CN111323594A - 一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法 - Google Patents

一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111323594A
CN111323594A CN202010103238.2A CN202010103238A CN111323594A CN 111323594 A CN111323594 A CN 111323594A CN 202010103238 A CN202010103238 A CN 202010103238A CN 111323594 A CN111323594 A CN 111323594A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rabbit
antigen
protein
antibody
detected
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010103238.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111323594B (zh
Inventor
易汪雪
华权高
张芳
殷婷子
舒芹
赵愿安
张雪娇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cusabio Biotech Co ltd
Original Assignee
Cusabio Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cusabio Biotech Co ltd filed Critical Cusabio Biotech Co ltd
Priority to CN202010103238.2A priority Critical patent/CN111323594B/zh
Publication of CN111323594A publication Critical patent/CN111323594A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111323594B publication Critical patent/CN111323594B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/245—Escherichia (G)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法：制备含靶标蛋白的阳性待测样本；将所述阳性待测样本按照蛋白大小进行电泳分离，得到分离出的特定大小的待测蛋白；制备载有所述待测蛋白的抗原固相载体；将所述抗原固相载体浸于封闭液中，得到封闭后的抗原固相载体；将所述封闭后的抗原固相载体与兔抗血清进行孵育结合，得到孵育后的抗原抗体复合物固相载体；将所述抗原抗体复合物固相载体与二抗进行孵育结合，得到抗原抗体酶标记复合物的固相载体；然后使用ECL进行酶显色检测。本发明所述方法显著提高了所述兔抗血清的抗体特异性检测结果的准确性，从而使得所述蛋白质免疫印迹检测方法可以准确的反映阳性待测蛋白实验结果。

Description

一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法。
背景技术
蛋白质免疫印迹法(Western blot)是由Harry Towbin实验室发明创造，成为基础科学研究和临床实验中最常用的蛋白质分析工具。其具体方法是根据蛋白质分子量、电荷和构象不同，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离天然蛋白质或变性蛋白质；凝胶上按照大小分离的蛋白质，常用湿转或半干转的方式转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜、聚偏氟乙烯膜)上，固相载体以非共价键方式吸附该蛋白质，并能保持电泳分离多肽的生物学活性不变；其中通常使用5％脱脂奶粉、1％牛血清白蛋白(BSA)和1％酪蛋白等溶液作为封闭液进行封闭；使用含有1％表面活性剂Tween-20的PBS缓冲液进行洗涤，以防止一抗与固相载体的非特异性结合，同时避免由于洗涤不干净造显色背景过深现象；被转移到固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应的抗体形成抗原-抗体复合物，再与酶或同位素标记的第二抗体结合，经底物显色或放射自显影以检测电泳分离的目的蛋白。
其中需要说明的是，抗体的质量稳定性、重复性、特异性一直是抗体制备领域中的壁垒，在多克隆抗体领域更为突出。通常，对抗体特异性影响较大的是抗体的交叉反应。在特异性正常情况下，抗体只能结合唯一的一种蛋白，但如果抗体本身出现问题，就可能会结合其它非目标蛋白，从而引起交叉反应。而更为困难的是，这种结合其它非目标蛋白的非特异结合很难被鉴定出来。
目前制备抗体的各生产厂家使用的实验兔都是普通饲养环境下饲养，通常注射有兔瘟疫苗制剂(主要是兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂或兔大肠杆菌疫苗制剂)。因此，在制备兔抗血清过程中，所使用的家兔在经过特定抗原免疫之前兔血清中可能已经含有了针对兔瘟疫苗制剂的抗体，而这些抗体可能会和各种待测样本中的某些蛋白发生交叉反应，产生非特异性结合，而这种结合给抗体产品的质量控制造成了很大干扰，非常容易引起假阳性鉴定，使得抗体产品的可信性不足。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法。本发明通过相关实验证实了通常所得到的兔抗血清中存在一些识别非靶标蛋白的抗体。具体而言，在进行特定抗原免疫之前，对于那些事先经过兔瘟疫苗制剂，即兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和/或兔大肠杆菌疫苗制剂，在免疫试验兔的兔抗血清进行抗体特异性蛋白质免疫印迹检测中，通过将兔瘟疫苗制剂，即兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和/或兔大肠杆菌疫苗制剂，作为该检测方法中的封闭添加剂来制备所述封闭液，从而将针对兔瘟疫苗制剂免疫所产生的非特异抗原抗体结合信号在检测前进行提前封闭，在一定程度上排除了所述兔抗血清由于事先免疫了所述兔瘟疫苗制剂本身所引起的假阳性结果，显著提高了所述兔抗血清的抗体特异性检测结果的准确性，从而使得所述蛋白质免疫印迹检测方法可以准确的反映阳性待测蛋白实验结果。
用于实现上述目的的技术方案如下：
本发明提供一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，所述方法包括：制备含靶标蛋白的阳性待测样本；将所述阳性待测样本(即：含靶标蛋白的阳性待测样本)按照蛋白大小进行电泳分离，得到分离出的特定大小的待测蛋白；制备载有所述待测蛋白(即：分离出的特定大小的待测蛋白)的抗原固相载体；将所述载有所述待测蛋白的抗原固相载体浸于封闭液中，得到封闭后的抗原固相载体；将所述封闭后的抗原固相载体与兔抗血清进行孵育结合，得到孵育后的抗原抗体复合物固相载体；将所述抗原抗体复合物固相载体(孵育后的抗原抗体复合物固相载体)与二抗进行孵育结合，得到抗原抗体酶标记复合物的固相载体；对所述抗原抗体酶标记复合物的固相载体使用ECL进行酶显色检测，呈现阳性结果；其中，所述兔抗血清经过特定靶标抗原免疫，并含有特异性识别靶标蛋白的抗体；所述二抗经HRP标记，并异性识别所述兔抗血清；
其特征在于，所述封闭液包含兔瘟疫苗制剂。
在一个实施方案中，本发明所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法中，所述兔瘟疫苗制剂选自兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂或兔大肠杆菌疫苗制剂中的一种或两种以上；
优选地，所述兔瘟疫苗制剂包含兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂；
优选地，所述兔瘟疫苗制剂包含所述兔大肠杆菌疫苗制剂。
在一个实施方案中，本发明所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法中，当通过以下步骤(即，在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和所述兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂进行免疫)制备所述兔抗血清时，所述封闭液包含所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和所述兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂，所述步骤包括：在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和所述兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂进行免疫；
优选地，当通过以下步骤(即，在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过兔大肠杆菌疫苗制剂进行免疫)制备所述兔抗血清时，所述封闭液包含所述兔大肠杆菌疫苗制剂，所述步骤包括：在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过兔大肠杆菌疫苗制剂进行免疫。
在一个实施方案中，本发明所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法中，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和1％兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂；
优选地，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、1％兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和5％脱脂奶粉。
在一个实施方案中，本发明所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法中，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔大肠杆菌疫苗制剂；
优选地，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔大肠杆菌疫苗制剂和5％脱脂奶粉。
在一个实施方案中，本发明所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法中，所述将所述载有所述待测蛋白的抗原固相载体浸于封闭液中，得到封闭后的抗原固相载体，包括：将载有所述待测蛋白的抗原固相载体采用1×PBST洗涤4～6min，后浸于温度为25℃的所述封闭液中振荡孵育2～3h，得到所述封闭后的抗原固相载体；
优选地，所述固相载体(该固相载体包括所述载有所述待测蛋白的抗原固相载体、所述封闭后的抗原固相载体以及所述孵育后的抗原抗体复合物固相载体中含有的固相载体)选自硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。
在一个实施方案中，本发明所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法中，所述制备含靶标蛋白的阳性待测样本包括：提取细胞上清液和/或提取组织上清液；
