CN105622735B - 一组结核分枝杆菌蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
一组结核分枝杆菌蛋白及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一组结核分枝杆菌蛋白及其编码基因与应用。本发明公开一组蛋白，由如下(1)‑(7)所示的蛋白组成：(1)SEQ ID No.1所示的蛋白；(2)SEQ ID No.3所示的蛋白；(3)SEQ ID No.5所示的蛋白；(4)SEQ ID No.7所示的蛋白；(5)SEQ ID No.9所示的蛋白；(6)SEQ ID No.11所示的蛋白；(7)SEQ ID No.13所示的蛋白。本发明公开的蛋白质芯片对有效诊断活动性肺结核、有效监控肺结核病人的康复过程具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一组蛋白及其编码基因与应用；特别涉及一组结核分枝杆菌蛋白及其编码基因与应用，属于生物医药领域。
背景技术
多个世纪以来，结核病持续在全球成为一个不容忽视的公共卫生问题。目前全球已有三分之一的人口携带结核分枝杆菌，仅2010年一年就新增结核病病例880万，死亡145万，平均不到22秒即有一人死于肺结核病，结核病高居传染病死亡人数之首。而我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者人数高居全球第二位，受感染人数超过5亿，仅2010年一年就有新发病例90～120万，占据了全球总新增病例的约12％，如不及时采取有效措施，在未来十年内可能有3000万人发病，将会导致严重的公共卫生问题和社会问题，所以从国家战略层面必需尽快实现对肺结核的有效控制。
科学表明由于活动性肺结核的极易传播性，对活动性肺结核的诊断及尽快消除传染源，结核病的治疗效果评估及控制结核病流行有非常重大的意义。然而肺结核的根治目前还不能完全做到，据研究表明活动性结核病患者经不同的短程化疗治愈后，有1％-9％的患者将会复发，而在一些特殊人群中，高达20％(Hong Kong Chest Service/BritishMedical Research Council.Am Rev Respir Dis,1991,143:700-706)，而且耐药性结核病进一步传播与复发未及时诊断的结核患者有很大的关系。所以关于结核治愈患者的活动性肺结核诊断对于防治结核的整体战略具有很大的意义。另外，从临床治疗角度看，结核病的常规治疗方案一般需要6个月的时间，而常规结核病的治疗药物有一定的毒副作用，病人的依从性并不好。由于个体间的差异，理论上不同病人实际需要的用药时间可能会有很大的不同，但对于如何细分病人，目前仍缺乏客观的判断指标。通过系统地比较活动性结核病病人和结核康复人群的血清，有可能发现一批可以准确区分这两类人群的生物标识物，这些标识物将可用于康复过程的监控，从而有可能指导活动性结核病病人的个体化用药，缩短用药周期，提高病人对治疗的依从性，降低治疗费用，提高最终的治疗效果。
目前活动性判断应综合临床、X线表现和痰菌决定，而主要依据是痰菌和X线。痰涂片检查简便易行，准确性较高，是活动性肺结核确诊的金标准，但某些研究中其检出率甚至低于10％。基于核酸扩增的诊断方法，如实时定量PCR以及DNA芯片的优点是灵敏度高且耗时短，其问题在于特异性较难保证，容易导致假阳性结果。而基于抗原抗体反应的血清学诊断，由于其简便性、快速性，日益成为重要的活动性肺结核临床辅助性诊断手段，并且能满足区分结核康复人群与活动性肺结核的要求。因此，从长远角度综合来看，应致力于发现敏感性和特异性均较好的结核标志物。
理想的结核诊断标志物应符合以下条件：(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)存在于体液，特别是血液中，易于检测。但是目前肺结核分枝杆菌血清学诊断所针对的抗原如抗原5、38KD抗原、30/31KD抗原以及抗原60等，均存在阳性检出率低，与其它分支杆菌的交叉免疫性等问题，虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值，但目前仍不能用于活动性肺结核的确诊及对病人康复过程的监控。为了实现对活动性肺结核的高灵敏性，高特异性的诊断，及对康复过程的有效监控，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的活动性肺结核生物标志物。
发明内容
本发明的目的是提供一组结核分枝杆菌蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供一组蛋白，由如下(1)-(7)所示的蛋白组成：
(1)SEQ ID No.1所示的蛋白；
(2)SEQ ID No.3所示的蛋白；
(3)SEQ ID No.5所示的蛋白；
(4)SEQ ID No.7所示的蛋白；
(5)SEQ ID No.9所示的蛋白；
(6)SEQ ID No.11所示的蛋白；
(7)SEQ ID No.13所示的蛋白。
上述蛋白是用于诊断或辅助诊断活动性肺结核的一组蛋白。
上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述编码基因中，所述编码基因为如下(1)-(7)所示的DNA分子：
(1)DNA分子1：
1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白中SEQ ID No.1所示的蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述蛋白中SEQ IDNo.1所示的蛋白的DNA分子；
