CN103149356A - 一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡 - Google Patents
一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103149356A CN103149356A CN2013100330740A CN201310033074A CN103149356A CN 103149356 A CN103149356 A CN 103149356A CN 2013100330740 A CN2013100330740 A CN 2013100330740A CN 201310033074 A CN201310033074 A CN 201310033074A CN 103149356 A CN103149356 A CN 103149356A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- brucella abortus
- antibody
- test paper
- paper card
- test
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 241000589562 Brucella Species 0.000 title abstract description 11
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 claims description 77
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 claims description 77
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 35
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 29
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 claims description 28
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 28
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 26
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 21
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 21
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 claims description 4
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 3
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000003805 vibration mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 abstract 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 abstract 1
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- IICCLYANAQEHCI-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrachloro-3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodospiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound O1C(=O)C(C(=C(Cl)C(Cl)=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 IICCLYANAQEHCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 206010059484 Haemodilution Diseases 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 229930187593 rose bengal Natural products 0.000 description 2
- 229940081623 rose bengal Drugs 0.000 description 2
- STRXNPAVPKGJQR-UHFFFAOYSA-N rose bengal A Natural products O1C(=O)C(C(=CC=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 STRXNPAVPKGJQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 2
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 206010019847 hepatosplenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012946 outsourcing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了属于免疫检测技术领域的一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡。该所述检测试纸卡由外壳和其内部的试纸条构成，外壳由上板和下板构成，上板有检测窗和加样孔，试纸条由底板和在底板上依次粘贴的样品吸收垫、胶体金标记垫、检测反应区构成，样品吸收垫正对加样孔，检测反应区正对检测窗。本发明还公开了应用上述试纸条检测牛布鲁氏菌抗原的方法。本发明的牛布鲁氏菌抗原现场快速检测试纸卡灵敏度和重复率高，特异性强，稳定性能好，假阳率和假阴率低，使用方便，容易观察区别，适合于临床快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患全身传染病，在世界各地都广泛流行，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病，是国际贸易检验中必检的一种传染病。布鲁氏菌可感染包括人类在内的多种家畜和野生动物，主要通过消化道、皮肤黏膜、呼吸道等途径侵入机体，感染后引起相似的临床症状，如长期发热、流产与不育、虚弱、关节痛及肝脾肿大等。1897年，丹麦医生Bang发现了导致牛流产的布鲁氏菌，又称班活氏菌，又称流产布鲁氏菌(Brucella abortus)。布鲁氏菌病在我国广泛存在，尤其以畜牧生产为主的东北、华北、西北一带，经常有疫情爆发的报道，直接危害人类的健康，严重困扰畜牧业的发展和动物及其产品的进出口贸易。
为防控该病，各国学者建立了多种布鲁氏菌病诊断和检测技术，主要包括细菌学、免疫学和分子生物学等方法。目前布鲁氏菌病的诊断手段主要包括病原分离鉴定、虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR等。
免疫胶体金技术自问世以来，得到了迅速发展。广泛应用于化学检测和免疫学检测领域，尤其是胶体金免疫层析技术具有操作简单、快速灵敏、结果清楚、易于判断和保存，且无需任何仪器设备等优点。更适合于临床快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。
在我国，布鲁氏菌病的检测标准方法是WS269-2007，但其敏感性和特异性差、反应时间长、假阳性率相对较高，为国际贸易已淘汰技术。酶联免疫吸附试验、PCR为目前较常用的该疫病的诊断方法，但均存在样品前处理复杂、仪器设备昂贵、分析费事长、要求熟练的专业技术人员才能完成等问题。但布鲁氏菌病多发于农村和牧区，基层单位特别是牧区设备简单、技术人员缺少，很难对该病开展广泛检测。因此，开发简便易行、灵敏、特异、快速的布鲁氏菌病现场筛查方法具有现实与实践意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种敏感度高、特异性好、操作简单、低成本的利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原现场快速检测试纸卡及其检测方法。
一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，所述检测试纸卡由外壳1和其内部的试纸条2构成，外壳1由上板3和下板4构成，上板3有检测窗5和加样孔6，试纸条2由底板7和在底板7上依次粘贴的样品吸收垫8、胶体金标记垫9、检测反应区10构成，样品吸收垫8正对加样孔6，检测反应区10正对检测窗5。
所述胶体金标记垫9包被有牛布鲁氏菌抗体-胶体金标记物。
所述牛布鲁氏菌抗体-胶体金标记物的制备方法为：
(1)将牛布鲁氏菌抗体在0.005M/L pH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，4℃，10000-12000rpm条件下离心1h；
(2)将OD526的胶体金溶液的pH调节至5.0-9.0；
(3)将步骤(1)离心得到的牛布鲁氏菌抗体用0.005M/L pH9.0的硼酸盐缓冲溶液稀释至5μg/ml～50μg/ml，取1ml稀释后的牛布鲁氏菌抗体加入到1ml胶体金溶液中，振荡混匀，静置5min，加入0.1ml10％的NaCl溶液，混匀后静置2h，离心纯化制得胶体金标记的牛布鲁氏菌抗体。
所述检测反应区10由包被牛布鲁氏菌抗体-载体蛋白偶联物的测试区11和包被牛布鲁氏菌抗原的质控区12组成。
所述牛布鲁氏菌抗体-载体蛋白偶联物的制备方法为：
(1)取5mg牛布鲁氏菌抗体和2.5mg载体蛋白溶解在250μl TE buffer中，充分震荡使其溶解，再取EDC·HCl79mg充分溶解于250μl TE buffer中；
(2)将牛布鲁氏菌抗体和载体蛋白的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC·HCl溶液，在37℃摇床中反应2h以上；
(3)先用Sephadex柱分离步骤(2)反应后的偶联产物和未结合的牛布鲁氏菌抗体，再透析纯化，将0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天换液两次，每次换液200ml，透析产物分装成20份，于-20℃保存，得到牛布鲁氏菌抗体-载体蛋白偶联物。
所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白或鸡卵白蛋白。
所述样品吸收垫含有植物凝集素或抗红细胞抗体。
所述抗红细胞抗体为使用人红细胞免疫小鼠、羊或兔，常规制备的抗红细胞单克隆抗体。
上述检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡的检测方法，按照如下步骤进行：
(1)血液样品处理：血液标本收集在洁净、干燥的容器内，将采集的新鲜血液加入浓度为2.5％抗凝剂；
(2)取经过处理的血液样品100μL，滴入加样孔；
(3)待血液样品流过测试区和质控区，判定样品中是否含有牛布鲁氏菌抗原，判定规则如下：
阴性(-)：仅质控区出现一条紫红色条带，在测试区内无紫红色条带出现；
阳性(+)：两条紫红色条带出现，一条位于测试区内，另一条位于质控区内；
无效：当质控区不显示出紫红色条带，则无论测试区显示出紫红色条带与否，该试纸卡判为无效。
本发明的检测原理：当含有牛布鲁氏菌抗原的血液样品流经胶体金标记垫时，胶体金标记垫上的牛布鲁氏菌抗体-胶体金标记物与牛布鲁氏菌抗原结合，继续流经质控区时牛布鲁氏菌抗体-胶体金标记物与质控区的牛布鲁氏菌抗原结合显示紫红色条带，流经测试区时牛布鲁氏菌抗体-胶体金标记物和牛布鲁氏菌抗原的结合物与牛布鲁氏菌抗体-载体蛋白偶联物相结合，显示紫红色条带，若血液样品没有牛布鲁氏菌抗原，这种结合则不能进行，测试区不显示紫红色。
