CN104059140A - Lolp-1蛋白和用于癌症的诊断等的试剂盒 - Google Patents

Lolp-1蛋白和用于癌症的诊断等的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白-1，以及一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒。

Description

LOLP-1蛋白和用于癌症的诊断等的试剂盒
技术领域
本文涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白-1(Light of life protein-1，LOLP-1蛋白)，以及一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒。
背景技术
乳腺癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌和肝癌等癌症均是目前多发和常见的癌症，并且致死率非常高。目前尚缺乏有效地针对乳腺癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌和肝癌患者的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的方法。因此，急需新的特异性高、敏感性高、易操作的、对人体无危害、能在癌症发病的早期及时诊断、并且对于治疗指导、预后判断或复发检测等具有实用价值的靶标和检测评估方法。
发明内容
针对上述问题，本发明人从人类原发性肿瘤组织中分离鉴定出一个新的特异性蛋白，即人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白-1(Light of life protein-1，LOLP-1蛋白)。该蛋白质由316个氨基酸组成，在除消化道外的正常成体组织中几乎不表达。但经本发明人的研究发现LOLP-1蛋白在人类肝癌、肺癌、乳腺癌及甲状腺癌中过度表达。相反，LOLP-1蛋白在人的正常消化道组织中高表达，但是在肠癌组织中低表达或不表达。
本发明人进一步进行了深入地研究，获得了一种新的蛋白质以及编码该蛋白质的核苷酸序列，并利用该蛋白质或其核苷酸序列的特异性，开发用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，
具体而言，本文涉及如下内容：
1.一种人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白-1(LOLP-1蛋白)，其由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成。
2.编码LOLP-1蛋白的DNA，其由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或 其互补序列构成。
3.一种重组载体，其包括项2的重组载体。
4.一种转化体，其是将项3所述的重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。
5.一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，其包含特异性检测LOLP-1蛋白的试剂。
6.项5所述的试剂盒，其中，所述特异性检测LOLP-1蛋白的试剂是特异性识别LOLP-1蛋白的抗体。
7.项6所述的试剂盒，其中所述LOLP-1蛋白由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成。
8.项5-7中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂可用于检测血清、尿液、乳汁和肠液等体液，大便或组织样本。
9.项5所述的试剂盒，其中，所述特异性检测LOLP-1蛋白的试剂是特异性识别LOLP-1蛋白核酸的引物或探针。
10.项9所述的试剂盒，其中，所述LOLP-1蛋白核酸由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。
11.项5-10中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含LOLP-1蛋白或核酸标准品。
12.项5-11中任一项所述的试剂盒，其中所述癌症选自下组：肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌和乳腺癌。
13.项5-8中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是酶联免疫法吸附测定(ELISA)试剂盒、时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)试剂盒、化学发光检测试剂盒。