优选地，所述制备载有所述待测蛋白的抗原固相载体，包括：将所述待测蛋白进行转膜，得到所述载有所述待测蛋白的固相载体。
在一个实施方案中，本发明所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法中，所述兔抗血清能够与所述待测蛋白结合；
优选地，所述将所述封闭后的抗原固相载体与所述兔抗血清进行孵育结合，包括以下步骤：
将所述封闭后的抗原固相载体浸于含有所述兔抗血清的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1～1.5h或在温度为4℃下过夜；
优选地，所述含有所述兔抗血清的稀释液包含所述兔抗血清和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述兔抗血清和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:5000～50000，优选1:20000。
在一个实施方案中，本发明所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法中，所述将所述抗原抗体复合物固相载体与所述二抗进行孵育结合，包括以下步骤：
(1)将所述抗原抗体复合物固相载体采用1×PBST振荡洗涤3～4次，每次洗涤10min；
(2)将步骤(1)得到的所述抗原抗体复合物固相载体浸于含有所述二抗的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1～1.5h；优选地，所述含有所述二抗的稀释液包含所述二抗和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述二抗和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:5000～50000，优选1:20000。
本发明还提供本发明所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，所述待测样本来源于动物细胞、动物组织、植物细胞和植物组织。
在本发明中，将试验兔在进行特定抗原免疫之前进行了兔瘟疫苗制剂的注射，即所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和兔大肠杆菌疫苗制剂，以保证试验兔的正常生长。在进行特定抗原免疫之后，在一定周期内获取到阳性兔抗血清样本，然后进行本发明所述的兔抗血清和阳性待测样本进行蛋白质免疫印迹来验证所述兔抗血清的抗体特异性，本发明所设置的实验组别为：(1)按体积百分比计，包含5％的脱脂奶粉的封闭液，(2)按体积百分比计，包含1％的兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和1％的兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂的封闭液，(3)按体积百分比计，包含5％的脱脂奶粉和1％的兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和1％的兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂封闭液，(4)按体积百分比计，包含1％的兔大肠杆菌疫苗制剂的封闭液，(5)按体积百分比计，包含5％的脱脂奶粉和1％的兔大肠杆菌疫苗制剂的封闭液。其中，如果检测方法中所使用的封闭液中仅包含5％的脱脂奶粉时，检测结果显示所发生的非特异结合所占的比率为95％以上；而如果检测方法中所使用的封闭液中包含5％的脱脂奶粉以及所述浓度的兔瘟疫苗制剂时，对阳性抗原固相载体进行同时封闭，则检测结果显示发生的非特异结合所占的比率下降了60～80％。
具体而言，本发明所述提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法所使用的试剂包括：RIPA蛋白抽提试剂，蛋白酶抑制剂PMSF，蛋白Marker，6×加样缓冲液，去离子水，浓度为30％的丙烯酰胺溶液，pH为8.8的Tris-HCl缓冲液，pH为6.8的Tris-HCl缓冲液，浓度为10％的过硫酸铵(APS)溶液，浓度为10％的十二烷基磺酸钠溶液，四甲基乙二胺，异丙醇，蛋白质电泳缓冲液，转膜缓冲液，PBS缓冲液，PBST缓冲液，浓度为5％的脱脂奶粉溶液，发光底物，显影液，定影液。
本发明所述提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法包括以下步骤：
一、制备含靶标蛋白的阳性待测样本：将所述RIPA蛋白抽提试剂进行预冷后与所述蛋白酶抑制剂PMSF(需要时现场进行配制)混合，得到混合物；在该混合物中添加浓度为0.1M的PMSF(需要时现场进行配制)母液至得到的PMSF(需要时现场进行配制)母液的终浓度为1mM，得到RIPA强蛋白裂解液；将待测细胞计数，当细胞数量为1×107时，向待测细胞中添加所述RIPA强蛋白裂解液1ml，然后用枪头吹打使细胞充分悬起，并超声破碎细胞，得到待测细胞液；将该待测细胞液在冰上孵育20min，然后于温度为4℃、离心速率为12000rpm下进行离心15～25min；离心完成后取上清液，得到所述阳性待测样本(细胞上清液)，并使用Bradford法进行浓度检测；
或者，将所述RIPA蛋白抽提试剂进行预冷后与所述蛋白酶抑制剂PMSF(需要时现场进行配制)混合，得到混合物；在该混合物中添加浓度为0.1M的PMSF(需要时现场进行配制)母液至得到的PMSF(需要时现场进行配制)母液的终浓度为1mM，得到RIPA强蛋白裂解液；用液氮研磨组织，然后在该组织中添加所述RIPA强蛋白裂解液(所述组织的质量和所述RIPA强蛋白裂解液的体积的比例为0.1g:1mL)，以然后用枪头吹打使组织充分悬起，并超声破碎细胞，得到待测组织液；将该待测组织液在冰上孵育20min，然后于温度为4℃、离心速率为12000rpm下进行离心15～25min；离心完成后取上清液，得到所述阳性待测样本(组织上清液)，并使用Bradford法进行浓度检测；
二、将所述阳性待测样本按照蛋白大小进行电泳分离，得到分离出的特定大小的待测蛋白，具体步骤包括：
1、制备聚丙烯酰胺凝胶
(1)将用于灌制聚丙烯酰胺凝胶的两个玻璃板固定；
(2)配制浓度为12％的分离胶溶液10mL，该分离胶溶液中包含：去离子水3.3mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液4mL，浓度为1.5mol/L、pH为8.8Tris-HCl缓冲液2.5mL，浓度为10％的APS溶液100μL，浓度为10％的SDS溶液100μL，TEMED 6μL；
(2)迅速在步骤(1)中所固定的两个玻璃板之间的间隙中添加所述分离胶溶液，并留出灌注以下步骤中所制备的浓缩胶溶液所需的空间，然后在所述分离胶溶液上覆盖一层异丙醇，置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在温度为37℃下放置，加快凝胶凝固；待该分离胶溶液聚合完全后，去除所得到的分离胶表面的液体，并用吸水滤纸的边缘吸净所残留的液体；
(3)配制浓度为5％的浓缩胶溶液3mL，该浓缩胶溶液中包含：去离子水2.7mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液670μL，浓度为1.5mol/L、pH为6.8Tris-HCl缓冲液500μL，浓度为10％的APS溶液40μL，浓度为10％的SDS溶液140μL，TEMED 6μL；
(4)迅速在步骤(2)得到的分离胶上直接灌注步骤(3)得到的浓缩胶溶液，不要产生气泡，立即垂直插入梳子,置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在37℃放置，加快凝胶凝固；待该浓缩胶溶液聚合完全后，得到载有聚丙烯酰胺凝胶的制胶装置，垂直移除梳子，露出笔直的点样孔，将该丙烯酰胺凝胶固定于电泳装置；
2、在点样孔中进行点样：向所述电泳装置的电泳槽内添加蛋白质电泳缓冲液，直至浸没步骤(4)得到的点样孔。当进行多克隆抗体检测时，将上述阳性待测样本与2×加样缓冲液按照1:1体积比进行混合或与6×加样缓冲液按照5:1体积比进行混合，调整10μL上样蛋白溶液(质量为10-30μg左右)，将得到的混合物用沸水煮沸5min，使蛋白完全变性，然后用移液枪慢慢将上述10μL混合物添加至所述电泳装置的样品槽中，并同时在另一样品槽中添加预染Maker 10μL(商购)；当进行哺乳动物、昆虫上清检测时，将上述待测样本30μL和6×加样缓冲液6μL混合，将该得到的混合物后用沸水煮沸5min，然后用移液枪慢慢将上述10μL混合物添加至所述电泳装置的样品槽中，后向样品槽中添加阳性对照蛋白和阴性对照蛋白，同时在另一样品槽中添加预染Maker 10μL；
3、然后将电泳仪连接到电泳仪电源上，检查正负极正确相连；打开电源，调整电泳仪电源为80V，开始电泳。按照恒压80V电泳30min，后将电泳仪电源电压调至100-120V直至溴酚蓝加样缓冲液在聚丙烯酰胺凝胶中迁移至聚丙烯酰胺凝胶底部，关闭电源，停止电泳，实现阳性待测样本的蛋白完全分离开，得到载有阳性待测蛋白的聚丙烯酰胺凝胶。
三、将所述待测蛋白进行转膜，得到所述载有所述待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)：
1、取出上述聚丙烯酰胺凝胶后去掉上层所述浓缩胶，取下层分离胶，完全浸入转膜缓冲液中；
2、将聚偏二氟乙烯膜浸泡于异丙醇中1min，以进行膜上正电基团的活化(硝酸纤维素膜无需进行此操作)，后将该聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)浸入转膜缓冲液中；将6片转印滤纸浸入该转膜缓冲液中，且将聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)、转印滤纸均剪裁为与上述聚丙烯酰胺凝胶相同尺寸，均为6cm×8cm；
3、用上述转膜缓冲液冲洗石墨电极，并在该石墨电极上铺三张滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)；然后在三张转印滤纸上覆盖所述分离胶(在该聚丙烯酰胺凝胶上滴少许上述转膜缓冲液)；在该聚丙烯酰胺凝胶上覆盖上述处理得到的聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)，并在该聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)滴少许上述转膜缓冲液；最后在该聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)上铺三张转印滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)。这个过程中，使用涂棒避免各层之间产生气泡，并避免两端的转印滤纸相接触而造成短路；
4、连接电极，选择电泳仪电源上的恒流模式，以1.5mA/cm2凝胶体积进行1.5h，得到载有所述待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)。
四、将载有待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)采用1×PBST洗涤4～6min，后浸于温度为25℃的所述封闭液中振荡孵育2～3h，得到封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)。
所述封闭液包含兔瘟疫苗制剂；所述兔瘟疫苗制剂选自兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂或兔大肠杆菌疫苗制剂中的一种或两种以上；或者所述兔瘟疫苗制剂包含兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂；或者所述兔瘟疫苗制剂包含所述兔大肠杆菌疫苗制剂。
