲル染脱色キットは、さらに、ゲルの染脱色を実施するための説明書及び／又は本発明のゲルの電気泳動脱色装置を含むことが好ましい。

本発明において、「ゲル」とは、生物学、化学、医学、薬学、バイオサイエンス等の分野において、生体物質や化学物質を分離分析するための分子ふるい素材のことをいい、好ましくは、電気泳動法による試料成分の分布支持体をいう。前記ゲルの素材としては、特に制限されないが、例えば、従来公知のポリアクリルアミドやアガロース等が挙げられる。本発明のゲルの染脱色方法に用いるゲルとしては、好ましくは、タンパク質の電気泳動後のゲルが挙げられる。本発明のゲルの染脱色方法によれば、染色工程において前記タンパク質を染色し、脱色工程においてタンパク質を染色した色素の脱色を抑制することができ、タンパク質の検出方法として利用できる。ただし、本発明のゲルの染脱色方法の用途は、これらに限定されるものではない。前記タンパク質の電気泳動としては、特に制限されず、従来公知の電気泳動、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)、ドデシル硫酸ナトリウムを添加したポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)、オファーレルの二次元電気泳動法、ＲＦＨＲの二次元電気泳動法（特公平６−４１９３３）等が挙げられる。ゲルの大きさや形状も特に制限されず、ディスク式の円柱状のものであっても、スラブ式のシート状のものであってもよい。

本発明において、「ゲルの染脱色方法」とは、前記ゲルを染色する方法と、染色後のゲルを脱色する方法とを含む方法をいう。また、本発明において、「アルコール」とは、特に制限されず、一価アルコール及び多価アルコールを含むが、好ましくは、一価アルコールであって、より好ましくは、エタノール、メタノール及びイソプロパノールである。

以下に、本発明のゲルの染脱色方法について説明する。

（染色工程）
まず、ゲルを、色素を含み、アルコールを含まない酸性の水溶液（以下、染色液ともいう）を用いてゲルを染色する。前記ゲルは、前述のとおり、例えば、タンパク質の電気泳動後のゲルである。

前記色素は、ゲル中に分布するタンパク質等の生体物質や化学物質に結合することで、それらを検出可能とする着色物質のことをいう。本発明では前記色素を電気泳動して脱色するから、前記色素は、いずれかのｐＨで電荷を有する分子であることが好ましい。前記色素の染色対象である生体物質や化学物質としては、特に制限されず、例えば、タンパク質が挙げられる。前記タンパク質は、糖タンパク質、脂質タンパク質等の修飾されたタンパク質を含む。タンパク質に対する色素としては、例えば、ＣＢＢ Ｇ２５０、ＣＢＢ Ｒ２５０、アミドブラック１０Ｂ、ポンソー３Ｒ、ニグロシン等が挙げられ、その中でも、ＣＢＢが好ましい。

前記染色液において排除すべきアルコールは、少なくとも、エタノール、メタノール及びイソプロパノールであって、好ましくは、一価アルコールであり、より好ましくは、アルコール全般である。

前記染色液は酸性であるが、そのｐＨとしては、ｐＨ２〜５の範囲が好ましく、より好ましくは、ｐＨ２〜３の範囲である。前記ｐＨは、例えば、酢酸やリン酸等の酸又は酸性のバッファーで調整できるが、前記染色液は、酢酸を含むことが好ましい。酢酸は、前記色素の染色効率の向上し、色素のタンパク質への結合を安定化し、タンパク質のゲルへの固定を促進する等の効果があるからである。酢酸と色素とを使用して前記脱色液を調製する場合、酢酸の含有量としては、例えば、１０〜１００ｍＬ／Ｌであって、好ましくは、２０〜１００ｍＬ／Ｌであり、より好ましくは、２０〜５０ｍＬ／Ｌであり、前記色素の含有量としては、例えば、０．１〜１００ｇ／Ｌであって、好ましくは、０．５〜５０ｇ／Ｌであり、より好ましくは、１．０〜１０ｇ／Ｌである。前記染色液は、さらに、ホウ酸（オルトホウ酸）を、例えば、０．０１〜１．０ｇ／Ｌの範囲で含んでいても良い。