14.项13所述的试剂盒，其包括：
包被有LOLP-1蛋白的特异性捕获抗体的ELISA板；
生物素标记的另一种属来源的LOLP-1蛋白的特异性检测抗体；该捕获抗体与检测抗体均可与LOLP-1蛋白结合。
15.项14所述的试剂盒，其还包括：
包被缓冲液(1×PBS，pH7.3±0.1)；
样品稀释液(1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH7.3±0.1)；
封闭液(1×PBS、3%BSA)；
洗脱液PBST(1×PBS、0.05%Tween-20)；
Streptavidin-HRP或者Streptavidin-Eu。
16.根据项14或15的试剂盒，其中捕获抗体和检测抗体是利用LOLP-1蛋白免疫动物获得的纯化抗体或单克隆抗体。
17.根据项14-16中任一项的试剂盒，其中检测抗体的生物素标记效率(生物素/抗体)为5-10。
18.根据项5-17中任一项所述的试剂盒，其中所述早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测包括：
a)利用所述特异性检测LOLP-1蛋白的试剂测量来自受试者的生物学样品中LOLP-1蛋白或核酸的水平；
b)将a)中测得的水平与正常样品中的相应水平比较。
19.根据项18的试剂盒，其中所述样品是血清、尿液、乳汁、肠液等体液，大便或组织样品。
20.特异性检测LOLP-1蛋白的试剂在制备用于癌症早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒中的用途。
21.根据项20所述的用途，其中，所述特异性检测LOLP-1蛋白的试剂是特异性识别LOLP-1蛋白的抗体。
22.根据项20所述的用途，其中所述LOLP-1蛋白由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成。
23.根据项20-22中任一项所述的用途，其中所述试剂可用于检测血清、尿液、乳汁和肠液等体液，大便或组织样本。
24.根据项20所述的用途，其中，所述特异性检测LOLP-1蛋白的试剂是特异性识别LOLP-1蛋白核酸的引物或探针。
25.根据项24所述的试剂盒，其中所述LOLP-1蛋白核酸由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。
26.根据项20-25中任一项所述的用途，其中所述试剂盒还包含LOLP-1蛋白或核酸标准品。
27.根据项20-26中任一项所述的用途，其中所述癌症选自下组：肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌和乳腺癌。
28.根据项20-22中任一项所述的用途，其中所述试剂盒是酶联免疫法吸附测定(ELISA)试剂盒、时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)试剂盒、化学发光 检测试剂盒。
29.根据项28所述的用途，其包括：
包被有LOLP-1蛋白特异性捕获抗体的ELISA板；
生物素标记的另一种属来源的LOLP-1蛋白的特异性检测抗体；该捕获抗体与检测抗体均可与LOLP-1蛋白结合。
30.根据项29所述的用途，其还包括：
包被缓冲液(1×PBS，pH7.3±0.1)；
样品稀释液(1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH7.3±0.1)；
封闭液(1×PBS、3%BSA)；
洗脱液PBST(1×PBS、0.05%Tween-20)；
Streptavidin-HRP或者Streptavidin-Eu。
31.根据项29或30的用途，其中捕获抗体和检测抗体是利用LOLP-1蛋白免疫动物获得的纯化抗体或单克隆抗体。
32.根据项29-31中任一项的用途，其中检测抗体的生物素标记效率(生物素/抗体)为5-10。
33.根据项20-32中任一项所述的用途，其中所述早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测包括：
a)利用所述特异性检测LOLP-1蛋白的试剂测量来自受试者的生物学样品中LOLP-1蛋白或核酸的水平；
b)将a)中测得的水平与正常样品中的相应水平比较。
34.根据项33的试剂盒，其中所述样品是血清、尿液、乳汁、肠液等体液，大便或组织样品。
35.一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，其包含用于特异性检测SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的引物或探针。
附图说明
图1为显示LOLP-1蛋白在正常人组织中的表达的图。图1：LOLP-1蛋白和β-肌动蛋白(β-Actin)在人类正常组织中的表达结果。利用从图示中的人类组织中提取的蛋白质，以及本文的LOLP-1蛋白特异性抗体进行Western印迹，再用不同荧光标记的二抗显示抗原抗体反应结果。
图2为显示LOLP-1蛋白在肝癌中的表达的图。图2：LOLP-1蛋白在人类肝癌组织中的表达，其中图2(a)为用人类肝癌冰冻切片进行免疫组织化学并利用显微镜观察而检测到的LOLP-1蛋白在肝癌组织中的表达情况，图2(b)为利用显微镜观察的无抗体对照。其中图2(a)用LOLP-1蛋白特异性抗体检测到LOLP-1蛋白。图2(b)用兔血清IgG取代LOLP-1蛋白特异性抗体，证明结果的特异性。
图3为显示LOLP-1蛋白在肺癌中的表达的图。图3：免疫组织化学检测的LOLP-1蛋白在人类肺癌组织中的表达，其中图3(a)为利用显微镜观察的LOLP-1蛋白在正常肺组织中的表达情况，图3(b)为利用显微镜观察的LOLP-1蛋白在肺癌组织中的表达情况，即用肺癌组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。结果表明LOLP-1蛋白在人类正常肺组织中不表达，但在肺癌组织中特异性表达。
图4为显示LOLP-1蛋白在甲状腺癌中的表达的图。图4：LOLP-1蛋白在人类甲状腺癌组织中的表达，其中图4(a)为利用显微镜观察的LOLP-1蛋白在正常甲状腺组织中的表达情况，图4(b)为利用显微镜观察的LOLP-1蛋白在甲状腺癌组织中的表达情况，即用甲状腺癌组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。结果表明LOLP-1蛋白在人类正常甲状腺组织中不表达，但在甲状腺癌组织中特异性表达。
图5为显示LOLP-1蛋白在乳腺癌中的表达的图。图5：LOLP-1蛋白在人类乳腺癌组织中的表达，其中图5(a)为利用显微镜观察的LOLP-1蛋白在正常乳腺组织中的表达情况，图5(b)为利用显微镜观察LOLP-1蛋白在乳腺癌组织中的表达情况，即用人类乳腺组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。结果表明LOLP-1蛋白在人类正常乳腺组织中不表达，但在乳腺癌组织中特异性表达。
图6为显示LOLP-1蛋白在乳腺癌速冻组织中的表达的图。图6：LOLP-1蛋白在人类乳腺癌速冻组织中的表达结果，其中图6(a)为RT-PCR的结果，是通过从组织中提取RNA、反转录为cDNA、再进行PCR扩增而得到的结果。图6(b)为Western blot的结果，是从冰冻组织中提取的蛋白，以本文的LOLP-1蛋白特异性抗体进行Western杂交，再用不同荧光标记的二抗显示抗原抗体杂交结果。
图7为显示LOLP-1蛋白在结肠癌中的表达下降的图。图7：LOLP-1 蛋白在人类结肠癌组织中的表达，其中图7(a)为利用显微镜观察的LOLP-1蛋白在正常结肠组织中的表达情况，图7(b)为利用显微镜观察的LOLP-1蛋白在结肠癌组织中的表达情况，即用组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。结果表明LOLP-1蛋白在人类正常结肠组织中高表达，但在结肠癌组织中未见表达。
图8为显示LOLP-1蛋白纯化及ELISA检测的灵敏度的图。图8：LOLP-1蛋白纯化及夹心ELISA试剂盒的灵敏性。
(a)纯化的LOLP-1蛋白(考马士亮蓝染色)分析。
(b)用纯化的LOLP-1蛋白检测夹心ELISA的灵敏度分析。其中捕获抗体来自用全长LOLP-1蛋白免疫山羊获得的纯化抗体；检测抗体来自用全长LOLP-1蛋白免疫兔获得的纯化抗体。用纯化的、不同量的LOLP-1蛋白作为待检样品，以确定最低检测灵敏度。
图9为显示LOLP-1蛋白在正常人群和乳腺癌及肝癌患者血清中的浓度分布的图。图9：示出正常人群和乳腺癌患者、肝癌患者血清中LOLP-1蛋白浓度分布，其是利用上述的夹心ELISA检测得到的分布结果。
图10为显示LOLP-1蛋白在肺癌患者血清中的浓度分布的图。图10：示出肺癌患者血清中LOLP-1蛋白浓度分布。其是利用上述的夹心ELISA检测得到的分布结果。
图11为显示LOLP-1蛋白在甲状腺癌患者血清中的浓度分布的图。图11：示出甲状腺癌患者血清中LOLP-1蛋白浓度分布。其是利用上述的夹心ELISA检测得到的分布结果。
图12：示出LOLP-1蛋白在肠液中的浓度。
具体实施方式
本文涉及一种人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白-1(Light of life protein-1)，在本文中有时也简称为LOLP-1蛋白，该蛋白质是从人类原发性肿瘤组织中分离鉴定出来的一个新的特异性蛋白(抗原)。该蛋白质具有316个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本文中利用考马士亮蓝染色分析对经纯化的LOLP-1蛋白进行分析，纯化后的蛋白质的结构和大小如图8(a)所示，其大小约为37kDa。
本文进一步涉及编码LOLP-1蛋白的DNA(有时也用lolp-1表示)，其由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。
本文所涉及的DNA序列可以通过SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物从人体细胞(如肠上皮细胞或肝、肺等肿瘤细胞)扩增获得LOLP-1蛋白的cDNA。对于扩增得到的cDNA进行测序，该序列即为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
本文还涉及包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的重组载体，以及将所述重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。在本文中可以采用上述克隆得到的编码本文的LOLP-1蛋白的DNA，将其导入适当的宿主并进行表达，可以得到本文的LOLP-1蛋白。例如，通过基于本说明书中记载的编码本发明的LOLP-1蛋白的基因的碱基序列的信息，设计本发明的LOLP-1蛋白的 基因特异性的探针或引物，使用该探针或引物从人体细胞(如肠上皮细胞或肝、肺等肿瘤细胞)中扩增编码本文LOLP-1蛋白的DNA，利用基因重组技术将其装入载体，再导入宿主细胞，并在宿主细胞中表达，能够得到本发明的LOLP-1蛋白。
本文涉及的LOLP-1蛋白在人的正常大脑、脾、肝、肺、胸腺、心脏、肾中不表达或基本不表达(参见图1)，而在罹患肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌的患者的肝、肺、甲状腺及乳腺癌组织中却有明显表达。相反，LOLP-1蛋白在人的正常肠组织中高表达，但是在肠癌组织中低表达或不表达(参见图2~图5，以及图7)。
此外，进一步利用半定量RT-PCR及Western blot方法来研究LOLP-1蛋白在人类乳腺癌中的表达。RT-PCR的结果显示，在正常的乳腺组织中未观察到编码LOLP-1蛋白的DNA向RNA的转录，而在乳癌患组织中则观察到了编码LOLP-1蛋白的DNA向RNA的转录(参见图6(a))。由此可以说明LOLP-1蛋白在DNA向RNA转化的过程中即发生了变化。
此外，Western blot的结果进一步证实LOLP-1蛋白在正常乳腺组织中未见表达，而在乳腺癌组织中高表达，其中β-Actin作为参照(参见图6(b))。
初步的研究表明LOLP-1蛋白可能促进肿瘤细胞的生长、增殖及浸润，在肿瘤的发生、发展中起极为重要的作用。
本发明人发现肿瘤细胞可分泌LOLP-1蛋白到外周血液循环中，在罹患肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌的患者的血清中检测到LOLP-1蛋白浓度的增加。因此LOLP-1蛋白可以作为新的肿瘤血清标记物，可用于肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌的早期诊断、诊断、治疗指导，复发监测和预后判断。相反，本发明人发现人的正常肠上皮细胞可分泌LOLP-1蛋白到肠液、大便中，但在肠癌患者的肠液、大便中LOLP-1蛋白浓度减少或检测不到LOLP-1蛋白。因此，LOLP-1蛋白也可以用于肠癌的早期诊断、治疗指导，复发监测和预后判断。
本文提供的检测LOLP-1蛋白的试剂盒，包括特异性识别LOLP-1蛋白的抗体，该抗体被包被在固体载体上。
本文利用夹心ELISA技术建立了检测血清LOLP-1蛋白抗原的试剂盒，此试剂盒适用于肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌及乳腺癌的早期诊断和大规模的人群筛查，并可用于指导治疗、预后判断以及监测复发病人。
本文还涉及提供一种检测LOLP-1蛋白的夹心ELISA试剂盒。该试剂盒主要包括有：包被有捕获LOLP-1蛋白的抗体的ELISA板；生物素标记的检测抗体(2μg/ml兔抗LOLP-1蛋白抗体或单克隆抗体)；捕获抗体与检测抗体均可与LOLP-1蛋白抗原结合。
所述检测LOLP-1蛋白的夹心ELISA试剂盒还包括有：包被缓冲液(1×PBS，pH7.3±0.1)；样本稀释液/抗体稀释液(1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH7.3±0.1)；封闭液(1×PBS、3%BSA)；洗脱液PBST(1×PBS、0.05%Tween-20)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉抗生物素蛋白(Streptavidin-HRP)或者链霉抗生物素蛋白-Eu(Streptavidin-Eu)；标准品(不同浓度的纯LOLP-1蛋白，分别为：0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20ng/ml)。
