CN103197076A - 用于诊断癌症的生物标志物以及使用该生物标志物分离癌细胞的方法 - Google Patents

Abstract

用于检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的生物标志物，用于检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的试剂盒(该试剂盒包括抗生物标志物的抗体)，使用该试剂盒诊断癌症的方法，以及分离癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的方法。通过使用癌症诊断的生物标志物以及包括抗生物标志物的抗体的试剂盒，有效地检测和分离癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞。

Description

用于诊断癌症的生物标志物以及使用该生物标志物分离癌细胞的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年1月10日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2012-0003081的优先权，在此将其全部公开内容引用作为参考。 

技术领域

本文涉及多种用于检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的循环癌细胞的生物标志物，用于检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括生物标志物，用其诊断癌症的方法，以及分离癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的方法。 

背景技术

在具有实体癌的患者中出现的肿瘤转移是涉及单个肿瘤细胞的释放和这些细胞经由血管转移至身体其他部位的过程，是癌症引起死亡的主要原因。目前，通常使用活组织检测(在转移的早期阶段将组织的一部分取出并进行分析的方法)来诊断癌症。但是，该方法的缺点是不易确定准确的活检位点。另一方面，目前备受关注的液体活组织检测是仅收集血液样品并检测血液中肿瘤细胞的方法。该方法的优点在于确定癌症进展和治疗，以及在早期阶段检测和诊断癌症。 

随着对能快速确定转移癌病人治疗结果和灵敏反映药效的检测方法的强烈需求，对因肿瘤浸润而出现在癌症患者血流中的循环肿瘤细胞(CTC)、以及患者其它器官中出现了但未被临床发现的播散型肿瘤细胞(disseminatedtumor cell,DTC)的检测越来越受到关注。CTC是出现在血液中、并因此在机体中循环和在肿瘤转移中发挥关键作用的罕见肿瘤细胞。相应地，检测血液中的肿瘤细胞仍是癌症诊断和治疗中重要的课题。 

目前，作为抗癌治疗的方法，在所有未经确认CTC或DTC存在与否的 病例中，都对大多数患者给药抗癌药物。因此，对于根据经检测和分析CTC而确定的CTC的存在与否来选择性给予抗癌药物，或者对于根据CTC的分子性质来进行个性化给药以改进抗癌药物的效力，都有需求。 

已知CTC涉及癌症的转移和复发。尤其是，已有人提出，CTC很可能包含癌症干细胞，后者是近期癌症研究的最重要的主题。因此，人们希望有通过分析CTC来预测现有活检方法无法预测的癌症预后的新可能性，并希望有基于它来开发个性化治疗方案的可能性。 

但是，CTC在血液中的含量非常少且不稳定，故很难检测CTC和对其进行计数。因此，仍需要开发能检测患者机体中CTC、癌细胞或癌症干细胞的高度敏感的诊断方法，以及有效分离生物样品中所含CTC的方法，以及有关的设备。 

发明概述

本发明提供了用于检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的生物标志物，该生物标志物包括窖蛋白(Caveolin)-1。 

本发明提供了用于检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的试剂盒，该试剂盒包括特异性结合窖蛋白-1的抗体，或其片段或其抗原结合片段。 

本发明提供了用于从生物样品中检测窖蛋白-1以提供癌症诊断所需的信息的方法。 

本发明提供了用窖蛋白-1作为生物标志物来分离癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的方法。 

附图说明

通过后文对实施方案的描述，并结合附图，本发明的这些和/或其他方面将更为明显和更容易理解： 

图1示出了根据本发明一实施方式的western印迹结果，其显示九种癌细胞系中窖蛋白-1的表达水平； 

图2A~2C的图是显示根据本发明多个实施方式的免疫细胞化学和western印迹结果，它们表明，在MCF7细胞系中诱导了上皮-间充质转换，其中，球形表示上皮-间充质转换-诱导的细胞； 

