CN105445471B - 心血管疾病标记物palm及利用其的心血管疾病诊断方法 - Google Patents

心血管疾病标记物palm及利用其的心血管疾病诊断方法 Download PDF

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Abstract

本发明的题目是心血管疾病标记物PALM及利用其的心血管疾病诊断方法。本发明涉及一种作为可用作心血管疾病的诊断用标记物的蛋白质的PALM(paralemmin)及利用其的心血管疾病的诊断试剂盒，具体而言，与正常人相比，PALM在心血管疾病患者中表达量特异性地增加，因此可将所述PALM有效地用作心血管疾病诊断用标记物。

Description

心血管疾病标记物PALM及利用其的心血管疾病诊断方法
技术领域
本发明涉及一种对于心血管疾病为特异性的诊断标记物，涉及一种在心血管疾病患者的组织或血清中特异性增加表达的PALM(paralemmin)及利用其的心血管疾病诊断用试剂盒。
背景技术
心血管类疾病是全球导致死亡最多的疾病,根据世界保健机构的预测,心血管类疾病今后也将是在全球提供最多死亡原因的疾病。2005年因心血管类疾病死亡的人数为1750万,这相当于全球死亡人数的30％。在这些死亡者中,760万人死于心脏麻痹,57万人死于脑中风。在未采取恰当的措施的情况下,到2015为止估算每年有2千万人死于心血管类疾病,其中主要死于心脏麻痹与脑中风。心血管类疾病是因心脏与血管的障碍而引起,特别是冠状心脏疾病(心脏麻痹)、冠状动脉疾病、血压上升(高血压)、末梢动脉疾病、风湿性心脏疾病、先天性心脏病及心功能不全包含在所述心血管类疾病中。在心血管疾病中占据重要部分的冠状动脉疾病大致是因动脉硬化而向心脏供给血液的冠状动脉堵塞或变窄所导致。因动脉硬化导致冠状动脉完全堵塞而心脏肌肉组织死亡的疾病为心肌梗塞，冠状动脉变窄而感觉到胸部压迫管或胸痛的疾病为心绞痛。
确认存在心血管疾病发病危险的个人是用以进一步有效地预防或治疗所述疾病的重要战略。以往，只有心血管疾病发展到某种程度时方能通过物理方法诊断，从而早期诊断或预测有限。通常，对于心血管疾病，利用造影装备对心脏内部及冠状动脉进行X射线及超声波拍摄而进行诊断，但这种方法仅可在发病后进行诊断。另外，目前在临床上使用预测可从血液样品测定的心血管疾病的若干危险因数、例如与LDL(Low Density Lipoprotein，低密度脂蛋白)及HDL(High Density Lipoprotein，高密度脂蛋白)胆固醇数值相关的因数，但患有动脉粥样硬化的许多患者并不具有这种危险因数。进而，未表现出这种危险因数的许多个人也会发生心血管疾病，因此也考虑发生心血管疾病的危险较低的个人。因此，一直以来要求一种对患者侦测发生心血管疾病的危险的方法。
心血管相关疾病是毫无征兆地突发的疾病，因此与人的生命及日常生活的功能限制具有非常密切的关联性。因此，需要事先预测诊断这种已发展的心血管疾病而挽救患者的生命并提高生活质量。作为迄今为止已知的心血管类疾病的生物标记物，有CRP、IL-6、IL-8、MCP-1、IP-10等。除此之外，申请有与利用MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、eotaxin、M-CSF、IL-3、IP-10、TNFα、Ang-2、IL-5、IL-7与IGF-1等的组合的心血管类生物标记物相关的专利(US 2007/0099239)。然而，因各种检查而医疗费增加，以所有人为对象进行以筛查为目的的检查有限，因此对可简便地通过一次采血进行诊断的生物标记物的需求日益增强。
因此，本发明人等为了开发新颖的特异性心血管疾病标记物而进行努力，结果确认到如下情况而完成了本发明：与正常组相比，PALM(paralemmin)在心血管疾病小鼠及患者中呈增加的现象，与作为现有的心血管疾病标记物的CK-MB及troponin(肌钙蛋白)-T的表达相似，由此可将所述PALM有效地用作心血管疾病标记物。
发明内容
[发明要解决的问题]
本发明的目的在于提供一种包含特异性地结合到PALM(Paralemmin)的抗体的心血管类疾病诊断用试剂盒及用以提供诊断心血管疾病的信息的蛋白质检测方法。
[解决问题的技术手段]
为了达成所述目的，本发明提供一种包含特异性地结合到PALM(Paralelllmin)的抗体的心血管类疾病诊断用试剂盒。
另外，本发明提供一种用以提供诊断心血管疾病的信息的蛋白质检测方法，其包含如下步骤：
1)从患者的分离的试料测定PALM的表达量的步骤；及
2)筛选所述步骤1)的蛋白质的表达量高于正常对照组的个体的步骤。
[发明效果]
本发明涉及一种作为心血管疾病诊断用生物标记物的PALM(paralemmin)，所述PALM在心血管疾病小鼠及患者中呈增加的现象，与作为现有的心血管疾病标记物的CK-MB及troponin-T的表达相似，因此可实现可通过简单的采血而简便地进行心血管类诊断或判断发展程度的效果，因此可有效地用作心血管疾病标记物。
附图说明
图1是关于通过LAD(Left Anterior Descending，左前降支)结扎而构建心血管疾病小鼠模型的图。
图2是利用从心血管疾病小鼠模型获得的组织或血清对在加载到凝胶后表达的蛋白质进行染色的图。
图3是使用利用从心血管疾病小鼠模型获得的组织或血清的样品进行质量分析的结果。
图4是在心血管疾病小鼠中利用免疫印迹法对PALM(Paralemlllin)蛋白图案进行分析的图。
图5是在心血管疾病患者中利用免疫印迹法对PALM蛋白图案进行分析的图。
图6是从心血管疾病患者的血清分析作为现有标记物的CK-MB及Troponin-T的蛋白质图案的图。
图7是从心血管疾病患者的血清分析作为现有标记物的CK-MB及Troponin-T蛋白质图案的图。
图8是根据心血管疾病患者的血清而与现有标记物比较分析PALM(Paralemmin)蛋白图案的图。
具体实施方式
以下，详细地对本发明进行说明。
本发明提供一种包含特异性地结合到PALM(Paralemmin)的抗体的心血管类疾病诊断用试剂盒。
所述心血管类疾病诊断用试剂盒的特征在于，所述PALM在心血管类疾病患者中增加表达量。
所述抗PALM抗体均可使用通过注入PALM蛋白而制作的抗PALM抗体或市售的抗PALM抗体，所述PALM优选为人PALM，更优选为具有记载为序列1的PALM氨基酸序列的PALM。另外，所述抗体包含可与多克隆抗体、单克隆抗体及表位(epitope)结合的片段等。
多克隆抗体可通过向动物注射所述PALM蛋白并从所述动物进行采血而获得包含抗体的血清的以往的方法来生产。这种多克隆抗体可通过本技术领域人员所熟知的任一方法纯化，可从山羊、兔子、老鼠、大鼠、鸡、绵羊、猴子、马、猪、牛、狗等任意的动物宿主制造，优选为以兔子为宿主，但并不限定于此。
单克隆抗体可使用通过连续细胞株的培养生成抗体分子的任一技术来制造。作为这种技术，包含融合瘤技术、人鼠B-细胞融合瘤技术及EBV(Epstein Barr virus，埃-巴二氏病毒)-融合瘤技术，但并不限定于此(Kohler G et al.,Nature 256:495-497,1975；Kozbor D et al.,J Immunol Methods 81；31-42,1985；Cote RJ et al.,Proc Natl Acadsci80:2026-2030,1983；及Cole SP et al.,Mol Cell Biol 62:109-120,1984)。
另外，可制造含有对所述PALM蛋白的特定结合位点的抗体片段。例如，可将抗体分子分解成胃蛋白酶而制造F(ab')2片段，可通过还原F(ab')2片段的二硫桥键而制造Fab片段，但并不限定于此。作为其他方法，可使Fab表达库变小而迅速且简便地鉴定所需的具有特异性的单克隆Fab片段(Huse WD et al.,Science 254:1275-1281,1989)。
为了使清洗或复合体的分离等后续步骤变容易，所述抗体可结合到固体基质(solid substrate)。固体基质例如有合成树脂、硝化纤维素、玻璃基板、金属基板、玻璃纤维、微细球体及微珠等。另外，在所述合成树脂中，有聚酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、PVDF(Polyvinylidene Fluoride，聚偏二氟乙烯)及尼龙等。
所述抗体可结合显色酶、显色物质、或荧光分子，可结合到配位体。所述显色酶优选为HRP(horseradish peroxidase，辣根过氧化酶)或碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)。另外，所述显色物质优选为胶体金(coloid gold)，所述荧光分子可使用羧酸荧光素(FCA)、异硫氰酸荧光素(FITC)、硫脲荧光素(FTH)、7-乙酰氧基香豆素-3-基、荧光素-5-基。荧光素-6-基、2',7'-二氯荧光素-5-基、2',7'-二氯荧光素-6-基、二氢四甲基亚硝基氨-4-基、四甲基若丹明-5-基、四甲基若丹明-6-基、4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚烯-3-乙基或4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚烯-3-乙基等。