所述捕获抗体来自用全长LOLP-1抗原免疫羊获得的纯化抗体或免疫小鼠获得的单克隆抗体；检测抗体来自用全长LOLP-1抗原免疫兔获得的纯化抗体或单克隆抗体。检测抗体的生物素标记效率(生物素/抗体)为5-10:1，即每一个抗体分子结合5-10个生物素。
本文的另一个目的是提供上述试剂盒的制备方法。
为此目的，本发明提供一种制备上述检测LOLP-1蛋白抗原的夹心ELISA试剂盒的方法，包括以下步骤：
用包被缓冲液将捕获抗体稀释成7-10μg/ml，在ELISA板的每孔中加入100μl上述抗体稀释液，4°C过夜；取出，置于37°C30分钟；甩去液体，用PBST洗涤5次；空干，每孔加入100μl封闭液，37°C2小时；甩去液体，用PBS洗2次；在室温下，自然风干2小时；用锡箔纸真空密封，放于4°C，备用。
使用时，将血清样本1:10稀释，每孔加入100μl稀释血清和标准品(0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20ng/ml LOLP-1蛋白纯蛋白稀释品)，37°C孵育1小时。去除样本液，用PBST洗5次，用抗体/缀合物缓冲液(Antibody/Conjugate buffer)稀释生物素标记的兔抗LOLP-1蛋白抗体(1:500)，然后每孔加入100μl抗体稀释液，37°C孵育1小时。去除抗体液，用PBST洗5次，用Antibody/Conjugate buffer稀释Streptavidin-HRP(1:5000)，然后每孔加入100μl稀释液，37°C孵育1小时。去除Streptavidin-HRP稀释液，用PBST洗5次，每孔加入100μl TMB(HRP底物)，37°C孵育30分钟。每孔 加入50μl终止液(Stop solution)终止反应。在30分钟内，用450nm波长读取OD值，以620nm作为参考。以标准品制作的标准曲线，计算出稀释血清中LOLP-1蛋白的浓度，然后将浓度乘以10，得到血清样本中的终浓度。
任选地，该试剂盒还可以包含下述：与正常或疾病样本产生的信号相关的信息、标准化材料、如用于对照的来自正常和/或疾病样本的LOLP-1蛋白标准品、适当的酶、缓冲液和溶液。任选地，所述试剂盒还可包含任何描述如何实施本文方法的说明书、任选地提供用于解析实施本文方法时获得的结果的标准图、数据和软件。
本发明人在研究中，发现LOLP-1蛋白在肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌组织中高表达，在同一患者的癌旁组织中低表达或不表达(参见图1~图6)。相反，本发明人发现人的正常肠上皮细胞高表达LOLP-1蛋白，但在肠癌组织中LOLP-1蛋白减少或检测不到。本发明人建立的检测LOLP-1蛋白的夹心ELISA试剂盒、时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)试剂盒、及化学发光检测试剂盒，可适用于肝癌，肺癌、肠癌、甲状腺癌和乳腺癌早期诊断和人群筛查、治疗效果判断、复发监测及预后判断等方面，具有快速、客观和准确性等优点。
本文还提供一种检测LOLP-1蛋白的试剂盒，其包括特异性检测LOLP-1蛋白的试剂，该特异性检测LOLP-1蛋白的试剂是特异性识别LOLP-1蛋白核酸的引物或探针。
本文还涉及一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，其包含用于特异性检测SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的引物或探针。
其中可以使用上述引物，通过常规的分子克隆方法扩增SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述探针可以与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列杂交。
探针和引物按照本领域常规的方法设计和合成即可，只要其可以特异性识别LOLP-1蛋白核酸序列即可。探针或引物是指核酸序列。引物的实例例如为本文中所提及的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
此外，上述探针和引物可被固定在一种或多种固体载体上。所述固体载体是指能通过疏水、离子或共价交联结合探针和/或引物的任何固体材料，例如有珠子、膜、过滤器材、生物芯片等。连接在固体载体上的探针和/或引物可以用于形成本文的试剂盒。
本文提供的检测LOLP-1蛋白的试剂盒，包括特异性识别LOLP-1蛋白核酸的引物或探针，其可以被固定于固体载体上。