本发明的有益效果：本发明的牛布鲁氏菌抗原现场快速检测试纸卡灵敏度和重复率高，特异性强，稳定性能好，假阳率和假阴率控制在1％以下，吸收垫含有的植物凝集素或抗红细胞抗体能有效的凝集拦截红细胞，避免红细胞透过吸收垫，干扰后续的检测，该试纸卡检测反应容易观察区别，使用方便，适合于临床快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。
附图说明
图1为本发明试纸卡结构示意图；
图2为本发明试纸条结构示意图；
图中，1-外壳、2-试纸条、3-上板、4-下板、5-检测窗、6-加样孔、7-底板8-样品吸收垫、9-胶体金标记垫、10-检测反应区、11-测试区、12-质控区。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡结构
利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，如图1和图2所示，所述检测试纸卡由外壳1和其内部的试纸条2构成，外壳1由上板3和下板4构成，上板3有检测窗5和加样孔6，试纸条2由底板7和在底板7上依次粘贴的样品吸收垫8、胶体金标记垫9、检测反应区10构成，样品吸收垫8正对加样孔6，检测反应区10正对检测窗5。胶体金标记垫9包被有布鲁氏菌抗体和胶体金标记物。检测反应区10由包被布鲁氏菌抗体-载体蛋白偶联物的测试区11和包被布鲁氏菌抗原的质控区12组成。
载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白或鸡卵白蛋白。
样品吸收垫含有植物凝集素或抗红细胞抗体。
抗红细胞抗体为使用人红细胞免疫小鼠、羊或兔，常规制备的抗红细胞单克隆抗体。
实施例2检测牛布鲁氏菌抗原的方法
1、牛布鲁氏菌抗体-胶体金标记物的制备
(1)将牛布鲁氏菌抗体在0.005M/L pH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，4℃，10000-12000rpm条件下离心1h；
(2)将OD526的胶体金溶液的pH调节至4.0-9.0；
(3)将步骤(1)离心得到的牛布鲁氏菌抗体用0.005M/L pH9.0的硼酸盐缓冲溶液稀释至5μg/ml～50μg/ml，取1ml稀释后的牛布鲁氏菌抗体加入到1ml胶体金溶液中，振荡混匀，静置5min，加入0.1ml10％的NaCl溶液，混匀后静置2h，离心纯化制得胶体金标记的牛布鲁氏菌抗体。
2、牛布鲁氏菌抗体-载体蛋白偶联物的制备
(1)取5mg牛布鲁氏菌抗体和2.5mg载体蛋白溶解在250μl TE buffer中，充分震荡使其溶解，再取EDC·HCl79mg充分溶解于250μl TE buffer中；
(2)将牛布鲁氏菌抗体和载体蛋白的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC·HCl溶液，在37℃摇床中反应2h以上；
(3)先用Sephadex柱分离步骤(2)反应后的偶联产物和未结合的牛布鲁氏菌抗体，再透析纯化，将0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天换液两次，每次换液200ml，透析产物分装成20份，于-20℃保存，得到牛布鲁氏菌抗体-载体蛋白偶联物。
3、血液样品的处理
取100份经过牛布鲁氏菌感染的牛血液样品，血液标本收集在洁净、干燥的容器内，将采集的新鲜血液加入浓度为2.5％抗凝剂；血液标本在2℃～8℃冷藏可保存48小时。
4、检测步骤
(1)将100份经过处理的血液样品各100μL，标准牛布鲁氏菌抗原100μL(浓度为10μg/ml)，去离子水100μL，滴入加样孔；
(2)待血液样品、标准牛布鲁氏菌抗原、去离子水流过各自试纸条的测试区和质控区，判定样品中是否含有牛布鲁氏菌抗原，判定规则如下：
阴性(-)：仅质控区出现一条紫红色条带，在测试区内无紫红色条带出现；
阳性(+)：两条紫红色条带出现，一条位于测试区内，另一条位于质控区内；
无效：当质控区不显示出紫红色条带，则无论测试区显示出紫红色条带与否，该试纸卡判为无效。
判定结果为：牛血液样品99份呈阳性，1份呈阴性。
实施例3检测牛布鲁氏菌抗原的试纸条假阳性率和假阴性测试实验
1、假阳性测试
(1)取100份普通牛血液样品，采用血液前处理装置对血液样品进行处理；
(2)将经过处理的100份普通牛血液样品各100μL，去离子水100μL，滴入加样孔；
(2)待血液样品、去离子水流过各自试纸条的测试区和质控区，判定样品中是否含有牛布鲁氏菌抗体，判定规则如下：
阴性(-)：仅质控区出现一条紫红色条带，在测试区内无紫红色条带出现；
阳性(+)：两条紫红色条带出现，一条位于测试区内，另一条位于质控区内；
无效：当质控区不显示出紫红色条带，则无论测试区显示出紫红色条带与否，该试纸卡判为无效。
判定结果为：牛血液样品1份呈阳性，99份呈阴性，全部有效，假阳性率为1％。
2、假阴性测试
(1)取100份标准牛布鲁氏菌抗原(浓度为10μg/ml)各100μL，去离子水100μL，滴入加样孔；
(2)待标准牛布鲁氏菌抗原、去离子水流过各自试纸条的测试区和质控区，判定样品中是否含有牛布鲁氏菌抗原，判定规则如下：
阴性(-)：仅质控区出现一条紫红色条带，在测试区内无紫红色条带出现；
阳性(+)：两条紫红色条带出现，一条位于测试区内，另一条位于质控区内；
无效：当质控区不显示出紫红色条带，则无论测试区显示出紫红色条带与否，该试纸卡判为无效。
判定结果为：牛血液样品99份呈阳性，1份呈阴性，全部有效，假阴性率为1％。
实施例4检测牛布鲁氏菌抗原的试纸条其他性能的测定
(1)布鲁氏菌抗原现场快速检测试纸卡的特异性测定
应用制备的布鲁氏菌抗原试纸卡检测与布鲁氏菌种系较近的5种细菌全血，其结果均为阴性，表明其特异性好，无交叉。
(2)布鲁氏菌抗原现场快速检测试纸卡的敏感性
取外购牛布鲁氏菌阳性血清，用ELISA检测其平均效价约为1∶8000，虎红平板凝集抗原在血液稀释度低于50倍时检测为阳性；布鲁氏菌抗原现场快速检测试纸卡测到的阳性结果的血液效价为1∶6000，血液稀释度≥6000倍时，试纸卡检测线显色不清晰或无显色。故布鲁氏菌抗体现场快速检测实在卡的灵敏度明显高于虎红平板凝集试验，但其灵敏度仍低于ELISA。
(3)布鲁氏菌抗原现场快速检测试纸卡的重复性
进行平行检测5个试纸卡，其检测结果一致，说明该检测方法具有可重复性。