(2)DNA分子2：
1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白中SEQ ID No.3所示的蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述蛋白中SEQ IDNo.3所示的蛋白的DNA分子；
(3)DNA分子3：
1)SEQ ID No.6所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白中SEQ ID No.5所示的蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述蛋白中SEQ IDNo.5所示的蛋白的DNA分子；
(4)DNA分子4：
1)SEQ ID No.8所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白中SEQ ID No.7所示的蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述蛋白中SEQ IDNo.7所示的蛋白的DNA分子；
(5)DNA分子5：
1)SEQ ID No.10所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白中SEQ ID No.9所示的蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述蛋白中SEQ IDNo.9所示的蛋白的DNA分子；
(6)DNA分子6：
1)SEQ ID No.12所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白中SEQ ID No.11所示的蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述蛋白中SEQ IDNo.11所示的蛋白的DNA分子；
(7)DNA分子7：
1)SEQ ID No.14所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白中SEQ ID No.13所示的蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述蛋白中SEQ IDNo.13所示的蛋白的DNA分子；
含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
一种蛋白质芯片也属于本发明的保护范围，包括基片和与其连接的上述的蛋白质；且每种蛋白单独成立一个检测点；
所述蛋白质芯片上，每种蛋白点样形成的检测点的数量≥2。
上述蛋白质芯片中，所述基片为载体玻片；
所述蛋白质芯片是分别将所述的蛋白质点样于所述载体玻片上制成的；
所述蛋白质芯片还包括IgG标准品或Cy5标记羊抗人抗体二抗形成的检测点作为阳性对照；
所述IgG标准品具体购自YEASEN，产品目录号为36110ES10；
所述Cy5标记羊抗人抗体二抗具体购自lifeholder，产品目录号为LH-G11345。
含有上述蛋白的试剂盒也属于本发明的保护范围。
含有上述任一所述的蛋白质芯片的试剂盒也属于本发明的保护范围。
上述试剂盒中，所述试剂盒还包含使用说明书，说明书中记载内容如下：
1)将待检血清点样于上述任一所述的蛋白质芯片进行检测，并用Cy5标记的抗人二抗进行显色，将蛋白质芯片在Cy5荧光的发射波长下进行检测，得到各检测点的信噪比，记作SNR；
所述SNR的计算公式为
所述公式中，S和B分别为蛋白质芯片中检测点的原始的信号值和背景值，σ代表检测点的原始信号的标准差；
所述原始的信号值为芯片扫描仪直接显示的数值；
所述背景值为蛋白质芯片上非样品点制区域的信号值；
所述标准差所对应的实验次数具体为3次；
2)如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的上述蛋白中所述的SEQ ID No.1所示的蛋白的所有检测点的SNR≥8.32且≤10.21，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQ ID No.1所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.94且≤8.27，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQ ID No.1所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的上述蛋白中所述的SEQ ID No.3所示的蛋白的所有检测点的SNR≥7.68且≤9.95，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQID No.3所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.31且≤7.55，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQ ID No.3所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的上述蛋白中所述的SEQ ID No.5所示的蛋白的所有检测点的SNR≥7.16且≤9.75，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQID No.5所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.50且≤7.03，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQ ID No.5所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的上述蛋白中所述的SEQ ID No.7所示的蛋白的所有检测点的SNR≥7.44且≤11.16，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQID No.7所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.04且≤7.20，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQ ID No.7所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的上述蛋白中所述的SEQ ID No.9所示的蛋白的所有检测点的SNR≥7.98且≤9.83，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQID No.9所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.84且≤7.70，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQ ID No.9所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的上述蛋白中所述的SEQ ID No.11所示的蛋白的所有检测点的SNR≥7.81且≤10.62，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQ ID No.11所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.29且≤7.63，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQ ID No.11所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的上述蛋白中所述的SEQ ID No.13所示的蛋白的所有检测点的SNR≥8.05且≤10.87，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQ ID No.13所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.45且≤7.84，则待检血清候选判定为上述蛋白中所述的SEQ ID No.13所示的蛋白的抗体阴性；
3)根据步骤2)，在待检血清的检测结果中，如果该待检血清对上述蛋白中所述的SEQ ID No.1所示的蛋白、上述蛋白中所述的SEQ ID No.3所示的蛋白、上述蛋白中所述的SEQ ID No.5所示的蛋白、上述蛋白所述中的SEQ ID No.7所示的蛋白、上述蛋白中所述的SEQ ID No.9所示的蛋白、上述蛋白中所述的SEQ ID No.11所示的蛋白、上述蛋白中所述的SEQ ID No.13所示的蛋白中的至少4种蛋白的抗体为阳性，则候选判定该待检血清是活动性肺结核阳性血清，该血清来源的患者为活动性肺结核患者，否则该待检血清为活动性肺结核阴性血清，该血清来源的患者为非活动性肺结核患者；
所述蛋白质芯片制备时所用的各点样液中的所述的蛋白的浓度均为50μg/ml；
所述待检血清的稀释倍数为100倍；
所述Cy5标记的抗人二抗的浓度为1μg/ml；
所述Cy5标记的抗人二抗具体的商品名称为Cy5标记羊抗人抗体二抗，购自lifeholder，产品目录号为LH-G11345；
所述发射波长的检测通道具体为635nm通道；
所述各点样液的点样体积为1nL；
所述待检血清稀释时所使用的样品稀释液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为NaCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H20和KCl：所述NaCl在所述样品稀释液中的浓度为8.0g/L,所述KH2PO4在所述样品稀释液中的浓度为0.2g/L,所述Na2HPO4·12H20在所述样品稀释液中的浓度为2.9g/L,所述KCl在所述样品稀释液中的浓度为0.2g/L。
上述蛋白、上述任一所述的蛋白质芯片或上述任一所述的试剂盒在制备诊断或辅助诊断活动性肺结核的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
通过本发明提供的蛋白质芯片，检测活动性肺结核患者及正常人血清中7个蛋白抗原各自相应的IgG抗体的水平，联合分析这7个蛋白质的相应抗体的检测结果，判断被检人是否为活动性肺结核，检测结果表明，本发明提供的蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的最佳工作点的特异性为79％，敏感性为80.2％，均高于现有技术中活动性肺结核诊断的指标。
本发明提供的结核分枝杆菌蛋白质芯片具备快速分析的优势，可以应用于检测活动性肺结核病人相关血清200份(活动性肺结核病人100份、结核康复病人血清100份)，在较短时间内比较了活动性肺结核患者和肺结核康复患者样品中的不同。本发明提供的蛋白质芯片对有效诊断活动性肺结核、有效监控肺结核病人的康复过程具有重要意义。
附图说明
图1为所制备的7个抗原蛋白MT1571、Rv0324、Rv0350、Rv1860、Rv3874、Rv3881c和Rv3899c的银染定量结果图。