任选地，该试剂盒还可以包含下述：与正常或疾病样本产生的信号相关的信息、标准化材料、如用于对照的来自正常和/或疾病样本的核酸标准品、适当的酶、缓冲液和溶液。任选地，所述试剂盒还可包含任何描述如何实施本文方法的说明书、任选地提供用于解析实施本文方法时获得的结果的标准图、数据和软件。
此试剂盒适用于肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌及乳腺癌的早期诊断和大规模的病人筛查，并可用于指导治疗、预后判断以及监测复发病人。
本文中的早期诊断是指在当肿瘤还很小，没有转移，病人还没有出现临床症状时，通过检测血清中的LOLP-1蛋白水平的改变(例如，在血清中检测到出现该LOLP-1蛋白)，来进行诊断；或者对患者肠液、大便中的LOLP-1蛋白水平进行检测以判断其是否发生改变(例如，样品中LOLP-1蛋白的浓度减少或检测不到LOLP-1蛋白)，来进行诊断。肿瘤的早期诊断是提高治愈率，减少死亡率的关键。
本文中的诊断是指利用人血清中LOLP-1蛋白水平的改变的检测结果，或者肠液、大便中的LOLP-1蛋白水平的改变的检测结果来对肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌、肠癌进行诊断。具体地，将检测到的LOLP-1蛋白水平与相应的非癌对照进行比较，若LOLP-1蛋白水平高于非癌对照，则表明患者患有或风险罹患肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌；或LOLP-1蛋白水平低于非癌对照，则表明患者患有或有风险罹患肠癌。这里，“非癌对照”可以是来自同一患者的与待诊断的癌症具有相同组织来源的非癌性组织或细胞中LOLP-1蛋白的水平，也可以是从已知的正常人的相应组织中LOLP-1蛋白的平均水平。本领域技术人员能够合适地确定非癌对照的水平。
本文中的治疗指导是指检测接受治疗的肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌、肠癌病人血清中或肠液、大便中的LOLP-1蛋白水平的改变，可判断疗效。对于肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌的患者而言，如果与实施治疗之前相比，实施治疗之后血清中的LOLP-1蛋白的水平降低则表示治疗有效，而LOLP-1蛋白水平升高则预示病情恶化。
本文中的监测复发是指定期检测已治愈的肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌病人血清中LOLP-1蛋白水平的改变，如果相比于基线水平LOLP-1蛋白 的水平升高则预示癌症复发。
本文中的预后判断是指肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌病人血清中LOLP-1蛋白的水平往往与肿瘤的大小及瘤组织中LOLP-1蛋白的表达水平有关，二者均为预后不良的征兆。再有接受治疗的肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌病人血清中LOLP-1蛋白的变化，也预示治疗的效果及病人的预后。对于肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌患者而言，测定患者血清中LOLP-1蛋白的水平，并与预后良好的对照水平进行比较，如果与预后良好的对照相比患者血清中LOLP-1蛋白的水平升高，则提示患者的预后不良，反之，则预后良好。
实施例
下面结合具体实施例对本文作进一步说明，但本文并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所述引物合成及测序工作均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，所有的限制性内切酶均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Thermo Fisher Scientific inc.)。实验中使用的试剂购自西格玛奥德里奇中国公司(Sigma-Aldrich Co.LLC)。
实施例1：LOLP-1蛋白cDNA序列的获得
通过如下方法获得了LOLP-1蛋白的cDNA序列。用Trizol(Invitrogen,USA)提取人肝癌细胞内总RNA，溶解在去离子水中，测定浓度。用下例反应体系去除污染的DNA：
将该反应体系放置在室温15分钟
加多聚Oligo(dT) 1μl
然后在75°C加热10分钟，后置于冰上速冻。
按照下述组成逆转合成cDNA：
添加后置于42°C孵育45分钟。
按照如下条件进行PCR
94°C变性5分钟，然后94°C变性45秒，56°C复性45秒，72°C延长90秒，共30个循环。然后利用常规方法纯化DNA并进行测序，测序结果如SEQ ID NO:2所示。
其中所使用的PCR引物为：
SEQ ID NO:3：5’端：CAGAAAGCAGGACGTGGGACATC