所述配位体优选为对生物素、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素具有本质上与生物素相同的结合作用的生物素衍生物，还可追加性地包含结合在特异性结合分子的显色酶、结合有显色物质或荧光分子的可视化共轭物。
在所述配位体中，有特异性地结合到蛋白质A或检测用抗体的二次抗体等。
本发明的心血管疾病诊断用试剂盒可追加包含与酶发生显色反应的基质、及可去除未结合的蛋白质等而仅保留所结合的标记物的清洗液或洗脱液。为了进行分析而使用的试料包含血清、尿、眼泪、唾液等可确认到可与正常状态加以区分的疾病特异性多肽的生物体试料。作为所述清洗液，优选为包含磷酸盐缓冲溶液、NaCl及吐温20(Tween 20)，但并不限定于此。
本发明的心血管疾病诊断用试剂盒通过抗原-抗体结合反应或蛋白质-配位体结合反应而定量或定性地分析结合反应，由此可诊断心血管疾病，所述结合反应可利用通常的酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)、夹心测定法(sandwich assay)、免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组织化学染色法(immunohitochemicalstaining)、荧光免疫法、酶基质显色法、抗原-抗体-凝集法等方法进行测定。
所述心血管疾病可为选自动脉粥样硬化、缺血性心脏疾病、冠状动脉心脏疾病(CHD)、再狭窄、脑中风、高血压、心功能不全、心律不齐、心肌病、心内膜炎、末梢动脉疾病、冠状动脉旁路移植术、颈动脉疾病、动脉炎、心肌炎、心血管炎、脉管炎、不稳定型心绞痛(UA)、不稳定型难治愈性心绞痛、稳定型心绞痛(SA)、慢性稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征(ACS)、心肌梗塞、包含一次或复发型心肌梗塞、无Q波型心肌梗塞、非ST段抬高型心肌梗塞及ST段抬高型心肌梗塞在内的急性心肌梗塞(AMI)中的任一种以上。
在本发明的具体实施例中，构建心血管疾病小鼠模型(参照图1)，利用1-D凝胶而与正常组比较在心血管疾病小鼠模型中表达的蛋白质，利用内部数据库服务器确认作为特定蛋白质之一的PALM(Paralemmin)(参照图2及图3)。在心血管疾病小鼠中分析PALM蛋白图案，结果确认到从心血管疾病小鼠获得的血清的PALM依存于LAD结扎后的时间而增加(参照图4)。另外，在心血管疾病患者中分析PALM蛋白图案，结果确认到与正常人相比，PALM在引发心肌梗塞的心血管疾病患者中增加(参照图5)。确认到与正常人相比，作为现有的标记物的CK-MB及Troponin T在心血管疾病患者中增加(参照图6及图7)。另外，确认到本发明的PALM与作为现有的心血管疾病标记物的CK-MB及Troponin T的表达图案相似(参照图8)。
因此，确认到与正常人血液相比，本发明的PALM(paralemmin)蛋白的表达量在心血管疾病患者的血液中增加，且确认到可通过简单的采血而简便地诊断心血管疾病，由此可有效地用作心血管疾病诊断用标记物。
另外，本发明提供一种用以提供诊断心血管疾病的信息的蛋白质检测方法，其包含如下步骤：
1)从患者的分离的试料测定PALM的表达量的步骤；及
2)筛选所述步骤l)的蛋白质的表达量高于正常对照组的个体的步骤。
在所述步骤l)中，在使从患者获得的试料与可特异性地结合到结合在固体基质的本发明的标记蛋白质的抗体接触的情况下，可在与抗体接触前适当地稀释试料。优选为可从生物学液体试料、例如血液、血清、血浆进行测定，更优选为可从血清进行测定。能够以增加标记物的侦测感度的方式准备试料，例如可利用阴离子交换层析法、亲和层析法、尺寸排阻层析法(size exclusion chromatography)、液体层析法、连续提取(sequentialextraction)或凝胶电泳等方法对从患者获得的血清试料进行预处理，但并不限定于此。
在所述步骤2)中，对所述标记物处理检测用抗体后，探测检测用抗体的量，由此可对心血管疾病进行监控、诊断及筛查。或者，在对所述抗体及标记复合物依次处理检测用抗体及配位体后，探测检测用抗体的量，由此可对心血管疾病进行诊断及筛查。在对检测用抗体与经清洗的抗体-标记复合物进行恒温配置后，进行清洗而测定检测用抗体，由此可测定所述标记物的量。可通过荧光、发光、化学发光(chemiluminescence)、吸光度、反射或透射而测定检测用抗体的量或检测是否存在检测用抗体。