图3的图显示根据本发明一实施方式的比较结果：其比较了具有窖蛋白-1抗体的珠与经历了上皮细胞-间充质转化的MCF-7细胞结合的结合亲和力、和这些珠与正常癌细胞结合的结合亲和力；以及 

图4的图显示根据本发明实施方式的western印迹结果，确认窖蛋白-1、蜗牛蛋白(Snail)、ALDH1、CD133和CD44在上皮-间充质转换-诱导的MCF7细胞中的表达水平。 

发明详述

现在详细描述各实施方案，附图中举例说明了它们的实例，其中同样的参考号指代全文上下的相同要素。在这点上，当前的实施方案可以具有不同的形式且不应解释为限于本文中所列的描述。因而，下文仅仅为了解释本说明书的各方面而参照附图来描述各实施方案。 

根据本发明的一实施方式，本发明提供用于检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的生物标志物，该生物标志物包括窖蛋白-1，与正常癌细胞相比，其在癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞中具有相对较高的表达水平。 

窖蛋白-1是由CAV1编码的蛋白质，已知其是胞膜窖(caveolae)中的主要蛋白质，并且是参与促进细胞周期进程的蛋白质，而胞膜窖是能在大多数类型的人细胞中发现的细胞膜上的内陷结构。此外，窖蛋白-1的氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示。 

根据一实施方式，窖蛋白-1显示出与其他在癌细胞(例如，癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞)中用作现有的生物标志物的蛋白质相同的表达增加模式，因此，窖蛋白-1可以作为生物标志物用于癌症诊断的，尤其是用于检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞。 

根据本发明的另一实施方式，本发明提供用于检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的试剂盒，该试剂盒包括与窖蛋白-1或其片段特异性结合的抗体或其抗原结合片段。 

窖蛋白-1的片段可以例如是免疫原性片段，它是指，具有生物标志物蛋白上至少一个能被抗窖蛋白-1(其为生物标志物蛋白)的抗体识别的表位的片段。 

根据本发明一实施方式的癌症诊断试剂盒可以用多种本领域已知方法 中的一种来制备，该试剂盒通常可以包括冻干的抗体以及缓冲液、稳定剂、无活性的蛋白质等。抗体可以用放射性核素、荧光染料或酶来标记。 

根据一实施方式，该试剂盒可以用来检测癌细胞，例如癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞，但不限于此。 

抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。多克隆抗体可以根据本领域多种已知方法中的一种，通过向外源宿主注入生物标志物蛋白质或其片段作为免疫原来制备。外源宿主包括哺乳动物例如小鼠、大鼠、绵羊、以及兔子。免疫原注射可以通过肌肉注射、腹腔内注射或皮下注射来进行，在这种情况下，通常可以与佐剂一起用以改进抗原性。然后，定期从外源宿主采血以收集有增加的滴度和抗原特异性的血清，从中分离和纯化抗体。 

单克隆抗体可以用本领域已知的经融合而制备永生化细胞系的技术来制备。下面将简述该制备方法。首先，获得适当量(约10μg)的纯蛋白，用它免疫Balb/C小鼠。或者，合成纯蛋白的多肽片段，与牛血清白蛋白结合，用其免疫小鼠。然后，从小鼠中分离出产生抗体的淋巴细胞，将其与人或小鼠的骨髓瘤融合，以制备永生化杂交瘤。然后，用ELISA法选出并仅仅繁殖能产生所需单克隆抗体的杂交瘤，从培养物中分离和纯化单克隆抗体。 

单克隆抗体可以以不同方式用于免疫测定试剂盒(例如，ELISA、抗体包被的试管的测试、侧向流测试(lateral-flow test)、便携式生物传感器)，还可以通过开发高度特异和灵敏的抗体来开发具有针对各种癌细胞的检测范围(detection spectrum)的蛋白质芯片。 

在一实施方式中，抗原结合片段可以选自：scFv片段、(scFv)₂片段、Fab片段、Fab'片段、以及F(ab′)₂片段，但不限于这些。本文中使用的术语“抗原结合片段”是指完整免疫球蛋白的片段，以及多肽上包含抗原结合区的任何部分。Fab片段具有一个抗原结合位点并且含有轻链和重链两者的可变区，轻链的恒定区，以及重链的第一恒定区CH1。Fab'片段不同于Fab片段，因为Fab'片段另外包括重链的铰链区，其在重链C_H1区的C末端包括至少一个半胱氨酸残基。Fab'片段的半胱氨酸残基通过在铰链区的二硫键连接形成了F(ab′)₂片段。Fv片段是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，制备Fv片段的重组技术是本领域公知的。双链Fv片段可以具有将重链可变区通过非共价键与轻链可变区连接的结构。单链Fv片段通常具有在下述双链Fv片段中的二聚体结构，在所述双链Fv片段中，重链可变区与轻链可变区 通过肽接头共价连接或在其C-末端彼此直接连接。抗原结合片段可以用蛋白酶获得(例如，完整抗体用木瓜蛋白酶消化以获得Fab片段或用胃蛋白酶消化以获得F(ab')₂片段)，也可以通过基因重组技术来制备。 

根据本发明的另一实施方式，本发明提供从生物样品中检测窖蛋白-1的方法，以提供诊断癌症所需的信息，该方法包括从很可能患有癌症的生物样品中检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞，与正常癌细胞相比，癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞具有相对较高的窖蛋白-1表达水平；并且根据检测结果来确定是否在生物样品中发展了癌症。 

根据从生物样品中检测窖蛋白-1的方法，该方法可以包括从很可能患有癌症的生物样品中检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞，与正常癌细胞相比，癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞具有相对较高的窖蛋白-1表达水平。 

该检测方法可以通过用检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的试剂盒来进行，以及可以通过免疫测定法来进行。免疫测定法可以用常规开发的免疫测定或免疫染色法来准备。免疫测定或免疫染色法的实例包括：放射免疫分析、放射免疫沉淀、免疫沉淀、酶联免疫吸附试验(ELISA)、捕获-ELISA、抑制或竞争试验、夹心分析、流式细胞术、免疫荧光染色和免疫亲和纯化，但不限于此。例如，在放射免疫测定法的实施方式中，可以使用放射性同位素标记的抗体来检测窖蛋白-1。放射性同位素可以是例如C¹⁴、I¹²⁵、P³²或S³⁵。 

在ELISA方法的实施方式中，该方法可以包括：(i)利用正常人和很可能患有癌症的受试者各自的血液样品来包被固体基质的表面；(ii)使血液样品与特异性结合窖蛋白-1的抗体或其片段(作为第一抗体)接触；(iii)使(II)步骤所得产物与偶联酶的第二抗体反应；以及(iv)检测酶的活性。 

固体基质可以是碳氢聚合物例如聚苯乙烯或聚丙烯、玻璃、金属或凝胶。例如，固体基质可以是微量滴定板。与第二抗体偶联的酶可以是催化显色反应、荧光反应、发光反应或红外反应的酶，但不限于上述。例如，酶可以是碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶或细胞色素P₄₅₀。当使用碱性磷酸酶时，可以使用溴-氯-吲哚-磷酸(BCIP)、氮蓝四唑(NBT)、萘酚-AS-B1-磷酸、或增强型化学荧光(ECF)作为底物。当使用辣根过氧化物 酶时，可以使用氯萘酚、氨基乙基咔唑、二氨基联苯胺、D-荧光素、光泽精(双N-甲基吖啶硝酸)、7-苄氧基试卤灵(resorufin benzyl ether)、鲁米诺、Amplex红试剂(10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪)、超敏反应溶液(HYR:p-苯二胺-HCl和邻苯二酚)、四甲基联苯胺(TMB)、2,2-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉磺酸](ABTS)、邻苯二胺(OPD)和萘酚/派若宁、葡萄糖氧化酶和t-氮蓝四唑(t-NBT)或m-吩嗪硫酸甲酯(m-PMS)作为底物。 

在捕获-ELISA法的实施方式中，该方法可以包括：(i)利用特异性结合窖蛋白-1的抗体或其片段(作为捕获抗体)包被固体基质的表面；(ii)使捕获抗体和很可能患有癌症的受试者的血液样品接触来诱导抗原-抗体反应；(iii)使(II)步骤的产物与附着有产信号的标记的检测抗体反应；以及(iv)检测标记所产生的信号。所述检测抗体可以具有能产生可检测的信号的标记。所述标记可以是化学标记例如生物素；酶标记例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶和细胞色素P₄₅₀；放射性标记例如C¹⁴、I¹²⁵、P³²和S³⁵；荧光标记例如荧光素；发光标记；化学发光标记；或荧光共振能量转移(FRET)标记，但不限于此。 

ELISA法和捕获-ELISA法中的酶活性或信号的最终测定可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行，从而能够定量或定性地分析窖蛋白-1。例如，在使用生物素标记抗体的情况下，信号可以简单地通过链霉亲和素来检测，在使用荧光素酶标记的抗体的情况下，信号可以简单地通过荧光素来检测。 

作为上述试剂盒，可以使用微芯片或自动微阵列系统，它们通过在微芯片上固定特异性结合窖蛋白-1的抗体或其片段，以及然后使所述抗体与从受试者分离的生物样品反应，可以检测所述抗体的抗原。用这种方法，可以一次分析大量生物样品。 

根据一实施方式，生物样品可以是含有癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的任何样品。例如，生物样品可以选自：血液、骨髓液、淋巴液、唾液、泪液、尿液、粘液、羊水、以及它们的组合，但是不限于此。 

检测窖蛋白-1的方法可以包括根据测定结果确定是否在生物样品中发展了癌症。 

换言之，可以通过分析来自上述免疫测定的最终信号的强度来诊断癌症。例如，当很可能罹患癌症的受试者的样品(例如血液)的窖蛋白-1信号强 于正常对照样品的相应信号时，可以诊断受试者罹患了癌症。 

根据本发明的另一实施方式，分离癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的方法包括：从生物样品中检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞(其表面上表达了窖蛋白-1)；以及从生物样品中分离检测到的癌症干细胞或检测到的经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞。 

根据分离癌细胞的方法，首先，该方法可以包括从生物样品中检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞(其表面上表达了窖蛋白-1)。 

根据一实施方式，癌细胞可以是癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞，但不限于此。 

如上所述，窖蛋白-1可以用作用于检测癌细胞，例如癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的生物标志物。因此，可以使用抗窖蛋白-1的抗体或其抗原结合片段来进行窖蛋白-1的检测。例如，可以用抗窖蛋白-1的抗体或其抗原结合片段，以及结合了可检测标记例如荧光标记的珠，通过与生物样品中癌细胞表面的窖蛋白-1发生抗原-抗体反应，来进行检测步骤。 

在检测步骤之后，该方法可以包括从生物样品中分离检测出的癌症干细胞或检测出的经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞。 

例如，当使用抗窖蛋白-1的抗体或其抗原结合片段，以及结合了可检测标记例如荧光标记的珠来检测癌细胞时，分离步骤可以通过离心、过滤或色谱法来进行。分离出的癌细胞可以利用本领域技术人员熟知的培养方法来培养，从而使其适于在实验中使用。 

本发明的一或多个实施方式参考下述实施例来进一步充分地描述。但是，提供的这些实施例仅为示例性的，不意在限制本发明的范围。 

实施例1：通过微阵列检测在乳腺癌细胞系中表达的具有低EpCAM表达水平的蛋白质

51种乳腺癌细胞系根据是否表达EpCAM来区分，参考了Cancer Cell,10(6):515-527),2006，表达在乳腺癌细胞系表面的蛋白用微阵列数据来分析。根据微阵列数据，确认了包括ZR 75-1、SKBR3、MCF-7等20种乳腺癌细胞系具有EpCAM的高表达水平，并确认了包括MDA231、MDA436、MCF10A等31种乳腺癌细胞系具有EpCAM的低表达水平。分析结果表明，具有EpCAM的低表达水平的乳腺癌细胞系具有窖蛋白-1的高表达水平。 

实施例2：确认各种癌细胞系的窖蛋白-1表达水平

窖蛋白-1在各种癌细胞系中的表达水平通过western印迹确认。9种癌细胞系(购自ATCC(美国典型培养物保藏中心))，包括乳腺癌细胞系(即ZR75-1、SKBR3、MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-436、MCF10A)和前列腺癌细胞系(即PC3、LnCAP、DU145)，在100mm培养皿中的DMEM培养基中培养，再从中获得细胞提取物。每种细胞提取物取20μg，用NovexNuPAGE Bis-Tris电泳系统(Invitrogen)分离，然后转移至硝酸纤维素膜(Invitrogen,产品目录号#LC2006)。每个膜用3%脱脂牛奶封闭1小时，然后与稀释至1:1000的窖蛋白-1抗体(AbCAM,产品目录号#2910)在4℃反应18小时或更长时间。然后，将所得膜用TBS-T溶液充分清洗，以除去未反应的抗体，再将每个膜与山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)在室温反应1小时。然后，将所得膜用TBS-T溶液充分清洗，向其中添加过氧化物酶底物溶液(Thermo Scientific Pierce ECL Western Blotting Substrate,产品目录号#32106)，以产生荧光。检测产生的荧光，以比较窖蛋白-1在这9种癌细胞系中的表达水平。 

结果如图1所示，确认了在9种癌细胞系中，MDA-MB-231、MDA-MB-436、MCF-10A和DU145细胞系这几种无EpCAM表达的细胞系具有较强的窖蛋白-1表达水平。 

实施例3：制备结合有窖蛋白-1的抗体的珠

直径1或3μm的COOH聚苯乙烯(polystyrene)珠用EDC(N-羟基琥珀酰亚胺)/NHS(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐)处理，将处理过的珠添加到制得的PBS溶液中，向其中添加0.65mg/ml特异性结合窖蛋白-1的抗体，将所得溶液在室温缓慢摇动2小时，从而制得带有特异性结合窖蛋白-1的抗体的珠。 

实施例4：在乳腺癌细胞系中人工诱导上皮-间充质转换

为了在乳腺癌细胞系MCF7中诱导上皮-间充质转换，采用了下文描述的乳球体培养方法(mammosphere culture method)代替现有的贴壁培养(DMEM+10%FBS)方法。用含DMEM-F12、1x B27、20ng/ml FGF、20ng/mlEGF和5ug/ml胰岛素的培养基作为进行培养的培养基，将MCF7细胞(2x10⁵个细胞/ml)接种在100mm培养皿中，培养1周。之后，对培养的MCF7细胞进行免疫细胞化学分析。结果如图2A所示，确认EpCAM(其是上皮性 标志物)无表达，并确认波形蛋白(其是间充质标志物)的表达增加。此外，western印迹结果见图2B，图中显示，β-联蛋白(已知在上皮-间充质转换被诱导时表达下降的蛋白)量减少，蜗牛蛋白、N-钙黏着蛋白和波形蛋白(都是已知在上皮-间充质转换被诱导时表达增加的蛋白)量增加，由此证实，已经诱导了上皮-间充质转换。在这一方面，图2B和2C表明，当上皮-间充质转换被诱导时，窖蛋白-1的表达水平显著增加。 

实施例5：确认携有窖蛋白-1抗体的珠与经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的结合亲和力

为确认窖蛋白-1是否在经历了上皮-间充质转换的MCF-7细胞系表面表达，首先，如实施例4，在高水平表达EpCAM的乳腺癌细胞系MCF7中诱导上皮-间充质转换。随后，将根据实施例3而制得的结合有窖蛋白-1抗体的珠以30μl添加至在DMEM培养基中悬浮的1x 10⁵个MCF-7细胞系中，放置1小时。然后，用荧光显微镜(Olympus IX-81)通过荧光素的荧光强度来确认这些珠是否与MCF-7细胞系结合。在该实施例中，用结合有EpCAM抗体的珠作对照。结果见图3，其表明，结合有窖蛋白-1抗体的珠与经历了上皮-间充质转换的MCF-7细胞系的结合比与正常癌细胞的结合显著增加。然后，通过离心分离这些结合有窖蛋白-1抗体的珠。 

实施例6：确认窖蛋白-1是癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的标志物

为了确认窖蛋白-1能用作癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的标志物，用western印迹确认，ALDH1、CD133和CD44(都已知是癌症干细胞的标志物)，以及蜗牛蛋白(已知是经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的标志物)，是否在诱导了上皮-间充质转换的乳腺癌细胞系MCF7中表达。Western印迹按照实施例2所述进行，不同在于，用窖蛋白-1抗体(AbCAM,产品目录号#2910)、蜗牛蛋白抗体(Cell signaling产品目录号#3879)、ALDH1抗体(AbCAM,产品目录号#23375)、CD133抗体(AbCAM,产品目录号#27699)、以及CD44抗体(Cell signaling产品目录号#5640)分别作为这些标志物的第一抗体。 

结果见图4，其表明，在诱导了上皮-间充质转换的乳腺癌细胞系MCF7中，窖蛋白-1、蜗牛蛋白、ALDH1、CD133和CD44的表达水平都增加。鉴于窖蛋白-1的表达增长模式与蜗牛蛋白、ALDH1、CD133和CD44的相同， 这表明，窖蛋白-1也能用作经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的标志物，或用作癌症干细胞的标志物。 

如上所述，根据本发明的一或多种上述实施方式，通过使用癌症诊断的生物标志物以及包含抗所述生物标志物的抗体的试剂盒，可以有效地检测和分离癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞。 

应当理解本文所述的示例性实施方式仅为描述性的，并不意在限制。应理解，每个实施方式中众多特征或众多方面的描述可也适用于其他实施方式中的其他相似特征。 

Claims (9)

1.试剂盒，用于检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞，所述试剂盒包括与窖蛋白-1或其片段特异性结合的抗体或抗原结合片段。

2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述抗原结合片段选自：scFv片段、(scFv)₂片段、Fab片段、Fab'片段、以及F(ab')₂片段。

3.根据权利要求1的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体。

4.检测癌症干细胞或经历了上皮细胞-间充质转换的循环癌细胞的方法，包括：

检测正常癌细胞、以及很可能患有癌症的生物样品的细胞中窖蛋白-1的表达水平。

5.根据权利要求4的方法，其中生物样品选自：血液、骨髓液、淋巴液、唾液、泪液、尿液、粘液、羊水、以及它们的组合。

6.分离癌症干细胞或经历了上皮细胞-间充质转换的循环癌细胞的方法，该方法包括：

在生物样品中检测癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞，其中窖蛋白-1在所述癌症干细胞或循环癌细胞表面表达；以及

从生物样品中分离出检测到的癌症干细胞或检测到的经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞。

7.根据权利要求6的方法，其中所述生物样品选自：血液、骨髓液、淋巴液、唾液、泪液、尿液、粘液、羊水、以及它们的组合。

8.窖蛋白-1在制备用于检测或分离癌症干细胞或经历了上皮-间充质转换的循环癌细胞的试剂盒中的用途。

9.权利要求8的用途，其中所述试剂盒包含特异性结合窖蛋白-1的抗体或其片段或其抗原结合片段。

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