图2为所制备的7个抗原蛋白MT1571、Rv0324、Rv0350、Rv1860、Rv3874、Rv3881c和Rv3899c鉴定结果图。
图3为应用蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的方法的特异性和敏感性统计结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
结核分枝杆菌(Mycobacterium M.tuberculosis)H37Rv菌株(北京株)在文献“Nature 1998Nov 12；396(6707):190.”中公开过，公众可从中国科学院生物物理研究所，上海交通大学，中国科学院武汉病毒研究所，广东体必康生物科技有限公司获得。
结核分枝杆菌(Mycobacterium M.tuberculosis)CDC1551菌株在文献“JBacteriol.2002 October；184(19):5479–5490.”中公开过，公众可从中国科学院生物物理研究所，上海交通大学，中国科学院武汉病毒研究所，广东体必康生物科技有限公司获得。
pDONR221载体购自Invitrogen。
pEGH-A载体在文献“Jian Zhu，Heng Zhu，et al：J.Virol.May 2009vol.83no.105219-5231”中公开过，公众可从中国科学院生物物理研究所，上海交通大学，中国科学院武汉病毒研究所，广东体必康生物科技有限公司获得。
Pep4酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在文献“Heng Zhu，Michael Snyder，et al：Nature Genetics 26,283–289(2000)doi:10.1038/81576”中公开过，公众可从广东体必康生物科技有限公司获得。
谷胱甘肽琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽beads)购自国家生化工程技术研究中心。
Anti-GST鼠抗购自NovaGen，产品目录号为71097-3。
羊鼠抗荧光800通道购自LI-COR，产品目录号为926-32212。
商品化的三维H载体玻片购自北京博奥生物芯片有限责任公司，产品目录号为420042。
IgG标准品购自YEASEN，产品目录号为36110ES10。
Cy5标记羊抗人抗体二抗购自lifeholder，产品目录号为LH-G11345。
实施例1、蛋白质芯片的制备
一、7种结核分枝杆菌抗原蛋白的制备
(一)蛋白的表达
1、从分枝杆菌属结核分枝杆菌(Mycobacterium M.tuberculosis)H37Rv菌株(北京株)和CDC1551菌株中，分别通过PCR克隆获得MT1571、Rv0324、Rv0350、Rv1860、Rv3874、Rv3881c和Rv3899c七个蛋白的编码基因片段，分别将各编码基因片段连接到pDONR221载体上，得到各重组质粒。
2、通过LR酶(Invitrogen)将编码基因的片段换至经过改造的能够表达GST标签的pEGH-A载体上，得到各重组质粒。
3、将步骤2得到的各重组质粒转化到Pep4酿酒酵母中，获得表达MT1571、Rv0324、Rv0350、Rv1860、Rv3874、Rv3881c和Rv3899c 7种蛋白的酿酒酵母菌株，在诱导培养基中培养，待其OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为2g/L的半乳糖，诱导6h，然后4000rpm离心收集菌，-80℃保存。
每1L诱导培养基的组分如表1所示。
表1 诱导培养基(1L)
表1所示的诱导培养基的余量为水。
(二)蛋白的纯化
1、裂解液的制备
50ml裂解液(如表2所示)中加50μlβ-巯基乙醇，125μl PMSF及两片Roche蛋白酶抑制剂；
2、取120ml步骤(一)的诱导培养基培养收集到的菌体，加400μl氧化锆珠和400μl裂解液，4℃环境中震荡30s，然后置冰上2min，重复四次；
3、11,000rpm离心2min，取上清于一个新的15ml离心管中；
4、重复2和3四次，将上清收集于同一离心管中；
5、添加裂解液至12ml即原始诱导培养基体积的1/10，同时用没加抑制剂的裂解液将谷胱甘肽beads清洗3次，将300μl的beads加入所述溶液中；
6、将溶液4℃孵育2h；
7、11,000rpm离心2min后取上清保存于4℃。Beads用清洗液Ι和清洗液II各洗3次；
8、加300μl洗脱缓冲液孵育beads 15min后，离心取上清收集于一新的离心管中，重复一次，得到的洗脱液即溶有目的蛋白。
上述纯化过程中所用到的裂解液、清洗液I、清洗液II和洗脱缓冲液的组份分别如表2-表5所示。
表2 裂解液(1L)
表3 清洗液I(1L)
表4 清洗液II(1L)
表5 洗脱缓冲液(1L)
以上裂解液、清洗液I、清洗液II和洗脱缓冲液的余量为水。
二、蛋白的鉴定
下述实验过程中，所述的溶剂或液体的百分数为体积百分数。
(一)材料的准备
配置两块12％的SDS-PAGE胶，一块用于银染定量，一块用于Western Blotting。
(二)将步骤一制备的各目的蛋白溶液各取20μl，进行SDS-PAGE用于银染或Western Blotting。
其中，银染时同时制备规格浓度梯度的BSA样品作为银染定量的对照，WesternBlotting时所用的第一抗体是Anti-GST鼠抗，第二抗体是羊鼠抗荧光800通道。
具体步骤如下：
1、跑胶
依次每孔加入12μl步骤一制备的各目的蛋白溶液样品，BSA梯度样品，2.5μMarker(购自Takara)记录次序。80V 30min，140V 1h。