另外，作为探测所述检测用抗体或配位体的量的方法，优选为利用超高速筛查(high throughput screening(HTS))系统的方法，此处优选为利用如下方法，但并不限定于此：以荧光物质附着到检测体而检测荧光的方式执行的荧光法、或以放射线同位素附着到检测体而检测放射线的方式执行的放射线法；无检测体的标记而实时测定表面的等离子体共振变化的SPR(surface plasmon resonance，表面等离子体共振)方法或将SPR系统成像化而进行确认的SPRI(surface plasmon resonance imaging，表面等离子体共振成像)方法。
例如，所述荧光法是利用荧光扫描程序将所述检测用抗体标示成荧光物质后进行定位而确认的方法，可应用这个方法确认结合强度。所述荧光物质优选为选自由Cy3、Cy5、多聚赖氨酸-异硫氰酸荧光素(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate，FITC)、若丹明B异硫氰酸酯(rhodamine-B-isothiocyanate，RITC)、若丹明(rhodamine)所构成的群组中的任一种，但并不限定于此。
所述SPR系统与荧光法不同，无需将试料标记成荧光物质而可实时分析抗体的结合程度，但具有无法进行同时多发性试料分析的缺点。在SPRI的情况下，可利用微排列方法实现同时多发性试料分析，但具有侦测强度较低的缺点。
因此，确认到与正常人的血液相比，本发明的PALM(paralemmin)蛋白的表达量在心血管疾病患者的血液中增加，由此可通过所述PALM的表达水平的特性而有效地使用在心血管疾病的诊断技术中。
以下，根据实施例及实验例而详细地本发明进行说明。
然而，下述实施例及实验例仅为例示本发明的实施例及实验例，本发明的内容并不限定于下述实施例及实验例。
＜实施例1＞心血管疾病小鼠模型的构建
为了执行用以测定在心血管疾病中表达的特定蛋白质并将所述特定蛋白质活用作标记物的实验，构建被诱发心血管疾病的小鼠模型。
具体而言，对8周龄的成熟小鼠进行注射麻醉，以腹面朝上的方式将小鼠固定到手术台上后，通过气管插管使其保持机械呼吸。对机械呼吸已稳定化的小鼠的胸部左侧的皮肤进行消毒，切开1cm左右而分离皮肤与正下方的大胸肌和小胸肌。此后，切开大胸肌与小胸肌后，使第四个肋间露出。利用微剪刀切开所露出的第四个肋间而开放胸腔，利用牵引器(retractor)使第四个肋间扩开1～1.5cm左右而使心脏露出。利用聚丙烯(polyprolene)手术线对分布在距左耳3～5mm的下侧的心脏的冠状动脉左前降支(left anteriordescending coronary artery(LAD))进行结扎而阻断向左心室肌的血液供给，由此诱发心肌梗塞。在LAD结扎结束后，对第四个肋骨与第五个肋骨进行结扎，由此闭合胸腔，利用导管吸出胸腔内的空气而使胸腔内的负压恢复，从而使小鼠可自主呼吸。此后，按照小胸肌、大胸肌及皮肤的顺序进行缝合而对伤口部位进行消毒后，使小鼠复原(图1)。
其结果，在手术24小时后，通过血液内的肌酸激酶(creating kinase(CK))及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase(AST))分析确认到是否已诱发心肌缺血(myocardial ischemia)，在手术7天后，取出心脏而确认到左心室壁变薄。
＜实施例2＞利用1-D凝胶分离在心血管疾病小鼠模型中表达的特定蛋白质
为了利用从所述＜实施例1＞的心血管疾病小鼠模型获得的组织或血清确认在心血管疾病小鼠模型中表达的特定蛋白质而执行下述实验。
具体而言，在溶解正常对照组(N1、N2、N3及N4)与心血管疾病小鼠模型组(P14、P17、P22及P26)的组织或血清后进行采样。将各样品电泳到ID-凝胶后，为了确认而进行染色。将图2中以箭头表示的带(Band)切断成约1mm～2mm的尺寸而放入到1.5ml的管中，添加200μl的脱色溶液(destaining solution)而在常温下进行一夜的脱色。次日，利用移液管以不会带出凝胶的方式小心地去除脱色溶液，利用200μl的脱色溶液在常温下再次进行2～3小时的脱色，以便完全去除染料。将200μl的乙腈(acetonitrile)放入所述管后，在常温下进行5分钟的脱水化(dehydrate)，利用移液管小心地去除溶液。利用真空离心分离器(vacuum centrifuge)2～3分钟而使其完全干燥。其次，放入30μl的10mM DTT(Dithiothreitol，二硫苏糖醇)，在常温下还原蛋白质的双硫键30分钟。利用移液管去除DTT，添加30μl的50mM碘乙酰胺(iodoacetamide)后，在常温下将蛋白质烷基化(alkylate)30分钟。