SEQ ID NO:4：3’端：GCACGTCGATTCGCGTCTATGAC
实施例2：LOLP-1蛋白的纯化
将LOLP-1cDNA克隆到含组氨酸标签的pQE原核细胞蛋白表达载体，导入活化的大肠杆菌，分选阳性克隆，用LB培养基培养、扩增，IPTG诱导蛋白表达，收集菌液、离心收集细菌。用超声破碎细菌、离心取上清，与Ni-NTA反应结合含组氨酸标签的LOLP-1蛋白，洗涤、收集蛋白，测定浓度。
通过上述方法得到的该纯化的蛋白与常规1x加样缓冲液在95°C加热5分钟，用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用考马斯亮蓝染色，结果如图8(a)所示，得到了大小与预期大小相同的为37kDa的LOLP-1蛋白。
实施例3:制备检测LOLP-1蛋白抗原的夹心ELISA试剂盒
实施例3中所使用的捕获抗体和检测抗体是利用实施例2表达并纯化而获得的全长LOLP-1蛋白分别免疫山羊和家兔后获得血清，并用LOLP-1抗 原制备的亲和柱纯化后获得的。兔抗LOLP-1蛋白抗体被生物素标记。本文获得的捕获抗体和检测抗体的灵敏度和特异性都很强，如图8(b)所示，夹心ELISA可检测到0.03125ng/ml的LOLP-1蛋白。其中生物素标记试剂盒购自Pierce公司。Streptavidin-HRP购自alpha Diagnostic公司。检测LOLP-1蛋白的ELISA板由按照本文所描述的方法制备；所用试剂配制如下：包被缓冲液(1×PBS，pH7.3±0.1)；样本稀释液/抗体稀释液(1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH7.3±0.1)；封闭液(1×PBS、3%BSA)；洗脱液PBST(1×PBS、0.05%Tween-20)；检测抗体(1μg/ml兔抗LOLP-1蛋白抗体)；标准品(不同浓度LOLP-1蛋白抗原：0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20ng/ml)。
实施例4：正常人群和乳腺癌患者、肝癌患者血清中LOLP-1蛋白浓度分布
检测ELISA板的制备：用包被缓冲液将实施例3中得到的捕获抗体稀释成7-10μg/ml，在ELISA板的每孔中加入100μl上述抗体稀释液，4°C过夜；取出，置于37°C30分钟；甩去液体，用PBST洗涤5次；空干，每孔加入100μl封闭液，37°C2小时；甩去液体，用PBS洗2次；在室温下，自然风干2小时；用锡箔纸真空密封，放于4°C，备用。
血清样本的检测：血清样本用PBS以1∶10稀释，每孔加入100μl样品稀释液或标准品(不同浓度LOLP-1蛋白抗原：0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20ng/ml)，37°C，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，空干；检测抗体用抗体稀释液以1:500稀释，每孔加入100μl实施例3制备的检测抗体稀释液，37°C，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，控干；Streptavidin-HRP用抗体稀释液以1:80000稀释，每孔加入100μlStreptavidin-HRP稀释液，37°C，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，空干；100μl加入底物——3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)，37°C，避光孵育30分钟；加入50μl2M H2SO4中止反应；用酶标仪以450nm波长测定OD值。绘制标准曲线，根据标准曲线，计算出血清样本中LOLP-1蛋白的浓度，并×10，得到血清LOLP-1蛋白终浓度。
检测结果分析
选取71例健康人、50例乳腺癌患者和50例原发性肝癌患者进行血清样本检测，结果用Graphpad4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，平 均LOLP-1蛋白水平在两组人群中有显著性统计学差异(p<0.001)。如表1所示，在这71例正常人群中，血清LOLP-1蛋白的浓度范围为0~11ng/ml，平均值为5.19ng/ml，最高值为10.7ng/ml。其中，74.6%的样本的LOLP-1蛋白浓度集中在3~9ng/ml(如图9)。乳腺癌患者血清LOLP-1蛋白的浓度范围为9.5~68.4ng/ml，平均值为20.72ng/ml。88%的患者血清LOLP-1蛋白的浓度高于10ng/ml，最高值达到了68.4g/ml。肝癌患者血清LOLP-1蛋白的浓度范围为12.4~89ng/ml，平均值为32.5ng/ml。
表1.血清LOLP-1蛋白浓度分布(ng/ml)