当所述兔抗血清的制备步骤包括：在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和所述兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂进行免疫，则所述封闭液包含所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和所述兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂。
当所述兔抗血清的制备步骤包括：在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过兔大肠杆菌疫苗制剂进行免疫，则所述封闭液包含所述兔大肠杆菌疫苗制剂。
所述封闭液包含1％兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和1％兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂；
优选地，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、1％兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和5％脱脂奶粉；
优选地，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔大肠杆菌疫苗制剂；
优选地，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔大肠杆菌疫苗制剂和5％脱脂奶粉。
五、将所述封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)与所述兔抗血清进行孵育结合，得到所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)：
将所述封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜(或抗原硝酸纤维素膜)浸于含有所述兔抗血清的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1～1.5h或在温度为4℃下过夜；优选地，所述含有所述兔抗血清的稀释液包含：所述兔抗血清和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述兔抗血清和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:5000～50000，优选1:20000。
六、将所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)与所述二抗进行孵育结合，得到所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)：(1)将所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)采用1×PBST振荡洗涤3～4次，每次洗涤10min；
(2)将步骤(1)得到的所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)浸于含有所述二抗的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1～1.5h；优选地，所述含有所述二抗的稀释液包含所述二抗和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述二抗和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:5000～50000，优选1:20000。
以上步骤中，所述兔抗血清经过特定靶标抗原免疫，并含有特异性识别靶标蛋白的抗体；所述二抗经HRP标记，并异性识别所述兔抗血清。
七、对所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)进行显色检测：
1、将A、B发光液(商购)等比例稀释混合均匀(各500ml)，得到发光混合液；将所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)平铺于保鲜膜上，将所述发光混合液均匀滴至所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)上，在其上覆盖保鲜膜，避光静置3min；打开上述保鲜膜，用滤纸去除上述所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)表面的残留液体，后将所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)置于保鲜膜内，避免气泡与皱褶；
2、将上述步骤1得到的保鲜膜(包覆有所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜))平铺并固定于暗盒中；将该暗盒至于暗室中，并取出胶片迅速置于暗盒内膜上，并避免产生重影；关闭暗盒(一般曝光时间为1min，若条带较弱，则可延长压片时间或者过夜或采用增强显影液重新进行显影)；后打开该暗盒，取出胶片立即完全浸入显影液中直至显出可见条带；取出胶片，清水漂洗后浸入至定影液中2min；取出胶片，用水冲洗后烘干；在该烘干的胶片上标示出标记，并依此标记来记录待测样本的详细信息(兔编号、基因编号、基因名、理论大小、样本、抗体浓度、稀释比例)。
本发明所述检测方法，通过将所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂或兔大肠杆菌疫苗制剂中的一种或两种以上来作为蛋白质免疫印迹检测方法中的封闭添加剂(所述封闭液中使用的封闭添加剂)，来排除所述兔抗血清中由于注射兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和兔大肠杆菌疫苗制剂的导致的非特异性结合信号所引起的假阳性结果，从而大大提升所述兔抗血清的抗体特异性验证结果的可信性；通过采用本发明所述检测方法，检测结果显示所发生的非特异结合所占的比率下降了60～80％。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了通过本发明所述提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法所得到的蛋白质免疫印迹验证结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
以下实施例中使用的试剂，即：RIPA蛋白抽提试剂、蛋白酶抑制剂PMSF(需要时现场进行配制)，蛋白Marker、6×加样缓冲液、去离子水、浓度为30％的丙烯酰胺溶液、pH为8.8的Tris-HCl缓冲液、pH为6.8的Tris-HCl缓冲液、浓度为10％的过硫酸铵(APS)溶液、浓度为10％的十二烷基磺酸钠溶液、四甲基乙二胺、异丙醇、蛋白质电泳缓冲液、转膜缓冲液、PBS缓冲液、PBST缓冲液、浓度为5％的脱脂奶粉溶液、发光底物、显影液、定影液，均为商购产品。
实施例1：本发明所述提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法
一、制备含靶标蛋白的阳性待测样本：将所述RIPA蛋白抽提试剂进行预冷后与所述蛋白酶抑制剂PMSF(需要时现场进行配制)混合，得到混合物；在该混合物中添加浓度为0.1M的PMSF(需要时现场进行配制)母液至得到的PMSF(需要时现场进行配制)母液的终浓度为1mM，得到RIPA强蛋白裂解液；将待测细胞计数，当细胞数量为1×107时，向待测细胞中添加所述RIPA强蛋白裂解液1ml，然后用枪头吹打使细胞充分悬起，并超声破碎细胞，得到待测细胞液；将该待测细胞液在冰上孵育20min，然后于温度为4℃、离心速率为12000rpm下进行离心15min；离心完成后取上清液，得到所述阳性待测样本(细胞上清液)，并使用Bradford法进行浓度检测；
二、将所述阳性待测样本按照蛋白大小进行电泳分离，得到分离出的特定大小的待测蛋白，具体步骤包括：
1、制备聚丙烯酰胺凝胶
(1)将用于灌制聚丙烯酰胺凝胶的两个玻璃板固定；
(2)配制浓度为12％的分离胶溶液10mL，该分离胶溶液中包含：去离子水3.3mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液4mL，浓度为1.5mol/L、pH为8.8Tris-HCl缓冲液2.5mL，浓度为10％的APS溶液100μL，浓度为10％的SDS溶液100μL，TEMED 6μL；
(2)迅速在步骤(1)中所固定的两个玻璃板之间的间隙中添加所述分离胶溶液，并留出灌注以下步骤中所制备的浓缩胶溶液所需的空间，然后在所述分离胶溶液上覆盖一层异丙醇，置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在温度为37℃下放置，加快凝胶凝固；待该分离胶溶液聚合完全后，去除所得到的分离胶表面的液体，并用吸水滤纸的边缘吸净所残留的液体；
(3)配制浓度为5％的浓缩胶溶液3mL，该浓缩胶溶液中包含：去离子水2.7mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液670μL，浓度为1.5mol/L、pH为6.8Tris-HCl缓冲液500μL，浓度为10％的APS溶液40μL，浓度为10％的SDS溶液140μL，TEMED 6μL；
(4)迅速在步骤(2)得到的分离胶上直接灌注步骤(3)得到的浓缩胶溶液，不要产生气泡，立即垂直插入梳子,置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在37℃放置，加快凝胶凝固；待该浓缩胶溶液聚合完全后，得到载有聚丙烯酰胺凝胶的制胶装置，垂直移除梳子，露出笔直的点样孔，将该丙烯酰胺凝胶固定于电泳装置；
2、在点样孔中进行点样：向所述电泳装置的电泳槽内添加蛋白质电泳缓冲液，直至浸没步骤(4)得到的点样孔。当进行多克隆抗体检测时，将上述阳性待测样本与2×加样缓冲液按照1:1体积比进行混合或与6×加样缓冲液按照5:1体积比进行混合，调整10μL上样蛋白溶液(质量为10-30μg左右)，将得到的混合物用沸水煮沸5min，使蛋白完全变性，然后用移液枪慢慢将上述10μL混合物添加至所述电泳装置的样品槽中，并同时在另一样品槽中添加预染Maker 10μL(商购)；当进行哺乳动物、昆虫上清检测时，将上述待测样本30μL和6×加样缓冲液6μL混合，将该得到的混合物后用沸水煮沸5min，然后用移液枪慢慢将上述10μL混合物添加至所述电泳装置的样品槽中，后向样品槽中添加阳性对照蛋白和阴性对照蛋白，同时在另一样品槽中添加预染Maker 10μL；
3、然后将电泳仪连接到电泳仪电源上，检查正负极正确相连；打开电源，调整电泳仪电源为80V，开始电泳。按照恒压80V电泳30min，后将电泳仪电源电压调至100-120V直至溴酚蓝加样缓冲液在聚丙烯酰胺凝胶中迁移至聚丙烯酰胺凝胶底部，关闭电源，停止电泳，实现阳性待测样本的蛋白完全分离开，得到载有阳性待测蛋白的聚丙烯酰胺凝胶。
三、将所述待测蛋白进行转膜，得到所述载有所述待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜：
1、取出上述聚丙烯酰胺凝胶后去掉上层所述浓缩胶，取下层分离胶，完全浸入转膜缓冲液中；