利用移液管去除碘乙酰胺，放入200μl的乙腈，在常温下进行5分钟的脱水化，再次利用移液管去除溶液。利用真空离心分离器干燥2～3分钟。混合20μg的胰朊酶(trypsin)与利用冰块变冰冷的(ice-cold)1000μl的50mM碳酸氢铵(ammonium bicarbonate)而在冰块条件下准备胰朊酶溶液。对各样品放入30μl的胰朊酶溶液，在冰块条件下进行45分钟的再水合(rehydrate)后，进行30秒钟的离心分离而使样品下沉。去除胰朊酶溶液，在样品中放入50μl的50mM碳酸氢铵，在37℃下分解(digestion)一夜。将上层转移到崭新的1.5ml的管中，放入50μl的提取缓冲液(extraction buffer)进行涡旋，进行1小时的肽提取。进行30秒钟的离心分离而使样品下沉，混入到崭新的l.5ml的管中，利用真空离心分离器进行干燥，利用微量层析柱(zip tip)对肽进行纯化。
通过利用1.7μm的BEH C18柱(75μm×150mm；Waters)的NanoAcquity(纳升级)UPLC(ultra performance liquid chromatography，超高效液相层析法)系统(Waters)对经胰朊酶处理的肽进行分离。此时，所使用的条件为从2％至40％(体积/体积)的乙腈(0.1％(体积/体积)甲酸中的)呈40-min linear gradient(40分钟线性梯度)，溶液移动速度为300nL/分。利用与column output(柱输出端)结合的纳米喷雾装置(nanospray device)将所溶出的肽(Eluting peptide)注入到Synapt Q-TOF MS设备(waters)内。为了以质量基准值使用格外的[Glul]血纤维肽B(fibrinopeptide B)(400fmol/μL；Sigma)，在阳离子模式(positive mode)下每30秒获得一次质谱。为了获得数据依存性ms/ms质谱而使用液相层析-质量分析(liquid chromatography mass spectrometry(LC-MS))数据，通过[Glul]血纤维肽B(fibrinopeptid B)测定准确的质量值。在350～1,600m/z范围内，通过在MSsurvey scan(测量扫描)(O.68s)中检测到的具有最强信号的离子的肽片段收集MS/MS质谱。此时，使用从电荷及质量值自动地调节的碰撞能量(collision enegy)，以测定到的母离子(precursur ion)的m/z与电荷状态为基础而在此后排除ms/ms质谱的收集30秒钟(图2)。
＜实施例3＞从1-D凝胶分离的蛋白质的确认
利用下述程序对从所述＜实施例2＞获得的液相层析-质量分析仪数据进行分析。
具体而言，利用Mascot 2.3.0(Matrix Science)，通过内部数据库服务器(in-house database server)进行数据库(Database)研究。数据库参数(parameters)为分类(taxonomy)(Homo sapiens)、酶(trypsin)、可变性修饰(variable modifications)(氧化(oxidation)[M])、固定修饰(半胱氨酸碘乙酰胺化(Carbamidomethyl[C])，质量值(monoisotopic)、肽质量误差(peptide mass tolerance)(30ppm)、片段质量误差(fragment mass tolerance)(0.1Da)、及最大未酶切位点(max missed cleavages)，设备型号为ESI-QLAD-TOF。
其结果，如图3所示，作为利用所述样品对质量进行分析的结果，将PALM(paralemlllin)选作候选标记物之一而进行分析。
＜实验例1＞在心血管疾病小鼠中分析PALM(Paralelllmin)蛋白图案
利用从所述＜实施例3＞获得数据，调查作为与心血管疾病相关的候选标记物之一的PALM(Paralemmin)的图案。
具体而言，在进行LAD结扎后，通过采血从心血管模型小鼠中分别获得第1个小时、第1天、第4天及第10天的心脏组织及血清样品。将心脏组织溶解到RIPA(Radio ImmunoPrecipitation assay放射免疫沉淀测定)缓冲液，即时涡旋(vortex)混合血清样品后，在13,00O rpm、4℃的条件下对各个样品进行30分钟的离心分离(Hanil centrifuge modelMICRO17TR)。以成为1∶1∶1的比率的方式一同混合上清液、RIRA缓冲液与加样缓冲液而制作混合物，以5μl为单位加载到12％SDS PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中。此后，进行一夜的考马斯亮蓝染色(coomassie blue stain)后，利用染色去除缓冲液(destaining buffer)以20分钟为单位清洗10次。切出2μg左右的小鼠心脏组织后，连同1ml的RIPA缓冲液与珠粒(bead)一并利用均质器(QIAGEN tiissue lyser LT homogenizer)提取蛋白质。利用蛋白质定量分析试剂盒(Pierce BCA Protein assay kit)将各个样品定量成蛋白质4μg，以每孔10μl加载到12％SDS PAGE凝胶中后，利用伯乐小型电泳系统(Bio-rad Mini-PROTEANTetra system)以80V、2小时的条件进行电泳。在进行电泳后，利用电泳仪TE22(hoeferTE22)以250V进行2小时的凝胶向PVDF膜的转移。免疫印迹法使用5％脱脂乳粉进行1小时的阻断(blocking)，作为一次抗体将β-肌动蛋白(beta-actin)(santacruz sc-8118)与PALM(paralemmin)(santacruz sc-365869)分别按照1∶1000进行稀释而培养2小时。在对一次抗体进行培养后，利用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)-T以5分钟为单位清洗3次，使用作为二次抗体的小鼠-HRP IgG(Sigma，a9917)，以1∶6000的稀释比率培养40分钟后，利用PBS-T以10分钟为单位清洗6次。向所述膜喷洒ECL(Electrochemiluminescence，电化学发光)溶液(Bio-rad，Clarity western ECL substrate)后，使其暴露在x-ray(X射线)底片。
其结果，如图4所示，确认到从心血管疾病小鼠获得的血清的PALM在LAD结扎后依存于时间而增加。另外，确认到与对照组相比，PALM在从心血管疾病小鼠获得的血清及组织中增加(图4)。
＜实验例2＞在心血管疾病患者中分析PALM(Paralemmin)蛋白图案
为了在人体中调查PALM的图案，利用从心血管疾病患者获得的血清执行下述实验。
具体而言，对正常人(N1至N7)与心血管疾病患者(T组及P组)的血清样品进行涡旋而即时混合，以13,000rpm、30分钟、4℃进行离心分离(Hanil centrifuge modelMICRO17TR)。以成为1∶1∶1的方式混合上清液、RIPA缓冲液与加样缓冲液而制作蛋白质样品后，以5μl为单位加载到12％SDS PAGE凝胶中。在进行电泳后，执行一夜的考马斯亮蓝染色，利用染色去除缓冲液(destaining buffer)以20分钟为单位清洗10次。以每孔5μl加载到12％SDS PAGE凝胶中，利用伯乐小型电泳系统(Bio-rad Mini-PROTEAN Tetra system)以80V、2小时的条件进行电泳。在进行电泳后，利用电泳仪TE22(hoefer TE22)以25O V进行2小时的凝胶向PVD膜的转移。利用5％脱脂乳粉对经转移的膜进行1小时的阻断，利用按照1∶l000稀释而成的一次抗体PALM(paralemmin)(santacruz，sc-365869)、Cl(santacruz，sc-61750)、铁传递蛋白(transferrin)(abcam，ab1223)及CYBSD2(santacruz，sc-136639)培养2小时，利用PBS-T以5分钟为单位清洗3次。按照1∶6000稀释作为二次抗体的小鼠-HRP IgG而培养40分钟后，利用PBS-T以10分钟为单位清洗6次。利用ECL溶液(Bio-rad)进行显影。
其结果，如图5所示，确认到与正常人相比，PALM1在诱发心肌梗塞的心血管疾病患者中增加。相反地，确认到与正常人相比，铁传递蛋白受体(transferrin receptor)、CYB5D2及CHMP4A在诱发心肌梗塞的心血管疾病患者中减少(图5)。
＜实验例4＞根据心血管疾病患者的血清而与现有标记物比较分析PALM(Paralemmin)蛋白图案
为了根据心血管疾病患者的血清而与现有标记物(CK-MB及Troponin T)调查PALM(Paralemmin)蛋白图案，执行如下实验。