2、银染操作步骤：
固定：30min或者更长时间40％乙醇10％冰醋酸加水到250ml；
致敏：30min 75ml乙醇30％乙醇17g乙酸钠28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠(大苏打)加水到终体积250ml；
水洗：3x10min；
银染：20min 0.625g AgNO3 100μl 37％甲醛(在使用前加入)加水到终体积250ml；
水洗：2x1min；
显色：时间视情况而定6.25g Na2CO3 50μl 37％甲醛(在使用前加入)加水到终体积250ml；
终止：10min 1g甘氨酸加水到终体积250ml；
保存：1％冰醋酸，4℃。
3、Western-Blotting步骤：
转膜：15V 40min(半干转，Bio-Rad)。转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml
封闭：5％脱脂牛奶(Bio-Rad)1h。
第一抗体孵育：Anti-GST鼠抗终浓度1μg/ml 1h
第二抗体孵育：羊鼠抗荧光800通道终浓度1μg/ml 1h
Odyssey扫描仪扫描，保存图片。
进行银染定量和Western-Blotting鉴定的结果分别如图1和图2所示。
图1结果表明，所制备的MT1571、Rv0324、Rv0350、Rv1860、Rv3874、Rv3881c和Rv3899c蛋白的量均为50μg/ml；图2结果证明，所制备的MT1571、Rv0324、Rv0350、Rv1860、Rv3874、Rv3881c和Rv3899c蛋白正确。
经测序，所制备的各目的蛋白的序列如下：
MT1571的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,其编码基因序列如SEQ ID No.2所示。
Rv0324的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示,其编码基因序列如SEQ ID No.4所示。
Rv0350的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示,其编码基因序列如SEQ ID No.6所示。
Rv1860的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示,其编码基因序列如SEQ ID No.8所示。
Rv3874的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示,其编码基因序列如SEQ ID No.10所示。
Rv3881c的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示,其编码基因序列如SEQ ID No.12所示。
Rv3899c的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示,其编码基因序列如SEQ ID No.14所示。
三、预点抗原的蛋白质芯片的制备
在含上述制备的50μg/ml的MT1571抗原蛋白的洗脱液溶液中，加入终浓度为25％(体积百分比)的甘油、0.02％(体积百分比)的Tween20、0.05mg/ml的BSA和0.1g/L的NaN3。采用生物芯片点样仪将上述混合液点于载体玻片(载体玻片作为基片，载体玻片为商品化的三维H载体玻片)上，每点点样约1nL、2个平行点。采用生物芯片点样仪(购自北京博奥生物芯片有限责任公司)点制。
将上述MT1571抗原蛋白分别替换为Rv0324、Rv0350、Rv1860、Rv3874、Rv3881c和Rv3899c、作为阳性对照的IgG(1mg/ml)标准品或Cy5标记羊抗人抗体二抗(20μg/ml)，混合液中其它组分和终浓度不变，制备出分别含Rv0324、Rv0350、Rv1860、Rv3874、Rv3881c、Rv3899c抗原蛋白、IgG标准品或Cy5标记羊抗人抗体二抗的混合液。
以上述相同的点样方法，将分别含Rv0324、Rv0350、Rv1860、Rv3874、Rv3881c、Rv3899c、IgG标准品或Cy5标记羊抗人抗体二抗的混合液点于上述同一载体玻片上，形成微阵列，每玻片可点12个重复平行封闭区间。点样结束后贴上12个孔的塑料围栏，并保持在35％RH湿度4℃环境中16h后，将玻片放置于塑料盒中封口-80℃低温保存。
实施例2、应用蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核
一、待测血清样品的准备
将全血标本(由广东省结核病控制中心提供，经过体检者的知情同意)于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。4℃解冻后的样品应再次离心，然后检测。
二、诊断过程中所涉及的各种缓冲液及试剂的配制
(1)样品稀释液(见表6)：pH 7.4PBS溶液
表6
(2)洗涤液(见表7)：pH 7.4的PBST溶液
表7
(3)芯片封闭液(见表8)：含BSA的pH 7.4PBS溶液
表8
(4)Cy5标记抗人第二抗体的浓缩液：使用市售的Cy5标记羊抗人抗体二抗，稀释至浓度为1mg/ml，分装于避光小管。
三、应用蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核
使用实施例1制备的蛋白质芯片可以检测被检人血液样品中7个蛋白抗原MT1571、Rv0324、Rv0350、Rv1860、Rv3874、Rv3881c和Rv3899c各自相应的IgG抗体的水平，联合分析这7个蛋白质的相应抗体的检测结果，可以判断被检人是否为活动性肺结核。
(一)具体操作步骤