2、将聚偏二氟乙烯膜浸泡于异丙醇中1min，以进行膜上正电基团的活化，后将该聚偏二氟乙烯膜浸入转膜缓冲液中；将6片转印滤纸浸入该转膜缓冲液中，且将聚偏二氟乙烯膜、转印滤纸均剪裁为与上述聚丙烯酰胺凝胶相同尺寸，均为6cm×8cm；
3、用上述转膜缓冲液冲洗石墨电极，并在该石墨电极上铺三张滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)；然后在三张转印滤纸上覆盖所述分离胶(在该聚丙烯酰胺凝胶上滴少许上述转膜缓冲液)；在该聚丙烯酰胺凝胶上覆盖上述处理得到的聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)，并在该聚偏二氟乙烯膜(或硝酸纤维素膜)滴少许上述转膜缓冲液；最后在该聚偏二氟乙烯膜上铺三张转印滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)。这个过程中，使用涂棒避免各层之间产生气泡，并避免两端的转印滤纸相接触而造成短路；
4、连接电极，选择电泳仪电源上的恒流模式，以1.5mA/cm2凝胶体积进行1.5h，得到载有所述待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜。
四、将载有待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜采用1×PBST洗涤4min，后浸于温度为25℃的所述封闭液中振荡孵育2h，得到封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜。
所述兔抗血清的制备步骤包括：在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和所述兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂进行免疫。所述封闭液包含1％兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和1％兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂；
五、将所述封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜与所述兔抗血清进行孵育结合，得到所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜：
将所述封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜浸于含有所述兔抗血清的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1h或在温度为4℃下过夜；优选地，所述含有所述兔抗血清的稀释液包含：所述兔抗血清和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述兔抗血清和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:5000。
六、将所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜与所述二抗进行孵育结合，得到所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜：(1)将所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜采用1×PBST振荡洗涤3次，每次洗涤10min；
(2)将步骤(1)得到的所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜浸于含有所述二抗的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1h；所述含有所述二抗的稀释液包含所述二抗和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述二抗和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:5000。
以上步骤中，所述兔抗血清经过特定靶标抗原免疫，并含有特异性识别靶标蛋白的抗体；所述二抗经HRP标记，并异性识别所述兔抗血清。
七、对所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜进行显色检测：
1、将A、B发光液(商购)等比例稀释混合均匀(各500ml)，得到发光混合液；将所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜平铺于保鲜膜上，将所述发光混合液均匀滴至所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜上，在其上覆盖保鲜膜，避光静置3min；打开上述保鲜膜，用滤纸去除上述所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜表面的残留液体，后将所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜置于保鲜膜内，避免气泡与皱褶；
2、将上述步骤1得到的保鲜膜(包覆有所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜)平铺并固定于暗盒中；将该暗盒至于暗室中，并取出胶片迅速置于暗盒内膜上，并避免产生重影；关闭暗盒(一般曝光时间为1min，若条带较弱，则可延长压片时间或者过夜或采用增强显影液重新进行显影)；后打开该暗盒，取出胶片立即完全浸入显影液中直至显出可见条带；取出胶片，清水漂洗后浸入至定影液中2min；取出胶片，用水冲洗后烘干；在该烘干的胶片上标示出标记，并依此标记来记录待测样本的详细信息(兔编号、基因编号、基因名、理论大小、样本、抗体浓度、稀释比例)。
实施例2：本发明所述提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法
一、制备含靶标蛋白的阳性待测样本：
将所述RIPA蛋白抽提试剂进行预冷后与所述蛋白酶抑制剂PMSF(需要时现场进行配制)混合，得到混合物；在该混合物中添加浓度为0.1M的PMSF(需要时现场进行配制)母液至得到的PMSF(需要时现场进行配制)母液的终浓度为1mM，得到RIPA强蛋白裂解液；用液氮研磨组织，然后在该组织中添加所述RIPA强蛋白裂解液(所述组织的质量和所述RIPA强蛋白裂解液的体积的比例为0.1g:1mL)，以然后用枪头吹打使组织充分悬起，并超声破碎细胞，得到待测组织液；将该待测组织液在冰上孵育20min，然后于温度为4℃、离心速率为12000rpm下进行离心25min；离心完成后取上清液，得到所述阳性待测样本(组织上清液)，并使用Bradford法进行浓度检测；
二、将所述阳性待测样本按照蛋白大小进行电泳分离，得到分离出的特定大小的待测蛋白，具体步骤包括：
1、制备聚丙烯酰胺凝胶
(1)将用于灌制聚丙烯酰胺凝胶的两个玻璃板固定；
(2)配制浓度为12％的分离胶溶液10mL，该分离胶溶液中包含：去离子水3.3mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液4mL，浓度为1.5mol/L、pH为8.8Tris-HCl缓冲液2.5mL，浓度为10％的APS溶液100μL，浓度为10％的SDS溶液100μL，TEMED 6μL；
(2)迅速在步骤(1)中所固定的两个玻璃板之间的间隙中添加所述分离胶溶液，并留出灌注以下步骤中所制备的浓缩胶溶液所需的空间，然后在所述分离胶溶液上覆盖一层异丙醇，置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在温度为37℃下放置，加快凝胶凝固；待该分离胶溶液聚合完全后，去除所得到的分离胶表面的液体，并用吸水滤纸的边缘吸净所残留的液体；
(3)配制浓度为5％的浓缩胶溶液3mL，该浓缩胶溶液中包含：去离子水2.7mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液670μL，浓度为1.5mol/L、pH为6.8Tris-HCl缓冲液500μL，浓度为10％的APS溶液40μL，浓度为10％的SDS溶液140μL，TEMED 6μL；
(4)迅速在步骤(2)得到的分离胶上直接灌注步骤(3)得到的浓缩胶溶液，不要产生气泡，立即垂直插入梳子,置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在37℃放置，加快凝胶凝固；待该浓缩胶溶液聚合完全后，得到载有聚丙烯酰胺凝胶的制胶装置，垂直移除梳子，露出笔直的点样孔，将该丙烯酰胺凝胶固定于电泳装置；
2、在点样孔中进行点样：向所述电泳装置的电泳槽内添加蛋白质电泳缓冲液，直至浸没步骤(4)得到的点样孔。当进行多克隆抗体检测时，将上述阳性待测样本与2×加样缓冲液按照1:1体积比进行混合或与6×加样缓冲液按照5:1体积比进行混合，调整10μL上样蛋白溶液(质量在10-30μg左右)，将得到的混合物用沸水煮沸5min，使蛋白完全变性，然后用移液枪慢慢将上述10μL混合物添加至所述电泳装置的样品槽中，并同时在另一样品槽中添加预染Maker 10μL(商购)；当进行哺乳动物、昆虫上清检测时，将上述待测样本30μL和6×加样缓冲液6μL混合，将该得到的混合物后用沸水煮沸5min，然后用移液枪慢慢将上述10μL混合物添加至所述电泳装置的样品槽中，后向样品槽中添加阳性对照蛋白和阴性对照蛋白，同时在另一样品槽中添加预染Maker 10μL；
3、然后将电泳仪连接到电泳仪电源上，检查正负极正确相连；打开电源，调整电泳仪电源为80V，开始电泳。按照恒压80V电泳30min，后将电泳仪电源电压调至100-120V直至溴酚蓝加样缓冲液在聚丙烯酰胺凝胶中迁移至聚丙烯酰胺凝胶底部，关闭电源，停止电泳，实现阳性待测样本的蛋白完全分离开，得到载有阳性待测蛋白的聚丙烯酰胺凝胶。
三、将所述待测蛋白进行转膜，得到所述载有所述待测蛋白的抗原硝酸纤维素膜：
1、取出上述聚丙烯酰胺凝胶后去掉上层所述浓缩胶，取下层分离胶，完全浸入转膜缓冲液中；
2、将硝酸纤维素膜浸入转膜缓冲液中；将6片转印滤纸浸入该转膜缓冲液中，且将硝酸纤维素膜、转印滤纸均剪裁为与上述聚丙烯酰胺凝胶相同尺寸，均为6cm×8cm；
3、用上述转膜缓冲液冲洗石墨电极，并在该石墨电极上铺三张滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)；然后在三张转印滤纸上覆盖所述分离胶(在该聚丙烯酰胺凝胶上滴少许上述转膜缓冲液)；在该聚丙烯酰胺凝胶上覆盖上述处理得到的硝酸纤维素膜，并在该硝酸纤维素膜滴少许上述转膜缓冲液；最后在该硝酸纤维素膜上铺三张转印滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)。这个过程中，使用涂棒避免各层之间产生气泡，并避免两端的转印滤纸相接触而造成短路；
4、连接电极，选择电泳仪电源上的恒流模式，以1.5mA/cm2凝胶体积进行1.5h，得到载有所述待测蛋白的抗原硝酸纤维素膜。
四、将载有待测蛋白的抗原硝酸纤维素膜采用1×PBST洗涤6min，后浸于温度为25℃的所述封闭液中振荡孵育3h，得到封闭后的抗原硝酸纤维素膜。
所述兔抗血清的制备步骤包括：在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过兔大肠杆菌疫苗制剂进行免疫，所述封闭液包含所述兔大肠杆菌疫苗制剂。按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔大肠杆菌疫苗制剂。
五、将所述封闭后的抗原硝酸纤维素膜与所述兔抗血清进行孵育结合，得到所述抗原抗体复合物硝酸纤维素膜：
