CN110672846A

CN110672846A - 一种风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条及免疫印迹试剂盒

Info

Publication number: CN110672846A
Application number: CN201911075814.0A
Authority: CN
Inventors: 于鹏鹤; 沈忠原; 陶占领; 王春霞; 许利明
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2019-11-06
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2020-01-10
Also published as: WO2021088532A1

Abstract

本发明涉及抗体检测技术领域，特别涉及一种风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条及免疫印迹试剂盒。该膜条的制备方法包括如下步骤：将风疹病毒用抗原稀释液进行稀释，在95～105℃条件下处理4～6min；抗原稀释液的组成为：Tris‑HCl 8vt％～12vt％，SDS 3w/v％～5w/v％，甘油15vt％～25vt％，溴酚蓝0.01w/v％～0.02w/v％，水补足；抗原稀释液不包括还原剂；对抗原进行电泳分离，将风疹病毒蛋白转印至硝酸纤维膜，封闭。本发明将纯化后的风疹病毒经凝胶电泳对目的蛋白进行再次纯化，减少因目的蛋白中杂蛋白引起的非特异性反应，提升检测的灵敏度和特异性。

Description

一种风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条及免疫印迹试剂盒

技术领域

本发明涉及抗体检测技术领域，特别涉及一种风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条及免疫印迹试剂盒。

背景技术

风疹病毒很久以前被阿拉伯医生所发现，最初被认为是麻疹病毒的一种，在1752年和1758年，德国医生de Bergen和Orlow分别首次将风疹病毒描述为一种独特的临床病原体。随后在美国和英国出现风疹的报道。1866年，Henry Veale引进风疹一词，在1881年伦敦举行的国际医学大会上，风疹被一致认为是一种新型的疾病。

风疹病毒(rubella virus)属于疱疹类病毒中的披膜病毒科风疹病毒属，是引起风疹的病原体，为RNA病毒，人是其唯一宿主。病毒经过呼吸道传播，潜伏期约2～3周，病毒增殖后进入血流引起病毒血症。风疹的临床表现类似麻疹，但较麻疹感染症状轻，合并症少，受风疹病毒感染的成年人，症状如一般的感冒，先有感冒的一般症状及耳后和枕下淋巴结肿大，随后面部出现潜红色斑丘疹并迅速遍及全身，多在1～3天内消退，预后良好。人群中感染率约为95％，常被人们忽视。孕妇在孕期6个月内感染风疹病毒，病毒可通过胎盘侵犯胎儿(垂直传播)，除引起流产、死产外，活产者大约29％表现为“先天性风疹综合征”(congenital rubella syndrome，CRS)，即出生时体重低于2.5公斤，发育迟缓；出生后全身性器官受损，先天性心脏病，畸形，耳聋、失明等；CRS患儿最常见的是白内障等眼疾患，其次是耳聋，60％有心血管系统缺损。由于孕妇感染风疹病毒后常呈现亚临床症状，因此必须借助于免疫学方法对孕妇进行风疹病毒IgM抗体的筛查，判断其是既往感染还是急性感染。目前常用的检测方法学有胶体金、酶联免疫、化学发光等，但由于各方法使用的方法学、原材料差异较大，且各方法受到的各种非特异性干扰因素不同，导致各厂家检测IgM阳性符合率只有约50％，给临床医生后续处理带来困扰，增加患者心里负担。

目前商品化的风疹病毒IgM抗体检测试剂多采用胶体金法、酶联免疫法、化学发光法等，且不同厂家使用原材料、方法学差异较大，导致各厂家检测RV-IgM阳性符合率较低，且由于类风湿因子、非特异性反应的原因，导致RV-IgM阳性检测结果中存在假阳性，给患者提供错误的检测结果；采用RV-IgM免疫印迹检测方法，可有效降低非特异性反应、类风湿因子(RF)等导致的假阳性，提升检测结果的准确性，且目前未有商品化的风疹病毒IgM抗体免疫印迹试剂盒，所以急需开发出风疹病毒IgM抗体免疫印迹试剂盒，为RV-IgM抗体检测提供一种确认方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条及免疫印迹试剂盒。该膜条或试剂盒对于风疹病毒IgM抗体的检测具有较高的灵敏度和特异性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条，其制备方法包括如下步骤：