(4)布鲁氏菌抗原现场快速检测试纸卡的稳定性
4℃放置布鲁氏菌抗原现场快速检测试纸卡，定期检测标准阳性血清，结果显示其稳定性可保存1年，1年后金释放速度减慢，层析速度减慢等现象。产品的稳定性为4℃环境为1年。
Claims (9)
1.一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，其特征在于，所述检测试纸卡由外壳(1)和其内部的试纸条(2)构成，外壳(1)由上板(3)和下板(4)构成，上板(3)有检测窗(5)和加样孔(6)，试纸条(2)由底板(7)和在底板(7)上依次粘贴的样品吸收垫(8)、胶体金标记垫(9)、检测反应区(10)构成，样品吸收垫(8)正对加样孔(6)，检测反应区(10)正对检测窗(5)。
2.根据权利要求1所述一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，其特征在于，所述胶体金标记垫(9)包被有牛布鲁氏菌抗体-胶体金标记物。
3.根据权利要求2所述一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，其特征在于，所述牛布鲁氏菌抗体-胶体金标记物的制备方法为：
(1)将牛布鲁氏菌抗体在0.005M/L pH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，4℃，10000-12000rpm条件下离心1h；
(2)将OD526的胶体金溶液的pH调节至5.0-9.0；
(3)将步骤(1)离心得到的牛布鲁氏菌抗体用0.005M/L pH9.0的硼酸盐缓冲溶液稀释至5μg/ml～50μg/ml，取1ml稀释后的牛布鲁氏菌抗体加入到1ml胶体金溶液中，振荡混匀，静置5min，加入0.1ml10％的NaCl溶液，混匀后静置2h，离心纯化制得胶体金标记的牛布鲁氏菌抗体。
4.根据权利要求1所述一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，其特征在于，所述检测反应区(10)由包被牛布鲁氏菌抗体-载体蛋白偶联物的测试区(11)和包被牛布鲁氏菌抗原的质控区(12)组成。
5.根据权利要求4所述一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，其特征在于，所述牛布鲁氏菌抗体-载体蛋白偶联物的制备方法为：
(1)取5mg牛布鲁氏菌抗体和2.5mg载体蛋白溶解在250μl TE buffer中，充分震荡使其溶解，再取EDC·HCl79mg充分溶解于250μl TE buffer中；
(2)将牛布鲁氏菌抗体和载体蛋白的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC·HCl溶液，在37℃摇床中反应2h以上；
(3)先用Sephadex柱分离步骤(2)反应后的偶联产物和未结合的牛布鲁氏菌抗体，再透析纯化，将0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天换液两次，每次换液200ml，透析产物分装成20份，于-20℃保存，得到牛布鲁氏菌抗体-载体蛋白偶联物。
6.根据权利要求1所述一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白或鸡卵白蛋白。
7.根据权利要求1所述一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，其特征在于，所述样品吸收垫含有植物凝集素或抗红细胞抗体。
8.根据权利要求7所述一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，其特征在于，所述抗红细胞抗体为使用人红细胞免疫小鼠、羊或兔，常规制备的抗红细胞单克隆抗体。
9.应用权利要求1所述检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡的检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)血液样品处理：血液标本收集在洁净、干燥的容器内，将采集的新鲜血液加入浓度为2.5％抗凝剂；
(2)取经过处理的血液样品100μL，滴入加样孔；
(3)待血液样品流过测试区和质控区，判定样品中是否含有牛布鲁氏菌抗原，判定规则如下：
阴性(-)：仅质控区出现一条紫红色条带，在测试区内无紫红色条带出现；
阳性(+)：两条紫红色条带出现，一条位于测试区内，另一条位于质控区内；
无效：当质控区不显示出紫红色条带，则无论测试区显示出紫红色条带与否，该试纸卡判为无效。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310033074.0A CN103149356B (zh) | 2013-01-29 | 2013-01-29 | 一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310033074.0A CN103149356B (zh) | 2013-01-29 | 2013-01-29 | 一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103149356A true CN103149356A (zh) | 2013-06-12 |
| CN103149356B CN103149356B (zh) | 2016-03-16 |
Family
ID=48547559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310033074.0A Active CN103149356B (zh) | 2013-01-29 | 2013-01-29 | 一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103149356B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106018800A (zh) * | 2016-05-25 | 2016-10-12 | 南方医科大学 | 一种布鲁氏菌感染的检测装置 |