将所述封闭后的抗原硝酸纤维素膜浸于含有所述兔抗血清的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1.5h或在温度为4℃下过夜；优选地，所述含有所述兔抗血清的稀释液包含：所述兔抗血清和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述兔抗血清和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:50000。
六、将所述抗原抗体复合物硝酸纤维素膜与所述二抗进行孵育结合，得到所述抗原抗体酶标记复合物硝酸纤维素膜：(1)将所述抗原抗体复合物硝酸纤维素膜采用1×PBST振荡洗涤4次，每次洗涤10min；
(2)将步骤(1)得到的所述抗原抗体复合物硝酸纤维素膜浸于含有所述二抗的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1.5h；优选地，所述含有所述二抗的稀释液包含所述二抗和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述二抗和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:50000。
以上步骤中，所述兔抗血清经过特定靶标抗原免疫，并含有特异性识别靶标蛋白的抗体；所述二抗经HRP标记，并异性识别所述兔抗血清。
七、对所述抗原抗体酶标记复合物硝酸纤维素膜进行显色检测：
1、将A、B发光液(商购)等比例稀释混合均匀(各500ml)，得到发光混合液；将所述抗原抗体酶标记复合物硝酸纤维素膜平铺于保鲜膜上，将所述发光混合液均匀滴至所述抗原抗体酶标记复合物硝酸纤维素膜上，在其上覆盖保鲜膜，避光静置3min；打开上述保鲜膜，用滤纸去除上述所述抗原抗体酶标记复合物硝酸纤维素膜表面的残留液体，后将所述抗原抗体酶标记复合物硝酸纤维素膜置于保鲜膜内，避免气泡与皱褶；
2、将上述步骤1得到的保鲜膜(包覆有所述抗原抗体酶标记复合物硝酸纤维素膜)平铺并固定于暗盒中；将该暗盒至于暗室中，并取出胶片迅速置于暗盒内膜上，并避免产生重影；关闭暗盒(一般曝光时间为1min，若条带较弱，则可延长压片时间或者过夜或采用增强显影液重新进行显影)；后打开该暗盒，取出胶片立即完全浸入显影液中直至显出可见条带；取出胶片，清水漂洗后浸入至定影液中2min；取出胶片，用水冲洗后烘干；在该烘干的胶片上标示出标记，并依此标记来记录待测样本的详细信息(兔编号、基因编号、基因名、理论大小、样本、抗体浓度、稀释比例)。
实施例3：本发明所述提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法
一、制备含靶标蛋白的阳性待测样本：将所述RIPA蛋白抽提试剂进行预冷后与所述蛋白酶抑制剂PMSF(需要时现场进行配制)混合，得到混合物；在该混合物中添加浓度为0.1M的PMSF(需要时现场进行配制)母液至得到的PMSF(需要时现场进行配制)母液的终浓度为1mM，得到RIPA强蛋白裂解液；用液氮研磨组织，然后在该组织中添加所述RIPA强蛋白裂解液(所述组织的质量和所述RIPA强蛋白裂解液的体积的比例为0.1g:1mL)，以然后用枪头吹打使组织充分悬起，并超声破碎细胞，得到待测组织液；将该待测组织液在冰上孵育20min，然后于温度为4℃、离心速率为12000rpm下进行离心20min；离心完成后取上清液，得到所述阳性待测样本(组织上清液)，并使用Bradford法进行浓度检测；
二、将所述阳性待测样本按照蛋白大小进行电泳分离，得到分离出的特定大小的待测蛋白，具体步骤包括：
1、制备聚丙烯酰胺凝胶
(1)将用于灌制聚丙烯酰胺凝胶的两个玻璃板固定；
(2)配制浓度为12％的分离胶溶液10mL，该分离胶溶液中包含：去离子水3.3mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液4mL，浓度为1.5mol/L、pH为8.8Tris-HCl缓冲液2.5mL，浓度为10％的APS溶液100μL，浓度为10％的SDS溶液100μL，TEMED 6μL；
(2)迅速在步骤(1)中所固定的两个玻璃板之间的间隙中添加所述分离胶溶液，并留出灌注以下步骤中所制备的浓缩胶溶液所需的空间，然后在所述分离胶溶液上覆盖一层异丙醇，置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在温度为37℃下放置，加快凝胶凝固；待该分离胶溶液聚合完全后，去除所得到的分离胶表面的液体，并用吸水滤纸的边缘吸净所残留的液体；
(3)配制浓度为5％的浓缩胶溶液3mL，该浓缩胶溶液中包含：去离子水2.7mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液670μL，浓度为1.5mol/L、pH为6.8Tris-HCl缓冲液500μL，浓度为10％的APS溶液40μL，浓度为10％的SDS溶液140μL，TEMED 6μL；
(4)迅速在步骤(2)得到的分离胶上直接灌注步骤(3)得到的浓缩胶溶液，不要产生气泡，立即垂直插入梳子,置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在37℃放置，加快凝胶凝固；待该浓缩胶溶液聚合完全后，得到载有聚丙烯酰胺凝胶的制胶装置，垂直移除梳子，露出笔直的点样孔，将该丙烯酰胺凝胶固定于电泳装置；
2、在点样孔中进行点样：向所述电泳装置的电泳槽内添加蛋白质电泳缓冲液，直至浸没步骤(4)得到的点样孔。当进行多克隆抗体检测时，将上述阳性待测样本与2×加样缓冲液按照1:1体积比进行混合或与6×加样缓冲液按照5:1体积比进行混合，调整10μL上样蛋白溶液(质量在10-30μg左右)，将得到的混合物用沸水煮沸5min，使蛋白完全变性，然后用移液枪慢慢将上述10μL混合物添加至所述电泳装置的样品槽中，并同时在另一样品槽中添加预染Maker 10μL(商购)；当进行哺乳动物、昆虫上清检测时，将上述待测样本30μL和6×加样缓冲液6μL混合，将该得到的混合物后用沸水煮沸5min，然后用移液枪慢慢将上述10μL混合物添加至所述电泳装置的样品槽中，后向样品槽中添加阳性对照蛋白和阴性对照蛋白，同时在另一样品槽中添加预染Maker 10μL；
3、然后将电泳仪连接到电泳仪电源上，检查正负极正确相连；打开电源，调整电泳仪电源为80V，开始电泳。按照恒压80V电泳30min，后将电泳仪电源电压调至100-120V直至溴酚蓝加样缓冲液在聚丙烯酰胺凝胶中迁移至聚丙烯酰胺凝胶底部，关闭电源，停止电泳，实现阳性待测样本的蛋白完全分离开，得到载有阳性待测蛋白的聚丙烯酰胺凝胶。
三、将所述待测蛋白进行转膜，得到所述载有所述待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜：
1、取出上述聚丙烯酰胺凝胶后去掉上层所述浓缩胶，取下层分离胶，完全浸入转膜缓冲液中；
2、将聚偏二氟乙烯膜浸泡于异丙醇中1min，以进行膜上正电基团的活化，后将该聚偏二氟乙烯膜浸入转膜缓冲液中；将6片转印滤纸浸入该转膜缓冲液中，且将聚偏二氟乙烯膜、转印滤纸均剪裁为与上述聚丙烯酰胺凝胶相同尺寸，均为6cm×8cm；
3、用上述转膜缓冲液冲洗石墨电极，并在该石墨电极上铺三张滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)；然后在三张转印滤纸上覆盖所述分离胶(在该聚丙烯酰胺凝胶上滴少许上述转膜缓冲液)；在该聚丙烯酰胺凝胶上覆盖上述处理得到的聚偏二氟乙烯膜，并在该聚偏二氟乙烯膜滴少许上述转膜缓冲液；最后在该聚偏二氟乙烯膜上铺三张转印滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)。这个过程中，使用涂棒避免各层之间产生气泡，并避免两端的转印滤纸相接触而造成短路；
4、连接电极，选择电泳仪电源上的恒流模式，以1.5mA/cm2凝胶体积进行1.5h，得到载有所述待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜。
四、将载有待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜采用1×PBST洗涤5min，后浸于温度为25℃的所述封闭液中振荡孵育1.5h，得到封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜。
所述兔抗血清的制备步骤包括：在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和所述兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂进行免疫，所述封闭液包含所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和所述兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂。按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、1％兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和5％脱脂奶粉；
五、将所述封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜与所述兔抗血清进行孵育结合，得到所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜：
将所述封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜浸于含有所述兔抗血清的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1.5h或在温度为4℃下过夜；优选地，所述含有所述兔抗血清的稀释液包含：所述兔抗血清和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述兔抗血清和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:20000。
六、将所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜与所述二抗进行孵育结合，得到所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜：(1)将所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜采用1×PBST振荡洗涤4次，每次洗涤10min；
(2)将步骤(1)得到的所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜浸于含有所述二抗的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1.5h；优选地，所述含有所述二抗的稀释液包含所述二抗和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述二抗和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:20000。
以上步骤中，所述兔抗血清经过特定靶标抗原免疫，并含有特异性识别靶标蛋白的抗体；所述二抗经HRP标记，并异性识别所述兔抗血清。
七、对所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜进行显色检测：