实施例5:肺癌患者血清中LOLP-1蛋白浓度分布
采用与实施例4相同的方法制备检测ELISA板，以及血清样本，此外，选取76位肺癌患者进行血清样本检测，分布的结果图10所示。在76位肺癌患者血清中，只有5例低于10ng/ml，其余均高于11.0ng/ml。用Graphpad4.0统计学软件进行分析，t检验结果显示，LOLP-1蛋白抗原水平在肺癌患 者血清中明显高于正常人群(p<0.001)。
实施例6:甲状腺癌患者血清中LOLP-1蛋白浓度分布
采用与实施例4相同的方法制备检测ELISA板，以及血清样本，此外，选取42位肺癌患者进行血清样本检测，分布的结果图11所示。在42位甲状腺癌患者血清中，只有1位低于10ng/ml，其余均高于11.0ng/ml。用Graphpad4.0统计学软件进行分析，t检验结果显示，平均LOLP-1蛋白抗原水平在甲状腺癌患者血清中明显高于正常人群(p<0.001)。
实施例7:肠癌患者肠液中LOLP-1浓度的检测
用肠镜收集肠液，离心、沉淀，收集上清。采用与实施例4相同的方法制备ELISA板检测肠液中LOLP-1蛋白抗原水平。我们收集、检测了10例正常人和15例肠癌患者的肠液。结果用Graphpad4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，平均LOLP-1蛋白抗原水平在两组人群中有显著性统计学差异(p<0.001)。分布的结果图12所示。
本文发现了一种新的LOLP-1蛋白作为一种肿瘤血清标记物，该LOLP-1蛋白以及编码LOLP-1蛋白的DNA具有很强的肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌及乳腺癌特异性。本文提供了检测血清、肠液中LOLP-1蛋白抗原的实验方法和夹心ELISA试剂盒。本文所述方法的特异性强，本底水平低。此外本文所述的夹心ELISA试剂盒的灵敏度高，可检测到0.03125ng/ml LOLP-1蛋白，如图8(b)所示。另外本文所述方法简单快捷。整个实验操作对于实验仪器和试剂的要求都不高，在一般实验室均可进行，其准确度高，结果由酶标仪定量分析，排除了主观性。

Claims (11)

1.一种人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白-1(Light of life protein-1，LOLP-1蛋白)，其由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成。
2.编码LOLP-1蛋白的DNA，其由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。
3.一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，其包含特异性检测LOLP-1蛋白的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述特异性检测LOLP-1蛋白的试剂是特异性识别LOLP-1蛋白的抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述LOLP-1蛋白由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂可用于检测血清、尿液、乳汁和肠液等体液，大便或组织样本。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述特异性检测LOLP-1蛋白的试剂是特异性识别LOLP-1蛋白核酸的引物或探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述LOLP-1蛋白核酸由SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的试剂盒，其中所述癌症选自下组：肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌和乳腺癌。
10.根据权利要求3-6中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是酶联免疫法吸附测定(ELISA)试剂盒、时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)试剂盒、化学发光检测试剂盒。
11.一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，其包含用于特异性检测SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的引物或探针。
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