CN112986579A - 一种动态准确检测原代肿瘤细胞免疫特征的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体为一种原代肿瘤细胞免疫特征的检测方法。本发明的原代肿瘤细胞免疫特征的体外检测方法，包括：培养不同患者来源的原代肿瘤细胞，建立膀胱癌原代肿瘤细胞库，通过高通量流式检测平台对原代细胞IFN‑γ刺激前后PD‑L1的表达水平进行检测，并将原代细胞与重组人PD‑1‑Fc嵌合蛋白进行孵育，检测原代细胞对PD‑1蛋白的结合能力；结合上述一系列指标，实现对相应患者的免疫治疗效果的预测。本发明利用便捷的原代细胞培养方法及高通量流式检测平台，通过对原代肿瘤细胞进行动态、快速、准确、定量的免疫相关蛋白表达水平及体外结合能力的检测，实现体外平台对癌症患者的个性化预后评估。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种原代肿瘤细胞免疫特征检测方法，并以此为基础进行癌症患者免疫治疗效果预测。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病以男性为主,其发病率在男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中居首位，且近年来有逐年增加的趋势。与许多其他癌症不同，在过去的三十年中，膀胱癌的生存率并没有显著提高。尽管有标准的治疗方案，非肌层浸润性患者的5年复发率仍高达60～70％，进展率高达45％。对肌层浸润性患者而言，临床化疗的响应率低于20％，患者预后相对较差，在5年随访中死亡风险约为65％。
如今，随着肿瘤免疫治疗的快速发展，针对免疫治疗的研究有了极大进步，在实际临床治疗中的应用比例有了明显的提高。截止目前已经有五种被FDA批准用于治疗膀胱癌的免疫检查点抑制剂药物，包括Pembrolizumab，Atezolizumab，Nivolumab，Avelumab和Durvalumab，分别为PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，用于治疗局部晚期或转移性膀胱癌。其中Pembrolizumab(PD-1抑制剂)最近刚被FDA批准可用于治疗对BCG治疗无应答的非肌层浸润性膀胱癌。虽然免疫检查点抑制剂的效果令人振奋，然而目前临床上相当一部分的晚期膀胱癌患者仍然无法从中受益。临床中发现，晚期膀胱癌患者免疫检查点抑制剂药物的应答率平均仅为15～30％。此外，免疫检查点药物价格昂贵，同时存在引起自身免疫性疾病等风险。因此，提前预测患者是否对免疫检查点抑制剂类药物有响应，从而制定更好的治疗方案变得尤为重要。
由于免疫治疗应用于临床的时间有限，目前对于免疫治疗对不同患者的治疗效果评估主要是用药1-2个疗程后通过常规CT、PET-CT、组织切片免疫组化等检查方法进行评判。但由于免疫治疗引起的免疫相关不良事件(immune-related adverse events,irAE)对患者的病情进展及后期治疗均有极大影响，且肿瘤进展速度快，治疗方案的提前确定极为重要，这种用药后评估方法还远远不够。目前，免疫组化(immunohistochemistry，IHC)检测PD-L1在肿瘤细胞或肿瘤浸润免疫细胞上的表达，已成为免疫检查点抑制剂治疗中应用最广泛的生物标志物。早期研究显示，通过IHC检测的肿瘤组织PD-L1表达水平与PD-1/PD-L1抑制剂的治疗疗效相关，然而，这种相关性并不呈现在所有的临床免疫治疗试验中。除了肿瘤组织PD-L1的表达水平外，研究比较热门的预测性指标还包括肿瘤突变负荷(tumormutation burden，TMB)以及肿瘤浸润CD8+T细胞的比例等。虽然这些指标在回顾性分析中被认为与患者的预后有一定的相关性，但就预测性标记物而言，它们的作用仍然有限。有一些体外的模型也在尝试应用于免疫治疗的响应预测，比如复杂的基因分析和计算机模拟平台，以及PDX模型和类器官的建立等，这些模型都只是在尝试和摸索的阶段，也都有其应用的局限性存在。
由于PD-L1在肿瘤细胞上的表达机制有两种，组成性广泛(固有)表达和适应性诱导表达。组成性表达是由致癌基因或抑癌基因信号通路的失调，异常转录因子的激活等引起的，表达相对恒定。适应性表达是在肿瘤微环境中的免疫细胞分泌的促炎症因子如IFN-γ的作用下诱导表达，是动态变化的。因此，本发明应用前期所建立的条件性重编程培养体系，从膀胱癌患者的组织/尿液中分离培养了一批原代膀胱癌细胞，通过高通量流式方法对来自不同患者的原代肿瘤细胞进行PD-L1表达水平，对IFN-γ的响应程度以及对PD-1蛋白的结合能力的检测，评估原代肿瘤细胞的免疫特征，进而对患者临床免疫治疗的效果进行预测，实现对患者治疗方案的个性化指导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动态且定量的原代肿瘤细胞免疫特征的检测方法，并进一步对癌症患者临床免疫治疗进行效果预测。
本发明提供的原代肿瘤细胞免疫特征的检测方法，包括原代膀胱癌细胞免疫相关蛋白PD-L1表达情况及对细胞因子IFN-γ响应情况的检测，原代细胞对PD-1蛋白结合能力的测定，以及数据的统计分析；具体步骤为：
(1)原代肿瘤细胞按一定密度铺板；
(2)对细胞进行IFN-γ刺激处理；
将培养过夜的原代肿瘤细胞进行换液，对照组的上清更换为新鲜的Complete F培养基，处理组的上清更换为含有IFN-γ的Complete F培养基，置于37℃，5％CO2条件下培养24h；
(3)采用高通量流式细胞仪对样品进行检测，包括：
(3.1)对照组的原代肿瘤细胞检测其表面固有PD-L1表达水平；
(3.2)处理组的原代肿瘤细胞检测IFN-γ刺激后细胞表面诱导性PD-L1表达水平；
(3.3)对照组的原代肿瘤细胞同时检测细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力：将原代肿瘤细胞依次同人PD-1-Fc嵌合蛋白和Anti-IgG抗体进行孵育，随后采用高通量流式细胞仪检测其对人PD-1-Fc嵌合的结合能力；
(4)对流式细胞仪检测数据进行统计学分析，包括标准化处理流式检测数据。
本发明中，所述原代肿瘤细胞来自从膀胱癌患者的肿瘤组织或尿液中分离得到的肿瘤上皮细胞经体外培养后获得。
所述原代肿瘤细胞为条件性重编程培养法培养的原代肿瘤细胞。
所述原代肿瘤细胞选自处于生长对数期的状态良好的原代肿瘤细胞。
所述条件性重编程培养法选用Complete F培养基进行培养。
本发明中，所述IFN-γ的优选含量为50IU/mL～300IU/mL。
本发明中，所述Anti-PD-L1检测抗体优选稀释比例为1:2000～1:5000。
本发明中，所述Anti-IgG检测抗体优选稀释比例为1:100～1:500。
本发明中，所述高通量流式细胞仪检测原代肿瘤细胞PD-L1表达水平，选用中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1和过表达人源化PD-L1的CHO-K1稳转细胞株作为标准化数据的依据。
本发明中，作为优选，膀胱癌组织来源肿瘤上皮细胞的获取过程是：将手术样本或膀胱镜样本来源的肿瘤组织于无菌环境中切分后用组织消化酶进行消化，消化为单个悬浮细胞后离心清洗消化酶，用培养基重悬，得到原代细胞悬液。
本发明中，作为优选，膀胱癌尿液来源肿瘤上皮细胞的获取过程是：清洁环境下，收集膀胱癌患者的尿液于无菌离心管内，800～1200rpm离心8～12min。用添加0.8～1.2％的青霉素-链霉素双抗的PBS(磷酸盐缓冲溶液)进行重悬，再次离心，重复两次后得到的肿瘤上皮细胞用培养基重悬，得到原代细胞悬液。
本发明中，作为优选，步骤(3)分为两部分：原代细胞表面PD-L1表达水平检测采用Anti-PD-L1检测抗体进行孵育，原代细胞对PD-1蛋白的结合能力检测采用两步孵育法，分别依次同人PD-1-Fc嵌合蛋白和Anti-IgG检测抗体孵育。
本发明中，作为优选，所述原代细胞表面PD-L1表达水平检测，具体流程是：IFN-γ刺激24h后，收集细胞，用PBS清洗两遍后，对照组和处理组均加入稀释好的PD-L1检测抗体，4℃避光孵育30min，再次PBS清洗后进行荧光强度检测。
本发明中，作为优选，所述原代细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力检测，具体流程是：对照组细胞用PBS清洗两遍后分为两等份，一份中加入纯化的hPD-1-Fc蛋白室温孵育30min，一份作为不孵育的对照，孵育完成后采用PBS清洗两遍，去除掉未结合的蛋白，之后两份均加入稀释好的Anti-IgG抗体4℃避光孵育30min，再次PBS清洗后进行荧光强度检测。
本发明中，所纯化的蛋白为人PD-1-Fc嵌合蛋白，可与原代肿瘤细胞表面的PD-L1进行结合。
本发明基于所述原代肿瘤细胞免疫特征的检测方法，进一步鉴定其方法的可靠性，采用Western blotting方式检测原代肿瘤细胞PD-L1的表达水平及其糖基化程度，将结果进行定量处理后，同相应细胞的流式检测结果进行对比。
本发明基于所述原代肿瘤细胞免疫特征的检测方法，进一步探索其在临床免疫治疗预测上的应用价值，参考原代肿瘤细胞在IFN-γ刺激前后其表面PD-L1的表达水平及其对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力，对比相应患者临床免疫治疗的疗效。
本发明构建了一种体外的肿瘤免疫治疗预测模型，利用不同患者来源的原代肿瘤细胞，得到病人自身肿瘤免疫相关蛋白情况，解决了用药前无法预先评估患者免疫治疗响应情况的临床问题，从而实现对患者免疫治疗方案的制定与指导。
本发明的优点在于，提供一种动态准确的检测原代肿瘤细胞免疫特征的方法，并以此为基础预测患者免疫治疗的响应情况。且针对膀胱癌患者，提供更为便利的通过收集尿液样本这一无创液体活检的方式进行体外预测，对晚期无法获取组织的癌症患者更为友好，可以根据其原代肿瘤细胞的免疫相关蛋白检测情况，及时对患者进一步治疗是否采用免疫治疗进行指导，从而进行精确的个性化治疗的方案的确定。
附图说明
图1为高通量流式细胞仪检测的原代膀胱癌细胞表面PD-L1的固有表达水平。
图2为高通量流式细胞仪检测的IFN-γ刺激后原代膀胱癌细胞表面PD-L1的表达水平。
图3为原代膀胱癌细胞对IFN-γ的响应程度。
图4为原代膀胱癌细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力。
图5为原代膀胱癌细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力与其表面PD-L1表达水平的相关性分析。
图6为Western blotting所检测原代膀胱癌细胞整体PD-L1的表达水平。
图7为Western blotting所检测原代膀胱癌细胞整体PD-L1的表达水平与高通量流式细胞仪检测原代膀胱癌细胞表面PD-L1表达水平的相关性分析。
图8为原代膀胱癌细胞的免疫特征同患者免疫治疗响应情况的相关性分析。其中，a为患者1采用Atezolizumab(PD-L1抑制剂)治疗3个月前后CT结果对比图，b为患者22采用Sintilimab(PD-1抑制剂)治疗3个月前后CT结果对比图，c为患者31采用Nivolumab(PD-1抑制剂)治疗3个月前后CT结果对比图。
具体实施方式
一、材料
DMEM培养基：购自美国Gibco公司
Opti-MEM培养基：购自美国Gibco公司
F12培养基：购自美国Gibco公司
F12K培养基：购自美国Gibco公司
10％胎牛血清：购自美国Gibco公司
链霉素-青霉素溶液：购自美国Thermo公司
胰酶：购自美国Gibco公司
PBS：磷酸盐缓冲液(1×)，0.0067M(PO4)
PEI：购自Sigma-Aldrich公司
EGF：购自上海生工公司
氢化可的松：由复旦大学附属华山医院提供
胰岛素：由复旦大学附属华山医院提供
Y-27632：购自美国Selleck公司
胶原酶：购自美国Sigma公司
分散酶：购自美国Gibco公司
透明质酸酶：购自美国Sigma公司
Protein A免疫沉淀磁珠：购自Cell Signaling Technology公司
IFN-γ：购自同立海源公司。
二、方法
(一)人PD-1-Fc嵌合蛋白纯化
1、取对数生长期状态良好的HEK293T工具细胞，消化收集进行细胞计数，接种1.5×107个细胞于15cm培养皿中，添加20mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5％CO2条件下培养过夜；
2、第二天细胞密度大概长至在80％左右，进行细胞转染，体系如下：
| 成分 | 体积 |
| 真核表达质粒 | 22.5μg |
| PEI | 67.5μL |
| Opti-MEM培养基 | 2.25mL |
将以上成分混合，室温静置30min；
3、将混合液均匀逐滴滴入HEK293T培养皿中，置于37℃，5％CO2条件下培养；
4、收集培养48h及96h的上清溶液，混合均匀，1000rpm，5min离心取上清；
5、所得到的上清溶液用0.45μm的无菌滤膜过滤后置于冰上；
6、取600μL Protein A磁珠于亲和层析柱中，用50mL PBS溶液(pH＝7.4)冲洗数次；
7、将过滤好的上清溶液加入亲和层析柱中，同时在柱管底部出口处收集所有流出的液体；
8、将所收集的流出液重新过一遍亲和层析柱，再次收集流出液；
9、用10mL PBS(pH＝7.4)清洗亲和层析柱中的磁珠，重复清洗两次；
10、用30mL PBS(pH＝5.0)洗去磁珠上粘附的杂质蛋白；
11、取10个1.5mL Ep管，每管提前加入100μL 1M Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液；
12、分10次，每次加500μL 100mM甘氨酸溶液(pH＝2.5)于亲和层析柱中，用上述10个Ep管依次收集流出液，混匀，即为所纯化的粗蛋白，置于4℃冰箱备用；
13、从以上10个收集管中分别取50μL，加10μL 6×样品裂解液，100℃金属浴煮样10min，取10μL样品跑蛋白胶，；
14、跑胶结束后，将蛋白胶浸于用考马斯亮蓝染液中染色1h；
15、蛋白胶置于脱色液中脱色过夜。
(二)人PD-1-Fc嵌合蛋白浓缩
1、根据蛋白胶电泳结果，合并有较浓蛋白条带的收集管中的蛋白溶液；
2、取10K超滤离心管，加入10mL ddH2O，5000rpm离心10min；
3、倒掉离心管中的ddH2O，加入10mL PBS(pH＝7.4)溶液，5000rpm离心10min；
4、将合并的蛋白溶液加入超滤离心管中，同时补加10mL PBS(pH＝7.4)溶液，5000rpm，4℃离心，直至超滤管中的液体剩余1mL左右；
5、再次补加10mL PBS(pH＝7.4)溶液，5000rpm，4℃离心，直至超滤管中的液体剩余1～2mL左右，即为浓缩后的蛋白；
6、对浓缩后的蛋白进行BCA蛋白浓度定量，之后分装100μL/管于1.5mL Ep管中，置于-80℃冰箱储存备用；
7、向使用后的超滤离心管中加入10mL PBS(pH＝7.4)溶液，5000rpm离心10min；
8、倒掉管中的PBS溶液，向管中加入10mL ddH2O，5000rpm离心10min；
9、倒掉管中的ddH2O，向管中加入10mL 20％乙醇溶液，5000rpm离心10min；
10、倒掉超滤离心管中的乙醇溶液，重新将超滤离心管内外均加满20％乙醇溶液，置于4℃冰箱储存，可循环利用。
(三)BCA蛋白定量
1、将BSA标准品稀释为如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.015625mg/mL，共7个浓度梯度，待测样品如果预估浓度过大，可同样进行稀释；
2、将BCA工作液A液与B液按1:50的体积比例混合；
3、将标准品及待测样品各取20μL于96孔板中，加入200μL A+B混合工作液，移液器轻柔吹打混匀后，置于37℃孵箱孵育30min；
4、用Enspire多功能酶标仪检测各个孔在562nm处的吸光值；
5、将BSA标准品在562nm处经空白校正后的吸光值对其对应的蛋白浓度作图，绘制标准曲线；
6、使用标准曲线计算浓缩后人PD-1-Fc嵌合蛋白样品的浓度。
(四)原代细胞表面PD-L1表达水平检测
1、取生长至对数期的状态良好的原代细胞，胰酶消化，收集细胞离心后进行细胞计数；
2、取2×105个细胞接种于六孔板中，添加2mL完全F培养基，每种细胞接种2个孔，置于37℃，5％CO2条件下培养过夜；
3、待细胞完全贴壁后，对细胞进行换液处理，对照孔中的细胞上清更换为新鲜的完全F培养基，处理孔中的细胞上清更换为含有100IU/mL IFN-γ的完全F培养基，置于37℃，5％CO2条件下培养24h；
4、处理结束后，弃去细胞培养基上清，用PBS洗一遍，加入胰酶消化细胞；
5、收集细胞，用PBS洗一遍，1000rpm，5min离心，弃上清；
6、对照组和处理组均加入Anti-PD-L1抗体，4℃冰箱避光孵育30min；
7、孵育结束后，1000rpm，5min离心，弃上清；
8、用PBS缓冲液洗两遍，1000rpm，5min离心，弃上清；
9、采用高通量流式细胞仪检测样品的平均荧光强度。
(五)原代细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白结合能力检测
1、取生长至对数期的状态良好的原代细胞，胰酶消化，收集细胞离心后进行细胞计数；
2、取2×105个细胞接种于六孔板中，添加2mL完全F培养基，每种细胞接种2个孔，置于37℃，5％CO2条件下培养过夜；
3、待细胞完全贴壁后，对细胞进行换液处理，对照孔中的细胞上清更换为新鲜的完全F培养基，处理孔中的细胞上清更换为含有100IU/mL IFN-γ的完全F培养基，置于37℃，5％CO2条件下培养24h；
4、处理结束后，弃去细胞培养基上清，用PBS洗一遍，加入胰酶消化细胞；
5、收集细胞，用PBS洗一遍，1000rpm，5min离心，弃上清；
6、重复步骤5；
7、将每孔所收集的细胞分为两份，一份作为对照，另一份作为处理组加入50ng/μL纯化的hPD-1-Fc蛋白，室温孵育30min；
8、孵育结束后，1000rpm，5min离心，弃上清；
9、用PBS缓冲液洗两遍，1000rpm，5min离心，弃上清；
10、对照组和处理组均加入Anti-IgG抗体，4℃冰箱避光孵育30min；
11、孵育结束后，1000rpm，5min离心，弃上清；
12、用PBS缓冲液洗两遍，1000rpm，5min离心，弃上清；
13、采用高通量流式细胞仪检测样品的平均荧光强度。
(六)原代细胞整体PD-L1表达水平检测
1、取生长至对数期的状态良好的原代细胞，胰酶消化，收集细胞离心后进行细胞计数；
2、取2×105个细胞接种于六孔板中，添加2mL完全F培养基，每种细胞接种2个孔，置于37℃，5％CO2条件下培养过夜；
3、待细胞完全贴壁后，对细胞进行换液处理，对照孔中的细胞上清更换为新鲜的完全F培养基，处理孔中的细胞上清更换为含有100IU/mL IFN-γ的完全F培养基，置于37℃，5％CO2条件下培养24h；
4、处理结束后，弃去细胞培养基上清，用PBS洗2～3遍；
5、将细胞培养皿置于冰上，向细胞中加入适量的添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，裂解5～10min后，用刮片轻轻刮下裂解后的细胞，转移至1.5mL Ep管中；
6、取适量的细胞裂解液，加入相同体积的2×上样缓冲液，100℃金属浴煮样10min；
7、煮好的样品进行免疫印迹，检测PD-L1表达水平。
(七)高通量流式细胞仪检测数据处理
采用FlowJo流式细胞分析软件对检测样品高通量流式检测结果进行处理，得到样品的平均荧光强度后，用CHO-K1细胞系和过表达人源化PD-L1的CHO-K1稳转细胞株对不同实验批次数据进行标准化处理。
(八)患者临床预后相关性分析
收集患者的临床预后资料，通过临床回顾性分析将原代肿瘤细胞免疫特征与患者免疫治疗的响应情况进行了对比分析，证明此方法指导肿瘤临床免疫治疗的潜力。
三、结果
(一)原代肿瘤细胞表面PD-L1固有表达水平检测
如图1所示，不同患者来源的原代肿瘤细胞表面PD-L1的固有表达水平差异很大。
(二)原代肿瘤细胞表面PD-L1诱导性表达水平检测
如图2所示，不同患者来源的原代肿瘤细胞经IFN-γ刺激后其表面PD-L1的表达水平差异很大。
(三)原代肿瘤细胞对IFN-γ的响应程度分析
如图3所示，不同患者来源的原代肿瘤细胞对IFN-γ的响应程度差异很大。
(四)原代肿瘤细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力检测
如图4所示，不同患者来源的原代肿瘤细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力差异很大。
(五)原代肿瘤细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力与其PD-L1表达水平的关系
如图5所示，原代肿瘤细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力与其表面PD-L1的表达水平之间呈现中等程度的显著相关性，说明原代细胞对PD-1蛋白的结合能力不仅与其表面PD-L1的表达水平相关，可能还与一些其他因素有关。
(六)高通量流式细胞仪检测平台的可靠性验证
如图6、7所示，Western blotting所检测的原代肿瘤细胞整体PD-L1的表达水平同高通量流式细胞仪所检测原代肿瘤细胞表面PD-L1的表达水平之间呈现显著的正相关，证明高通量流式方法不仅可以准确定量的检测原代细胞PD-L1的表达，同时这种检测方法不受PD-L1高度糖基化这一特征的影响。
(七)原代肿瘤细胞的免疫相关特征的临床指导意义
如图8所示，通过临床回顾性分析将原代肿瘤细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力与患者免疫治疗的响应情况进行了对比分析。BCC1和BCC31对PD-1蛋白的结合能力均非常低，代表其肿瘤在体内对T细胞的抑制作用并不主要通过PD-1/PD-L1途径，这两位患者在临床治疗过程中，分别采用Atezolizumab(PD-L1抑制剂)和Nivolumab(PD-1抑制剂)，3个月后的CT结果均显示疾病进展。BCC22对PD-1蛋白的结合能力较高，提示其肿瘤在体内很可能通过PD-L1和PD-1的结合，对T细胞具有强烈的免疫抑制作用。该患者临床上采用Sintilimab(PD-1抑制剂)治疗，3个月后的CT结果显示病灶得到部分缓解，表明对于患者BCC22而言，阻断掉PD-L1/PD-1的结合，可以很好的恢复T细胞的功能，恢复免疫系统的作用。三位患者的案例分析结果显示出原代细胞对PD-1蛋白的结合能力在免疫治疗预测中的潜在价值。
综上所述，本发明构建的体外原代肿瘤细胞免疫特征评估模型在肿瘤免疫治疗个性化预测中具有重要潜在价值，其不仅动态，客观，准确，而且可最大程度还原患者本身的肿瘤状态，为患者是否进行免疫治疗及其治疗疗效进行快速的体外评估，填充了目前免疫治疗体外预测模型的空白。
表1
Claims (10)
1.一种原代肿瘤细胞免疫特征的检测方法，包括原代膀胱癌细胞免疫相关蛋白PD-L1表达情况及对细胞因子IFN-γ响应情况的检测，原代细胞对PD-1蛋白结合能力的测定，以及数据的统计分析；其特征在于，具体步骤为：
（1）原代肿瘤细胞按一定密度铺板；
（2）对细胞进行IFN-γ刺激处理；
将培养过夜的原代肿瘤细胞进行换液，对照组的上清更换为新鲜的Complete F培养基，处理组的上清更换为含有IFN-γ的Complete F培养基，置于37℃，5%CO2条件下培养24h；
（3）采用高通量流式细胞仪对样品进行检测，包括：
（3.1）对照组的原代肿瘤细胞检测其表面固有PD-L1表达水平；
（3.2）处理组的原代肿瘤细胞检测IFN-γ刺激后细胞表面诱导性PD-L1表达水平；
（3.3）对照组的原代肿瘤细胞同时检测细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力：将原代肿瘤细胞依次同人PD-1-Fc嵌合蛋白和Anti-IgG抗体进行孵育，随后采用高通量流式细胞仪检测其对人PD-1-Fc嵌合的结合能力；
（4）对流式细胞仪检测数据进行统计学分析，包括标准化处理流式检测数据。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述原代肿瘤细胞来自从膀胱癌患者的肿瘤组织或尿液中分离得到的肿瘤上皮细胞经体外培养后获得。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述原代肿瘤细胞为条件性重编程培养法培养的原代肿瘤细胞，所述条件性重编程培养法选用Complete F培养基进行培养。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述IFN-γ的含量为50 IU/mL~300IU/mL。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）分为两部分：原代细胞表面PD-L1表达水平检测采用Anti-PD-L1检测抗体进行孵育，原代细胞对PD-1蛋白的结合能力检测采用两步孵育法，分别依次同人PD-1-Fc嵌合蛋白和Anti-IgG检测抗体孵育。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Anti-PD-L1检测抗体稀释比例为1:2000 ~ 1:5000；所述Anti-IgG检测抗体稀释比例为1:100～1:500。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述原代细胞表面PD-L1表达水平检测，具体流程是：IFN-γ刺激24h后，收集细胞，用PBS清洗两遍后，对照组和处理组均加入稀释好的PD-L1检测抗体，4℃避光孵育30 min，再次PBS清洗后进行荧光强度检测。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述原代细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力检测，具体流程是：对照组细胞用PBS清洗两遍后分为两等份，一份中加入纯化的hPD-1-Fc蛋白室温孵育30 min，一份作为不孵育的对照，孵育完成后采用PBS清洗两遍，去除掉未结合的蛋白，之后两份均加入稀释好的Anti-IgG抗体4℃避光孵育30 min，再次PBS清洗后进行荧光强度检测。
9. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述标准化处理流式检测数据，是采用高通量流式细胞技术检测原代肿瘤细胞的免疫特征，批次之间采用不表达人PD-L1的中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1 和过表达人PD-L1的CHO-K1-PD-L1稳转细胞株作为标准化对照。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，对不同患者来源的原代肿瘤细胞经高通量流式细胞仪检测其PD-L1蛋白表达水平及PD-1蛋白结合能力，并通过临床回顾性分析，将原代肿瘤细胞免疫特征与对应患者免疫治疗的响应情况进行对比分析，从而对患者临床免疫治疗的效果进行预测。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114432386A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-05-06 | 湖南中医药大学第一附属医院((中医临床研究所)) | 一种马归液在非可控性炎症中的用途及验证方法 |
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2021
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