1、将A、B发光液(商购)等比例稀释混合均匀(各500ml)，得到发光混合液；将所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜平铺于保鲜膜上，将所述发光混合液均匀滴至所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜上，在其上覆盖保鲜膜，避光静置3min；打开上述保鲜膜，用滤纸去除上述所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜表面的残留液体，后将所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜置于保鲜膜内，避免气泡与皱褶；
2、将上述步骤1得到的保鲜膜(包覆有所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜)平铺并固定于暗盒中；将该暗盒至于暗室中，并取出胶片迅速置于暗盒内膜上，并避免产生重影；关闭暗盒(一般曝光时间为1min，若条带较弱，则可延长压片时间或者过夜或采用增强显影液重新进行显影)；后打开该暗盒，取出胶片立即完全浸入显影液中直至显出可见条带；取出胶片，清水漂洗后浸入至定影液中2min；取出胶片，用水冲洗后烘干；在该烘干的胶片上标示出标记，并依此标记来记录待测样本的详细信息(兔编号、基因编号、基因名、理论大小、样本、抗体浓度、稀释比例)。
实施例4：本发明所述提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法
一、制备含靶标蛋白的阳性待测样本：将所述RIPA蛋白抽提试剂进行预冷后与所述蛋白酶抑制剂PMSF(需要时现场进行配制)混合，得到混合物；在该混合物中添加浓度为0.1M的PMSF(需要时现场进行配制)母液至得到的PMSF(需要时现场进行配制)母液的终浓度为1mM，得到RIPA强蛋白裂解液；将待测细胞计数，当细胞数量为1×107时，向待测细胞中添加所述RIPA强蛋白裂解液1ml，然后用枪头吹打使细胞充分悬起，并超声破碎细胞，得到待测细胞液；将该待测细胞液在冰上孵育20min，然后于温度为4℃、离心速率为12000rpm下进行离心25min；离心完成后取上清液，得到所述阳性待测样本(细胞上清液)，并使用Bradford法进行浓度检测；
二、将所述阳性待测样本按照蛋白大小进行电泳分离，得到分离出的特定大小的待测蛋白，具体步骤包括：
1、制备聚丙烯酰胺凝胶
(1)将用于灌制聚丙烯酰胺凝胶的两个玻璃板固定；
(2)配制浓度为12％的分离胶溶液10mL，该分离胶溶液中包含：去离子水3.3mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液4mL，浓度为1.5mol/L、pH为8.8Tris-HCl缓冲液2.5mL，浓度为10％的APS溶液100μL，浓度为10％的SDS溶液100μL，TEMED 6μL；
(2)迅速在步骤(1)中所固定的两个玻璃板之间的间隙中添加所述分离胶溶液，并留出灌注以下步骤中所制备的浓缩胶溶液所需的空间，然后在所述分离胶溶液上覆盖一层异丙醇，置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在温度为37℃下放置，加快凝胶凝固；待该分离胶溶液聚合完全后，去除所得到的分离胶表面的液体，并用吸水滤纸的边缘吸净所残留的液体；
(3)配制浓度为5％的浓缩胶溶液3mL，该浓缩胶溶液中包含：去离子水2.7mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液670μL，浓度为1.5mol/L、pH为6.8Tris-HCl缓冲液500μL，浓度为10％的APS溶液40μL，浓度为10％的SDS溶液140μL，TEMED 6μL；
(4)迅速在步骤(2)得到的分离胶上直接灌注步骤(3)得到的浓缩胶溶液，不要产生气泡，立即垂直插入梳子,置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在37℃放置，加快凝胶凝固；待该浓缩胶溶液聚合完全后，得到载有聚丙烯酰胺凝胶的制胶装置，垂直移除梳子，露出笔直的点样孔，将该丙烯酰胺凝胶固定于电泳装置；
2、在点样孔中进行点样：向所述电泳装置的电泳槽内添加蛋白质电泳缓冲液，直至浸没步骤(4)得到的点样孔。当进行多克隆抗体检测时，将上述阳性待测样本与2×加样缓冲液按照1:1体积比进行混合或与6×加样缓冲液按照5:1体积比进行混合，调整10μL上样蛋白溶液(质量在10-30μg左右)，将得到的混合物用沸水煮沸5min，使蛋白完全变性，然后用移液枪慢慢将上述10μL混合物添加至所述电泳装置的样品槽中，并同时在另一样品槽中添加预染Maker 10μL(商购)；当进行哺乳动物、昆虫上清检测时，将上述待测样本30μL和6×加样缓冲液6μL混合，将该得到的混合物后用沸水煮沸5min，然后用移液枪慢慢将上述10μL混合物添加至所述电泳装置的样品槽中，后向样品槽中添加阳性对照蛋白和阴性对照蛋白，同时在另一样品槽中添加预染Maker 10μL；
3、然后将电泳仪连接到电泳仪电源上，检查正负极正确相连；打开电源，调整电泳仪电源为80V，开始电泳。按照恒压80V电泳30min，后将电泳仪电源电压调至100-120V直至溴酚蓝加样缓冲液在聚丙烯酰胺凝胶中迁移至聚丙烯酰胺凝胶底部，关闭电源，停止电泳，实现阳性待测样本的蛋白完全分离开，得到载有阳性待测蛋白的聚丙烯酰胺凝胶。
三、将所述待测蛋白进行转膜，得到所述载有所述待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜：
1、取出上述聚丙烯酰胺凝胶后去掉上层所述浓缩胶，取下层分离胶，完全浸入转膜缓冲液中；
2、将聚偏二氟乙烯膜浸泡于异丙醇中1min，以进行膜上正电基团的活化(硝酸纤维素膜无需进行此操作)，后将该聚偏二氟乙烯膜浸入转膜缓冲液中；将6片转印滤纸浸入该转膜缓冲液中，且将聚偏二氟乙烯膜、转印滤纸均剪裁为与上述聚丙烯酰胺凝胶相同尺寸，均为6cm×8cm；
3、用上述转膜缓冲液冲洗石墨电极，并在该石墨电极上铺三张滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)；然后在三张转印滤纸上覆盖所述分离胶(在该聚丙烯酰胺凝胶上滴少许上述转膜缓冲液)；在该聚丙烯酰胺凝胶上覆盖上述处理得到的聚偏二氟乙烯膜，并在该聚偏二氟乙烯膜滴少许上述转膜缓冲液；最后在该聚偏二氟乙烯膜上铺三张转印滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)。这个过程中，使用涂棒避免各层之间产生气泡，并避免两端的转印滤纸相接触而造成短路；
4、连接电极，选择电泳仪电源上的恒流模式，以1.5mA/cm2凝胶体积进行1.5h，得到载有所述待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜。
四、将载有待测蛋白的抗原聚偏二氟乙烯膜采用1×PBST洗涤4～6min，后浸于温度为25℃的所述封闭液中振荡孵育3h，得到封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜。
所述兔抗血清的制备步骤包括：在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过兔大肠杆菌疫苗制剂进行免疫，则所述封闭液包含所述兔大肠杆菌疫苗制剂。按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔大肠杆菌疫苗制剂和5％脱脂奶粉。
五、将所述封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜与所述兔抗血清进行孵育结合，得到所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜：
将所述封闭后的抗原聚偏二氟乙烯膜浸于含有所述兔抗血清的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1～1.5h或在温度为4℃下过夜；优选地，所述含有所述兔抗血清的稀释液包含：所述兔抗血清和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述兔抗血清和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:5000～50000，优选1:20000。
六、将所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜与所述二抗进行孵育结合，得到所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜：(1)将所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜采用1×PBST振荡洗涤4次，每次洗涤10min；
(2)将步骤(1)得到的所述抗原抗体复合物聚偏二氟乙烯膜浸于含有所述二抗的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1.5h；优选地，所述含有所述二抗的稀释液包含所述二抗和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述二抗和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:20000。
以上步骤中，所述兔抗血清经过特定靶标抗原免疫，并含有特异性识别靶标蛋白的抗体；所述二抗经HRP标记，并异性识别所述兔抗血清。
七、对所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜进行显色检测：
1、将A、B发光液(商购)等比例稀释混合均匀(各500ml)，得到发光混合液；将所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜平铺于保鲜膜上，将所述发光混合液均匀滴至所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜上，在其上覆盖保鲜膜，避光静置3min；打开上述保鲜膜，用滤纸去除上述所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜表面的残留液体，后将所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜置于保鲜膜内，避免气泡与皱褶；
2、将上述步骤1得到的保鲜膜(包覆有所述抗原抗体酶标记复合物聚偏二氟乙烯膜)平铺并固定于暗盒中；将该暗盒至于暗室中，并取出胶片迅速置于暗盒内膜上，并避免产生重影；关闭暗盒(一般曝光时间为1min，若条带较弱，则可延长压片时间或者过夜或采用增强显影液重新进行显影)；后打开该暗盒，取出胶片立即完全浸入显影液中直至显出可见条带；取出胶片，清水漂洗后浸入至定影液中2min；取出胶片，用水冲洗后烘干；在该烘干的胶片上标示出标记，并依此标记来记录待测样本的详细信息(兔编号、基因编号、基因名、理论大小、样本、抗体浓度、稀释比例)。
实施例5：本发明所述检测方法的实验验证
(1)取未进行任何免疫的日本大耳白兔，兔龄1个月左右，体重1kg左右，耳静脉取血1ml，在温度为4℃下过夜离心取上清液；
(2)将步骤(1)的日本大耳白兔进行兔病毒性出血症灭活疫苗和兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的免疫，2-3周后耳静脉取血1ml，在温度为4℃下过夜离心取上清液；
(3)将以上步骤(1)和(2)的兔血清进行同步蛋白质免疫印迹检测；