1)将实施例1点制好密封的蛋白质芯片从-80℃取出，室温复温10分钟。
2)封闭：将芯片放入洗涤盒，加入约50ml芯片封闭液(表8)，摇床50rpm，室温1h。
3)快速甩掉芯片上多余的液体，置于湿盒内。
4)待测样品的稀释与加样：将待测血清样品按体积比1:100用上述配制的样品稀释液(表6)稀释，取30μL稀释后的含待测血清的溶液加入到封闭的围栏封闭空间中。反应1h，室温。待检测样品临用前15分钟内配制。
5)将芯片从湿盒中取出，置于洗涤盒，加入约50ml上述配制的洗涤液(见表7)，摇床50rpm，室温5min，重复3次。
6)快速甩掉芯片上多余的液体，置于湿盒内。
7)每个封闭空间加入30μL已经稀释至终浓度1μg/ml的Cy5标记抗人第二抗体于芯片上，避光反应1h。
8)将芯片从湿盒中取出，置于洗涤盒，加入约50ml上述配制的洗涤液(见表7)，摇床50rpm，室温5min，重复3次。再用约50ml超纯水洗一次，5min。
9)离心干燥，用Genepix扫描仪在635nm通道下读取数据。
(二)待测样品分别对7种抗原蛋白抗性的判定
用Genepix扫描仪在635nm通道(该通道的选择是Cy5荧光标记决定的)扫描得到的结果是通过点样点的信噪比(SNR)来进行衡量,点样点的信噪比(SNR)计算公式为：
(公式1)
公式1中，S和B分别代表芯片中原始的信号值(是扫描仪直接显示的数值)和背景值(非样品点制区域的信号值)，而σ则是代表该点原始信号的标准差(σ对应的实验次数为3次)。
将蛋白质芯片上点样点的信噪比值与下述表9-表15的信噪比区间(所述信噪比区间包括所给出的信噪比区间的两端值)进行对比，以进行待测样品对相应抗原抗性的阳性、阴性结果的判定。
抗MT1571(见表9)：
表9
抗Rv0324(见表10)：
表10
抗Rv0350(见表11)：
表11
抗Rv1860(见表12)：
表12
抗Rv3874(见表13)：
表13
抗Rv3881c(见表14)：
表14
抗Rv3899c(见表15)：
表15
(三)待测样品检验结果的判定
判定标准：如果待测样品的检测结果中，至少有4种抗体呈阳性(判断抗体是否为阳性的标准：实施例1制备的蛋白质芯片上同一抗原的2个平行点样点都判定为阳性时，该抗体为阳性)，则判定该待测样品是活动性肺结核阳性，否则为活动性肺结核阴性。
四、应用蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的特异性和敏感性
采用200份活动性肺结核相关患者的血清(临床诊断为活动性肺结核的患者100份，肺结核康复患者100份；血清样本由广东省结核病控制中心提供，血清样本的取得均经过患者及体检者的知情同意。)对实施例1的蛋白质芯片进行了特异性和敏感性检测，诊断阈值为阳性抗体数大于或等于4即被检人阳性抗体数大于或等于4，即被判断为活动性肺结核阳性。
检测结果如图3所示。
图3中，横坐标假阳性率代表特异性，纵坐标真阳性率代表敏感性。根据阳性似然比即敏感性/特异性计算得出实施例1的蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的最佳工作点的特异性为79％，敏感性为80.2％，均大大高于现有技术中活动性肺结核诊断的指标。
100份活动性肺结核患者中，有80份被检测出阳性；100份肺结核康复患者中，有21份被检测出阳性。
Claims (10)
1.一组蛋白，由如下(1)-(7)所示的蛋白组成：
(1)SEQ ID No.1所示的蛋白；
(2)SEQ ID No.3所示的蛋白；
(3)SEQ ID No.5所示的蛋白；
(4)SEQ ID No.7所示的蛋白；
(5)SEQ ID No.9所示的蛋白；
(6)SEQ ID No.11所示的蛋白；
(7)SEQ ID No.13所示的蛋白。
2.权利要求1所述一组蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下(1)-(7)所示的DNA分子：
(1)DNA分子1：SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(2)DNA分子2：SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(3)DNA分子3：SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(4)DNA分子4：SEQ ID No.8所示的DNA分子；
(5)DNA分子5：SEQ ID No.10所示的DNA分子；
(6)DNA分子6：SEQ ID No.12所示的DNA分子；
(7)DNA分子7：SEQ ID No.14所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种蛋白质芯片，包括基片和与其连接的权利要求1所述的一组蛋白；且每种蛋白单独成立一个检测点。
6.根据权利要求5所述的蛋白质芯片，其特征在于：所述基片为载体玻片。
7.含有权利要求1所述一组蛋白的试剂盒。
8.含有权利要求5或6所述蛋白质芯片的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含使用说明书，说明书中记载内容如下：
1)将待检血清点样于权利要求5或6所述的蛋白质芯片进行检测，并用Cy5标记的抗人二抗进行显色，将蛋白质芯片在Cy5荧光的发射波长下进行检测，得到各检测点的信噪比，记作SNR；
所述SNR的计算公式为
所述公式中，S和B分别为蛋白质芯片中检测点的原始的信号值和背景值，σ代表检测点的原始信号的标准差；
所述原始的信号值为芯片扫描仪直接显示的数值；
所述背景值为蛋白质芯片上非样品点制区域的信号值；