将风疹病毒用抗原稀释液进行稀释，在95～105℃条件下处理4～6min；抗原稀释液的组成为：Tris-HCl 8vt％～12vt％，SDS 3w/v％～5w/v％，甘油15vt％～25vt％，溴酚蓝0.01w/v％～0.02w/v％，水补足；抗原稀释液不包括还原剂；

采用SDS-PAGE对所得抗原溶液进行电泳分离，得到含有风疹病毒蛋白的分离胶；

将风疹病毒蛋白转印至硝酸纤维膜，封闭后得到风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条。

本发明公开了一种免疫印迹法风疹病毒IgM抗体检测试剂盒，本试剂盒膜条上包被的抗原是细胞培养的高纯度风疹病毒经非还原胶SDS-PAGE分离出的三个结构蛋白：衣壳蛋白C和两种包膜糖蛋白E1、E2，膜条上显示三条条带包括E1-E2二聚体条带、E1-E1二聚体条带、E1条带，具有较高的灵敏度和特异性。本试剂盒通过膜条上风疹病毒三个结构蛋白E1、E2、C与样本中风疹病毒IgM抗体的反应，定性检测样本中的风疹病毒IgM抗体，用于风疹病毒急性感染的辅助诊断，或者对酶联免疫、化学发光等方法检测的风疹病毒IgM抗体样本进行复测确认。

本发明的技术方案为：细胞培养的高度纯化天然风疹病毒用非还原SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，将病毒三个结构蛋白根据分子量的大小分开，然后转印至硝酸纤维素膜上，制备成病毒抗原膜条。用辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体制备酶结合物。用TMB(四甲基联苯胺)制备显色剂。应用时将膜条放进小槽中，加入稀释后的样本与之反应，洗涤后加入酶结合物，反应结束后洗涤，加入显色剂，根据三个结构蛋白条带的显色即可判断检测结果。

作为优选，抗原稀释液的组成为：Tris-HCl 10vt％，SDS 4w/v％，甘油20vt％，溴酚蓝0.0168w/v％，水补足。

作为优选，Tris-HCl的浓度为0.8～1.2M，pH值为6.5～7.0。

优选地，Tris-HCl的浓度为1M，pH值为6.8。

作为优选，风疹病毒与抗原稀释液的体积比为(1～2)：(1～2)。

优选地，风疹病毒与抗原稀释液的体积比为1：1。

优选地，将风疹病毒用抗原稀释液进行稀释，在100℃条件下处理5min。

作为优选，电泳的电压为180～220V，时间为50～70min，点样量为0.08～0.12mL。

优选地，电泳的电压为200V，时间为60min，点样量为0.1mL。

作为优选，硝酸纤维膜为经预处理后的硝酸纤维膜，预处理为将硝酸纤维膜放在0.4～0.6M Tris-甘氨酸电泳缓冲液中浸泡5～10min。

作为优选，转印为在100～200mA的电流条件下转膜5～15min。

优选地，转印为在150mA的电流条件下转膜10min。

作为优选，封闭所采用的封闭液组成为：0.01～0.03M PBS缓冲液、0.5％～1.5％Casein、5％～15％蔗糖、0.05％～0.15％P300、0.05％～0.15％吐温20、0.05％～0.15％ADP；封闭的温度为15～25℃，封闭的时间为2～4h。

优选地，封闭所采用的封闭液组成为：0.02M PBS缓冲液、1％Casein、10％蔗糖、0.1％P300、0.1％吐温20、0.1％ADP；封闭的温度为室温，封闭的时间为2～4h。

作为优选，免疫印迹膜条长30～70mm，宽1～3mm。

在本发明提供的具体实施例中，免疫印迹膜条长50mm，宽2mm。

本发明还提供了一种检测风疹病毒IgM抗体免疫印迹试剂盒，该试剂盒包括上述风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条、酶标记抗体和底物。

