CN101363859A - 布鲁氏菌抗体快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测布鲁氏菌特异性抗体的快速检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有包被布鲁氏菌特异性抗原bp26的检测带和包被布鲁氏菌外膜蛋白bp26多克隆抗体的质控带；所述结合物释放垫包被胶体金标记的布鲁氏菌外膜蛋白bp26。，应用膜层析双抗原夹心法，检测标本中布鲁氏菌的特异性抗体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对布鲁氏菌的感染诊断起到辅助作用。

Description

布鲁氏菌抗体快速检测试纸条

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因工程抗原的制备和布鲁氏菌抗体快速检测试纸条(胶体金法)及其应用。

技术背景

布鲁氏菌病(brucellosis)是由布氏杆菌(Brucella)引起的人兽共患的传染病，俗称波浪热。临床特点为长期发热、多汗、关节疼痛、疲乏、肝脾肿大等，此病在世界各国均有不同程度的流行。

人主要通过皮肤、黏膜、消化道和呼吸道感染，尤其以感染羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌最为严重。猪种布鲁氏菌感染人较少见，犬种布鲁氏菌感染人罕见，绵羊附睾种布鲁氏菌、沙林鼠种布鲁氏菌基本不感染人。

布鲁氏菌病易误诊为风湿性疾病、伤寒、结核病、病毒感染、或作为长期发热原因待查诊治。其长期误诊的主要原因为：(1)临床医生对布氏杆菌病的认识不足是导致误诊的主要原因。(2)流行病学资料询问不详细，特别是病史、接触史、职业、饮食习惯、居住地区及流行地区等。(3)临床表现多样化且临床症状不典型。(4)缺乏操作简单、快速、特异、敏感的检测手段。

目前对布鲁氏菌感染的检测主要在实验室进行。主要有：

(1)病原学诊断：

显微镜检查：采集流产胎衣、绒毛膜水肿液、肝、脾、淋巴结、胎儿胃内容物等组织，制成抹片，用柯兹罗夫斯基染色法染色，镜检，布鲁氏菌为红色球杆状小杆菌，而其它菌为蓝色。

分离培养：新鲜病料可用胰蛋白月示琼脂面或血液琼脂斜面、肝汤琼脂斜面、3％甘油0.5％葡萄糖肝汤琼脂斜面等培养基培养；37℃培养7～10天后，进行菌落特征检查和单价特异性抗血清凝集试验。

(2)血清学诊断：主要以下几种，虎红平板凝集试验(RBPT)全乳环状试验(MRT)，试管凝集试验(SAT)，补体结合试验(CFT)等。近年来，人们用布鲁氏菌的粗提抗原研制ELISA法检测试剂盒，检测感染血清中的抗体，取得了良好的效果。

(3)其它如PCR，检测布鲁氏菌特异性的特异性核苷酸等。

bp26蛋白是布鲁氏菌外膜蛋白的一种，已有的研究表明，bp26蛋白具有良好的免疫原性，而且从基因水平上看，各种布鲁氏菌(B.abortus，B.ovis和B.melitensis等)的bp26基因序列几乎完全一致，只是核苷酸有微小差异，但氨基酸序列无差别。因此属于各种布鲁氏菌的共同抗原，可作为布鲁氏菌的检测抗原，用于检测诊断。

发明内容

本发明的目的是利用布鲁氏菌的共同的外膜蛋白抗原bp26，研制一种可以快速，准确检验布鲁氏菌抗体的快速检测试纸，检测人类或动物血清标本中布鲁氏菌特异性抗体，用于人或动物布鲁氏菌感染的辅助诊断。

本发明的另一目的在于提供上述试纸条的制备方法。

为实现上述目的，本发明首先利用基因工程技术，克隆并高效表达布鲁氏菌共同的外膜蛋白抗原bp26，并通过免疫学技术对其免疫原性及特异性进行检定。实验表明，通过该方法得到的外膜蛋白抗原bp26具有良好的免疫原性及特异性。

进而，本发明利用上述方法制备的布鲁氏菌外膜蛋白bp26，研制布鲁氏菌抗体快速检测试纸(胶体金法)，其包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有包被的检测带和包被布鲁氏菌外膜蛋白bp26多克隆抗体的质控带；所述结合物释放垫包被胶体金标记的布鲁氏菌外膜蛋白bp26。

其中，反应膜可为硝酸纤维膜，结合物释放垫可为玻璃纤维膜。

本发明还提供一种制备上述检测试纸条的方法，其包括如下步骤：

1)制备布鲁氏菌外膜蛋白bp26及其多克隆抗体；

2)将步骤1)制备的布鲁氏菌外膜蛋白bp26及其多克隆抗体在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；

3)用胶体金标记步骤1)制备的布鲁氏菌外膜蛋白bp26，包被到结合物释放垫中；

4)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。

本发明布鲁氏菌抗体快速检测试纸(胶体金法)具有以下优点：

(1)检测快速：10分钟出结果；

(2)特异性：仅对布鲁氏菌各种人或动物血清标本呈阳性，而对其他病原体感染的血清标本呈阴性结果；

(3)敏感性：对布鲁氏菌抗体检测高于血清凝集实验两个滴度。

(4)保存和运输方便，在室温下可保存18个月；

(5)便于临床和家居使用，而且具有产业性。

本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性半定量检测样本中可能存在的布鲁氏菌特异性抗体，可快速筛检病人和受染动物，对布鲁氏菌的感染诊断起到辅助作用。节省了大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和流行病学调查。

附图说明

图1：A本发明试纸条的正面示意图；B本发明试纸条的侧面示意图。其中，1：吸水垫；2：硝酸纤维膜(T：布鲁氏菌外膜蛋白bp26的条带；C：包被抗bp26蛋白多克隆抗体的质控条带)；3：玻璃纤维：含有胶体金标记的布鲁氏菌外膜蛋白bp26；4：金标抗体保护膜；5：反应支持物。

图2：检测结果示意图。其中：从左至右依次为：T、C两条线阳性；C一条线阴性；T、C两条线阴性，无效。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因工程抗原的制备

(1)目的基因的获得

根据目的基因片段序列(GenBank登录号为AY166769)及pGEX-4T-1(Pharmacia)表达载体的特点设计两端含有限制性内协酶EcoR1、Xho1酶切位点的引物：

5’gaattcatgaacactcgtgct3’

5’gcctcgagttacttgatttcaa3’

然后，从布鲁氏菌基因组中扩增出目的基因片断bp26，扩增条件：95℃变性5min；95℃ 1min，49.8℃ 1min，70℃ 1min，进行35个循环；最后70℃延伸10min。

(2)目的基因的克隆和阳性重组子的筛选

PCR扩增产物电泳后切胶回收，与PMD-18T克隆载体16℃过夜连接后，转化到DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌株，37℃过夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆菌株，测定序列。

(3)bp26融合表达载体的构建

用限制性内切酶EcoRI、XhoI分别酶切T/bp26和pGEX-4T-1，1％琼脂糖电泳切胶回收bp26目的片段和pGEX-4T-1双酶切后的大片段，用T4连接酶将两者16℃过夜连接，连接产物转入BL21感受态细胞，LB固体培养基培养8～10小时，挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用PCR及限制性内切酶EcoR I、XhoI双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切产物用1％琼脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组的质粒测序。

(4)pGEX-bp26融合蛋白的诱导表达

筛选出的阳性克隆菌在LB培养基中摇菌培养过夜后，将过夜菌按照1:100的比例接种至1000ml LB液体培养基中，37℃摇床培养。bp26基因转化菌在接种后2小时为最佳诱导时机(OD600nm 0.5)，IPTG浓℃ 0.3mmol/L，29℃诱导8小时，目的蛋白存在于细胞裂解液上清中。

(5)pGEX-bp26融合蛋白的纯化、鉴定

将(4)中1000ml菌液12000r/m、4℃离心，弃上清，将菌体用细胞裂解液裂解，使用含有GST标签的亲和层析柱子纯化融合蛋白，(B-PER细菌GST标签融合蛋白柱式纯化Kit货号：78200赛默飞世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进行纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层测得产率在95％以上。

融合蛋白的Western-Blot鉴定

切取一半胶用BioRad公司生产的半干电转仪转于硝酸纤维素膜上，进行印迹试验，一抗为布鲁氏菌单抗(北京博奥森生物技术有限公司)，TMB显色后，结果有特异性蛋白条带出现。

实施例2：外膜蛋白bp26多克隆抗体的制备

(1)动物免疫：

选择1-2kg的新西兰白兔，用bp26蛋白于背部皮下多点注射，免疫剂量为1mg/kg。共免疫4次。

(2)免疫效价检测：

包被bp26蛋白的酶标板，每孔4μg。按间接ELISA法检测免疫血清的效价。血清效价达到1:20000以上，可采集血清。

(3)抗体提纯及检定：

采用常规辛酸法提纯。纯度用非变性PAGE电泳检定，显示蛋白一条带。活性采用ELISA检定，效价大于1:20000。

实施例3：布鲁氏菌抗体检测试剂盒的研制

(1)胶体金-抗原结合物的制备：

经实验确定，以bp26蛋白作为金标抗原，其最佳结合pH值为8.0，蛋白配比为46μg/ml胶体金。标记胶体金经稳定剂(0.5％BSA，pH8.0，0.01M Tris缓冲液)处理后，按每平方厘米65μl的量，取胶体金-抗原结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，冷冻干燥，并在干燥环境中保存。

(2)包被抗原于硝酸纤维膜：

将布鲁氏菌外膜蛋白bp26用0.01M PBS稀释成3.5±0.1mg/ml。将羊抗鼠IgG多克隆抗体用0.01M PBS稀释成2±0.1mg/ml。用喷膜机将二者以1μl/cm的速度喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线。两条线之间的间隔为0.5cm。

把固定有抗原抗体的硝酸纤维置37℃烤箱中干燥2小时。干燥环境中保存备用。

(3)布鲁氏菌抗体检测试剂盒组成

反应支持物为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫为2cm×0.4cm的滤油纸；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜依次包被bp26蛋白，布鲁氏菌bp26蛋白的多克隆抗体，0.4cm×0.4cm的含有胶体金标记的布鲁氏菌bp26蛋白的玻璃纤维；金标抗体保护膜(样品垫)为2.7cm×0.4cm的滤纸纤维；即形成了布鲁氏菌抗原快速检测试纸条(胶体金法)。

(4)布鲁氏菌抗体检测试剂盒特异性及敏感度实验：

特异性实验：用本品检测正常的牛、羊、猪、犬血清，正常人血清，猪瘟血清，猪空肠弯曲菌血清，兔抗鼠伤寒沙门氏菌血清，兔抗土拉伦菌血清、兔抗耶尔森氏菌血清、兔抗大肠杆菌血清。结果均为阴性，表明布鲁氏菌抗体检测试剂盒有良好的特异性。

敏感度实验：分两部分，首先检测其对不同型布氏菌抗体的覆盖率。用本品分别检测牛种布氏菌、猪种布氏菌、羊种布氏菌、犬种布氏菌阳性血清，均为阳性，表明布鲁氏菌抗体检测试剂盒可检测四种布氏菌特异性抗体。对阳性血清用ELISA试剂盒进行效价检测，并稀释成不同的滴度，检测结果表明，本品最低检测出量为1:32(ELISA)。实施例4检测方法(参见图2)

将待检标本100-150μl加入检测条的样品垫(实施例2试纸条“4”处)上，样品液沿膜向上爬行，10-15分钟判读结果。

结果：

如样本中含有布鲁氏菌抗体，则与试纸条上胶体金标记的布鲁氏菌抗原bp26形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的布鲁氏菌的bp26结合，形成红色线条，即在T处形成红色条带，即为阳性结果。

无论是否含有相对应的抗体，胶体金标记的布鲁氏菌的bp26继续向上爬行与包被在膜上的抗bp26的多克隆抗体结合，形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。

序列表

<110>北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司

<120>布鲁氏菌抗体快速检测试纸条

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

Claims (6)

1、一种检测试纸条，其包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有包被布鲁氏菌特异性抗原bp26的检测带和包被布鲁氏菌外膜蛋白bp26多克隆抗体的质控带；所述结合物释放垫包被胶体金标记的布鲁氏菌外膜蛋白bp26。

2、如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，其中所述布鲁氏菌特异性抗原bp26是应用基因工程方法重组表达获得。

3、如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

4、如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述的结合物释放垫为玻璃纤维膜。

5、一种制备权利要求1～4任一项所述试纸条的方法，其包括如下步骤：

1)制备布鲁氏菌特异性抗原bp26；

2)将步骤1)制备的布鲁氏菌特异性抗原bp26及其多克隆抗体在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；

3)用胶体金标记步骤1)制备的布鲁氏菌特异性抗原bp26，包被到结合物释放垫中；

4)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。

6、权利要求1～4任一项所述试纸条在检测布鲁氏菌抗体中的应用。

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