所述标准差所对应的实验次数具体为3次；
2)如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的权利要求1中所述的SEQ ID No.1所示的蛋白的所有检测点的SNR≥8.32且≤10.21，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQID No.1所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.94且≤8.27，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQ ID No.1所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的权利要求1中所述的SEQ ID No.3所示的蛋白的所有检测点的SNR≥7.68且≤9.95，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQ IDNo.3所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.31且≤7.55，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQ ID No.3所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的权利要求1中所述的SEQ ID No.5所示的蛋白的所有检测点的SNR≥7.16且≤9.75，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQ IDNo.5所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.50且≤7.03，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQ ID No.5所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的权利要求1中所述的SEQ ID No.7所示的蛋白的所有检测点的SNR≥7.44且≤11.16，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQID No.7所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.04且≤7.20，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQ ID No.7所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的权利要求1中所述的SEQ ID No.9所示的蛋白的所有检测点的SNR≥7.98且≤9.83，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQ IDNo.9所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.84且≤7.70，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQ ID No.9所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的权利要求1中所述的SEQ ID No.11所示的蛋白的所有检测点的SNR≥7.81且≤10.62，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQID No.11所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.29且≤7.63，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQ ID No.11所示的蛋白的抗体阴性；
如果待检血清点样于所述蛋白质芯片上的权利要求1中所述的SEQ ID No.13所示的蛋白的所有检测点的SNR≥8.05且≤10.87，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQID No.13所示的蛋白的抗体阳性，如果SNR≥6.45且≤7.84，则待检血清候选判定为权利要求1中所述的SEQ ID No.13所示的蛋白的抗体阴性；
3)根据步骤2)，在待检血清的检测结果中，如果该待检血清对权利要求1中所述的SEQID No.1所示的蛋白、权利要求1中所述的SEQ ID No.3所示的蛋白、权利要求1中所述的SEQID No.5所示的蛋白、权利要求1中所述的SEQ ID No.7所示的蛋白、权利要求1中所述的SEQID No.9所示的蛋白、权利要求1中所述的SEQ ID No.11所示的蛋白、权利要求1中所述的SEQ ID No.13所示的蛋白中的至少4种蛋白的抗体为阳性，则候选判定该待检血清是活动性肺结核阳性血清，该血清来源的患者为活动性肺结核患者，否则该待检血清为活动性肺结核阴性血清，该血清来源的患者为非活动性肺结核患者；
所述蛋白质芯片制备时所用的各点样液中的权利要求1中所述的蛋白的浓度均为50μg/ml；
所述待检血清的稀释倍数为100倍。
10.权利要求1所述的一组蛋白、权利要求5或6所述的蛋白质芯片或权利要求7-9任一所述的试剂盒在制备诊断或辅助诊断活动性肺结核的产品中的应用。
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