前記染色液の調製方法は、特に制限されず、例えば、使用直前に調製してもよく、予め前記色素以外の酸性水溶液の濃縮物を調製しておき、使用直前に稀釈して前記色素を所定量混合して調製してもよい。

前記染色液でゲルを染色する方法は、前記染色液を前記ゲルに接触させることができる方法であれば特に制限されず、例えば、前記染色液に前記ゲルを浸漬する方法等が挙げられる。また、染色は、例えば、前記染色液に浸漬した前記ゲルを静置して行っても良く、又は、適度な振とうを加えながら行っても良い。使用する染色液の量は、特に制限されないが、例えば、ゲルの体積の５倍以上、好ましくは１０倍以上である。染色時間としては、例えば、５分〜６０分であり、好ましくは、１０分〜４５分であり、より好ましくは、１０分〜３０分である。

（脱色促進工程）
次に、前記染色工程で染色したゲルを、ｐＨ７を超え、アルコールを含まない水溶液（以下、脱色促進液ともいう）に浸漬する。前述のとおり、ＣＢＢは酸性条件下では電気泳動されないため、酸性の染色液で染色した後に一旦ｐＨ７を超える溶液にゲルを浸漬して後の電気泳動による脱色をより一層促進する。これは、ゲル中のＣＢＢのイオン化が促進するためであると考えられるが、本発明は、このようなメカニズムに限定されない。なお、脱色効率よりも脱色時間を重視する場合は、この脱色促進工程を省くことができる。例えば、非常に薄いゲルを使用した場合などは、そのまま、後の脱色工程に移行することもできる。バックグラウンドを低くし、コントラストを向上する点からは、脱色促進工程を行うことが好ましい。

前記脱色促進液のｐＨは、ｐＨ７を超え、好ましくは、ｐＨ７〜１０の範囲であって、より好ましくは、ｐＨ９〜１０の範囲である。前記ｐＨは、従来公知のバッファーを使用して調整でき、例えば、ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ）バッファー、ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡ）バッファー、Ｔｒｉｓ／塩酸／ＥＤＴＡバッファー等を使用できる。また、ｐＨは、例えば、ＫＯＨ、ＮａＯＨなどのアルカリ物質を前記バッファーに添加することで調整することもできる。なお、前記脱色促進液において排除すべきアルコールは、例えば、一価アルコールであって、より具体的は、エタノール、メタノール、イソプロパノールである。前記脱色促進液の調製方法は、特に制限されず、例えば、使用直前に調製してもよく、予め濃縮物を調製しておき使用前に希釈して調製してもよく、又は、予め調合した成分粉末を使用前に溶解して調製してもよい。

使用する脱色促進液の量は、特に制限されないが、例えば、ゲルの体積の５倍以上、好ましくは１０倍以上である。脱色促進液への浸漬時間としては、例えば、１分〜３０分であり、好ましくは、５分〜２０分であり、より好ましくは、１０分〜１５分である。脱色促進液への浸漬は、例えば、前記染色液に浸漬した前記ゲルを静置して行っても良く、又は、適度な振とうを加えながら行っても良い。

（脱色工程）
最後に、前記染色工程又は前記脱色促進工程後のゲルを、アルコールを含まない酸性の水溶液（以下、脱色液ともいう）中に配置し、これに電圧を印加して電気泳動により前記色素を脱色する。

