CN107365386A - 一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法和用途 - Google Patents

一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法和用途 Download PDF

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CN107365386A CN201610315704.7A CN201610315704A CN107365386A CN 107365386 A CN107365386 A CN 107365386A CN 201610315704 A CN201610315704 A CN 201610315704A CN 107365386 A CN107365386 A CN 107365386A
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Abstract

本发明公开一种抗细胞质胸苷激酶‑IgG抗体的制备方法和用途，设计用人的抗细胞质胸苷激酶TK1的全长重组蛋白作为抗原，制备抗细胞质胸苷激酶‑IgG抗体以及用上述抗体制备的试剂盒在肿瘤诊断中的应用。TK1的全长氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同。本发明同时提供了应用该抗原制备的抗细胞质胸苷激酶‑IgG抗体及试剂盒产品的制备工艺和检测方法，本发明提供的抗体试剂盒具有检测灵敏度高、抗体理化性质稳定、检测成本低廉等特点，通过酶联免疫法和免疫组化检测法能够定性和定量的对多种肿瘤进行早期检测、鉴别和预后检测。

Description

一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种抗体的制备方法和用途，具体涉及一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法和用途。
背景技术
本发明涉及用用人的TK1全长重组蛋白作为抗原, 制备抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体和以IgG抗体为有效成分的肿瘤诊断试剂盒。
癌症是一种细胞异常增殖疾病。当正常细胞生长调控失控，导致细胞恶性增殖，是导致人类死亡的杀手。死亡人数每年在增加。尽管近年来化疗，手术，放疗和内分泌治疗等，已经有了很大的进步，但远远不可能达到肿瘤的根治，并有复发和转移的可能。因此，早期的发现和早期的治疗将给予患者康复最佳的福音。
现在国内已有数十种肿瘤标记物如AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、HCG(绒毛膜促性腺激素)、PSA(前列腺特别抗原)、VCA(喉癌抗原)、CA(癌抗原)等，但这些肿瘤标记物或受限于个别器官，或灵敏度低。临床应用证实现有一系列单克隆抗体，如CEA，CA19-9，CA125，CA15-3，由于其特异性不理想，在临床上应用仍有争议。用来检测肠癌的CA19-9、乳腺癌的CA-15-3，由于其监控治疗效果的不理想，2002年美国临床肿瘤协会已不推荐使用。肿瘤特别是恶性肿瘤的早期诊断中，肿瘤标记物的检测已成为临床诊断的重要手段，在体检及临床中的恶性增殖病变筛查和治疗后的跟踪监测等具有广泛的使用价值。
胸苷激酶(TK)的酶学命名为腺苷三磷酸:胸苷5，-磷酸转移酶，EC.2.7.1.21, 简称胸苷激酶TK，是一种嘧啶补救途径的激酶，在ATP 为供体和镁离子参与的条件下，催化脱氧胸苷为一腺胸苷酸。人细胞中TK 以两种同功酶的形式出现，即TK1（位在于染色体17q23.2–q25.3）和TK2（位于染色体16q22–q23.1）。存TK1在于细胞质中，与细胞的分裂相关，称为细胞质胸苷激酶 ；TK2 存在于线粒体中，其表达与细胞周期无关，称为线粒体胸苷激酶。TK1 的水平升降与DNA 在细胞周期的S 期DNA 合成速度密切相关，正常增殖细胞TK1的水平在细胞周期的G1 和S 期交界处开始升高，随着细胞进入G1 晚期, TK1 酶的水平逐渐急剧上升, 直至S 和G2期交界处。因此，TK1 酶被称为一种嘧啶补救合成的DNA 的关键酶和S-期特殊酶。TK2 则仅能在静止期细胞中见到，在增殖细胞中水平非常低。70 年代以来，TK 酶的研究引起了广泛的关注，特别是TK1 与细胞增殖的密切相关特征，即非增殖细胞的TK1 和健康人血清和组织中TK1，其含量极微或检测不到； 但在恶性肿瘤患者中，TK1酶伴随着肿瘤细胞数的急剧增殖而升高。因此，TK1 可以作为一种好的血清学细胞增殖标志来检测增殖细胞的增殖活性，特别适用于恶性肿瘤的细胞增殖度检测。目前，已有利用胸苷类似物，[125I]-5-碘- 2´脱氧尿苷作为底物，检测血清TK1(STK)的放射性同位素方法的试剂盒(TK-REA-kit-[125I]-radio-assay)出售，此方法主要是采用TK 活性检测实体肿瘤细胞增殖度。但放射性同位素[125I]-5-碘–2´-脱氧尿苷并非是TK1 活性分析的专一性底物，它的半衰期仅在4 星期，并且在血清TK 的活性测定中，对pH 和温度非常敏感，常产生不准确结果；并且需要使用贵重的检测仪器((γ闪烁仪)。这种检测具有放射性污染且需要特别的设备和熟练技术人员操作，因此在临床应用上有很大的局限性。且已有研究显示TK1活性检测方法并不适用于实体癌患者的监测和预后。
制备抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体在国内尚未有报道。采用双抗体夹心法检测血清中TK1，应用于体检及临床中的恶性增殖病变筛查和治疗后的跟踪监测，目前在国内外尚属首创。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法和用途，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。
本发明设计用人的TK1的全长重组蛋白作为抗原，制备抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体以及用上述抗体制备的试剂盒在肿瘤诊断中的应用。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是细胞质胸苷激酶TK1，其的全长氨基酸序列与SEQID NO.1相同，
MSCINLPTVLPGSPSKTRGQIQVILGPMFSGKSTELMRRVRRFQIAQYKCLVIKYAKDTRYSSSFCTHDRNTMEALPACLLRDVAQEALGVAVIGIDEGQFFPDIVEFCEAMANAGKTVIVAALDGTFQRKPFGAILNLVPLAESVVKLTAVCMECFREAAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHSVCRLCYFKKASGQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQQILQCSPAN。
一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是应用细胞质胸苷激酶TK1作为抗原制备的抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体。
一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体。
本发明提供的抗体试剂盒具有检测灵敏度高、抗体理化性质稳定、检测成本低廉等特点，通过酶联免疫法和免疫组化检测法能够定性和定量的对多种肿瘤进行早期检测、鉴别和预后检测。
一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
采用细胞质胸苷激酶TK1全长重组蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体，最后制备和纯化了抗TK1-IgG抗体。
进一步，包含以下步骤：
（1）抗原的设计
所述抗原的氨基酸序列共包含234个氨基酸，是TK1的全长重组蛋白，对肿瘤细胞TK1分子特异性更强。
细胞质胸苷激酶TK1的氨基酸全长序列：Human TK1 full-length ORF(AAH07986.1, 1 a.a. - 234 a.a.) recombinant protein with GST-tag at N-terminal与SEQ ID NO.1相同。
MSCINLPTVLPGSPSKTRGQIQVILGPMFSGKSTELMRRVRRFQIAQYKCLVIKYAKDTRYSSSFCTHDRNTMEALPACLLRDVAQEALGVAVIGIDEGQFFPDIVEFCEAMANAGKTVIVAALDGTFQRKPFGAILNLVPLAESVVKLTAVCMECFREAAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHSVCRLCYFKKASGQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQQILQCSPAN
发明人采用TK1的全长重组蛋白作为抗原制备的TK1-IgG单克隆抗体对多种肿瘤血清学及组织学标本进行检测，检测的阳性率为87%-96%，高于常规肿瘤标志物检出率。获得针对TK1蛋白构象表位的IgG抗体，其检测灵敏度优于多肽制备的针对线性表位的抗体，可检测待测血样中ng 甚至pg 级的TK1蛋白；同时假阴性和假阳性的检出率低。该抗体制备的检测试剂盒，检测中所需要的待测血样量少，30ul即可完成多项检测，是已有同类型产品待测血样需求量的三分之一。
(2)抗体的制备和纯化
用上述抗原去免疫小鼠制备的抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的方法，制备的IgG抗体与IgA、IgM、IgD、IgE其它类型抗体相比，具有更高的亲和力。我们免疫过程中不需要BSA作为偶联分子，去除了BSA对抗体制备效果的影响。同时，全蛋白作为免疫原制备获得的抗体，可获得针对TK1蛋白构象表位和线性表位的不同IgG单抗，比单纯用人工合成的多肽制备针对线性表位的抗体，对肿瘤细胞TK1分子特异性更强。
利用上述抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选出分泌抗TK1-IgG的阳性克隆，收集阳性克隆细胞的培养上清液，利用亲和柱进行纯化，制备出与天然TK1分子有特异免疫反应的抗TK1-IgG抗体。
（3）TK1-IgG的鉴定
用三种细胞株分别鉴定抗体的纯度
（1）重组人TK1工程株（pT7 hTK1）
（2）一种表达TK1阳性的野生型淋巴瘤细胞株（CEM-TK1+）
（3）一种表达TK1阴性的细胞株（CEM-TK1-）
以这两种细胞株为标准来鉴定抗体的特异性。从上述细胞中制备含有天然TK1的细胞萃取物，经过SDS电泳、天然胶电泳和等电点聚集分离后，进行Westernblot实验，测定TK1的纯度和分子量。制备的抗体与（1）重组人TK1工程株（pT7 hTK1）表达的TK1做Westernblot实验比较，证实了该抗体具有纯度高，无非特异性免疫交叉反应，以其测定的分子量、等电点等与文献报道一致。
一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：
肿瘤诊断组合物是利用抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体，制备用于血清学检测的双抗体夹心ELISA检测和组织学检测的免疫组化检测组合物。
其中，双抗体夹心ELISA法检测组合物是由以下物质组成：
抗TK1-IgG兔来源抗体 1支，
抗TK1-IgG鼠来源抗体 1支，
辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG 1支，
显色液 1支，
终止液 1支。
该检测方法采用双抗体夹心的方法，对肿瘤的检出灵敏度为10-11-10-12g/L, 检测的阳性率可以达到87%-96%，高于常规肿瘤标志物检出率，能够鉴别良性肿瘤和恶性肿瘤，为肿瘤的早期检出和鉴别提供了方法学的依据。此方法的灵敏度与放射免疫法检测TK1活性相当，但无放射污染。同时该方法具有浓缩效应，能够快速检测出待测血样中TK1的含量。不仅适用于一天之内需检查几百甚至上千份标本的体检健康人群的肿瘤预防检测，也适合于临床肿瘤病人手术、放化疗效果检查和判断肿瘤的复发风险，明确肿瘤的临床分期。同时相对于已有同类型的TK1检测试剂盒，我们的检测方法消耗成本低且可进行微创采血；更为重要的一点是操作简单、快速且易于自动化操作，对操作人员的要求不高。
本发明中的免疫组化检测组合物由以下物质组成：
抗TK1-IgG鼠来源抗体 1支，
羊抗鼠生物素化IgG 1支，
辣根过氧化物酶标记的亲和素 1支。
应用上述检测试剂具有检测灵敏度高，同进口的同类型产品相比具有更高的性价比。
一种抗体的用途，其特征在于，所述抗体制备试剂盒用于体检健康人群的肿瘤预防检测，用于肿瘤病人手术、放化疗效果检查和判断肿瘤的复发风险。
本发明的有益效果：
本发明同时提供了应用该抗原制备的抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体及试剂盒产品的制备工艺和检测方法。
本发明提供的抗体试剂盒具有检测灵敏度高、抗体理化性质稳定、检测成本低廉等特点，通过酶联免疫法和免疫组化检测法能够定性和定量的对多种肿瘤进行早期检测、鉴别和预后检测。
附图说明
图1为构建细胞质胸苷激酶TK1抗体的氨基酸基因的阳性重组质粒的酶切鉴定。
图2细胞质胸苷激酶TK1抗原和抗体浓度的组合。
图3为Western blot分析原核表达目的蛋白的抗原性。1，3为目的蛋白，一抗分别加阳性和阴性鸡血清孵育；2，4为对照蛋白，一抗分别加阳性和阴性鸡血清孵育。
图4为SDS-PAGE分析重组蛋白的纯化。1，2为纯化的重组蛋白；3为未纯化蛋白。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
细胞质胸苷激酶抗原的选择，发明人采用细胞质胸苷激酶TK1全蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，制备抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体。细胞质胸苷激酶TK1的全长氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，
MSCINLPTVLPGSPSKTRGQIQVILGPMFSGKSTELMRRVRRFQIAQYKCLVIKYAKDTRYSSSFCTHDRNTMEALPACLLRDVAQEALGVAVIGIDEGQFFPDIVEFCEAMANAGKTVIVAALDGTFQRKPFGAILNLVPLAESVVKLTAVCMECFREAAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHSVCRLCYFKKASGQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQQILQCSPAN。采用全蛋白作为抗原免疫过程中不需要BSA作为偶联分子，去除了BSA对抗体制备效果的影响。同时，全蛋白作为免疫原制备获得的抗体，可获得针对TK1蛋白构象表位和线性表位的不同IgG单抗，比单纯用人工合成的多肽制备针对线性表位的抗体，特异性更强。
1、抗原的设计
发明人选择抗原的氨基酸序列共包含234个氨基酸，是TK1的全长重组蛋白，对肿瘤细胞TK1分子特异性更强。
细胞质胸苷激酶TK1氨基酸全长序列：Human TK1 full-length ORF(AAH07986.1, 1 a.a. - 234 a.a.) recombinant protein with GST-tag at N-terminal与SEQ ID NO.1相同.
MSCINLPTVLPGSPSKTRGQIQVILGPMFSGKSTELMRRVRRFQIAQYKCLVIKYAKDTRYSSSFCTHDRNTMEALPACLLRDVAQEALGVAVIGIDEGQFFPDIVEFCEAMANAGKTVIVAALDGTFQRKPFGAILNLVPLAESVVKLTAVCMECFREAAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHSVCRLCYFKKASGQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQQILQCSPAN
我们采用细胞质胸苷激酶TK1的全长重组蛋白作为抗原制备的TK1-IgG单克隆抗体对多种肿瘤血清学及组织学标本进行检测，检测的阳性率为87%-96%，高于常规肿瘤标志物检出率。获得针对TK1蛋白构象表位的IgG抗体，其检测灵敏度优于多肽制备的针对线性表位的抗体，可检测待测血样中ng 甚至pg 级的TK1蛋白；同时假阴性和假阳性的检出率低。该抗体制备的检测试剂盒，检测中所需要的待测血样量少，30ul即可完成多项检测，是已有同类型产品待测血样需求量的三分之一。
2、抗体的制备和纯化
如图1所示，用上述抗原去免疫小鼠制备的IgG抗体的方法，制备的IgG抗体与IgA、IgM、IgD、IgE等其它类型抗体相比，具有更高的亲和力。我们免疫过程中不需要BSA作为偶联分子，去除了BSA对抗体制备效果的影响。同时，全蛋白作为免疫原制备获得的抗体，可获得针对TK1蛋白构象表位和线性表位的不同IgG单抗，比单纯用人工合成的多肽制备针对线性表位的抗体，对肿瘤细胞TK1分子特异性更强，参见图2。
利用上述抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选出分泌抗TK1-IgG的阳性克隆，收集阳性克隆细胞的培养上清液，利用亲和柱进行纯化，制备出与天然TK1分子有特异免疫反应的抗TK1-IgG抗体。
3、TK1-IgG的鉴定
用三种细胞株分别鉴定抗体的纯度
（1）重组人TK1工程株（pT7 hTK1）
（2）一种表达TK1阳性的野生型淋巴瘤细胞株（CEM-TK1+）
（3）一种表达TK1阴性的细胞株（CEM-TK1-）
如图3和图4所示，以这两种细胞株为标准来鉴定抗体的特异性。从上述细胞中制备含有天然TK1的细胞萃取物，经过SDS电泳、天然胶电泳和等电点聚集分离后，进行Westernblot实验，测定TK1的纯度和分子量。制备的抗体与（1）重组人TK1工程株（pT7hTK1）表达的TK1做Westernblot实验比较，证实了该抗体具有纯度高，无非特异性免疫交叉反应，以其测定的分子量、等电点等与文献报道一致。
本发明的肿瘤诊断组合物是利用上述抗体，制备用于血清学检测的双抗体夹心ELISA检测和组织学检测的免疫组化检测组合物，其中双抗体夹心ELISA法检测组合物是由以下物质组成：
抗TK1-IgG兔来源抗体 1支，
抗TK1-IgG鼠来源抗体 1支，
辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG 1支，
显色液 1支，
终止液 1支。
该检测方法采用双抗体夹心的方法，对肿瘤的检出灵敏度为10-11-10-12g/L, 检测的阳性率可以达到87%-96%，高于常规肿瘤标志物检出率，能够鉴别良性肿瘤和恶性肿瘤，为肿瘤的早期检出和鉴别提供了方法学的依据。此方法的灵敏度与放射免疫法检测TK1活性相当，但无放射污染。同时该方法具有浓缩效应，能够快速检测出待测血样中TK1的含量。不仅适用于一天之内需检查几百甚至上千份标本的体检健康人群的肿瘤预防检测，也适合于临床肿瘤病人手术、放化疗效果检查和判断肿瘤的复发风险，明确肿瘤的临床分期。同时相对于已有同类型的TK1检测试剂盒，我们的检测方法消耗成本低且可进行微创采血；更为重要的一点是操作简单、快速且易于自动化操作，对操作人员的要求不高。
本发明中的免疫组化检测组合物由以下物质组成：
抗TK1-IgG鼠来源抗体 1支，
羊抗鼠生物素化IgG 1支，
辣根过氧化物酶标记的亲和素 1支，
应用上述检测试剂具有检测灵敏度高，同进口的同类型产品相比具有更高的性价比。
实施例2
细胞培养
采用常规细胞培养方法，将实验所用的CEM TK+,CEM TK1-细胞进行培养（含有10%胎牛血清的1640培养液），当25cm2细胞培养瓶长满80%时，收获细胞进行处理。
本发明的特点
采用全蛋白作为抗原，免疫小鼠制备的TK1-IgG单克隆抗体，与IgA、IgM、IgD、IgE等其它类型抗体相比，具有更高的亲和力。我们免疫过程中不需要BSA作为偶联分子，去除了BSA对抗体制备效果的影响。同时，全蛋白作为免疫原制备获得的抗体，可获得针对TK1蛋白构象表位和线性表位的不同IgG单抗，比单纯用人工合成的多肽制备针对线性表位的抗体，特异性更强。相比于国内市场目前已有的直接法检测试剂盒，我们的试剂盒采用双抗体夹心法来检测血清中TK1的表达，检测结果更稳定，重复性更好。已有文献报道采用IgG单克隆抗体制备的ELISA试剂盒，其检测限比IgY类型的抗体高。采用TK1-IgG单克隆抗体对多种肿瘤血清学及组织学标本进行检测，检测的阳性率为87%-96%，高于常规肿瘤标志物检出率。获得针对TK1蛋白构象表位的IgG抗体，其检测灵敏度优于多肽制备的针对线性表位的抗体，可检测待测血样中ng 甚至pg 级的TK1蛋白；同时假阴性和假阳性的检出率低。该抗体制备的检测试剂盒，检测中所需要的待测血样量少，30ul即可完成多项检测，是已有同类型产品待测血样需求量的三分之一。初步预实验结果显示，单次检测耗时短，4-5h即可查看结果。另外待测血样加到硝酸纤维素膜上，其最大加样量为10ul，我们的检测试剂盒加样范围可以达到200ul，采用的检测方法具有浓缩效应，能够快速检测出待测血样中TK1的含量。 不仅适用于一天之内需检查几百甚至上千份标本的体检健康人群的肿瘤预防检测，也适合于临床肿瘤病人手术、放化疗效果检查和判断肿瘤的复发风险，明确肿瘤的临床分期。同时相对于已有同类型的TK1检测试剂盒，我们的检测方法消耗成本低且可进行微创采血；更为重要的一点是操作简单、快速且易于自动化操作，对操作人员的要求不高，更适宜推广。
以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。
SEQUENCE LISTING
<110> 杨国民
<120> 一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法和用途
<130> 2016050401
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys
1 5 10 15
Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys
20 25 30
Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe Gln Ile Ala Gln Tyr
35 40 45
Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Ser
50 55 60
Phe Cys Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala Leu Pro Ala Cys Leu
65 70 75 80
Leu Arg Asp Val Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile
85 90 95
Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu Phe Cys Glu Ala Met
100 105 110
Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe
115 120 125
Gln Arg Lys Pro Phe Gly Ala Ile Leu Asn Leu Val Pro Leu Ala Glu
130 135 140
Ser Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Glu Cys Phe Arg Glu Ala
145 150 155 160
Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly
165 170 175
Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser Val Cys Arg Leu Cys Tyr Phe Lys Lys
180 185 190
Ala Ser Gly Gln Pro Ala Gly Pro Asp Asn Lys Glu Asn Cys Pro Val
195 200 205
Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro
210 215 220
Gln Gln Ile Leu Gln Cys Ser Pro Ala Asn
225 230

Claims (6)

1.一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
采用细胞质胸苷激酶TK1全长重组蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体，最后制备和纯化了抗TK1-IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包含以下步骤：
（1）抗原的设计
所述抗原的氨基酸序列共包含234个氨基酸，是细胞质胸苷激酶TK1的全长重组蛋白，对肿瘤细胞TK1分子特异性更强；
细胞质胸苷激酶TK1的氨基酸全长序列：Human TK1 full-length ORF (AAH07986.1,1 a.a. - 234 a.a.) recombinant protein with GST-tag at N-terminal与SEQ IDNO.1相同；
(2)抗体的制备和纯化
用上述抗原去免疫小鼠制备的抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的方法，制备的IgG抗体与IgA、IgM、IgD、IgE其它类型抗体相比，具有更高的亲和力，同时，全蛋白作为免疫原制备获得的抗体，可获得针对TK1蛋白构象表位和线性表位的不同IgG单抗，比单纯用人工合成的多肽制备针对线性表位的抗体，对肿瘤细胞TK1分子特异性更强；
利用上述抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选出分泌抗TK1-IgG的阳性克隆，收集阳性克隆细胞的培养上清液，利用亲和柱进行纯化，制备出与天然TK1分子有特异免疫反应的抗TK1-IgG抗体；
（3）TK1-IgG的鉴定
用三种细胞株分别鉴定抗体的纯度
1）重组人TK1工程株（pT7 hTK1），
2）一种表达TK1阳性的野生型淋巴瘤细胞株（CEM-TK1+），
3）一种表达TK1阴性的细胞株（CEM-TK1-），
以这两种细胞株为标准来鉴定抗体的特异性，从上述细胞中制备含有天然TK1的细胞萃取物，经过SDS电泳、天然胶电泳和等电点聚集分离后，进行Westernblot实验，测定TK1的纯度和分子量。
3.一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：
肿瘤诊断组合物是利用抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体，制备用于血清学检测的双抗体夹心ELISA检测和组织学检测的免疫组化检测组合物。
4.根据权利要求4所述的ELISA方法，其特征在于，其中，所述双抗体夹心ELISA法，采用检测组合物是由以下物质组成：
抗TK1-IgG兔来源抗体 1支，
抗TK1-IgG鼠来源抗体 1支，
辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG 1支，
显色液 1支，
终止液 1支。
5.根据权利要求4所述的ELISA方法，其特征在于，其中，所述双抗体夹心ELISA法，采用免疫组化检测组合物由以下物质组成：
抗TK1-IgG鼠来源抗体 1支，
羊抗鼠生物素化IgG 1支，
辣根过氧化物酶标记的亲和素 1支。
6.一种如权利要求1所述的抗体的用途，其特征在于，所述抗体制备试剂盒，用于体检健康人群的肿瘤预防检测，用于肿瘤病人手术、放化疗效果检查和判断肿瘤的复发风险。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110346569A (zh) * 2019-06-28 2019-10-18 安徽恩禾生物技术有限公司 一种胸苷激酶化学发光法检测试剂盒及其制备方法
CN112639475A (zh) * 2018-08-31 2021-04-09 豪夫迈·罗氏有限公司 Dlbcl的预后指数中的胸苷激酶(tk-1)
CN113533726A (zh) * 2021-07-13 2021-10-22 深圳上泰生物工程有限公司 用于检测胸苷激酶1的试剂盒及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1414017A (zh) * 2002-09-13 2003-04-30 深圳市华瑞同康生物技术有限公司 抗细胞质胸苷激酶－IgY的制备及肿瘤诊断组合物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1414017A (zh) * 2002-09-13 2003-04-30 深圳市华瑞同康生物技术有限公司 抗细胞质胸苷激酶－IgY的制备及肿瘤诊断组合物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK DATABASE: "TK1 protein[Homo sapiens]", 《GENBANK DATABASE》 *
KUROIWA N等: "Specific recognition of cytosolic thymidine kinase in the human lung tumor by monoclonal antibodies raised against recombinant human thymidine kinase", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *
KUROIWA,N等: "Regulation of the activity and polymerization status of recombinant human cytosolic thymidine kinase by thiols and ATP", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112639475A (zh) * 2018-08-31 2021-04-09 豪夫迈·罗氏有限公司 Dlbcl的预后指数中的胸苷激酶(tk-1)
CN110346569A (zh) * 2019-06-28 2019-10-18 安徽恩禾生物技术有限公司 一种胸苷激酶化学发光法检测试剂盒及其制备方法
CN113533726A (zh) * 2021-07-13 2021-10-22 深圳上泰生物工程有限公司 用于检测胸苷激酶1的试剂盒及其应用

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