具体而言，汇集心血管疾病患者的血清蛋白样品中表现出差异性的表达图案的组而通过与所述＜实验例3＞相同的方法进行电泳及免疫印迹。另外，为了与PALM免疫印迹数据进行比较而在相同的样品中执行对CK-MB及Troponin T的ELISA，利用0.1M的碳酸缓冲液(carbonate buffer，pH值为9.6)以成为1μg/ml的浓度的方式稀释对CK-MB及Troponin T的单克隆抗体(1μg/ml)，以100μl为单位分注到96孔的微量滴定板(microtiter plate)。利用所述CK-MB及Troponin T单克隆抗体在4℃下涂敷一夜后，利用包含0.05％吐温20(tween-20)的PBS-T清洗3次。利用1％BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)溶液在常温下进行2小时的阻断后，利用PBS-T溶液清洗3次。稀释所述样品的抗原而添加100μl后，在常温下反应2小时，利用PBS-T溶液清洗3次。以100μl为单位稀释对CK-MB及Troponin T蛋白的多克隆抗体(按照1∶1000稀释)后，反应2小时而进行清洗。此后，放入稀释成1000倍的接合有辣根过氧化酶(HRP)的二次抗体100μl后，在常温下反应1小时而清洗3次，最后利用OPD(o-Phenylenediamine，邻苯二胺)溶液进行显色。利用测定器(ELISA reader，MolecularDevice，Sunnyvale，CA，USA)在490nm波长下测定经显色的样品的吸光度。
其结果，如图6及图7所示，确认到与正常人相比，作为现有的标记物的CK-MB及Troponin T在心血管疾病患者中增加(图6)。确认到随着从低浓度增加到高浓度而各组的CK-MB的表达图案与Troponin-T表达图案相似(图6及图7)。另外，如图8所示，确认到作为本发明的新颖的心血管标记物的PALM(paralemmin)显示出与作为现有的心血管疾病标记物的CK-MB及Troponin T相似的表达图案，由此确认到可用作新颖的心血管疾病标记物(图8)。

Claims (13)

1.特异性地结合到具有记载为序列1的氨基酸序列的PALM的抗体在制备心肌梗塞诊断用试剂盒中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述PALM在心血管类疾病患者中增加表达量。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗体结合到固体基质(solidsubstrate)。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述固体基质选自由合成树脂、硝化纤维素、玻璃基板、玻璃纤维和微细球体所构成的群组。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗体结合有显色酶或荧光分子。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗体结合有显色物质。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述显色酶为HRP(horseradishperoxidase)或碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述显色物质为胶体金(coloid gold)。
9.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述荧光分子为FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate)或RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)。
10.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于：所述抗体结合在配位体。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述配位体为生物素、或对抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)具有本质上与生物素相同的结合作用的生物素衍生物。
12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述配位体进一步包含结合有显色酶或荧光分子的可视化共轭物，
其中所述显色酶或荧光分子结合有特异性结合分子。
13.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述配位体进一步包含结合有显色物质的可视化共轭物，
其中所述显色物质结合有特异性结合分子。
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