前記脱色液は酸性であるが、そのｐＨとしては、ｐＨ２〜５の範囲が好ましく、より好ましくは、ｐＨ２〜３の範囲である。前記ｐＨは、例えば、酢酸やリン酸等の酸又は酸性のバッファーで調整できるが、前記脱色液は、酢酸を含むことが好ましい。酢酸は、前記色素の脱色効率の向上し、色素のタンパク質への結合を安定化し、タンパク質のゲルへの固定を促進する等の効果があるからである。酢酸を使用して前記脱色液を調製する場合、酢酸の含有量としては、例えば、１０〜１００ｍＬ／Ｌであって、好ましくは、１０〜５０ｍＬ／Ｌであり、より好ましくは、１０〜２０ｍＬ／Ｌである。前記脱色液は、さらに、ホウ酸（オルトホウ酸）を、例えば、０．０１〜１．０ｇ／Ｌの範囲で含んでいてもよい。また、前記脱色液において排除すべきアルコールは、例えば、一価アルコールであって、より具体的は、エタノール、メタノール、イソプロパノールである。前記脱色液の調製方法は、特に制限されず、例えば、使用直前に調製してもよく、予め濃縮物を調製しておき使用直前に希釈して調製してもよい。

前記電気泳動の方法は、前記脱色液中で前記ゲルに電圧を印加できる方法であれば特に制限されないが、例えば、後述する本発明のゲルの電気泳動脱色装置を使用することができる。前記印加する電圧の向きは、前記ゲルが、例えば、スラブゲル等のシート状のゲルである場合、その表面法線方向とほぼ平行であることが好ましい。より短い距離で前記色素をゲル外へ移動させることができるからである。印加する電圧は、脱色液が沸騰や過度の加熱がおこらない範囲が好ましく、例えば、５０〜４００Ｖであって、好ましくは１００〜２００Ｖである。電圧の印加は、例えば、従来公知のパワーサプライを用いて、定電圧で行うことができる。ゲルの脱色のための電気泳動の時間としては、ゲルの厚みや、脱色の具合によって適宜調節可能であるが、例えば、１０〜３０分であり、好ましくは１０〜２０分である。また、使用する脱色液の量は、特に制限されないが、例えば、ゲルの体積の１０倍以上、好ましくは１５倍以上である。脱色は、前記脱色液に適度な撹拌を加えながら行うことが好ましい。前記脱色液を撹拌することで、ゲルから出た色素が再びゲルに付着することを効率的に防ぐことができる。撹拌のための手段は特に制限されないが、例えば、撹拌子を使用することができる。

次に、本発明のゲルの電気泳動脱色装置について説明をする。本発明のゲルの電気泳動脱色装置は、前述の脱色工程における電気泳動に使用できる装置である。

本発明のゲルの電気泳動脱色装置は、本体容器と、一対の電極と、ゲルコンテナとを含み、前記一対の電極が、前記本体容器の内部に配置され、前記ゲルコンテナが、ゲルを挟持する支持体を含み、前記本体容器内部の前記一対の電極間に、着脱自在に、配置されるゲルの電気泳動脱色装置である。前記一対の電極が形成する電界に前記ゲルコンテナを配置することで、前記ゲルコンテナ内のゲルを脱色することができる。

一般的なスラブゲル等のシート状のゲルを脱色する場合には、前記一対の電極及び前記ゲルコンテナが、電圧の向きとゲル表面法線とがほぼ平行になるように配置されることが好ましい。ゲルにかかる電圧を均一にして、脱色を均一にするためである。この場合、前記電極と前記ゲルコンテナとは、前記本体容器の底面に垂直に配置してもよく、水平に配置してもよい。前記本体容器に配置されるゲルコンテナは、１つに限られず、複数個のゲルコンテナを配置し、複数枚のゲルを同時に脱色することもできる。複数個のゲルコンテナを配置する場合には、前記電極及び前記ゲルコンテナは、前記本体容器の底面に垂直に配置することが好ましい。水平に配置した場合、脱色した色素の沈降により下部のゲルが影響を受けることがあるからである。

前記本体容器は、前記電極及び前記ゲルコンテナを配置でき、さらに、脱色するゲルに対応する量の脱色液を保持できるものであれば、特に制限されない。前記本体容器は、前記電極及び前記ゲルコンテナの配置を助けるための部材、例えば、前記ゲルコンテナを固定するためのスペーサ等を備えることが好ましい。前記本体容器の形状は、特に制限されない。また、前記本体容器の材質も、特に制限されず、例えば、アクリル樹脂等の各種プラスチックを使用できる。また、前記撹拌子を用いる場合には、前記本体容器の底面に撹拌子の位置取りを助けるための凹部を設けてもよい。前記凹部の位置や数は特に制限されないが、例えば、前記本体容器の中央部に一ヶ所設けることができる。

前記電極は、一定面積のゲルに均一に電圧をかけるために、前記ゲルと同程度かそれ以上面積を有する板状、網状、又は、同面積の面内に、例えば、ジグザグ、波形、円、渦巻き形等のように配置した線状の電極であることが好ましい。また、一対の電極は互いに平行であることが好ましい。前記電極は、前記本体容器の内部、例えば、対向する内壁等に固定されてもよく、または、前記本体容器と着脱自在な基板（以下、電極板ともいう）に固定され、本体容器と分離可能としてもよい。前記電極板の材質は、特に制限されず、例えば、前記本体容器と同じ材質が挙げられる。前記電極の材質は、特に制限されず、例えば、白金、カーボン等が挙げられる。

前記ゲルコンテナは、前記支持体でゲルを挟持することで、シート状のゲルの折れ曲がりや破損を防止でき、また、前記一対の電極間への配置を容易にすることができる。また、タンパク質の電気泳動後にゲルを前記ゲルコンテナに収納すれば、本発明の染脱色方法のおける染色工程、脱色促進工程、及び、脱色工程を一貫してゲルコンテナを利用して行うことができ、操作性が向上する。前記支持体でゲルを挟持する方法としては、例えば、２枚のシート状の支持体でゲルを挟み込んだり、１枚のシート状の支持体を２つ折りにしてゲルを挟み込むことが挙げられる。前記支持体としては、脱色液中における通電及び脱色を妨げないものが好ましく、例えば、ネット状又はメッシュ状の繊維、樹脂、ガラス、金属や、シート状の不織布等が挙げられる。

前記ゲルコンテナは、前記支持体や前記ゲルの変形を防止するため、前記支持体の枠（以下、ゲルコンテナ枠ともいう）を含むことが好ましい。前記ゲルコンテナ枠は、前記ゲルを挟み込んだ前記支持体を維持できるものであれば、形状は特に制限されない。また、前記ゲルコンテナ枠と前記支持体とは、予め取り付けられている形態でもよく、また、互に独立しており、支持体でゲルを挟持した後に枠を取り付ける形態でもよい。前記ゲルコンテナ枠の材質は、特に制限されず、例えば、アクリル樹脂等の各種プラスチックを使用できる。

本発明のゲルの電気泳動脱色装置は、さらに、例えば、撹拌手段やゲルコンテナを収容可能なゲル染色用容器等を含んでもよい。あるいは、前記本体容器を染色用容器として使用してもよい。前記撹拌手段は、特に制限されず、例えば、撹拌子及び前記撹拌子を回転させるための撹拌装置等があげられる。

本発明のゲルの電気泳動脱色装置の一態様を、図１〜３を用いて説明する。図１に示すとおり、本発明のゲルの電気泳動脱色装置１０は、本体容器１と、電極２と、ゲルコンテナ３とを主要構成要素としている。電極２は、電極板５に固定され、その一端が、電極プラグ６に接続している。前記電極板５は、本体容器１のスペーサ４と側壁との間隙に着脱自在に配置可能である。ゲルコンテナ３は、支持体７とゲルコンテナ枠８とからなり、本体容器１のスペーサ４の間隙に着脱自在に配置可能である。図２に、前記電極板５及び前記ゲルコンテナ３を前記本体容器１に配置した電気泳動脱色装置１０の図を示す。同図において、図１と同一箇所には、同一符号を付している。同図のとおり、本体容器１のスペーサ４を介して、一対の電極板５とゲルコンテナ３とを、平行に配置することで、均一な電気泳動による脱色が可能となる。図３に、ゲルコンテナ３の構成の一例を示す。同図において、図１と同一箇所には、同一符号を付している。同図のゲルコンテナ３は、ヒンジ部を有するゲルコンテナ枠８と、前記ゲルコンテナ枠８に固定された支持体７とからなり、シート状のゲル９を上下から挟み込むことで、ゲル９の形を崩すことなく、例えば、図２に示すように、前記容器本体１に垂直に配置することができる。