| CN108918883A (zh) * | 2018-05-18 | 2018-11-30 | 瑞莱生物科技江苏有限公司 | 一种快速定量检测心肌肌钙蛋白ｉ、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的免疫荧光试剂盒 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101236202A (zh) * | 2008-02-06 | 2008-08-06 | 中国计量学院 | 氯丙嗪-地西泮二联检测卡及其检测方法 |
| CN101363859A (zh) * | 2008-05-26 | 2009-02-11 | 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 | 布鲁氏菌抗体快速检测试纸条 |
| CN101362800A (zh) * | 2008-05-26 | 2009-02-11 | 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 | 一种用于布鲁氏菌快速检测的试纸条 |
| CN101441215A (zh) * | 2008-12-31 | 2009-05-27 | 吉林大学 | 一种布鲁氏菌抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法 |
| CN101520458A (zh) * | 2008-02-25 | 2009-09-02 | 广州天美生物技术有限公司 | 金标免疫分析检测hla-g及其抗体的简易方法 |
| CN101620226A (zh) * | 2009-08-07 | 2010-01-06 | 四川省迈克科技有限责任公司 | 血吸虫病快速测定试剂盒及其制备方法 |
| CN102002049A (zh) * | 2010-10-12 | 2011-04-06 | 北京大学 | 一种抗原及其制备方法与应用 |
-
2013
- 2013-01-29 CN CN201310033074.0A patent/CN103149356B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101236202A (zh) * | 2008-02-06 | 2008-08-06 | 中国计量学院 | 氯丙嗪-地西泮二联检测卡及其检测方法 |
| CN101520458A (zh) * | 2008-02-25 | 2009-09-02 | 广州天美生物技术有限公司 | 金标免疫分析检测hla-g及其抗体的简易方法 |
| CN101363859A (zh) * | 2008-05-26 | 2009-02-11 | 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 | 布鲁氏菌抗体快速检测试纸条 |
| CN101362800A (zh) * | 2008-05-26 | 2009-02-11 | 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 | 一种用于布鲁氏菌快速检测的试纸条 |
| CN101441215A (zh) * | 2008-12-31 | 2009-05-27 | 吉林大学 | 一种布鲁氏菌抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法 |
| CN101620226A (zh) * | 2009-08-07 | 2010-01-06 | 四川省迈克科技有限责任公司 | 血吸虫病快速测定试剂盒及其制备方法 |
| CN102002049A (zh) * | 2010-10-12 | 2011-04-06 | 北京大学 | 一种抗原及其制备方法与应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106018800A (zh) * | 2016-05-25 | 2016-10-12 | 南方医科大学 | 一种布鲁氏菌感染的检测装置 |
| CN108918883A (zh) * | 2018-05-18 | 2018-11-30 | 瑞莱生物科技江苏有限公司 | 一种快速定量检测心肌肌钙蛋白ｉ、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的免疫荧光试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103149356B (zh) | 2016-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111233985A (zh) | 一种新型冠状病毒IgA抗体快速检测试纸条的制备方法 | |
| CN103235120B (zh) | 一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒及其应用 | |
| CN111999507B (zh) | 一种检测新型冠状病毒抗体的荧光免疫层析试纸 | |
| CN108267577B (zh) | 一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条 | |
| CN101858914B (zh) | 梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条及其制备方法 | |
| CN105859843A (zh) | 呼吸道合胞病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的呼吸道合胞病毒抗体的快速检测试剂盒 | |
| CN101825634A (zh) | 梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法 | |
| CN105717308A (zh) | 快速定量检测粪便乳铁蛋白的免疫层析试剂盒 | |
| Won et al. | Multiplex serologic assessment of schistosomiasis in Western Kenya: antibody responses in preschool aged children as a measure of reduced transmission | |
| CN101825635B (zh) | 梅毒特异性IgG抗体与特异性总抗体联合检测试剂条及其制备方法 | |
| CN103149357B (zh) | 一种利用竞争法检测牛布鲁氏菌抗体的检测试纸卡 | |
| CN101592660A (zh) | 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒 | |
| CN105759028A (zh) | 一种诺如病毒拉曼探针标记的免疫层析检测方法 | |
| Ren et al. | A brief review of diagnosis of small ruminants brucellosis | |
| CN101799470A (zh) | 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒 | |
| Holland et al. | Evaluation of whole fresh blood and dried blood on filter paper discs in serological tests for Trypanosoma evansi in experimentally infected water buffaloes | |
| CN103149356B (zh) | 一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡 | |
| CN105223360A (zh) | 鉴别检测正常浆细胞和克隆性浆细胞的试剂盒及其应用 | |
| CN105738624B (zh) | 一种裂谷热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法 | |
| CN104569390A (zh) | 一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒 | |
| CN201489004U (zh) | 鼻咽癌双标记物金标测试卡 | |
| CN105388291B (zh) | 一种快速诊断活动性结核病的gamma delta T细胞表面活化分子及试剂盒 | |
| CN103424548A (zh) | 一种结核分枝杆菌抗体快速检测卡及其检测方法 | |
| CN102221619A (zh) | 隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体elisa检测方法及试剂盒 | |
| CN105403706A (zh) | 热休克蛋白90(hsp90)化学发光检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 310023 A401-403 room, No. 16, No. 1, Ho Ho Road, Xihu District, Zhejiang, Hangzhou Applicant after: HANGZHOU DNA SCI-TECH CO., LTD. Address before: 310023, building 2, building B3, No. 181, Wuchang Road, Yuhang District, Zhejiang, Hangzhou, China Applicant before: DNA Sci-tech Co., Ltd. |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Mingzhou Inventor after: Wang Minzi Inventor after: Wang Yanming Inventor after: Cheng Ye Inventor after: Wei Jianliang Inventor after: Wu Haifen Inventor after: Chen Zonglun Inventor before: Zhang Mingzhou Inventor before: Wang Minzi Inventor before: Cheng Ye Inventor before: Wei Jianliang Inventor before: Wu Haifen Inventor before: Chen Zonglun |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Test paper card for testing Brucella antibody through sandwich method Effective date of registration: 20170316 Granted publication date: 20160316 Pledgee: The Agricultural Bank of the West Branch of Hangzhou Chinese Limited by Share Ltd Pledgor: HANGZHOU DNA SCI-TECH CO., LTD. Registration number: 2017330000021 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20200904 Granted publication date: 20160316 Pledgee: The Agricultural Bank of the West Branch of Hangzhou Chinese Limited by Share Ltd. Pledgor: Zhejiang Dean Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: 2017330000021 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |