CN104422763A - 抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种疾病检测试剂盒,该试剂盒包括:人IgG、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体、作为二抗的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG、作为对照的抗Tif1-γ抗体阳性和抗NXP2抗体阳性的阳性对照品;人IgG、Tif1-γ抗原和NXP2抗原分别包被在所述载体的不同区域。本发明还提供了抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途,所述抗原组包括Tif1-γ抗原和NXP2抗原,所述疾病为皮肌炎合并肿瘤。本发明提供的疾病检测试剂盒,通过检测患者体内TIF1-γ抗体和抗NXP2抗体的存在,能够高特异性地诊断皮肌炎合并肿瘤,能够用于皮肌炎合并肿瘤的早期诊断,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地,涉及一种用于检测疾病的试剂盒和抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途。
背景技术
特发性炎症性肌病(idiopathic inflammatory myopathy,IIM)是一组以骨骼肌受累为主要表现形式的获得性的异质性疾病,主要包括多发性肌炎(polymyositis,PM)、皮肌炎(dermatomyositis,DM)和包涵体肌炎(inclusion body myositis,IBM)3种类型。临床实践中观察到IIM合并恶性肿瘤(cancer-associated myositis,CAM)的病例并不少见,既往国内外的研究显示IIM患者并发肿瘤的风险为6%-70%,其中,DM合并肿瘤的发生率明显高于PM。合并肿瘤的IIM治疗更困难,死亡率高,是影响患者预后的重要因素,早期发现肿瘤,积极治疗是改善患者预后的关键。目前,临床上用于肿瘤的筛查方法如肿瘤标记物、CT、MRI、PET-CT等,它们或是敏感性和特异性差,无法做到早期诊断,或是价格昂贵,不适合用作筛查的手段。因此,临床上至今尚无简便、实用、敏感而又特异的指标能够早期诊断和预测肿瘤的发生。
因此,急需开发一种高度敏感及特异的能够用于诊断特发性炎性肌病(IIM)合并肿瘤的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中没有能够预测及高效诊断特发性炎性肌病患者伴发恶性肿瘤的筛查手段的缺点,提供一种敏感及高特异性的能够用于诊断特发性炎性肌病(IIM)合并肿瘤的试剂盒。
转录中介因子α/γ(transcriptional intermediary factor1-α/γ,TIF1-α/γ)是近年来新发现的TIF1家族成员之一,它们是一种与肿瘤相关的自身抗原。TiF1-α可以通过其N端的RING结构域泛素化P53蛋白,降解该蛋白,从而使其在细胞中的表达水平降低。TIF1-γ抑制转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)信号传导通路上的重要蛋白Smad4,在多种实体瘤的发病中起重要作用。核基质蛋白2(anti-nuclear matrix protein2,NXP2)参与了活化肿瘤抑制基因p53的过程。
本发明的发明人经过多年研究发现在肌炎患者体内可检测到抗TiF1-γ抗体,尤其多见于皮肌炎合并肿瘤患者,因此,通过检测肌炎患者体内TiF1-γ抗体的存在能够对皮肌炎(DM)合并肿瘤具有很好的诊断及预测价值;通过在此领域的持续研究,本发明的发明人进一步发现在部分肌炎患者体内还可以检测到核基质蛋白2(anti-nuclear matrixprotein2,NXP2),通过检测肌炎患者体内NXP2抗体的存在也能够对皮肌炎(DM)合并肿瘤具有很好的诊断及预测价值;发明人更惊喜的发现,当通过将检测肌炎患者体内TiF1-γ抗体的存在和检测肌炎患者体内NXP2抗体的存在联合起来的同时,在患者体内同时检测到Tif1-α抗体和TiF1-γ抗体时,经后续病理实验证实具有更高的阳性预测值,能够更好地对患皮肌炎(DM)合并肿瘤的患者进行早期诊断和预测。
基于本发明发明人的上述发现,本发明提供了一种疾病检测试剂盒,该试剂盒包括:包被有人IgG、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体、作为二抗的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG、作为对照的抗Tif1-γ抗体阳性和抗NXP2抗体同时阳性的阳性对照品;人IgG、所述Tif1-γ抗原和所述NXP2抗原分别包被在所述载体的不同区域。
本发明还提供了抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途,其中,所述抗原组包括Tif1-γ抗原和NXP2抗原,优选地包括Tif1-α抗原、Tif1-γ抗原和NXP2抗原;所述疾病为皮肌炎合并肿瘤。
本发明提供的疾病检测试剂盒,通过将检测肌炎患者体内TiF1-γ抗体的存在和检测肌炎患者体内NXP2抗体的存在联合起来,经后续病理实验证实能够更好地对患皮肌炎(DM)合并肿瘤的患者进行早期诊断,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1所示电泳图谱是含有3401bp目的Tif1-γ基因长度的DNA片段的典型电泳图谱。
图2是洗脱下来的Tif1-γ-FLAG融合蛋白的典型的电泳图。
图3是抗TIF1-γ抗体以及抗FLAG抗体鉴定Tif1-γ-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
图4是含有2832bp目的NXP2基因长度的DNA片段的典型电泳图。
图5为洗脱的NXP2-FLAG融合蛋白的典型电泳图。
图6为抗NXP2抗体以及抗FLAG抗体鉴定NXP2-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
图7为含有3068bp目的Tif1-α基因长度的DNA片段的典型电泳图。
图8为洗脱的Tif1-α-FLAG融合蛋白的典型电泳图。
图9为抗Tif1-α抗体以及抗FLAG抗体鉴定Tif1-α-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
图10为检测实施例1的ROC曲线结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种疾病检测试剂盒,其中,该试剂盒包括:包被有人IgG、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体、作为二抗的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG、作为对照的抗Tif1-γ抗原的抗体阳性血清和抗NXP2抗原的抗体阳性血清;人IgG、所述Tif1-γ抗原和所述NXP2抗原分别包被在所述载体的不同区域。
根据本发明,所述Tif1-γ抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
根据本发明,所述Tif1-γ抗原可以通过转基因表达的方式得到,通过转基因技术来表达目的基因蛋白的方法为本领域技术人员所公知,例如可以通过以下步骤进行表达和纯化:
(一)取对数期K562细胞,经典Trizol法提取总RNA,再用Promega逆转录试剂盒逆转录为cDNA。
(二)根据Gene ID:51592所示的序列,用Primer5.0设计引物,上游引物加入酶切位点Sgf I,下游引物加入酶切位点Mlu I,通过PCR扩增出Tif1-γ基因,反应条件为:模板98℃变性2min,再按以下参数反应共35个循环:94℃预变性2min、94℃变性45s、54℃退火30s、72℃延伸140s、34个循环;最后一个循环72℃、延伸5min,PCR反应产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。通过PCR获得了含有3401bp目的基因长度的DNA片段。图1所示的电泳图谱是含有3401bp目的基因长度的DNA片段的典型电泳图谱。
引物Tif1-γ-T1:5’-TAGCGATCGCCATGGCGGAAAACAAAGG-3’(SEQ ID NO.4)
Tif1-γ-T2:5’-CGCACGCGTCTTTATATGTACTGGTCTCTCAT-3’(SEQ ID NO.5)
(三)DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
(四)建立Sgf I和Mlu I双酶切体系,37℃下过夜酶切PCR产物和pCMV6-AC-IRES-GFP质粒(带FLAG标签),带FLAG标签的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。
用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后产物,以插入目的片段和质粒载体5∶1的比例于16℃下T4连接酶催化连接反应5小时。
(五)采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞,将连接反应的产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态,接种于Amp+(氨苄青霉素)LB平板,37℃培养过夜,次日挑取单克隆接入5ml液体含100mg/L氨苄青霉素LB培养基培养,取1ml菌液送北京生工公司测序,其余菌液保存于4℃。
(六)将重组质粒的序列鉴定结果进行分析,将插入片段与目的基因序列完全一致且读码框正确的重组质粒,从菌液中提取出来,采用Lipofectamine2000转染HEK293T细胞。首先确定G418筛选浓度:按照每孔100个细胞的密度将HEK293T细胞接种到96孔板中培养,将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中,每个浓度设3个复孔,观察10-14d,使细胞全部死亡的最低G418浓度(1000mg/L),即作为转染后的筛选浓度。将正常生长的HEK293T细胞接种到6孔板中,24h后待其汇合度达到70-80%时,使用Lipofectamine2000进行转染;37℃、50mL/L CO2培养箱中培养,转染后6h更换含有100mL/L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养;24h后按照1∶4的比例将细胞传代至新的6孔板中培养;传代后24h,待细胞贴壁后即更换含有1000mg/L G418的筛选培养基进行筛选。稳定转染细胞的单克隆化:加压筛选过程中,每隔2d更换1次培养液,加压后4-7d后显微镜下可见细胞大量死亡,持续加压至细胞不再死亡,且以团簇的形式生长时即可认为是阳性细胞,继续加压至阳性克隆铺满6孔板,消化至培养瓶中扩大培养,待到阳性细胞长满培养瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作:预先对96孔板除第一排之外的所有孔加入100μL培养液,接着将混合克隆稀释至1×106个/L,按200μL/孔接种于96孔板的第一排,从中吸取100μL细胞液接种于第二排,混匀后,从第二排中吸取100μL接种于第三排,直至第八排,最后一排均丢弃100μL细胞液,待细胞贴壁生长后,倒置显微镜下观察,标记只含有1个细胞的培养孔,每天记录细胞生长情况,10~15d后,即可挑选单克隆细胞株。
(七)挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化;用预冷的PBS(50mM,pH值7.2)洗细胞2次,以106/ml的浓度加入细胞裂解液(50mM Tris-HCl(pH值8.0),150mM NaCl,0.5%NP-40,1mM PMSF0.1%DTT,1×蛋白酶抑制剂),重悬细胞,冰上孵育30min,12000rpm低温离心8min,留上清用于聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离心后的上清与经预处理的树脂(ANTI-FLAG M2Affinity Gel)1ml混合后,冰水浴摇床上结合2小时,然后装入层析柱中,用4℃预冷的洗涤缓冲液(TBS)洗涤20倍树脂体积,然后用6ml的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸(pH3.5))竞争洗脱Tif1-γ-FLAG融合蛋白,分别入6个含有20μL的1MTris(pH8.0)EP管中,-20℃保存。图2是洗脱下来的Tif1-γ-FLAG融合蛋白的典型电泳图。
(八)将纯化后的蛋白进行8%聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,60V30min,120V90min,半干转至PVDF膜上,转膜条件为15V110min,孵育一抗分别为鼠抗人Tif1-γ抗体,抗FLAG抗体,二抗采用羊抗鼠IgG-HRP,ECL发光液显色。图3是抗TIF1-γ抗体以及抗FLAG抗体鉴定Tif1-γ-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
根据本发明,所述NXP2抗原可以通过转基因表达的方式得到,通过转基因技术来表达目的基因蛋白的方法为本领域技术人员所公知,例如:
(一)取对数期K562细胞,经典Trizol法提取总RNA,再用Promega逆转录试剂盒逆转录为cDNA。
(二)根据Gene ID:23515所示的核苷酸序列,用Primer5.0设计引物,上游引物加入酶切位点Sgf I,下游引物加入酶切位点Mlu I,通过PCR扩增出NXP2基因,反应条件为:模板98℃变性2min,再按以下参数反应共35个循环:94℃预变性2min、94℃变性45s、56℃退火30s、72℃延伸110s、34个循环;最后一个循环72℃延伸5min,PCR反应产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。通过PCR获得了含有2832bp目的基因长度的DNA片段。图4是含有2832bp目的基因长度的DNA片段的典型电泳图。
引物NXP2-T1:5’-TAGCGATCGCCATGGCGGCGCAGCCACCCCG-3’(SEQ IDNO.6)
NXP2-T2:5’-CGCACGCGAGTACTACTGATTTCACTCATTTGTT-3’(SEQ ID NO.7)
(三)DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
(四)建立Sgf I和Mlu I双酶切体系,37℃下过夜酶切PCR产物和pCMV6-AC-IRES-GFP质粒(带FLAG标签),带FLAG标签的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。
用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后产物,以插入目的片段和质粒载体5∶1的比例于16℃下T4连接酶催化连接反应5小时。
(五)采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞,将连接反应的产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态,接种于Amp+(氨苄青霉素)LB平板,37℃培养过夜,次日挑取单克隆接入5ml液体含100mg/L氨苄青霉素LB培养基培养,取1ml菌液送北京生工公司测序,其余菌液保存于4℃。
(六)将重组质粒的序列鉴定结果进行分析,将插入片段与目的基因序列完全一致且读码框正确的重组质粒,从菌液中提取出来,采用Lipofectamine2000转染HEK293T细胞。首先确定G418筛选浓度:按照每孔100个细胞的密度将HEK293T细胞接种到96孔板中培养,将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中,每个浓度设3个复孔,观察10-14d,使细胞全部死亡的最低G418浓度(1000mg/L),即作为转染后的筛选浓度。将正常生长的HEK293T细胞接种到6孔板中,24h后待其汇合度达到70-80%时使用Lipofectamine2000进行转染;37℃、50mL/L CO2培养箱中培养,转染后6h更换含有100mL/L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养;24h后按照1∶4的比例将细胞传代至新的6孔板中培养;传代后24h,待细胞贴壁后即更换含有1000mg/L G418的筛选培养基进行筛选。稳定转染细胞的单克隆化:加压筛选过程中,每隔2d更换1次培养液,加压后4-7d后显微镜下可见细胞大量死亡,持续加压至细胞不再死亡,且以团簇的形式生长时即可认为是阳性细胞,继续加压至阳性克隆铺满6孔板,消化至培养瓶中扩大培养,待到阳性细胞长满培养瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作:预先对96孔板除第一排之外的所有孔加入100μL培养液,接着将混合克隆稀释至1×106个/L,按200μL/孔接种于96孔板的第一排,从中吸取100μL细胞液接种于第二排,混匀后,从第二排中吸取100μL接种于第三排,直至第八排,最后一排均丢弃100μL细胞液,待细胞贴壁生长后,倒置显微镜下观察,标记只含有1个细胞的培养孔,每天记录细胞生长情况,10-15d后,即可挑选单克隆细胞株。
(七)挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化;用预冷的PBS(50mM,pH值7.2)洗细胞2次,以106/ml的浓度加入细胞裂解液(50mM Tris-HCl(pH值8.0),150mM NaCl,0.5%NP-40,1mM PMSF0.1%DTT,1×蛋白酶抑制剂),重悬细胞,冰上孵育30min,12000rpm低温离心8min,留上清用于聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离心后的上清与经预处理的树脂(ANTI-FLAG M2Affinity Gel)1ml混合后,冰水浴摇床上结合2小时,然后装入层析柱中,用4℃预冷的洗涤缓冲液(TBS)洗涤20倍树脂体积,然后用6ml的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸(pH3.5))竞争洗脱NXP2-FLAG融合蛋白,分别入6个含有20μL的1MTris(pH8.0)EP管中,-20℃保存。图5为洗脱的NXP2-FLAG融合蛋白的典型电泳图。
(八)将纯化后的蛋白进行8%聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,60V30min,120V90min,半干转至PVDF膜上,转膜条件为15V100min,孵育一抗分别为鼠抗人NXP2抗体,抗FLAG抗体,二抗采用羊抗鼠IgG-HRP,ECL发光液显色。图6为抗NXP2抗体以及抗FLAG抗体鉴定NXP2-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
根据本发明,优选情况下,其中,所述载体上还包被有Tif1-α抗原;所述阳性对照品还呈现抗Tif1-α抗体阳性;所述Tif1-α抗原、人IgG、所述Tif1-γ抗原和所述NXP2抗原分别包被在所述载体的不同区域。在该优选情况下,在患者体内同时检测到Tif1-α抗体、TiF1-γ抗体和NXP2抗体时,经后续病理实验证实能够更好地对患皮肌炎(DM)合并肿瘤的患者进行早期诊断。
根据本发明,所述Tif1-α抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
根据本发明,所述Tif1-α抗原可以通过转基因表达的方式得到,通过转基因技术来表达目的基因蛋白的方法为本领域技术人员所公知,例如可以通过以下步骤进行表达和纯化:
(一)取对数期K562细胞,经典Trizol法提取总RNA,再用Promega逆转录试剂盒逆转录为cDNA。
(二)根据Gene ID:8805所示的序列,用Primer5.0设计引物,上游引物加入酶切位点Sgf I,下游引物加入酶切位点Mlu I,通过PCR扩增出Tif1-γ基因,反应条件为:模板98℃变性2min,再按以下参数反应共35个循环:94℃预变性2min、94℃变性45s、54℃退火30s、72℃延伸130s、34个循环;最后一个循环72℃、延伸5min,PCR反应产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。通过PCR获得了含有3068bp目的基因长度的DNA片段。图7所示的电泳图谱是含有3068bp目的基因长度的DNA片段的典型电泳图谱。
引物Tif1-α-T1:5’-TAGCGATCGCCATGGAGGTGGCGGTGGA-3’(SEQ ID NO.8)
Tif1-α-T2:5’-CGCAC GCGTTTTAAGCAACTGG CGTTCTTCAAG-3’(SEQ ID NO.9)
(三)DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
(四)建立Sgf I和Mlu I双酶切体系,37℃下过夜酶切PCR产物和pCMV6-AC-IRES-GFP质粒(带FLAG标签),带FLAG标签的氨基酸序列为SEQ IDNO.3。
用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后产物,以插入目的片段和质粒载体5∶1的比例于16℃下T4连接酶催化连接反应5小时。
(五)采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞,将连接反应的产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态,接种于Amp+(氨苄青霉素)LB平板,37℃培养过夜,次日挑取单克隆接入5ml液体含100mg/L氨苄青霉素LB培养基培养,取1ml菌液送北京生工公司测序,其余菌液保存于4℃。
(六)将重组质粒的序列鉴定结果进行分析,将插入片段与目的基因序列完全一致且读码框正确的重组质粒,从菌液中提取出来,采用Lipofectamine2000转染HEK293T细胞。首先确定G418筛选浓度:按照每孔100个细胞的密度将HEK293T细胞接种到96孔板中培养,将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中,每个浓度设3个复孔,观察10-14d,使细胞全部死亡的最低G418浓度(1000mg/L),即作为转染后的筛选浓度。将正常生长的HEK293T细胞接种到6孔板中,24h后待其汇合度达到70-80%时,使用Lipofectamine2000进行转染;37℃、50mL/L CO2培养箱中培养,转染后6h更换含有100mL/L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养;24h后按照1∶4的比例将细胞传代至新的6孔板中培养;传代后24h,待细胞贴壁后即更换含有1000mg/L G418的筛选培养基进行筛选。稳定转染细胞的单克隆化:加压筛选过程中,每隔2d更换1次培养液,加压后4-7d后显微镜下可见细胞大量死亡,持续加压至细胞不再死亡,且以团簇的形式生长时即可认为是阳性细胞,继续加压至阳性克隆铺满6孔板,消化至培养瓶中扩大培养,待到阳性细胞长满培养瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作:预先对96孔板除第一排之外的所有孔加入100μL培养液,接着将混合克隆稀释至1×106个/L,按200μL/孔接种于96孔板的第一排,从中吸取100μL细胞液接种于第二排,混匀后,从第二排中吸取100μL接种于第三排,直至第八排,最后一排均丢弃100μL细胞液,待细胞贴壁生长后,倒置显微镜下观察,标记只含有1个细胞的培养孔,每天记录细胞生长情况,10~15d后,即可挑选单克隆细胞株。
(七)挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化;用预冷的PBS(50mM,pH值7.2)洗细胞2次,以106/ml的浓度加入细胞裂解液(50mM Tris-HCl(pH值8.0),150mM NaCl,0.5%NP-40,1mM PMSF0.1%DTT,1×蛋白酶抑制剂),重悬细胞,冰上孵育30min,12000rpm低温离心8min,留上清用于聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离心后的上清与经预处理的树脂(ANTI-FLAG M2Affinity Gel)1ml混合后,冰水浴摇床上结合2小时,然后装入层析柱中,用4℃预冷的洗涤缓冲液(TBS)洗涤20倍树脂体积,然后用6ml的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸(pH3.5))竞争洗脱Tif1-α-FLAG融合蛋白,分别入6个含有20μL的1MTris(pH8.0)EP管中,-20℃保存。图8是洗脱下来的Tif1-γ-FLAG融合蛋白的典型电泳图。
(八)将纯化后的蛋白进行8%聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,60V30min,120V90min,半干转至PVDF膜上,转膜条件为15V110min,孵育一抗分别为鼠抗人Tif1-α抗体,抗FLAG抗体,二抗采用羊抗鼠IgG-HRP,ECL发光液显色。图9是抗TIF1-α抗体以及抗FLAG抗体鉴定Tif1-α-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
根据本发明,所述包被有人IgG、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体可以通过将人IgG、Tif1-α抗原、Tif1-γ抗原和NXP2抗原包被在载体上得到,优选情况下,所述载体上还包被有Tif1-α抗原,所述载体可以为免疫试剂盒领域常用的各种载体,例如,硝酸纤维膜(NC膜)。将抗原包被在载体上的方法可以为各种常规的用于将抗原包被于载体上的方法,例如,可以通过以下方法制备:将长方形的NC膜(购自Millipore公司)粘贴在带有粘性的PVC底板(上海金标生物科技有限公司)中间,放置在划膜仪(上海金标生物科技有限公司,HM3010单维往复划膜仪)既定的位置上,划膜仪上设有多个加液泵,按照划膜仪的说明书,向第一个加液泵中灌注液体状的人源的免疫球蛋白(IgG),第二个加液泵中灌注液体状的Tif1-α抗原(优选情况下),第三个加液泵中灌注液体状的Tif1-γ抗原,第四个加液泵中灌注液体状的NXP2抗原。启动划膜仪,加液泵开始匀速移动并在硝酸纤维膜中划线,并依次形成功能质控带以及Tif1-α抗原带(优选情况下)、Tif1-γ抗原带和NXP2抗原带。将硝酸纤维素膜浸泡入含2%BSA的磷酸盐缓冲液中1小时,将整个PVC板在37℃干燥箱中干燥1小时,随后,根据需要用ZQ微电脑自动斩切机(上海金标生物科技有限公司)沿着与各个抗原带垂直的方向上将硝酸纤维素膜裁剪,得到包被有人IgG、Tif1-α抗原(优选情况下)、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体,密封,4℃保存。
所述作为对照的抗Tif1-α抗体阳性(优选情况下)、抗Tif1-γ抗体阳性和抗NXP2抗体阳性的阳性对照品可以通过从抗Tif1-α抗体阳性、抗Tif1-γ抗体阳性和抗NXP2抗体阳性患者血清中提取而得到,例如,取抗Tif1-α抗体与抗Tif1-γ抗体同时阳性的5ml患者血清与抗NXP2抗体阳性的5ml患者血清混合后,与等量的生理盐水混合,逐滴中性饱和硫酸铵,使其饱和度为50%,室温放置1小时后,离心取沉淀。沉淀用20ml生理盐水溶解后,逐滴中性饱和硫酸铵,使其饱和度为33%,室温放置1小时后,离心取沉淀。沉淀用少量生理盐水溶解,即为上述IgG粗制品,然后将IgG粗制品通过重力型sephadex脱盐柱(上海生工生物工程有限公司,货号BSP090)脱盐,并替换为标准缓冲液(Southernbiotech,货号0230-01),最终蛋白浓度约为15mg/ml。得到的阳性对照品通过免疫印迹法进行验证,方法同前述转基因表达Tif1-α抗原、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的第八步骤。
所述作为二抗的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG以及人源的IgG可以通过商购得到,例如Abcam公司生产的ab50507货号的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG和Sigma公司生产的56834货号的人源的IgG。
根据本发明,本发明提供的疾病检测试剂盒的使用方法可以包括:
(一)使用样本缓冲液分别将患者的血液样本和作为对照的抗Tif1-α抗体阳性阳性(优选情况下)、抗Tif1-γ抗抗体阳性与抗NXP2抗体阳性的阳性对照品,按照1∶50-200的比例稀释;使用样本缓冲液将碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG,按照1∶15000-30000的比例稀释;所述样本缓冲液的种类和组成为本领域技术人员所公知,可以为免疫检测中各种常规的缓冲液。优选地,本发明提供的疾病检测试剂盒中还包括用作样本缓冲液的15-25体积%羊血清的磷酸盐缓冲液。更优选地,本发明提供的疾病检测试剂盒中还包括用作温育设备的温育盘,该温育盘的结构为本领域技术人员所公知,只要能够用于免疫学检测的温育即可,例如购自Bio-rad公司的温育盘。
(二)取出包被有人IgG、Tif1-α抗原(优选情况下)、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体,放入温育设备中,在温育设备中加入样本缓冲液,使液面覆盖包被有人IgG、Tif1-α抗原(优选情况下)、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体,于室温在摇床上温育5-10分钟后,除去温育设备中的液体后,加入步骤(一)中经稀释后的患者血清样本,在摇床上室温温育20-40分钟。
(三)温育设备中的液体去除掉,在摇床上用清洗缓冲液将步骤(二)中处理后的包被有人IgG、Tif1-α抗原(优选情况下)、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体清洗3-5次,每次5-10分钟,所述清洗缓冲液的种类和组成为本领域技术人员所公知,可以为各种用于免疫学检测的清洗缓冲液。优选情况下,本发明提供的疾病检测试剂盒还可以包括用作清洗缓冲液的含0.4-0.6体积%的吐温20的磷酸盐缓冲液。
(四)将温育设备中的清洗缓冲液去除掉,加入步骤(一)中经稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG,于摇床上室温温育20-40分钟。
(五)将温育设备中的液体去除掉,在摇床上用清洗缓冲液清洗3-5次,每次5-10分钟。
(六)将温育设备中的清洗缓冲液去除掉,加入底物液,于摇床上室温温育5-10分钟,所述底物液的种类和组成为本领域技术人员所公知,可以为各种用于免疫学检测的底物液。优选情况下,本发明提供的疾病检测试剂盒还可以包括用作底物液的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和四唑硝基蓝(购自Millipore公司;货号203790)。
(七)将位于设备中的液体吸去,用蒸馏水清洗3-5次,每次1-5分钟,吸水纸吸干后判断结果。
检测结果的判断:
(一)通过与上文记载相同的方法进行检测,不同的是使用作为对照的抗Tif1-α抗体阳性(优选情况下)、抗Tif1-γ抗体阳性与抗NXP2抗体阳性的阳性对照品替换患者的血清样本;
(二)功能质控带出现强的颜色反应说明实验操作正确;
(三)除功能质控带显色外无其他显色条带判断为阴性;针对Tif1-α抗原带出现紫色条带即判读为抗Tif1-α抗体阳性(优选情况下);针对Tif1-γ抗原带出现紫色条带即判读为抗Tif1-γ抗体阳性;针对NXP2抗原带出现紫色条带即判读为抗NXP2抗体阳性。
本发明还提供了抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途,其中,所述抗原组包括Tif1-γ抗原和NXP2抗原,优选情况下,所述抗原组包括Tif1-α抗原、Tif1-γ抗原和NXP2抗原,所述疾病为皮肌炎合并肿瘤。
根据本发明,所述Tif1-γ抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中,所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中,所述Tif1-α抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
下面通过实施例的方式对本发明进行更加详细的说明。
实施例1
(A)Tif1-γ抗原的制备:
(一)取对数期K562细胞(购自ATCC,货号CCL-243),经典Trizol法提取总RNA,再用Promega逆转录试剂盒逆转录为cDNA。
(二)使用上述cDNA作为扩增模板,使用由Tif1-γ-T1(5’-TAGCGATCGCCATGGCGGAAAACAAAGG-3’,SEQ ID NO.4)和Tif1-γ-T2(5’-CGCACGCGTCTTTATATGTACTGGTCTCTCAT-3’,SEQ ID NO.5)组成的引物对,通过PCR扩增出Tif1-γ基因,反应条件为:模板98℃变性2min,再按以下参数反应共35个循环:94℃预变性2min、94℃变性45s、54℃退火30s、72℃延伸140s、34个循环;最后一个循环72℃、延伸5min,PCR反应产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,鉴定结果如图1所示。
(三)DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
(四)建立Sgf I和Mlu I双酶切体系,37℃下过夜酶切PCR产物和pCMV6-AC-IRES-GFP质粒(购自Origene公司,货号PS100027,带FLAG标签),用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后产物,以插入目的片段和质粒载体5∶1的比例于16℃下T4连接酶催化连接反应5小时。
(五)采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞,将连接反应的产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态,接种于Amp+(氨苄青霉素)LB平板,37℃培养过夜,次日挑取单克隆接入5ml液体含100mg/L氨苄青霉素LB培养基培养,取1ml菌液送北京生工公司测序,其余菌液保存于4℃。
(六)将重组质粒的序列鉴定结果进行分析,将插入片段与目的基因序列完全一致且读码框正确的重组质粒,从菌液中提取出来,采用Lipofectamine2000转染HEK293T细胞。首先确定G418筛选浓度:按照每孔100个细胞的密度将HEK293T细胞接种到96孔板中培养,将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中,每个浓度设3个复孔,观察10d,使细胞全部死亡的最低G418浓度(1000mg/L),即作为转染后的筛选浓度。将正常生长的HEK293T细胞接种到6孔板中,24h后待其汇合度达到75%时,使用Lipofectamine2000进行转染;37℃、50mL/L CO2培养箱中培养,转染后6h更换含有100mL/L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养;24h后按照1∶4的比例将细胞传代至新的6孔板中培养;传代后24h,待细胞贴壁后即更换含有1000mg/L G418的筛选培养基进行筛选。稳定转染细胞的单克隆化:加压筛选过程中,每隔2d更换1次培养液,加压后5d后显微镜下可见细胞大量死亡,持续加压至细胞不再死亡,且以团簇的形式生长时即可认为是阳性细胞,继续加压至阳性克隆铺满6孔板,消化至培养瓶中扩大培养,待到阳性细胞长满培养瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作:预先对96孔板除第一排之外的所有孔加入100μL培养液,接着将混合克隆稀释至1×106个/L,按200μL/孔接种于96孔板的第一排,从中吸取100μL细胞液接种于第二排,混匀后,从第二排中吸取100μL接种于第三排,直至第八排,最后一排均丢弃100μL细胞液,待细胞贴壁生长后,倒置显微镜下观察,标记只含有1个细胞的培养孔,每天记录细胞生长情况,15d后,即可挑选单克隆细胞株。
(七)挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化;用预冷的PBS(50mM,pH值7.2)洗细胞2次,以106/ml的浓度加入细胞裂解液(50mM Tris-HCl(pH值8.0),150mM NaCl,0.5体积%NP-40,1mM PMSF,0.1体积%DTT),重悬细胞,冰上孵育30min,12000rpm低温离心8min,留上清用于聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离心后的上清与经预处理的树脂(ANTI-FLAG M2Affinity Gel)1ml混合后,冰水浴摇床上结合2小时,然后装入层析柱中,用4℃预冷的洗涤缓冲液(TBS)洗涤20倍树脂体积,然后用6ml的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸(pH3.5))竞争洗脱Tif1-γ-FLAG融合蛋白,分别入6个含有20μL的1MTris(pH8.0)EP管中,-20℃保存。图2是洗脱下来的Tif1-γ-FLAG融合蛋白的典型的电泳图。
(八)将纯化后的蛋白进行8%聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,60V30min,120V90min,半干转至PVDF膜上,转膜条件为15V110min,孵育一抗分别为鼠抗人Tif1-γ抗体,抗FLAG抗体,二抗采用羊抗鼠IgG-HRP,ECL发光液显色。图3是抗TIF1-γ抗体以及抗FLAG抗体鉴定Tif1-γ-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
根据图3的结果以及质粒测序结果可知,Tif1-γ-FLAG融合蛋白的氨基酸序列为据SEQ IDNO.1。
(B)NXP2抗原的制备:
(一)取对数期K562细胞(与上文相同),经典Trizol法提取总RNA,再用Promega逆转录试剂盒逆转录为cDNA。
(二)使用上述cDNA作为扩增模板,使用由NXP2-T1(5’-TAGCGATCGCCATGGCGGCGCAGCCACCCCG-3’,SEQ ID NO.6)和NXP2-T2(5’-CGCACGCGAGTACTACTGATTTCACTCATTTGTT-3’,SEQ ID NO.7)组成的引物对NXP2基因,反应条件为:模板98℃变性2min,再按以下参数反应共35个循环:94℃预变性2min、94℃变性45s、56℃退火30s、72℃延伸110s、34个循环;最后一个循环72℃延伸5min,PCR反应产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,鉴定结果如图4所示。
(三)DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
(四)建立Sgf I和Mlu I双酶切体系,37℃下过夜酶切PCR产物和pCMV6-AC-IRES-GFP质粒(购自Origene公司,货号PS100027,带FLAG标签),用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后产物,以插入目的片段和质粒载体5∶1的比例于16℃下T4连接酶催化连接反应5小时。
(五)采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞,将连接反应的产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态,接种于Amp+(氨苄青霉素)LB平板,37℃培养过夜,次日挑取单克隆接入5ml液体含100mg/L氨苄青霉素LB培养基培养,取1ml菌液送北京生工公司测序,其余菌液保存于4℃。
(六)将重组质粒的序列鉴定结果进行分析,将插入片段与目的基因序列完全一致且读码框正确的重组质粒,从菌液中提取出来,采用Lipofectamine2000转染HEK293T细胞。首先确定G418筛选浓度:按照每孔100个细胞的密度将HEK293T细胞接种到96孔板中培养,将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中,每个浓度设3个复孔,观察10d,使细胞全部死亡的最低G418浓度(1000mg/L),即作为转染后的筛选浓度。将正常生长的HEK293T细胞接种到6孔板中,24h后待其汇合度达到75%时使用Lipofectamine2000进行转染;37℃、50mL/L CO2培养箱中培养,转染后6h更换含有100mL/L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养;24h后按照1∶4的比例将细胞传代至新的6孔板中培养;传代后24h,待细胞贴壁后即更换含有1000mg/L G418的筛选培养基进行筛选。稳定转染细胞的单克隆化:加压筛选过程中,每隔2d更换1次培养液,加压后5d后显微镜下可见细胞大量死亡,持续加压至细胞不再死亡,且以团簇的形式生长时即可认为是阳性细胞,继续加压至阳性克隆铺满6孔板,消化至培养瓶中扩大培养,待到阳性细胞长满培养瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作:预先对96孔板除第一排之外的所有孔加入100μL培养液,接着将混合克隆稀释至1×106个/L,按200μL/孔接种于96孔板的第一排,从中吸取100μL细胞液接种于第二排,混匀后,从第二排中吸取100μL接种于第三排,直至第八排,最后一排均丢弃100μL细胞液,待细胞贴壁生长后,倒置显微镜下观察,标记只含有1个细胞的培养孔,每天记录细胞生长情况,15d后,即可挑选单克隆细胞株。
(七)挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化;用预冷的PBS(50mM,pH值7.2)洗细胞2次,以106/ml的浓度加入细胞裂解液(50mM Tris-HCl(pH值8.0),150mM NaCl,0.5%体积NP-40,1mM PMSF,0.1体积%DTT),重悬细胞,冰上孵育30min,12000rpm低温离心8min,留上清用于聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离心后的上清与经预处理的树脂(ANTI-FLAG M2Affinity Gel)1ml混合后,冰水浴摇床上结合2小时,然后装入层析柱中,用4℃预冷的洗涤缓冲液(TBS)洗涤20倍树脂体积,然后用6ml的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸(pH3.5))竞争洗脱NXP2-FLAG融合蛋白,分别入6个含有20μL的1MTris(pH8.0)EP管中,-20℃保存。图5是洗脱下来的NXP2-FLAG融合蛋白的典型的电泳图。
(八)将纯化后的蛋白进行8%聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,60V30min,120V90min,半干转至PVDF膜上,转膜条件为15V100min,孵育一抗分别为鼠抗人NXP2抗体,抗FLAG抗体,二抗采用羊抗鼠IgG-HRP,ECL发光液显色。图6为抗NXP2抗体以及抗FLAG抗体鉴定NXP2-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
根据图6的结果以及质粒测序结果可知,NXP2-FLAG融合蛋白的氨基酸序列为据SEQ IDNO.2。
(C)Tif1-α抗原的制备:
(一)取对数期K562细胞(购自ATCC,货号CCL-243),经典Trizol法提取总RNA,再用Promega逆转录试剂盒逆转录为cDNA。
(二)使用上述cDNA作为扩增模板,使用由Tif1-α-T1(5’-TAGCGATCGCCATGGAGGTGGCGGTGGA-3’,SEQ ID NO.8)和Tif1-α-T2(5’-CGCAC GCGTTTTAAGCAACTGG CGTTCTTCAAG-3’,SEQ ID NO.9)组成的引物对,通过PCR扩增出Tif1-γ基因,反应条件为:模板98℃变性2min,再按以下参数反应共35个循环:94℃预变性2min、94℃变性45s、54℃退火30s、72℃延伸130s、34个循环;最后一个循环72℃、延伸5min,PCR反应产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,鉴定结果如图7所示。
(三)DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
(四)建立Sgf I和Mlu I双酶切体系,37℃下过夜酶切PCR产物和pCMV6-AC-IRES-GFP质粒(购自Origene公司,货号PS100027,带FLAG标签),用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后产物,以插入目的片段和质粒载体5∶1的比例于16℃下T4连接酶催化连接反应5小时。
(五)采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞,将连接反应的产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态,接种于Amp+(氨苄青霉素)LB平板,37℃培养过夜,次日挑取单克隆接入5ml液体含100mg/L氨苄青霉素LB培养基培养,取1ml菌液送北京生工公司测序,其余菌液保存于4℃。
(六)将重组质粒的序列鉴定结果进行分析,将插入片段与目的基因序列完全一致且读码框正确的重组质粒,从菌液中提取出来,采用Lipofectamine2000转染HEK293T细胞。首先确定G418筛选浓度:按照每孔100个细胞的密度将HEK293T细胞接种到96孔板中培养,将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中,每个浓度设3个复孔,观察10d,使细胞全部死亡的最低G418浓度(1000mg/L),即作为转染后的筛选浓度。将正常生长的HEK293T细胞接种到6孔板中,24h后待其汇合度达到75%时,使用Lipofectamine2000进行转染;37℃、50mL/L CO2培养箱中培养,转染后6h更换含有100mL/L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养;24h后按照1∶4的比例将细胞传代至新的6孔板中培养;传代后24h,待细胞贴壁后即更换含有1000mg/L G418的筛选培养基进行筛选。稳定转染细胞的单克隆化:加压筛选过程中,每隔2d更换1次培养液,加压后5d后显微镜下可见细胞大量死亡,持续加压至细胞不再死亡,且以团簇的形式生长时即可认为是阳性细胞,继续加压至阳性克隆铺满6孔板,消化至培养瓶中扩大培养,待到阳性细胞长满培养瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作:预先对96孔板除第一排之外的所有孔加入100μL培养液,接着将混合克隆稀释至1×106个/L,按200μL/孔接种于96孔板的第一排,从中吸取100μL细胞液接种于第二排,混匀后,从第二排中吸取100μL接种于第三排,直至第八排,最后一排均丢弃100μL细胞液,待细胞贴壁生长后,倒置显微镜下观察,标记只含有1个细胞的培养孔,每天记录细胞生长情况,15d后,即可挑选单克隆细胞株。
(七)挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化;用预冷的PBS(50mM,pH值7.2)洗细胞2次,以106/ml的浓度加入细胞裂解液(50mM Tris-HCl(pH值8.0),150mM NaCl,0.5体积%NP-40,1mM PMSF,0.1体积%DTT),重悬细胞,冰上孵育30min,12000rpm低温离心8min,留上清用于聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离心后的上清与经预处理的树脂(ANTI-FLAG M2Affinity Gel)1ml混合后,冰水浴摇床上结合2小时,然后装入层析柱中,用4℃预冷的洗涤缓冲液(TBS)洗涤20倍树脂体积,然后用6ml的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸(pH3.5))竞争洗脱Tif1-α-FLAG融合蛋白,分别入6个含有20μL的1MTris(pH8.0)EP管中,-20℃保存。图8是洗脱下来的Tif1-α-FLAG融合蛋白的典型的电泳图。
(八)将纯化后的蛋白进行8%聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,60V30min,120V90min,半干转至PVDF膜上,转膜条件为15V110min,孵育一抗分别为鼠抗人Tif1-α抗体,抗FLAG抗体,二抗采用羊抗鼠IgG-HRP,ECL发光液显色。图9是抗TIF1-α抗体以及抗FLAG抗体鉴定Tif1-α-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
根据图9的结果以及质粒测序结果可知,Tif1-α-FLAG融合蛋白的氨基酸序列为据SEQ IDNO.3。
(D)包被有人IgG、Tif1-α抗原、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体的制备:
将硝酸纤维膜(Millipore公司,商品名:HF120)放置在划膜仪(上海金标生物科技有限公司,HM3010单维往复划膜仪)既定的位置上,划膜仪上设有多个加液泵,按照划膜仪的说明书,向第一个加液泵中灌注浓度为5mg/ml人源的免疫球蛋白(IgG),第二个加液泵中灌注步骤(A)中得到的Tif1-α抗原(用磷酸缓冲液(pH7.4)将步骤(A)得到的Tif1-γ抗原稀释至5mg/ml)、第三个加液泵中灌注步骤(A)中得到的Tif1-γ抗原(用磷酸缓冲液(pH7.4)将步骤(A)得到的Tif1-γ抗原稀释至5mg/ml)、第四个加液泵中灌注步骤(B)中得到的NXP2抗原(用磷酸缓冲液(pH7.4)将步骤(B)得到的NXP2抗原稀释至5mg/ml)。启动划膜仪,加液泵开始匀速移动并在硝酸纤维膜中划线,划膜仪的速度为1μl/cm,并依次形成功能指控带以及Tif1-γ抗原带和NXP2抗原带。随后,沿着与各个抗原带垂直的方向上将硝酸纤维素膜裁剪为4mm宽的试纸条,得到包被有人IgG、Tif1-α抗原、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体,将切好的试纸条与干燥剂封装在铝箔袋内保存在4℃待用。
(E)抗Tif1-α抗体阳性、抗Tif1-γ抗体阳性和抗NXP2抗体阳性的阳性对照品的制备:取抗Tif1-α抗体与抗Tif1-γ抗体同时阳性的5ml患者血清与抗NXP2抗体阳性的5ml患者血清混合后,与等量的生理盐水混合,逐滴中性饱和硫酸铵,使其饱和度为50%,室温放置1小时后,离心取沉淀。沉淀用20ml生理盐水溶解后,逐滴中性饱和硫酸铵,使其饱和度为33%,室温放置1小时后,离心取沉淀。沉淀用少量生理盐水溶解,即为上述IgG粗制品,然后将IgG粗制品通过重力型sephadex脱盐柱(上海生工生物工程有限公司,货号BSP090)脱盐,并替换为标准缓冲液(Southernbiotech,货号0230-01),最终蛋白浓度约为15mg/ml。得到的阳性对照品通过免疫印迹法进行验证,阳性对照品为抗Tif1-α抗体阳性、抗Tif1-γ抗体阳性和抗NXP2抗体阳性。
(F)疾病检测试剂盒的制备:
将步骤(D)制得的包被有人IgG、Tif1-α抗原、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体、步骤(E)制得的抗TIF1-α抗体、抗Tif1-γ抗体和抗NXP2抗体阳性的阳性对照品,及作为二抗的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(同上),组合在一起制得疾病检测试剂盒1。
实施例2
根据与实施例1相同的方法制备疾病检测试剂盒2,不同在于该试剂盒中还包括:用作样本缓冲液的20体积%羊血清的磷酸盐缓冲液、用作清洗缓冲液的含0.5体积%的吐温20的磷酸盐缓冲液、用作底物液的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和四唑硝基蓝(购自Millipore公司;货号203790)、以及购自Bio-rad公司的温育盘。
检测实施例1
(A)患者
特发性炎性肌病(IIM)组:选取患者211例,其中男性64例,女性147例,年龄6~82岁,平均(47±17)岁,病程0.5~218月,平均(24±39)月,其中多肌炎(polymyositis,PM)55例,皮肌炎(dermatomyositis,DM)156例。对所有患者进行随访,平均随访(4.5±2.6)年。PM中单纯PM为52例,PM合并肿瘤3例。DM中包括经典皮肌炎(Classicdermatomyositis,CDM)123例,无肌病性皮肌炎(Clinical amyopathic dermatomyositis,CADM)11例,儿童皮肌炎(Juvenile dermatomyositis,JDM)8例,DM合并肿瘤14例。PM,CDM及JDM患者均符合Bohan/Peter诊断标准,且JDM的发病年龄小于18岁,CADM患者符合Sontheimer[3]诊断标准(即有典型皮肌炎皮肤病变或皮肌炎样皮肤病变,但无肌病表现,时间超过6个月以上)。肌炎合并肿瘤患者中对于恶性肿瘤的诊断均依据相应的临床诊断标准。
其他结缔组织病组:系统性红斑狼疮(SLE)患者70例,男性14例,女性56例,年龄16~76岁,平均(46±17)岁。类风湿关节炎(RA)患者60例,男性16例,女性44例,年龄25~85岁,平均(53±17)岁。干燥综合征(SS)患者46例,男性16例,女性30例,年龄20~82岁,平均(49±16)岁。硬皮病(SSc)患者14例,男性4例,女性10例,年龄20~72岁,平均(41±16)岁。均符合相应的疾病诊断分类标准,且各组年龄分布上与特发性炎性肌病(IIM)组差异无统计学意义(P>0.05)。
健康对照组:选取年龄、性别相匹配的健康正常人共40例,其中男性12例,女性28例,年龄18~71岁,平均年龄(47±16)岁。
(B)检测
获得上述3组患者的血清,并按照1∶100的比例使用样本缓冲液(含20体积%羊血清的磷酸盐缓冲液)稀释,得到待测血清样品。
通过实施例1建立的试剂盒检测上述3组患者的血清样品,211例特发性炎性肌病(IIM)组患者中抗TIF1-γ以及抗NXP2抗体水平,发现共有28例患者抗TIF1-γ抗体阳性,且均为DM患者,阳性率为13.3%。共有8例患者抗NXP-2抗体阳性,其中PM患者为2例,DM患者为6例,阳性率为3.8%,其他结缔组织病(SLE,RA,SS,SSc)及健康对照组的抗TIF1-γ以及抗NXP2抗体阳性率均为0%。研究发现上述两种抗体均独立存在,并且不同时存在于相同患者中。
DM组中抗TIF1-γ抗体阳性的血清共28例,总阳性率为17.9%,其中单纯DM组共13例,阳性率为10.6%;CADM组共4例,阳性率为36.4%;JDM组共2例,阳性率为25%,DM合并肿瘤组共9例,阳性率为64.3%。PM组中血清抗TIF1-γ抗体均阴性。DM组中抗NXP2阳性的血清共6例,总阳性率为3.8%,其中单纯DM组共1例,阳性率为0.8%;CADM组共0例,阳性率为0%;JDM组共2例,阳性率为25%,DM合并肿瘤组共3例,阳性率为21.4%。PM组中血清抗NXP2抗体为2例,均为单纯PM。
如上所述,抗TIF1-γ抗体阳性诊断DM合并肿瘤的敏感性为64.3%,特异性为86.6%。阳性预测值为32.1%,阴性预测值为96.1%,而抗NXP2抗体阳性诊断DM合并肿瘤的敏感性为21.4%,特异性为97.9%,阳性预测值为50.0%,阴性预测值为92.7%。
采用并联试验诊断DM合并肿瘤,即抗TIF1-γ抗体与抗NXP2抗体中任何一种抗体阳性即诊断DM合并肿瘤阳性(联合诊断组),其敏感性和特异性分别为85.7%,84.5%,阳性预测值与阴性预测值分别为35.3%,98.4%,利用ROC曲线下面积对上述3种方法诊断DM合并肿瘤的绩效进行评价,对应的曲线下面积分别为0.76,0.60,0.85,且单纯抗TIF1-γ抗体阳性组,单纯抗NXP2抗体阳性组与联合诊断组相较差异具有显著性,联合诊断具有更高的诊断绩效,结果见图10。
由此说明,使用本发明的包含所述Tif1-γ抗原和所述NXP2抗原的试剂盒,通过将检测肌炎患者体内TiF1-γ抗体的存在和检测肌炎患者体内NXP2抗体的存在联合起来,经后续病理实验证实能够更好地对患皮肌炎(DM)合并肿瘤的患者进行早期诊断。
此外,研究还发现共有7例患者抗TIF1-α抗体与抗TIF1-γ抗体同时阳性,8例患者血清中仅单独存在抗TIF1-α抗体。DM组中抗TIF1-α抗体阳性的血清共11例,总阳性率为7.1%,其中单纯DM组共4例,阳性率为3.3%;CADM组共1例,阳性率为9.1%;JDM组共0例,阳性率为0%,DM合并肿瘤组共6例,阳性率为42.9%。PM组中抗TIF1-α抗体共4例,总阳性率为7.3%,为单纯PM患者。进一步分析后发现抗TIF1-α抗体与抗TIF1-γ抗体同时阳性组合并肿瘤的发生率显著高于单纯抗TIF1-γ抗体阳性组与单纯抗NXP2阳性组,差异有统计学意义(P<0.05)。采用串联试验诊断DM合并肿瘤,即抗TIF1-α与抗TIF1-γ抗体同时阳性才诊断为DM合并肿瘤阳性,其敏感性和特异性分别为42.9%和99.3%,阳性预测值与阴性预测值为85.7%和94.6%。
由此说明,若抗TIF1-γ抗体与抗NXP2抗体中任何一种抗体阳性,可提高皮肌炎合并恶性肿瘤的诊出率,在优选情况下,抗TIF1-α抗体与抗TIF1-γ抗体同时阳性具有更高的阳性预测值,尤其需要对这部分患者是否合并恶性肿瘤进行密切筛查和随访,因此抗TIF1-α抗体、抗TIF1-γ抗体和抗NXP2抗体的同时检测对皮肌炎患者合并恶性肿瘤具有很高的诊断价值。
Claims (10)
1.一种疾病检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:包被有人IgG、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体、作为二抗的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG、作为对照的抗Tif1-γ抗体阳性和抗NXP2抗体阳性的阳性对照品;人IgG、所述Tif1-γ抗原和所述NXP2抗原分别包被在所述载体的不同区域。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述Tif1-γ抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示;所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其中,所述载体上还包被有Tif1-α抗原;所述Tif1-α抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述阳性对照品还呈现抗Tif1-α抗体阳性;所述Tif1-α抗原、人IgG、所述Tif1-γ抗原和所述NXP2抗原分别包被在所述载体的不同区域。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,该试剂盒还包括:用作样本缓冲液的15-25体积%的羊血清的磷酸盐缓冲液;用作清洗缓冲液的含0.4-0.6体积%的吐温20的磷酸盐缓冲液;和,用作底物液的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和四唑硝基蓝。
5.根据权利要求1或4所述的试剂盒,其中,该试剂盒还包括:用于孵育硝酸纤维膜,抗原抗体反应的温育盘。
6.根据权利要求1或3所述的试剂盒,其中,所述阳性对照品通过从抗体阳性的患者血清中提取制备。
7.根据权利要求1或6所述的试剂盒,其中,所述载体为硝酸纤维膜。
8.抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途,其中,所述抗原组包括Tif1-γ抗原和NXP2抗原,优选地所述抗原组包括Tif1-α抗原、Tif1-γ抗原和NXP2抗原;所述疾病为皮肌炎合并肿瘤。
9.根据权利要求8所述的用途,其中,所述Tif1-γ抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
10.根据权利要求8或9所述的用途,其中,所述Tif1-α抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
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