在本发明中，酶标记抗体为酶标记抗人IgM抗体，酶标记抗人IgM抗体中的酶为辣根过氧化物酶，底物为TMB。

作为优选，本发明试剂盒还包括样本稀释液、洗涤液、质控样本中的一种或几种。

作为优选，样本稀释液为Tris-HCl缓冲液。

作为优选，洗涤液为Tris-HCl缓冲液。

作为优选，质控样本为RV-IgM抗体界值样本，即含有RV-IgM抗体的阳性样本。

本发明提供了一种风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条及免疫印迹试剂盒。该风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条的制备方法包括如下步骤：将风疹病毒用抗原稀释液进行稀释，在95～105℃条件下处理4～6min；抗原稀释液的组成为：Tris-HCl 8vt％～12vt％，SDS 3w/v％～5w/v％，甘油15vt％～25vt％，溴酚蓝0.01w/v％～0.02w/v％，水补足；抗原稀释液不包括还原剂；采用SDS-PAGE对所得抗原溶液进行电泳分离，得到含有风疹病毒蛋白的分离胶；将风疹病毒蛋白转印至硝酸纤维膜，封闭后得到风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条。与现有技术相比，本发明优点如下：

目前商品化的风疹病毒IgM抗体检测试剂多采用胶体金法、酶联免疫法、化学发光法等，且不同厂家使用原材料差异较大，原材料位点选择及纯度直接影响检测结果，本发明采用天然风疹病毒进行转膜，保证原材料抗原位点的完整性及蛋白纯度，降低因为原材料原因导致的漏检及假阳性问题，保证检测结果的灵敏度及特异性。

本发明将纯化后的风疹病毒经凝胶电泳对目的蛋白进行再次纯化，减少因目的蛋白中杂蛋白引起的非特异性反应，提升检测的灵敏度和特异性。在常规风疹病毒IgM抗体检测试剂易受类风湿因子、HAMA抗体干扰导致假阳性，本发明采用天然风疹病毒进行转膜，与样本进行反应，酶结合物采用HRP标记鼠抗人IgM，该模式可避免干扰，提升试剂特异性。

本发明转膜时用的抗原稀释液中去除了还原剂，还原剂会破坏风疹病毒蛋白结构，影响试剂盒性能。

本发明转膜时采用半干转法，与湿转法相比，操作简便，效率高，半干转常温即可进行，转膜时间仅需5-15分钟。

附图说明

图1为BIOMEX血清转化盘SCP-RUB-001检测结果；

图2为BIOMEX血清转化盘SCP-RUB-002检测结果；

图3为BIOMEX血清转化盘SCP-RUB-003检测结果；

图4为实施例1试剂盒抗原稀释液中有无还原剂的对比检测结果。

具体实施方式

本发明公开了一种风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条及免疫印迹试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种检测风疹病毒IgM抗体免疫印迹试剂盒，包括转印有经电泳分离的天然风疹病毒蛋白的免疫印迹膜条。

患者感染风疹病毒后血清中会产生相应抗体，本发明采用免疫印迹法，将待测样品与发明所述转印有经电泳分离的风疹病毒蛋白的免疫印迹膜条反应，待测样本中所含RV抗体会与膜条中蛋白抗原相结合，然后经酶联免疫反应出现显色区带，与质控带比较，进行结果判定，进而对患者感染情况进行分析。

其中抗原稀释液是一种溴酚蓝为染料，2倍浓缩的蛋白上样缓冲液。

经电泳分离后的蛋白需要利用电泳分离的蛋白质转移到固体载体上，本发明所述转移方法为半干转法(伯乐蛋白转印系统)，本发明所述固体支持物为硝酸纤维素膜。

在本发明中所述酶标记抗体为酶标记抗人IgM抗体，其中所述酶为辣根过氧化物酶，酶底物为TMB。

作为优选，本发明所述试剂盒还可以包括样本稀释液、洗涤液、质控样本中的一种或几种。

在本发明中，样本稀释液为Tris-HCl缓冲液。

在本发明中，所述洗涤液为Tris-HCl缓冲液。

在本发明中，所述质控样本为RV-IgM抗体界值样本。

本发明提供的风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条及免疫印迹试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。其中，风疹病毒抗原购自美国meridian公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条的制备