次に、本発明のゲルの染脱色キットについて説明する。本発明のゲルの染脱色キットは、本発明のゲルの染脱色方法のためのキットであって、前述の各工程に使用する水溶液、それらの濃縮物、又はそれらの成分粉末を含むキットである。また、本発明のゲル染脱色キットは、さらに、ゲルの染脱色を実施するための説明書や前述の本発明の電気泳動脱色装置を含んでもよい。

以下に、本発明のゲルの染脱色キットの一例について説明するが、本発明のゲルの染脱色キットの構成は、これに限定されない。本発明の染脱色キットとしては、下記の色素、Ａ液及びＢ液を含むキットや、下記の色素、Ａ液及びＣ液を含むキットが挙げられる。下記Ａ液は、前記染色液及び前記脱色液を調製するための溶液であり、下記Ｂ液及びＣ液は、前記脱色促進液の濃縮物である。Ａ液、Ｂ液、Ｃ液の水溶液の組成は、それぞれ、下記のとおりである。
色素：ＣＢＢ Ｒ２５０
Ａ液（１００ｍＬあたり）：酢酸 ５０ｍＬ
Ｂ液（１００ｍＬあたり）：Ｔｒｉｓ ５０ｇ、ホウ酸 ３．７５ｇ、ＥＤＴＡ２Ｎａ ５ｇ、ｐＨ９．８
Ｃ液（１００ｍＬあたり）：Ｔｒｉｓ １０ｇ、ホウ酸 ０．７５ｇ、ＥＤＴＡ２Ｎａ １ｇ、５Ｎ ＫＯＨ ５ｍＬ、ｐＨ１１．５

これらのキット及び前述の電気泳動脱色装置を用いた本発明のゲルの染脱色方法の一例を説明する。

まず、各工程で使用する水溶液（染色液、脱色促進液、脱色液）を調製する。前記染色液は、例えば、蒸留水に１００ｍＬあたり１〜５ｍＬ，好ましくは、４ｍＬとなるように前記Ａ液を加えた後、１００ｍＬあたり０．１〜０．５ｇ、好ましくは、０．２５ｇとなるようにＣＢＢを溶かして調製できる。前記脱色促進液は、例えば、１００ｍＬあたり０．５〜３ｍＬ、好ましくは、１ｍＬとなるように前記Ｂ液又はＣ液を蒸留水に加えて調製できる。前記脱色液は、例えば、１００ｍＬあたり１〜５ｍＬ，好ましくは、４ｍＬとなるように前記Ａ液を蒸留水に加えて調製できる。

次に、例えば、図３に示すように、タンパク質電気泳動後のゲル９を前記ゲルコンテナ３に収容し、ゲルを保持するゲルコンテナ３を前記染色液に浸漬して染色工程を行う。染色液の容器は、ゲルコンテナと染色液を保持できれば特に制限されず、例えば、前記電気泳動脱色装置の本体容器を使用してもよい。染色時間は、ゲルの染色度合いによって調整できるが、例えば、約１０〜３０分とすることができる。

そして、前記染色液を除いて、前記ゲルコンテナ及び前記染色液の容器を軽く水で洗浄した後、前記脱色促進溶液を加えて、例えば、約１０〜１５分間、静置又は振とうして、脱色促進工程を行う。

最後に、例えば、図２に示すように、前記ゲルコンテナ３を、電気泳動脱色装置１０の本体容器１にセットして、前記脱色液を加え、電極プラグ６から、例えば、１００〜２００Ｖの電圧を印加し、約１０〜３０分間電気泳動して脱色工程を行う。

次に、前記キット及び前述の電気泳動脱色装置を用いた本発明のゲルの染脱色方法のその他の例を説明する。この方法は、バックグラウンドの色素の抜け具合では上述の例に及ばないが、例えば、タンパク質のバンドの確認が行えればよい等の場合に、より迅速に脱色する方法である。この方法は、前記脱色促進工程を省くことを特徴とする。

まず、前述と同様に、各工程で使用する水溶液（染色液、脱色液）を調製する。なお、この例では、前記脱色促進液は使用しない。前記染色液は、例えば、蒸留水に１００ｍＬあたり１〜５ｍＬ，好ましくは、４ｍＬとなるように前記Ａ液を加えた後、１００ｍＬあたり０．１〜０．５ｇ、好ましくは、０．２５ｇとなるようにＣＢＢを溶かして調製する。前記脱色液は、例えば、１００ｍＬあたり１〜５ｍＬ，好ましくは、４ｍＬとなるように前記Ａ液を蒸留水に加えて調製する。

次に、前述と同様に、タンパク質電気泳動後のゲルを、ゲルコンテナに収容し、前記染色液に浸漬して、染色工程を行う。染色時間は、例えば、約１０分とすることができる。

そして、前記染色液を除いて、前記ゲルコンテナ及び前記染色液の容器を軽く水で洗浄した後、前記ゲルコンテナを、例えば、図２のように、前記本体容器にセットして電気泳動を行い、脱色工程を行う。電気泳動による脱色は、例えば、２００Ｖで約１０分とすることができる。このように、この例では、脱色促進工程を省くことで脱色までの時間をより短くでき、例えば、約２０分で、バンドを確認することができる。

上記の説明のとおり、本発明のゲルの染脱色方法は、非常に迅速かつ簡便な方法であり、例えば、広範囲におよぶ分野のバイオ実験において頻繁に行われるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ネイティブＰＡＧＥ、二次元電気泳動等を含むタンパク質の電気泳動を行った後、ゲルのタンパク質を色素染色して検出する場合に非常に有用である。

以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。

同一サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動したゲルを３等分し、そのうち１つを、本発明のゲルの染脱色方法によりＣＢＢ染脱色を行い、１つを、メタノールを使用する従来の方法でＣＢＢ染脱色を行い、１つを、市販のＣＢＢ染色キットを用いて、ＣＢＢ染脱色を行った。その結果を図４に示す。図４Ａは、本発明のゲルの染脱色方法に基づき、染色を２０分行い、電気泳動脱色を１００Ｖで３０分行った結果の写真である。図４Ｂは、従来法に基づき、染色を３０分行って脱色を１２時間行った結果の写真である。図４Ｃは、製造業者の取扱説明書に従って行った結果（作業時間９０分）の写真である。図４に示すとおり、本発明のゲルの染脱色方法は、従来法よりも大幅に迅速であり、また、その染色度は、前記キットよりも優れており、従来法と同等以上であった。

次に、サンプル中のタンパク量と染脱色後の色素の濃度との比例性を、本発明の染脱色方法と従来の染脱色方法とで比較した。タンパク質濃度１０μｇ／μＬのタンパク溶液を、それぞれ、２μＬ，５μＬ、１０μＬを添加して調製した３つサンプルを使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。条件を同一とするため、同一のゲルの６レーンに２組のサンプルをアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、そのゲルを二分割し、一方を本発明のＣＢＢ染脱色方法に使用し、他方を従来のＣＢＢ染脱色方法に使用した。その結果の一例を図５Ａ及びＢに示す。図５Ａは、本発明のゲルの染脱色方法に基づき、ＣＢＢ染色工程１０分、脱色促進工程５分、電気泳動脱色１０分（２００Ｖ）行った結果の写真である。図５Ｂは、従来法に基づき、ＣＢＢ染色を１０分行い、脱色を２５％メタノール、７．５％酢酸溶液を用いて１５時間行った結果の写真である。図５Ａ及びＢに示すとおり、本発明のゲルの染脱色方法は、添加したタンパク質量と脱色後のＣＢＢの濃度の比例性が高かった。一方、従来法では、添加したタンパク質量が大きくなってもそれに見合うＣＢＢ濃度が得られず、タンパク質量とＣＢＢ濃度との比例性に劣っていた。

以上、説明したとおり、本発明のゲルの染脱色方法によれば、例えば、タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ等をしたゲルの染脱色を、迅速かつ簡便に行うことができるから、本発明は、医学、薬学、生物学、バイオサイエンス等における研究・開発分野の実験ツールとして非常に有用である。

図１は、本発明のゲルの電気泳動脱色装置の一例を示す模式図である。 図２は、本発明のゲルの電気泳動脱色装置のその他の例を示す模式図である。 図３は、本発明のゲルの電気泳動脱色装置のゲルコンテナの一例を示す模式図である。 図４は、ゲルの染脱色方法の比較をした結果の一例を示す写真である（実施例１）。 図５は、ゲルの染脱色方法の比較をした結果のその他の例を示す写真である（実施例２）。

符号の説明

１．本体容器
２．電極
３．ゲルコンテナ
４．スペーサ
５．電極板
６．電極プラグ
７．ゲル支持体
８．ゲルコンテナ枠
９．ゲル
１０．電気泳動脱色装置

Claims (10)

1. ゲルの染脱色方法であって、
   色素を含み、アルコールを含まない酸性の水溶液を用いてゲルを染色する染色工程と、
   アルコールを含まない酸性の水溶液中に配置した前記ゲルに電圧を印加し、電気泳動により前記色素を脱色する脱色工程とを含むことを特徴とするゲルの染脱色方法。
2. 前記染色工程と前記脱色工程との間に、さらに、脱色促進工程を含み、
   前記脱色促進工程が、前記染色工程後のゲルを、ｐＨ７を超え、アルコールを含まない水溶液に浸漬する工程である請求項１記載のゲルの染脱色方法。
3. 前記染色工程及び前記脱色工程における水溶液が、酢酸を含む請求項１又は２に記載のゲルの染脱色方法。
4. 前記ゲルが、ポリアクリルアミドゲルである請求項１から３のいずれか一項に記載のゲルの染脱色方法。
5. 前記ゲルが、タンパク質を含み、前記色素が、クーマシーブリリアントブルーＧ２５０及びＲ２５０、アミドブラック１０Ｂ、ポンソー３Ｒ、ニグロシン、並びに、電荷をもつ色素からなる群から選択される色素である請求項１から４のいずれか一項に記載のゲルの染脱色方法。
6. 前記脱色工程が、さらに、前記水溶液を撹拌することを含む請求項１から５のいずれか１項に記載のゲルの染脱色方法。
7. ゲルの染脱色方法に使用するゲルの電気泳動脱色装置であって、
   本体容器と、一対の電極と、ゲルコンテナとを含み、
   前記一対の電極が、前記本体容器の内部に配置され、
   前記ゲルコンテナが、ゲルを挟持する支持体を含み、前記本体容器内部の前記一対の電極間に、着脱自在に配置されるゲルの電気泳動脱色装置。
8. 前記一対の電極及び前記ゲルコンテナが、電圧の向きとゲル表面法線とがほぼ平行になるように配置される請求項７記載のゲルの電気泳動脱色装置。
9. 請求項１から６のいずれか一項に記載のゲルの染脱色方法のためのキットであって、各工程で使用する水溶液、それらの濃縮物、及び、それら成分の粉末からなる群から選択される試薬を含むゲルの染脱色キット。
10. さらに、請求項７又は８に記載のゲルの電気泳動脱色装置を含む請求項９記載のゲルの染脱色キット。

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