通过以上步骤(1)和(2)的兔血清蛋白质免疫印迹检测结果来看，未进行任何免疫的兔血清中在各种不同的样本验证中有较弱的条带；通过兔病毒性出血症灭活疫苗和兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗进行免疫后，杂带明显变粗，杂带增多；从结果分析，兔病毒性出血症灭活疫苗和兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的免疫使日本大耳白兔产生了某些抗体能与各种人天然样本进行非特异性结合，这对于后期进行特定免疫抗原后而纯化的抗体有很强的干扰，从而导致兔抗血清的蛋白质免疫印迹验证出现较多的非特异性条带，出现假阳性的误判。因此，对于经过兔瘟疫苗制剂即兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和/或兔大肠杆菌疫苗制剂进行了免疫的兔抗血清，通过将兔瘟疫苗制剂即兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和/或兔大肠杆菌疫苗制剂作为蛋白质免疫印迹验证中的封闭添加剂来制备所述蛋白质免疫印迹检测方法中所使用的封闭液，从而排除了所述经过特定抗原免疫的兔抗血清本身引起的假阳性结果，大大提升了所述兔抗血清的抗体特异性信号的准确性，从而使得所述蛋白质免疫印迹检测方法准确地反映待测蛋白实验结果。
对比实施例1：
一、制备待测样本：将所述RIPA蛋白抽提试剂进行预冷后与所述蛋白酶抑制剂PMSF混合，得到混合物，PMSF需现配现用；在该混合物中添加浓度为0.1M的PMSF母液至得到的PMSF母液的终浓度为1mM，得到RIPA强蛋白裂解液；用液氮研磨组织，然后在该组织中添加所述RIPA强蛋白裂解液(所述组织的质量和所述RIPA强蛋白裂解液的体积的比例为0.1g:1mL)，以然后用枪头吹打使组织充分悬起，并超声破碎细胞，得到待测组织液；将该待测组织液在冰上孵育20min，然后于温度为4℃、离心速率为12000rpm下进行离心15～25min；离心完成后取上清液，得到待测样本(组织上清液)，并通过Bradford法检测蛋白浓度；
二、将所述待测样本进行电泳分离，得到特定大小的阳性待测蛋白，具体步骤包括：
1、制备聚丙烯酰胺凝胶
(1)将用于灌制聚丙烯酰胺凝胶的两个玻璃板固定；
(2)配制浓度为12％的分离胶溶液10mL，该分离胶溶液中包含：去离子水3.3mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液4mL，浓度为1.5mol/L、pH为8.8Tris-HCl缓冲液2.5mL，浓度为10％的APS溶液100μL，浓度为10％的SDS溶液100μL，TEMED 6μL；
(3)迅速在步骤(1)中所固定的两个玻璃板之间的间隙中添加所述分离胶溶液，并留出灌注以下步骤中所制备的浓缩胶溶液所需的空间，然后在所述分离胶溶液上覆盖一层异丙醇，置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在37℃放置，加快凝胶凝固；待该分离胶溶液聚合完全后，去除所得到的分离胶表面的液体，并用吸水滤纸的边缘吸净所残留的液体；
(4)配制浓度为5％的浓缩胶溶液3mL，该浓缩胶溶液中包含：去离子水2.7mL，浓度为30％的丙烯酰胺溶液670μL，浓度为1.5mol/L、pH为6.8Tris-HCl缓冲液500μL，浓度为10％的APS溶液40μL，浓度为10％的SDS溶液140μL，TEMED 6μL；
(5)迅速在步骤(2)得到的分离胶上直接灌注步骤(3)得到的浓缩胶溶液，不要产生气泡，立即垂直插入梳子,置于室温等待，使得凝胶充分均匀的凝固。温度较低时，可考虑在37℃放置，加快凝胶凝固；待该浓缩胶溶液聚合完全后，得到载有聚丙烯酰胺凝胶的制胶装置，垂直移除梳子，露出笔直的点样孔，将该丙烯酰胺凝胶固定于电泳装置；
2、在点样孔中进行点样：向所述电泳装置的电泳槽内添加蛋白质电泳缓冲液，直至浸没步骤(5)得到的点样孔。
3、然后将电泳仪连接到电泳仪电源上，检查正负极正确相连；打开电源，调整电泳仪电源为80V，开始电泳。按照恒压80V电泳30min，后将电泳仪电源电压调至100-120V直至溴酚蓝加样缓冲液在聚丙烯酰胺凝胶中迁移至聚丙烯酰胺凝胶底部，关闭电源，停止电泳，实现阳性待测样本的蛋白完全分离开，得到载有阳性待测蛋白的聚丙烯酰胺凝胶。
三、制备载有所述待测蛋白的硝酸纤维素膜
1、取出上述聚丙烯酰胺凝胶后去掉上层所述浓缩胶，取下层分离胶，完全浸入转膜缓冲液中；
2、将硝酸纤维素膜浸泡于异丙醇中1min，以活化膜上正电基团，后将该硝酸纤维素膜浸入转膜缓冲液中；将硝酸纤维素膜浸入转膜缓冲液中；将6片转印滤纸浸入该转膜缓冲液中，且将硝酸纤维素膜、转印滤纸均剪裁为与上述聚丙烯酰胺凝胶相同尺寸，均为6cm×8cm。
3、用上述转膜缓冲液冲洗石墨电极，并在该石墨电极上铺三张滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)；然后在三张转印滤纸上覆盖所述分离胶(在该聚丙烯酰胺凝胶上滴少许上述转膜缓冲液)；在该聚丙烯酰胺凝胶上覆盖上述处理得到的硝酸纤维素膜，并在该硝酸纤维素膜滴少许上述转膜缓冲液；最后在该硝酸纤维素膜上铺三张转印滤纸(在这三张滤纸上滴少许上述转膜缓冲液)。这个过程中，使用涂棒避免各层之间产生气泡，并避免两端的转印滤纸相接触而造成短路。
4、连接电极，选择电泳仪电源上的恒流模式，以1.5mA/cm2凝胶体积进行1.5h，得到载有所述阳性待测蛋白的硝酸纤维素膜。
四、将载有阳性待测蛋白的硝酸纤维素膜采用1×PBST洗涤6min，后浸于温度为25℃的所述封闭液中2h，得到封闭后的硝酸纤维素膜；
按体积百分比计，所述封闭液包含5％脱脂奶粉。
五、将所述封闭后的硝酸纤维素膜与兔抗血清进行孵育，得到孵育后的硝酸纤维素膜：
(1)将封闭后的硝酸纤维素膜浸于含有所述兔抗血清的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1.5h；优选地，所述含有所述兔抗血清的稀释液包含：所述兔抗血清和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述兔抗血清和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:2500。
六、将所述孵育后的硝酸纤维素膜与所述HRP标记特异性识别兔抗血清的二抗进行孵育，得到待测硝酸纤维素膜：
(1)将所述孵育后的硝酸纤维素膜采用1×PBST震荡洗涤4次，每次洗涤11min；
(2)将步骤(1)得到的硝酸纤维素膜浸于含有所述HRP标记特异性识别兔抗血清的二抗的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1.5h；优选地，所述含有所述HRP标记特异性识别兔抗血清的二抗的稀释液包含：所述兔抗血清的二抗和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述HRP标记特异性识别兔抗血清的二抗和所述5％脱脂奶粉溶液的体积比例为1:20000。
七、对所述待测硝酸纤维素膜进行显色检测：
1、将A、B发光液等比例稀释混合均匀(各500ml)，得到发光混合液；将待测硝酸纤维素膜平铺于保鲜膜上，将所述发光混合液均匀滴至所述待测硝酸纤维素膜上，在其上覆盖保鲜膜，避光静置3min；打开上述保鲜膜，用滤纸去除上述待测硝酸纤维素膜表面的残留液体，后将该待测硝酸纤维素膜置于保鲜膜内，避免气泡与皱褶；
2、将上述步骤1得到的保鲜膜(包覆有所述待测硝酸纤维素膜平铺并固定于暗盒中；将该暗盒至于暗室中，并取出胶片迅速置于暗盒内膜上，并避免产生重影；关闭暗盒(一般曝光时间为1min，若条带较弱，则可延长压片时间或者过夜或采用增强显影液重新进行显影)；后打开该暗盒，取出胶片立即完全侵入显影液中直至显出可见条带；取出胶片，清水漂洗后侵入至定影液中2min；取出胶片，用水冲洗后烘干；在该烘干的胶片上标示出标记，并依此标记来记录待测样本的详细信息(兔编号，基因编号，基因名，理论大小，样本，抗体浓度，稀释比例)。
综上所述，在以上实施例1～4和对比实施例1中，可以看出：
(1)按体积百分比计，当所述封闭液仅包含5％脱脂奶粉时，检测结果显示背景较深，杂带较多；按体积百分比计，当所述封闭液包含1％兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和1％兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂时，检测结果显示杂带减弱50％；按体积百分比计，当所述封闭液包含1％兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、1％兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和5％脱脂奶粉时，检测结果显示杂带减弱100％。
(2)按体积百分比计，当所述封闭液包含1％兔大肠杆菌疫苗制剂时，检测结果显示杂带减弱50％；按体积百分比计，当所述封闭液包含1％兔大肠杆菌疫苗制剂和5％脱脂奶粉时，检测结果显示杂带减弱100％。
因此，可以得出结论：对于进行特定抗免疫前，已经经过兔瘟疫苗制剂即兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和/或兔大肠杆菌疫苗制剂进行了免疫的所述兔抗血清，通过将兔瘟疫苗制剂即兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和/或兔大肠杆菌疫苗制剂作为蛋白质免疫印迹验证中的封闭添加剂来制备所述蛋白质免疫印迹检测方法中所使用的封闭液，从而能够排除所述兔抗血清本身所引起的假阳性结果，显著提高了所述兔抗血清的抗体特异性信号的准确性，从而使得所述蛋白质免疫印迹检测方法准确地反映待测蛋白实验结果。
总之，以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，所述方法包括：制备含靶标蛋白的阳性待测样本；将所述阳性待测样本按照蛋白大小进行电泳分离，得到分离出的特定大小的待测蛋白；制备载有所述待测蛋白的抗原固相载体；将所述载有所述待测蛋白的抗原固相载体浸于封闭液中，得到封闭后的抗原固相载体；将所述封闭后的抗原固相载体与兔抗血清进行孵育结合，得到孵育后的抗原抗体复合物固相载体；将所述抗原抗体复合物固相载体与二抗进行孵育结合，得到抗原抗体酶标记复合物的固相载体；对所述抗原抗体酶标记复合物的固相载体使用ECL进行酶显色检测，呈现阳性结果；其中，所述兔抗血清经过特定靶标抗原免疫，并含有特异性识别靶标蛋白的抗体；所述二抗经HRP标记，并异性识别所述兔抗血清；
其特征在于，所述封闭液包含兔瘟疫苗制剂。
2.根据权利要求1所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，其特征在于，所述兔瘟疫苗制剂选自兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂或兔大肠杆菌疫苗制剂中的一种或两种以上；
优选地，所述兔瘟疫苗制剂包含兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂；
优选地，所述兔瘟疫苗制剂包含所述兔大肠杆菌疫苗制剂。
3.根据权利要求1或2所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，其特征在于，当通过以下步骤制备所述兔抗血清时，所述封闭液包含所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和所述兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂，所述步骤包括：在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过所述兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和所述兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂进行免疫；
优选地，当通过以下步骤制备所述兔抗血清时，所述封闭液包含所述兔大肠杆菌疫苗制剂，所述步骤包括：在将试验兔进行特定抗原免疫之前，将所述试验兔通过兔大肠杆菌疫苗制剂进行免疫。