1、抗原稀释液配制：

取1M pH6.8 Tris-HCl 10mL，SDS 4g，甘油20mL，溴酚蓝0.0168g，加入纯化水定容至100mL；

2、将天然风疹病毒抗原用抗原稀释液1:1稀释，经100℃，处理5分钟，置4℃冷却后备用。

3、梯度不连续电泳(风疹病毒蛋白电泳分离)

a、分离胶制备：量取纯化水1.9mL、30％丙乙酰胺1.7mL、pH8.81.5M Tris-HCl1.3mL、10％SDS 0.05mL、10％过硫酸铵0.05mL、TEMED 0.002mL。

b、灌胶：用量筒量取7mL，用移液器吸取1mL纯化水，加到胶液上面密封，待分离胶凝固后，去除纯化水。

c、制备浓缩胶：量取纯化水2.1mL、30％丙乙酰胺0.5mL、pH 6.8 1.5M Tris-HCl0.38mL、10％SDS 0.03mL、10％过硫酸铵0.03mL、TEMED 0.003mL。

d、灌胶：用移液器吸取3mL，插入1.5mm规格梳子，待浓缩胶凝固。

e、电泳：将浓缩胶置于垂直电泳槽，注入电泳缓冲液，用移液器加入用抗原稀释液稀释的风疹病毒抗原样品液0.1mL，在200V恒压下电泳1h。

4、风疹病毒蛋白转印

1、硝酸纤维膜处理：将硝酸纤维膜放在转膜缓冲液(0.5M Tris-甘氨酸)中浸泡，浸泡时间5-10min。

2、铺膜：先铺阳极滤纸3层，然后将硝酸纤维膜与滤纸上沿对齐，之后铺分离胶，最后再铺阴极滤纸3层。

3、转印：放入转膜仪，恒流150mA转膜10min。

4、封闭：将转移好的膜条，放入膜条封闭液中(0.02M PBS缓冲、1％Casein、10％蔗糖、0.1％P300、0.1％吐温20、0.1％ADP)，室温封闭2-4h。

5、免疫印迹膜条制备与储存：用切膜机将膜条切割为长50mm，宽2mm左右膜条，在2-8℃储存。

实施例2：本发明所述试剂盒

一种检测风疹病毒IgM抗体免疫印迹试剂盒，包括实施例1制备的免疫印迹膜条，每条长50mm，宽2mm左右。

实施例3：本发明所述试剂盒

一种检测风疹病毒IgM抗体免疫印迹试剂盒，包括实施例1制备的免疫印迹膜条、酶标记抗体和底物。

实施例4：本发明所述试剂盒

一种检测风疹病毒IgM抗体免疫印迹试剂盒，包括实施例1制备的免疫印迹膜条、酶标记抗体、底物、样本稀释液、洗涤液、质控样本和说明书。

实施例5：本发明所述试剂盒检测风疹病毒IgM抗体

实验材料：

应用正确医用技术收集血清或血浆样本20μL，样本收集后在室温放置不可超过8小时；如果不在8小时内检测需将样本放置在2～8℃的冰箱中；若需48小时以上保存或运输，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。

实验方法：

步骤1、使用镊子将所需数量的免疫印迹膜条放入反应容器中，加入2mL样本稀释液和待检样本20μL(每次实验均需进行质控样本检测)，置摇床上37℃摇动孵育1h；

步骤2、除去反应容器中液体，加入2mL洗涤液，洗涤5min，重复进行4次；

步骤3、在反应容器中加入2mL酶标记抗体，置摇床上37℃摇动孵育1h；

步骤4、除去反应容器中液体，加入2mL洗涤液，洗涤5min，重复进行4次；

步骤5、在反应容器中加入1mL底物，置摇床上室温摇动15-20min，显色；

步骤6、待质控样本阳性区带显色清晰后，除去反应容器中液体，用纯化水洗涤3次，终止反应，取出免疫印迹膜条，放置在吸水纸上，干燥后将待测样本与质控样本条带对照，进行结果判定。

采用本发明免疫印迹试剂盒检测BIOMIX血清转化盘，结果如下：

1、SCP-RV-001(图1)：1-5号膜条为空白条，6-15号样本条显现出蛋白条带，且主要以E1蛋白条带为主。蛋白条带结果与BIOMIX公司自带结果(表1)对比发现，免疫印迹蛋白条带检出时间早于商业化试剂盒阳性检出时间，持续检出时间长于商业化试剂盒持续检出时间。

表1

2、SCP-RV-002(图2)：1-5号样本条无条带出现，6-11号样本主要显现条带为E1，且条带亮度随时间逐渐降低，12，13号样本E1蛋白条带较弱，结果揭示出E1蛋白可能随感染时间的增加而逐渐降低，WB蛋白条带与血清盘自带结果(表2)对比发现，免疫印迹蛋白条带出现时间与商业化试剂盒检测一致，但蛋白存在持续时间长于商业化试剂盒阳性检测时间。

表2

3、SCP-RV003(图3)：1-4号样本无条带出现，5号样本开始有E1蛋白条带显现，6-10号样本具有明显的E1条带，11，12号样本E1蛋白条带较弱，13-20号样本无蛋白条带出现。该结果与血清盘标定结果相比(表3)，蛋白条带出现时间及蛋白变化规律与商业试剂盒保持一致。

表3

通过BIOMIX血清转化盘检测，本发明风疹病毒IgM抗体检测试剂盒灵敏度优于主流商品化试剂。

对比例1

在RV抗原进行跑胶前预处理过程中，对抗原稀释液中有无还原剂进行验证：抗原稀释液中含有还原剂DTT(1号膜条)，抗原稀释液中不含有还原剂DTT(2号膜条)，转膜完毕后，用RV-IgM抗体阳性样本进行孵育反应，两种膜条检测结果差异较大，见附图4。

结果显示，2号膜条显色会出现明显的E1及二聚体蛋白条带，1号膜条无条带出现。从检测结果得知，还原剂可能会破坏风疹病毒蛋白与RV-IgM抗体的结合位点，因此转膜时抗原稀释液中不能含有还原剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

将风疹病毒用抗原稀释液进行稀释，在95～105℃条件下处理4～6min；所述抗原稀释液的组成为：Tris-HCl 8vt％～12vt％，SDS 3w/v％～5w/v％，甘油15vt％～25vt％，溴酚蓝0.01w/v％～0.02w/v％，水补足；所述抗原稀释液不包括还原剂；

2.根据权利要求1所述的风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条，其特征在于，所述抗原稀释液的组成为：Tris-HCl 10vt％，SDS 4w/v％，甘油20vt％，溴酚蓝0.0168w/v％，水补足。

3.根据权利要求1所述的风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条，其特征在于，所述Tris-HCl的浓度为0.8～1.2M，pH值为6.5～7.0。

4.根据权利要求1所述的风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条，其特征在于，所述风疹病毒与所述抗原稀释液的体积比为(1～2)：(1～2)。

5.根据权利要求1所述的风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条，其特征在于，所述电泳的电压为180～220V，时间为50～70min，点样量为0.08～0.12mL。

6.根据权利要求1所述的风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条，其特征在于，所述硝酸纤维膜为经预处理后的硝酸纤维膜，所述预处理为将硝酸纤维膜放在0.4～0.6MTris-甘氨酸电泳缓冲液中浸泡5～10min。

7.根据权利要求1所述的风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条，其特征在于，所述转印为在100～200mA的电流条件下转膜5～15min。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条，其特征在于，所述封闭所采用的封闭液组成为：0.01～0.03M PBS缓冲液、0.5％～1.5％Casein、5％～15％蔗糖、0.05％～0.15％P300、0.05％～0.15％吐温20、0.05％～0.15％ADP；封闭的温度为15～25℃，封闭的时间为2～4h。

9.一种检测风疹病毒IgM抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至8中任一项所述的风疹病毒IgM抗体检测免疫印迹膜条、酶标记抗体和底物。

10.根据权利要求9所述的检测风疹病毒IgM抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液、洗涤液、质控样本中的一种或几种。