CN101363857A - 一种麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条。其是在硝酸纤维膜(NC膜)上同时包被麻疹特异性基因工程抗原H、风疹病毒特异性基因工程抗原E1和质控二抗IgG，结合胶体金标记的抗人IgM，应用膜层析捕获法，检测标本中麻疹、风疹病毒特异性IgM抗体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和流行病学调查，对麻疹、风疹病毒感染起到辅助和鉴别诊断作用，并可用于疫苗接种后的免疫效果观察。

Description

一种麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用。

背景技术

麻疹病毒(measles virus，MV)感染除能引起发热、呼吸道卡他症状和全身斑丘疹等急性感染症状外，还同抑制细胞介导的免疫作用相关，从而导致肺炎、腹泻等继发感染。少数病例中甚至还能引起脑炎及持续性中枢神经系统感染等严重并发症。MV-H蛋白(血凝素蛋白)属于II型跨膜糖蛋白，分子量为73-78kD，能刺激机体产生有效的体液免疫和细胞免疫。MV-H蛋白是MV两类受体CD46和SLAM作用的主要位点，起始病毒的感染；同时还能与F蛋白共同作用，诱导病毒胞膜和细胞膜融合。

当前麻疹病例的临床症状往往不够典型，因此，对疑似麻疹病例的实验室诊断显得异常重要。目前，临床常用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测患者血清中麻疹IgM抗体进行确认。但是，特异性IgM抗体在发病初期1～3d时和恢复期的阳性率较低，仅为50～73％，尤其在发病当日和次日检出的阳性率更低。因此，容易造成漏诊，引起各种严重并发症。据报道，对出疹初期就诊临床符合，但麻疹IgM抗体阴性的患者，采用RT-PCR的方法检测MV-H基因，可以提高检测的阳性率。但受限于成本和PCR技术本身，不适合应用于大规模的临床检测。

风疹病毒(rubella virus，RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员。通常RV感染症状较轻，表现为急性、轻型、病程短、自限性出疹性疾病。RV对公众健康的最大威胁是它的致畸特性。妇女妊娠期，尤其是前3个月感染RV可导致新生儿产生一系列的器官畸形，称为先天性风疹综合征(CRS)。RV为单股正链RNA病毒，其3端的结构基因编码三种蛋白，即衣壳蛋白C和两种包膜糖蛋白E1和E2。在RV的3种主要结构蛋白E1、E2和C蛋白中，抗原表位主要存在于E1膜蛋白上。E1为包膜糖蛋白，与E2共同构成病毒包膜的刺突。E1相对分子质量为57,000，由412-418个氨基酸残基组成。应用单克隆抗体已确定E1上存在血凝及中和抗原决定簇。国外已有E1膜蛋白的全长基因表达，但完整的E1膜蛋白水溶性差，不易纯化，难以作为抗原用于RV病毒感染的血清学检测。据文献报道，E1膜蛋白中大多数抗原决定簇聚集区位于第202～305位氨基酸之间，并且这一抗原决定簇聚集区序列高度保守。

自HIA(血凝抑制)建立以来，RV感染的实验室诊断方法得到了不断的更新和改善。虽然ELISA是诊断先天性感染的主要常规方法，但是RV特异性抗体与微小病毒B19、EB病毒等发生交叉反应，I型糖尿病、慢性肝病患者也会出现阳性反应，使其特异性受到限制。而PCR在病毒感染的诊断中存在着其他方法难以比拟的优势。但目前尚缺乏PCR检测RV感染的诊断标准。有待进一步研究阐明。所以，单独从一个方面诊断RV感染是不可靠的，两种或两种以上方法如ELISA和PCR联合应用才是RV感染更具有说服力的诊断方法。

胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)始于上世纪90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗原、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测麻疹病毒、风疹病毒特异性IgM抗体的试纸条，检测人类标本中麻疹、风疹病毒特异性IgM抗体，用于麻疹、风疹病毒感染的辅助诊断和鉴别。

本发明的另一目的是提供一种麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条在用于检测麻疹、风疹病毒特异性IgM抗体中的应用。

本发明提供了一种麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条，其包括同时含有包被有麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1特异性抗原和二抗IgG的三个色带的硝酸纤维膜，及含有胶体金标记的抗人IgM的玻璃纤维膜。

其中，所述的麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1特异性抗原通过原核表达制备获得。

所述的抗IgG抗体为抗鼠IgG抗体。

所述硝酸纤维膜中麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1抗原的浓度为3.5mg/ml，所述抗鼠IgG抗体的浓度为2mg/ml，采用0.01MPBS进行稀释。

所述玻璃纤维膜中胶体标记的抗人IgM的pH值为7.6～8.0，胶体金和抗体的配比为18μg/ml胶体金。

本发明麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条，还包括反应支持物、金标抗体保护膜和吸水垫，所述反应支持物上依次相互搭接粘贴的金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。

所述反应支持物优选PVC板；所述吸水垫优选滤油纸；所述金标抗体保护膜同时具有吸水功能，优选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。

本发明麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1)分别制备麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1特异性抗原；

2)硝酸纤维膜的制备：将麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1抗原用PBS稀释成3.5mg/ml，将抗鼠IgG抗体用PBS稀释成2mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37℃中干燥2小时，备用；

3)玻璃纤维膜的制备：将胶体金调整至最适pH值为7.6～8.0，胶体金和抗体的配比为18μg/ml胶体金，经稳定剂(含0.05％BSA，pH8.0，0.01MTris缓冲液)处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；

4)最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。

本发明所述试纸条用于检测麻疹、风疹病毒特异性IgM抗体中的应用。

本发明采用纯化的麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1特异性基因工程抗原和抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的抗人IgM，应用膜层析捕获法的原理检测标本中的麻疹、风疹病毒特异性IgM抗体。

本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性半定量检测样本中可能存在的麻疹、风疹病毒特异性抗体，达到快速筛检病人，及时控制疫情的目的。可节省大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和流行病学调查，对麻疹、风疹病毒的感染起到辅助和鉴别诊断作用。

附图说明

图1A为本发明麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条的正面示意图；

图1B为本发明麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条的侧面示意图；

其中，1：吸水垫；

2：硝酸纤维膜(T1和T2：麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1特异性抗原的二条检测条带；C：包被抗鼠IgG的质控条带)；

3：含有胶体金标记抗人IgM的玻璃纤维膜；

4：金标抗体保护膜；

5：反应支持物。

图2为本发明试纸条检测结果示意图。

其中，从左至右依次为：T1、C或T2、C两条线阳性；C一条线阴性；T、C两条线阴性，无效。

具体实施方式

通过下面给出的本发明的具体实施例和实验例可以进一步清楚地理解本发明，但不是对本发明的限定。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1特异性抗原的克隆表达

(1)MV-H蛋白基因的扩增

按照Trizol法抽提MV基因组RNA，然后按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA第一链。(MV.H基因的GenBank登陆号为AB045300)再用引物5’CGCA AGCTTCTATCTGCGATTGGTTCCA3’和

5’TTAGGATCCATGTCACCACA ACGAGACCG3’

在高保真DNA聚合酶的作用下，以95℃ 3min；94℃ 30S，54℃35s，72℃ 105S，30个循环；再于72℃延伸10min的条件扩增MV-H基因。产物经PCR产物(小量)纯化试剂盒纯化。

病毒的重组

分别将MV-H基因和载体pGEMEX-1(Promega)置于BamHI和Hind-III的双酶切体系中，37℃水浴1h，产物用割胶回收试剂盒(TAKARA Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0货号：DV805A)纯化。MV-H和pGEMEX-1的酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，24℃水浴1h。立即将10μL连接产物与100μL大肠埃氏菌DH5α感受态细胞混匀，冰浴30min后，42℃水浴热激90S，再冰浴5min，然后加入450μL LB培养基，于180r/min37℃摇床振摇1h。将转化后菌液200μL均匀涂布于含100μg/mL氨苄西林的固体LB培养基平板表面，37℃孵箱过夜，筛选阳性克隆并对其进行酶切和测序鉴定，结果获得了10株阳性克隆。

融合蛋白的表达和鉴定将麻疹病毒血凝素

基因重组质粒MV-H基因和载体pGEMEX-1转化大肠埃希菌JM109(DE3)和BL21(DE3)，方法同前。阳性菌株在LB培养基中扩增3～4h后，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)分别诱导表达4h和6h。将得到的菌液离心沉淀，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)洗涤。经PBS溶解后，煮沸5分钟裂解菌液。最后，用8％SDS-PAGE蛋白凝胶电泳验证表达产物。用GST-融合蛋白纯化试剂盒(B-PER细菌GST标签融合蛋白柱式纯化Kit货号：78200赛默飞世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进行纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层测得产率在95％以上。

融合蛋白的Western-Blot鉴定

切取一半胶用BioRad公司生产的半干电转仪转于硝酸纤维素膜上，进行印迹试验，一抗为MV单抗(北京博奥森生物技术有限公司)，TMB显色后，结果有特异性蛋白条带出现。

(2)RV-E1

选取E1基因(登陆号EU622506)中，首先在待扩增目的基因下游选择一片段(nt9345～9365)，设计反转录引物P3。同时根据目的基因序列设计PCR引物P1和P2，并在引物的5端和3端分别引入BamHI酶切位点及保护碱基和EcoR I酶切位点及保护碱基。引物由上海生工公司合成。引物序列如下：

P1：5ATGAATG GATCCGGCAATCAGCAGTCCCGGT3

P2：5GCCGGAATTCTG TCAGGGGAATGGCGT3

P3：5GGTGAGATGGCAATTGCCT3

病毒总RNA的提取及RT-PCR应用Promega公司的总RNA提取试剂盒，并按所提供方法提取细胞内病毒基因组RNA。以提取的RNA作为模板，用Reverse Transcription System Kit(TAKARA RNAPCR Kit(AMV)Ver.3.0货号：DRR019A)进行反转录，反转录产物用去离子水稀释5倍后再行PCR，PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃ 30S、52℃ 30S、72℃ 30S，共35个循环；72℃延伸10min。PCR产物于琼脂糖凝胶上行电泳检测，并用Wizard PCR preps DNApurificaton system试剂盒(TaKaRa DNA Fragment Purification KitVer.2.0货号：DV807A)纯化回收。

重组融合表达质粒的构建PCR产物经测序鉴定后，用常规方法克隆入载体pGEX4T-2(Pharmacia)，转化DH-5α菌株，用BamH I和EcoR I双酶切鉴定筛选出阳性重组克隆，命名为pGEX4T-2/E1。

重组质粒在DH-5α菌株中的表达选取含pGEX4T-2原质粒及重组质粒的单个菌落分别接种于5ml LB培养液中，37℃剧烈振荡培养至A₆₀₀约为0.5。以1：100的比例活化细菌至A₆₀₀约为0.2，加IPTG至终浓度1mmol/L诱导3～5h。每隔1h取1ml培养物检测诱导情况。将诱导前及不同诱导时间所收集的各管菌液分别于4℃下以12,000r/min离心2min，弃上清，收集细菌。各管加入50μL的1×SDS蛋白凝胶加样缓冲液重悬，混匀后煮沸5min，以12000r/min离心5min，吸上清液-20℃保存备用。

表达产物的SDS-PAGE及纯化取上述制备的上清液各20μL与中相对分子质量标准蛋白质Marker同时行SDS PAGE，电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色，脱色液脱色后观察有无目的条带。用GST-融合蛋白纯化试剂盒(B-PER细菌GST标签融合蛋白柱式纯化Kit货号：78200赛默飞世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进行纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层测得产率在95％以上。

融合蛋白的Western-Blot鉴定

切取一半胶用BioRad公司生产的半干电转仪转于硝酸纤维素膜上，进行印迹试验，一抗为RV单抗(北京博奥森生物技术有限公司)，TMB显色后，结果有特异性蛋白条带出现。

实施例2：麻疹、风疹病毒IgM抗体快速检测试纸条(参见图1)

(1)胶体金-抗体结合物的制备：

经实验确定，抗人IgM单克隆抗体胶体标记的其最佳结合pH值为8.0，胶体金和抗体的配比为18μg/ml胶体金。标记胶体金经稳定剂(0.5％BSA，pH8.0，0.01M Tris缓冲液)处理后，标记胶体金抗原稀释至OD2.0，按每平方厘米65μl的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，冷冻干燥，并在干燥环境中保存。

(2)包被抗原于硝酸纤维膜：

将麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1抗原用0.01M PBS稀释成3.5mg/ml。将抗鼠IgG多克隆抗体用0.01MPBS稀释成2mg/ml。用喷膜机将二者以1ul/cm的速度喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线。三条线之间的间隔为0.5cm。

把固定有抗原、抗体的硝酸纤维置37℃烤箱中干燥2小时。干燥环境中保存备用。

(3)麻疹、风疹病毒IgM检测试剂盒组成

反应支持物5为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫1为2cm×0.4cm的滤油纸；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜2依次包被抗鼠IgG，麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1抗原，0.4cm×0.4cm的含有胶体金标记的抗人IgM单抗的玻璃纤维膜3；金标抗体保护膜(样品垫)4为2.7cm×0.4cm的滤纸纤维；即形成了麻疹病毒、风疹病毒IgM抗体检测试纸条(胶体金法)。

(4)麻疹、风疹病毒IgM检测试剂盒特异性及敏感度实验

特异性实验：本产品设计如下的阴性质控品：流感病毒血清、呼吸道合胞病毒血清、副流感病毒血清、流行性腮腺炎病毒血清、肺炎支原体血清、正常人血清、麻疹血清，风疹血清。所有血清均用相应的ELISA试剂盒进行筛选，为IgM阳性血清。检测结果表明，试剂盒的两条检测线仅与相应的IgM血清反应，而与其它的无交叉反应。

敏感度实验：麻疹IgM阳性血清，风疹IgM阳性血清，均经ELISA筛选标定。检测表明同，本产品对麻疹IgM阳性血清的最低检出量为1:40(ELISA效价)，对风疹IgM阳性血清的最低检出量为1:20(ELISA效价)。

实施例3检测方法(参见图2)

将待检标本(全血、血浆或血清)直接滴加入实施例2试纸条“4”处，样品液沿膜上行，10-15分钟判读结果。

结果：

如样本中含有麻疹病毒、风疹病毒IgM抗体，则与试纸条上胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1特异性抗原结合形成红色线条，即在T1、T2处形成红色条带。

无论是否含有相对应的抗体，胶体金标记抗人IgM的单克隆抗体继续向上爬行与包被在膜上的抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司

<120>一种麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用

<130>

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

Claims (9)

1、一种麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，其包括同时含有包被有麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1特异性抗原和二抗IgG的三个色带的硝酸纤维膜(2)，及含有胶体金标记的抗人IgM的玻璃纤维膜(3)。

2、根据权利要求1所述的麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，所述的麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1特异性抗原通过原核表达制备获得。

3、根据权利要求1或2所述的麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。

4、根据权利要求3所述的麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，所述抗鼠IgG抗体的浓度为2mg/ml。

5、根据权利要求1-4任意一项所述的麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维膜中胶体标记的抗人IgM的pH值为7.6～8.0，胶体金和抗体的配比为18μg/ml胶体金。

6、根据权利要求1-5任意一项所述的麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，所述麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1抗原的浓度为3.5mg/ml。

7、根据权利要求1-6任意一项所述的麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，还包括反应支持物(5)、金标抗体保护膜(4)和吸水垫(1)，所述反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的金标抗体保护膜(4)、玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维膜(2)和吸水垫(1)。

8、一种制备权利要求7所述的麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条的方法，包括以下步骤：

1)分别制备麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1特异性抗原；

2)硝酸纤维膜的制备：将麻疹病毒H抗原、风疹病毒E1抗原用PBS稀释成3.5mg/ml，将抗鼠IgG抗体用PBS稀释成2mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37℃中干燥2小时，备用；

3)玻璃纤维膜的制备：将胶体金调整抗体pH值为7.6～8.0，胶体金和抗体的配比为18μg/ml胶体金，经稳定剂处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；

4)最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。

9、权利要求1-7任意一项所述麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条在检测麻疹、风疹特异性IgM抗体中的应用。

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