4.根据权利要求3所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，其特征在于，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔病毒性出血症灭活疫苗制剂和1％兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂；
优选地，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔病毒性出血症灭活疫苗制剂、1％兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗制剂和5％脱脂奶粉。
5.根据权利要求3所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，其特征在于，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔大肠杆菌疫苗制剂；
优选地，按体积百分比计，所述封闭液包含1％兔大肠杆菌疫苗制剂和5％脱脂奶粉。
6.根据权利要求1或2所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，其特征在于，所述将所述载有所述待测蛋白的抗原固相载体浸于封闭液中，得到封闭后的抗原固相载体，包括：将载有所述待测蛋白的抗原固相载体采用1×PBST洗涤4～6min，后浸于温度为25℃的所述封闭液中振荡孵育2～3h，得到所述封闭后的抗原固相载体；
优选地，所述固相载体选自硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。
7.根据权利要求1或2所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，其特征在于，所述制备含靶标蛋白的阳性待测样本包括：提取细胞上清液和/或提取组织上清液；
优选地，所述制备载有所述待测蛋白的抗原固相载体，包括：将所述待测蛋白进行转膜，得到所述载有所述待测蛋白的固相载体。
8.根据权利要求1或2所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，其特征在于，所述兔抗血清能够与所述待测蛋白结合；
优选地，所述将所述封闭后的抗原固相载体与所述兔抗血清进行孵育结合，包括以下步骤：
将所述封闭后的抗原固相载体浸于含有所述兔抗血清的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1～1.5h或在温度为4℃下过夜；
优选地，所述含有所述兔抗血清的稀释液包含所述兔抗血清和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述兔抗血清和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:5000～50000，优选1:20000。
9.根据权利要求1或2所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，其特征在于，所述将所述抗原抗体复合物固相载体与所述二抗进行孵育结合，包括以下步骤：
(1)将所述抗原抗体复合物固相载体采用1×PBST振荡洗涤3～4次，每次洗涤10min；
(2)将步骤(1)得到的所述抗原抗体复合物固相载体浸于含有所述二抗的稀释液中，后于温度为25℃下孵育1～1.5h；优选地，所述含有所述二抗的稀释液包含所述二抗和浓度为5％的脱脂奶粉溶液；其中所述二抗和所述脱脂奶粉溶液的体积比例为1:5000～50000，优选1:20000。
10.根据权利要求1或2所述的提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法，其特征在于，所述待测样本来源于动物细胞、动物组织、植物细胞和植物组织。
CN202010103238.2A 2020-02-19 2020-02-19 一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法 Active CN111323594B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010103238.2A CN111323594B (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010103238.2A CN111323594B (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111323594A true CN111323594A (zh) 2020-06-23
CN111323594B CN111323594B (zh) 2021-02-02

Family

ID=71167308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010103238.2A Active CN111323594B (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111323594B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114142036A (zh) * 2021-11-23 2022-03-04 中科南京绿色制造产业创新研究院 锂硫电池复合电极的正极材料及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060210578A1 (en) * 2002-06-19 2006-09-21 Alan Murray Immunogenic polypeptide isolated from mycobacterium avium subspecies paratuberculosis and uses therof
US20080260763A1 (en) * 2004-07-01 2008-10-23 The Regents Of The University Of California High Throughput Proteomics
CN101900731A (zh) * 2010-08-05 2010-12-01 中国兽医药品监察所 一种区别检测猪瘟疫苗免疫与野毒感染抗体的elisa试剂盒及其制备方法
CN107167609A (zh) * 2017-04-11 2017-09-15 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接elisa检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060210578A1 (en) * 2002-06-19 2006-09-21 Alan Murray Immunogenic polypeptide isolated from mycobacterium avium subspecies paratuberculosis and uses therof
US20080260763A1 (en) * 2004-07-01 2008-10-23 The Regents Of The University Of California High Throughput Proteomics
CN101900731A (zh) * 2010-08-05 2010-12-01 中国兽医药品监察所 一种区别检测猪瘟疫苗免疫与野毒感染抗体的elisa试剂盒及其制备方法
CN107167609A (zh) * 2017-04-11 2017-09-15 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接elisa检测方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114142036A (zh) * 2021-11-23 2022-03-04 中科南京绿色制造产业创新研究院 锂硫电池复合电极的正极材料及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111323594B (zh) 2021-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4241176A (en) Magnetic gel suitable to immunoenzymatic determinations
US4775636A (en) Blot overlay assay using colloidal metal particles
EP2572189B1 (en) Western blot analytical technique
CN101421619A (zh) 通用快捷的免疫检测法及试剂和试剂盒
WO2015017285A2 (en) Multiplex blocker beads for immunoassays
CN111323594B (zh) 一种提高兔抗血清的抗体特异性的蛋白质免疫印迹检测方法
CN108603880A (zh) 受试物质的检测方法及受试物质的检测用试剂盒
JP2564540B2 (ja) 免疫分析方法
CN105445471B (zh) 心血管疾病标记物palm及利用其的心血管疾病诊断方法
CN112986586A (zh) 一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒
CN111363789B (zh) 一种同时检测蛋白质和rna的试剂盒和方法
CN106645715B (zh) 一种用于eb病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白抗体联合检测的蛋白质芯片及其制备和应用
US7112411B2 (en) Direct detection of biomolecules in polyacrylamide gel improvement comprising shrinking and rehydrating of gel prior to labeling
CN110514821A (zh) 一种蛋白质免疫印迹膜重生液及其使用方法
Johanson Immunoblotting (western blotting)
CN109030815A (zh) 一种用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片及其制备方法和应用
CN210181056U (zh) 评估hcp检测用多克隆抗体覆盖率的设备
Salwan et al. Sero-diagnostics in microbiology
Rak et al. Double Labeling Fluorescent Immunocytochemistry
CN207457244U (zh) 一种牛怀孕检测套件和试剂盒
CN114409767A (zh) 一种鉴别新冠突变型抗原的抗体、试剂及方法
Vayanaperumal Western Blotting a review: Principle, protocol and problem solving
SU1138742A1 (ru) Способ определени фибронектина
CN113567679A (zh) 一种超敏ecl发光液试剂及其使用方法
Jantzie et al. Methods in immunochemistry

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant