CN107202882B

CN107202882B - Rv0440蛋白在诊断潜伏性/活动性肺结核中的用途

Info

Publication number: CN107202882B
Application number: CN201610154675.0A
Authority: CN
Inventors: 陶生策; 毕利军; 张先恩; 邓教宇; 朱国峰; 侯剑; 王雅果
Original assignee: GUANGDONG TIBIKANG BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Tibikon Biotechnology (Guangdong) Co.,Ltd.
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2016-03-17
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2036-03-17
Also published as: CN107202882A

Abstract

本发明涉及结核分枝杆菌Rv0440蛋白在诊断潜伏性/活动性肺结核中的用途，所述的Rv0440蛋白是序列表中的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；本发明还涉及以所述Rv0440蛋白为活性成分的诊断潜伏性/活动性肺结核的检测芯片、检测试剂盒；以及抗Rv0440蛋白的抗体的制药、检测应用。

Description

Rv0440蛋白在诊断潜伏性/活动性肺结核中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及结核分枝杆菌Rv0440蛋白在诊断潜伏性/活动性肺结核中的用途。

背景技术

多个世纪以来，结核病持续在全球成为一个不容忽视的公共卫生问题。目前全球已有三分之一的人口携带结核分枝杆菌，仅2010年一年就新增结核病病例880万，死亡145万，平均不到22秒即有一人死于肺结核病，结核病高居传染病死亡人数之首。而我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者人数高居全球第二位，受感染人数超过5亿，仅2010年一年就有新发病例90～120万，占据了全球总新增病例的约12％，如不及时采取有效措施，在未来十年内可能有3000万人发病，将会导致严重的公共卫生问题和社会问题，所以从国家战略层面必需尽快实现对肺结核的有效控制。

科学证据表明，结核感染人体后，在大多数情况下，会受到人体内免疫系统的控制，从而处于一个潜伏感染状态，在任何时候都有可能转化为潜伏性结核病。考虑到全球结核感染人口，甚至在我国都是一个十分庞大的数字，结合结核病的易传播性和社会危害性，在健康人群中筛查结核潜伏患者就显得尤为重要。已有研究证实潜伏性肺结核感染(1atent tuberculosis infection，LTBI)的预防性治疗可降低HIV/TB双重感染人群进展为潜伏性TB的风险(Bucher HC，Griffith LE，Guyatt GH，et al：Isoniazid prophylaxisfor tuberculosis in HIV infection：a meta-analysis of randomized controlledtrails[J].AIDS，1999，13：501-508)。但是，目前国内诊断潜伏感染主要依据结核菌素皮试(PPD皮试)的结果，一般认为PPD强阳性或在短期内从阴性转为阳性者是结核病潜伏感染者。然而因为PPD皮试无法区分在中国广泛推广的BCG接种产生的免疫应答反应与潜伏感染产生的应答反应。而基于抗原抗体反应的血清学诊断，由于其简便性、快速性，是重要的潜伏性肺结核感染临床辅助性诊断手段。因此，从长远角度看，应致力于发现敏感性和特异性均较好的结核标志物。

理想的结核诊断标志物应符合以下条件：(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)存在于体液，特别是血液中，易于检测。但是目前肺结核分支杆菌血清学诊断所针对的抗原如抗原5、38KD抗原、30/31KD抗原以及抗原60等，均存在阳性检出率低，与其它分支杆菌的交叉免疫性等问题，虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值，但目前仍不能用于潜伏性肺结核感染的确诊。为了实现对潜伏性肺结核感染的高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的潜伏性肺结核感染生物标志物。

Rv0440蛋白基因名groEL2，编码一个60KD伴侣蛋白，行使阻止蛋白错误折叠和促进在压力条件下错误折叠的蛋白重折叠过程。

发明内容

本发明涉及Rv0440蛋白在制备鉴别、诊断/辅助诊断、筛查/辅助筛查目标检测样本是否来自于潜伏性/活动性肺结核患者的产品中的应用。

所述Rv0440蛋白是如下a)或b)的蛋白：

a)序列表中的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

SEQ ID No.1：

>M.tuberculosis H37Rv|Rv0440|groEL2

MAKTIAYDEEARRGLERGLNALADAVKVTLGPKGRNVVLEKKWGAPTITNDGVSIAKEIELEDPYEKIGAELVKEVAKKTDDVAGDGTTTATVLAQALVREGLRNVAAGANPLGLKRGIEKAVEKVTETLLKGAKEVETKEQIAATAAISAGDQSIGDLIAEAMDKVGNEGVITVEESNTFGLQLELTEGMRFDKGYISGYFVTDPERQEAVLEDPYILLVSSKVSTVKDLLPLLEKVIGAGKPLLIIAEDVEGEALSTLVVNKIRGTFKSVAVKAPGFGDRRKAMLQDMAILTGGQVISEEVGLTLENADLSLLGKARKVVVTKDETTIVEGAGDTDAIAGRVAQIRQEIENSDSDYDREKLQERLAKLAGGVAVIKAGAATEVELKERKHRIEDAVRNAKAAVEEGIVAGGGVTLLQAAPTLDELKLEGDEATGANIVKVALEAPLKQIAFNSGLEPGVVAEKVRNLPAGHGLNAQTGVYEDLLAAGVADPVKVTRSALQNAASIAGLFLTTEAVVADKPEKEKASVPGGGDMGGMDF

b)将序列表中的SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No.1所示蛋白具有相同功能的蛋白质。

所述的检测样品为全血样品、血清样品、组织样品、病理组织，优选为血清样品。

本发明还提供一种用于鉴别、诊断/辅助诊断、筛查/辅助筛查目标检测样本是否来自于潜伏性/活动性肺结核患者的标记物，所述的标记物为抗Rv0440的抗体，

优选的，所述抗体为IgG抗体，

更优选的，为人离体血清中的IgG抗体，

所述Rv0440是如下a)或b)的蛋白：

a)序列表中的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

本发明的再一个目的是提供血清中抗Rv0440抗体作为标志物在开发、设计和/或制备具有鉴别、诊断/辅助诊断、筛查/辅助筛查目标检测样本是否来自于潜伏性/活动性肺结核患者的产品中的应用；

优选的，所述抗体为IgG抗体，

更优选的，为人离体血清中的IgG抗体，

所述Rv0440是如下a)或b)的蛋白：

a)序列表中的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述鉴别、诊断/辅助诊断、筛查/辅助筛查目标检测样本是否来自于潜伏性/活动性肺结核患者具体指，

(1)鉴别、诊断和/或辅助诊断待测样本的来源个体是否患有潜伏性/活动性肺结核；

或(2)筛查和/或辅助筛查待测样本来源人群中患有潜伏性/活动性肺结核的情况。

本发明的又一个目的是提供一种以所述Rv0440蛋白为活性分子的用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜伏性/活动性肺结核的试剂盒，所述的试剂盒包括，

(1)检测芯片，所述检测芯片上设置有连接Rv0440蛋白的检测点，每个检测点独立于相邻的检测点，所述Rv0440是如下a)或b)的蛋白：

a)序列表中的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中的SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No.1所示蛋白具有相同功能的蛋白质；

(2)配合检测芯片一起使用的试剂，所述试剂包括样品稀释液、洗涤液、封闭液；

(3)用于显示检测结果的标记物，所述标记物优选为荧光标记的抗人第二抗体。

所述的样品稀释液为pH 7.4PBS溶液,其组成为：

所述的洗涤液为pH 7.4的PBST溶液,其组成为：

所述的封闭液为含BSA的pH 7.4PBS溶液：

所述的荧光标记的抗人第二抗体优选为抗人的IgG第二抗体。

所述试剂盒还包括说明书，所述说明书记载如下内容：

(1)与正常人相比，潜伏性/活动性肺结核感染患者的检测样品中，抗Rv0440抗体水平显著升高；

(2)所述的检测样品为全血样品、血清样品、组织样品、病理组织，优选为全血样品；

(3)所述抗体为IgG类型的抗体。

本发明还涉及所述试剂盒中的检测芯片的制备方法，所述的方法包括，

(1)将含有Rv0440蛋白的溶液点样于载体玻片上，所述含有Rv0440蛋白的溶液的配方为：

(2)采用生物芯片点样仪点样，每次点样使用的点样溶液体积为0.3-1nl；优选0.5-1nl；最优选1nl；

(3)点样后，将载体玻片保持在30％RH-40％RH湿度，4℃环境中过夜，优选的，湿度为35％RH；

(4)将载体玻片放置于塑料盒中封口-80℃低温保存。

所述含有Rv0440蛋白的溶液中，还进一步包括：体积百分比为25％的甘油、体积百分比为0.02％的Tween20、0.05mg/ml的BSA和0.1g/L的NaN₃。

根据需要，在点样步骤(2)和步骤(3)之间，可在每个载体玻片上贴上用于隔离每个检测点的塑料围栏，在玻片上形成点样孔。

所述载体玻片是三维H载体玻片。

本发明还涉及一种检测待测样品是否来自于潜伏型/活动型肺结核患者的方法，所述的方法为：

使用所述Rv0440蛋白或以Rv0440蛋白为活性分子的检测芯片/检测试剂盒检测待测样品，判断抗Rv0440抗体水平是否显著升高，所述的判断方法为：待测样品的检测结果中，抗Rv0440抗体呈阳性，则判定该待测样品是潜伏性/活动性肺结核阳性，否则为潜伏性/活动性肺结核阴性；

所述阳性具体判断标准为若各个抗体的信噪比值处于如下值之间，则认为是该抗体呈阳性：

Rv0440的抗体的信噪比值处于8.07和10.91之间，包括8.07和10.91；

所述信噪比值的计算公式为：

式中，S和B分别代表所述检测芯片中扫描仪直接显示的信号值和非样品点制区域的背景值，而σ则是代表该点原始信号的标准差；

所述σ对应的实验次数为3次；所述S和B值是用扫描仪在532nm通道扫描得到的；所述扫描仪优选为为GenePix。

所述抗Rv0440抗体优选为IgG抗体。

本发明的最后一个目的是提供上述任一所述试剂盒在制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜伏性/活动性肺结核用途的产品中的应用。

附图说明

图1为所制备的抗原蛋白Rv0440的银染定量结果图。

图2为所制备的抗原蛋白Rv0440的Western-Blotting鉴定结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、蛋白质芯片的制备

(一)结核分支杆菌抗原蛋白Rv0440的制备

1、表达

基因工程改造过的酿酒酵母利用半乳糖诱导过量表达，具体过程为：

首先从分支杆菌属结核分枝杆菌(Mycobacterium M.tuberculosis)(北京株)中，通过PCR从头克隆获得蛋白Rv0440的基因编码片段，通过Invitrogen公司的BP酶将片段连接到pDONR221载体(购自Invitrogen)上，转化到大肠杆菌DH5-Alpha中扩增，提取载体再通过LR酶(Invitrogen)换至经过改造的能够表达GST标签的pEGH-A载体(该载体在“JianZhu，Heng Zhu，et al：J.Virol.May 2009vol.83no.10 5219-5231”中公开过，)上，再次转化到大肠杆菌DH5-Alpha中扩增，提取质粒转化到Pep4酿酒酵母菌株(该菌株在文献“HengZhu，Michael Snyder，et al：Nature Genetics 26,283–289(2000)doi:10.1038/81576”中公开过，)中。诱导培养基中培养，待其OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为2g/L的半乳糖，诱导6h，4000rpm离心收集菌，-80℃保存。

PCR从头克隆中所使用的PCR引物序列如下所示：

扩增Rv0440蛋白的基因编码片段的引物对：

上游引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCCAAGACAATTGCGTACG

下游引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCAGAAATCCATGCCAC

每1L诱导培养基(溶剂为水)中含有的组分如表1所示：

表1

2、纯化

1)、准备裂解液：

50ml裂解液中加50μl巯基乙醇，125μlPMSF及两片Roche蛋白抑制剂；

2)、于-80℃冰箱里取出上述步骤1收集的菌(从120ml诱导培养基培养收集到的菌体)，加400μl氧化锆珠和400μl裂解液，4℃环境中震荡30s，后置冰上2min，重复四次；

3)、取出后11,000rpm离心2min，取上清于一新的15ml离心管中；

4)、重复2和3步四次，将上清收集于同一离心管中；

5)、添加裂解液至12ml即原始诱导培养基体积的1/10，同时用没加抑制剂的裂解液将谷胱甘肽beads清洗3次。12ml裂解液中加入300μl的beads；

6)、加入beads后的裂解液于4℃孵育2h；

7)、11,000rpm离心2min后取上清保存于4℃。Beads用清洗液Ι和清洗液II各洗3次；

8)、加300μl洗脱液孵育15min后，离心取上清收集于一新的离心管中，重复一次。

得到的洗脱液即溶有该蛋白。

上述纯化过程中所用到的缓冲液(溶剂均为水)的组成见表2-表5.

表2裂解液(1L)

表3清洗液I(1L)

表4清洗液II(1L)

表5洗脱液(1L)

3、鉴定

下述实验过程中，所述的溶剂或液体的百分数为体积百分数。

1)、材料制备

配置两块12％的SDS-PAGE胶，1.0mm，15孔。一块银染，一块Western Blotting。取上述纯化好的蛋白各20μl，加入4μl 6X Loading buffer，同时制备规格浓度梯度的BSA样品作为银染定量对照，煮样5min。

2)、跑胶

依次每孔加入12μl上述制备好的样品，BSA梯度样品，2.5μMarker(Takara)记录次序。80V 30min，140V 1h。

3)银染操作步骤：

固定：30min或者更长时间40％乙醇10％冰醋酸加水到250ml

致敏：30min 75ml乙醇30％乙醇17g乙酸钠28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠(大苏打)加水到终体积250ml

水洗：3x 10min

银染：20min 0.625g AgNO3 100μl 37％甲醛(在使用前加入)加水到终体积250ml

水洗：2x 1min

显色：时间视情况而定6.25g Na₂CO₃ 50μl 37％甲醛(在使用前加入)加水到终体积250ml

终止：10min 1g甘氨酸加水到终体积250ml

保存：1％冰醋酸，4℃

4)Western-Blotting步骤：

转膜：15V 40min(半干转，Bio-Rad)。转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH₂O定容至1000ml

封闭：5％脱脂牛奶(Bio-Rad)1h。

第一抗体孵育：Anti-GST鼠抗(NovaGen)终浓度1μg/ml 1h

第二抗体孵育：羊鼠抗荧光800通道(Odyssey)终浓度1μg/ml 1h

Odyssey扫描仪扫描，保存图片。

进行银染定量和Western-Blotting鉴定的结果分别如图1和图2所示。图1结果表明所制备的Rv0440蛋白的量均为50μg/ml；图2结果证明，所制备的Rv0440蛋白正确。

经测序，所制备的Rv0440蛋白组分具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

在此需要说明的是，本实施例仅记载一个具体的Rv0440蛋白的克隆表达方法，该方法中的相关宿主和载体并不影响本申请需要保护的技术方案的实现，仅用作帮助本领域技术人员理解该蛋白的克隆表达过程。本领域技术人员完全可以明晰的是，使用常规的分子生物学实验方法，通过其他常见的载体、宿主，也能够完成目标蛋白的克隆表达。(二)预点抗原的蛋白质芯片的制备

在含上述制备的50μg/ml的Rv0440抗原蛋白的洗脱液溶液中，加入终浓度为25％(体积百分比)的甘油、0.02％(体积百分比)的Tween20、0.05mg/ml的BSA和0.1g/L的NaN₃。采用生物芯片点样仪将上述混合液点于载体玻片(载体玻片为商品化的三维H载体玻片，购自北京博奥生物芯片有限责任公司)上，每点点样约1nL、2个平行点。采用生物芯片点样仪(购自北京博奥生物芯片有限责任公司)点制。

作为阳性对照的IgG(1mg/ml)标准品或Cy3标记抗人抗体二抗(20μg/ml)，混合液中其它组分和终浓度不变，制备出IgG标准品或Cy3标记抗人抗体二抗的混合液。以上述相同的点样方法，将分别含IgG标准品或Cy3标记抗人抗体二抗的混合液点于上述同一载体玻片上，形成微阵列，每玻片可点12个重复平行封闭区间。点样结束后贴上12个孔的塑料围栏，并保持在35％RH湿度4℃环境中16h后，将玻片放置于塑料盒中封口-80℃低温保存。

实施例2、应用蛋白质芯片辅助诊断潜伏性/活动性肺结核

(一)待测血清样品的准备

全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。4℃解冻后的样品应再次离心，然后检测。

(二)诊断过程中所涉及的各种缓冲液及试剂的配制

(1)样品稀释液(见表6)：pH 7.4PBS溶液

表6

(2)洗涤液(见表7)：pH 7.4的PBST溶液

表7

(3)芯片封闭液(见表8)：含BSA的pH 7.4PBS溶液

表8

(4)Cy3标记抗人第二抗体的浓缩液：使用市售的抗人IgG-Cy3荧光标记二抗，稀释至浓度为1mg/ml，分装于避光小管。

(三)应用蛋白质芯片辅助诊断潜伏性肺结核的方法

使用实施例1制备的蛋白质芯片可以检测被检人血液样品中抗原Rv0440相应的IgG抗体的水平，分析这个蛋白质的相应抗体的检测结果，可以判断被检人是否为潜伏性肺结核。

1、具体操作步骤

1)将实施例1点制好密封的芯片从-80℃取出，室温复温10分钟。

2)封闭：将芯片放入洗涤盒，加入约50ml芯片封闭液(表8)，摇床50rpm，室温1h。

3)快速甩掉芯片上多余的液体，置于湿盒内。

4)待测样品的稀释与加样：将待测血清样品按体积比1:100用上述配制的样品稀释液(表6)稀释，取30μL稀释后的含待测血清的溶液加入到封闭的围栏封闭空间中。反应1h，室温。待检测样品临用前15分钟内配制。

5)将芯片从湿盒中取出，置于洗涤盒，加入约50ml上述配制的洗涤液，摇床50rpm，室温5min，重复3次。

6)快速甩掉芯片上多余的液体，置于湿盒内。

7)每个封闭空间加入30μL已经稀释至终浓度1μg/ml的Cy3荧光抗人二抗于芯片上，避光反应1h。

8)将芯片从湿盒中取出，置于洗涤盒，加入约50ml上述配制的洗涤液，摇床50rpm，室温5min，重复3次。再用约50ml超纯水洗一次，5min。

9)离心干燥，用Genepix扫描仪在532nm通道下读取数据。

2、待测样品分别对3种抗原蛋白抗性的判定

用Genepix扫描仪在532nm通道扫描得到的结果是通过点样点的信噪比(SNR)来进行衡量,点样点的信噪比(SNR)计算公式为：

式中，S和B分别代表芯片中原始的信号值(是扫描仪直接显示的数值)和背景值(非样品点制区域的信号值)，而σ则是代表该点原始信号的标准差(σ对应的实验次数为3次)。

将蛋白质芯片上点样点的信噪比值与下述表9的信噪比区间(所述信噪比区间包括所给出的信噪比区间的两端值)进行对比，以进行待测样品对相应抗原抗性的阳性、阴性结果的判定：

表9

3、待测样品检验结果的判定

判定标准：

与正常未患有任何疾病的人相比，潜伏性肺结核感染人中，抗Rv0440抗体水平显著升高，具体表现为：

如果待测样品的检测结果中，抗Rv0440抗体呈阳性(判断抗体是否为阳性的标准：实施例1制备的蛋白质芯片上同一抗原的2个平行点样点都判定为阳性时，该抗体为阳性。)，则判定该待测样品是活动性/潜伏性肺结核阳性，否则为活动性/潜伏性肺结核阴性。

(四)、应用蛋白质芯片辅助诊断潜伏性肺结核的方法的特异性和敏感性

采用200份潜伏性肺结核相关患者的血清(临床诊断为潜伏性肺结核的患者100份，健康人100份；血清样本由广东省结核病控制中心提供，血清样本的取得均经过患者及体检者的知情同意。)对实施例1的蛋白质芯片进行了特异性和敏感性检测，以上述判定标准判定待测者是否为潜伏性肺结核阳性。。

检测显示，根据阳性似然比即敏感性/(1-特异性)计算得出实施例1的蛋白质芯片辅助诊断潜伏性肺结核的最佳工作点的特异性为84％，敏感性为67％，均高于现有技术中潜伏性肺结核诊断的指标。

100份潜伏性肺结核患者中，有67份被检测出阳性；100份健康人中，有16份被检测出阳性。

(五)、应用蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的方法的特异性和敏感性

采用200份活动性肺结核相关患者的血清(临床诊断为活动性肺结核的患者100份，健康人100份；血清样本由广东省结核病控制中心提供，血清样本的取得均经过患者及体检者的知情同意。)对实施例1的蛋白质芯片进行了特异性和敏感性检测，以上述判定标准判定待测者是否为活动性肺结核阳性。。

检测结果显示，根据阳性似然比即敏感性/(1-特异性)计算得出实施例1的蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的最佳工作点的特异性为83.0％，敏感性为64％，均大大高于现有技术中活动性肺结核诊断的指标。

100份活动性肺结核患者中，有64份被检测出阳性；100份健康人中，有17份被检测出阳性。

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，而非对本发明保护范围的限定。

Claims

1.Rv0440蛋白在制备鉴别、诊断、筛查目标检测样本是否来自于潜伏性肺结核患者的产品中的应用，

所述Rv0440蛋白是序列表中的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述的检测样品为血清样品。

2.抗Rv0440抗体作为标志物在开发、设计和/或制备具有鉴别、诊断、筛查目标检测样本是否来自于潜伏性肺结核患者的产品中的应用，

所述Rv0440是序列表中的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述抗体为人离体血清中的IgG抗体；

所述的检测样品为血清样品；

所述鉴别、诊断、筛查目标检测样本是否来自于潜伏性肺结核患者具体指：

(1)鉴别、诊断待测样本的来源个体是否患有潜伏性肺结核；

或(2)筛查待测样本来源人群中患有潜伏性肺结核的情况。