KR20140065370A - 대장직장암 마커에 대한 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는, SLC6A6 또는 이의 세포외 도메인에 결합하는 신규 모노클로날 항체가 개시되어 있다. 본 발명에서는, 천연 SLC6A6, 또는 SLC6A6 의 세포외 도메인의 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체가 개시되어 있다.

Description

대장직장암 마커에 대한 항체 {ANTIBODY FOR COLORECTAL CANCER MARKER}

본 발명은, SLC6A6 또는 이의 세포외 도메인에 결합하는 신규 모노클로날 항체, 그 항체를 생산하는 하이브리도마 세포, 및 그 항체를 사용하는 암의 검사 키트에 관한 것이다.

암은 전세계적으로 사망원인 중 상위에 랭크되어 있으며, 그 중에서도 대장직장암은 암의 사망률에 있어서 상위에 랭크되어 있는 질환이다. 일본에서도 대장직장암의 환자수는 최근 급격하게 증가하고 있고, 연간 약 6만명이 대장직장암에 걸리고 있다. 장기별 사망수에서도, 위암, 폐암에 이어 3번째로 높다. 대장직장암은 다른 암과는 달리, 조기 암이면 수술에 의해 100% 가깝게 완치될 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 대장직장암은 조기 암검진의 대상이 되어, 수많은 검사법이 고안되어 왔다.

현재, 부담의 적은 대장직장암의 일차 스크리닝법으로서 변잠혈 반응이 보급되어 있다. 이 방법에서는, 인간 헤모글로빈의 존재를 조사하는 것으로, 장내의 출혈의 유무를 진단해, 간접적으로 대장직장암의 발생을 예측한다.

변잠혈 반응은, 간단하게 받게 되는 검사이기 때문에 널리 이용되고 있지만, 검사의 유용성에 대한 의문이 제기되기도 한다. 예를 들어, Hemoccult II (Astellas Pharma Inc.) 를 이용한 시험으로 양성 판정이 되려면, 대장 내에서 1 일 당 20 mg의 출혈이 필요하다. 그러나, 실제의 대장직장암 환자의 출혈량은 10 mg 이하인 것으로 생각되고 있다. 결과적으로, 변잠혈 반응의 감도는 대략 26% 정도로, 실제의 대장직장암 환자의 대략 1/4 밖에 발견하지 못하고, 3/4 를 놓치고 있다는 보고가 있다 (비특허 문헌 1). 게다가 양성 판정이 이루어진 피험자 중에서, 실제로 대장직장암에 걸린 경우는 8.3% 에 지나지 않고, 많은 거짓 양성을 포함하고 있는 검사 방법이다.

이 외에도, 부담이 적은 대장직장암의 일차 스크리닝법으로서 분편으로부터 직접 핵산을 추출해, 유전자의 변이를 조사하는 유전자 진단법의 개발이 시도되고 있다. 그러나, 분편에 포함되는 핵산의 대부분은 여러가지 세균이나 정상세포에 유래하는 핵산이 대부분이어서, 암세포 유래의 핵산은 극미량이다 (약 0.05%). 그 때문에, 암세포에 유래하는 유전자의 변이나 발현 패턴의 미묘한 변화의 검출이 곤란하고, 유전자 진단의 실용화는 어렵다.

암검출의 정밀도 향상을 위해, 분편으로부터 암세포를 효율적으로 회수할 방법이 개발되었다. 대표적인 기술로서 분편의 현탁액으로부터 세포의 회수까지를 실온으로 실시해, 살아 있는 암세포를 회수하는 방법이 있다 (특허 문헌 1).

이 방법에 따르면, 분편에 포함되는 살아 있는 암세포의 회수가 간편하게 된다. 그러나, 당해 방법으로 사용하는 Ber-EP4 항체는, 표피 세포에 광범위하게 발현하는 표피성 세포 결합 분자 (epithelial cell adhesion molecule; EpCAM) 를 인식하기 (비특허 문헌 2) 때문에, 수득된 세포 집단에, 분편에 포함되는 대장 등의 정상 선상피 세포가 혼입할 가능성이 있다. 그 때문에, 암을 진단하려면, 회수한 세포를, 암에 특이적 특징을 검출하는 것과 같은 다른 검사 방법으로 분석할 필요가 있다.

일반적으로, 특정 세포를 특이적으로 검출하려면, 그 세포에 특이적으로 발현하는 분자와 항체나 앱타머를 사용하는 방법이 취해진다. 따라서, 본 발명자들은, 암세포에 있어서 발현이 항진되고 있는 유전자를 좁혀 나가는, 암세포를 특이적으로 검출하기 위한 마커 분자로서 SLC6A6 (용질 담체 패밀리 6 (신경전달물질 수송체, 타우린), 멤버 6) 에 주목했다.

SLC6A6 는, 620 아미노산으로 이루어지는 12회 막관통형의 막 단백질이며, NCBI (미국 생물 공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information)) 참조 서열 [RefSeq] ID: NM_003043, NP_003034.2 (SEQ ID NO: 1: 염기 서열, SEQ ID NO: 2: 아미노산 서열) 로서 등록되어 있다. SLC6A6 는 타우린의 세포내 흡수에 관여하고 있고, 나트륨 이온 및 클로라이드 이온과 함께 타우린을 공수송한다. SLC6A6 의 스플라이스 변이체로서, N-말단으로부터 200번째 위치까지의 아미노산으로 이루어지는 단백질 및 이의 유전자 (SEQ ID NO: 3 및 4), N-말단으로부터 359번째 위치까지의 아미노산으로 이루어지는 단백질 및 이의 유전자 (SEQ ID NO: 5 및 6) 등이 존재한다.

SLC6A6 유전자는, 정상 조직에 비해 결장암 조직에 있어서 발현 수준이 상승하는 유전자 중 하나로서 개시되어 있다 (특허 문헌 2). 특허 문헌 2 에서는, 10 종류의 1차 결장 종양과 10 종류의 정상 결장을 이용해, DNA 마이크로 어레이에 의해, slc6a6 를 포함한, 대장직장암 조직과 정상 조직과의 사이에 발현에 차이가 있는 30개 이상의 유전자가 동정되어 있고, 개시된 모든 유전자에 대해, 항체, 항체에 의한 폴리펩티드의 검출 방법, 암의 진단 방법, 항체를 포함한 의약 조성물에 대한 적용이 제시되어 있다. 그러나, slc6a6 에 대한 항체의 제조예는 없으며, 진단 또는 치료 목적에 있어서의, 단백질 레벨에서의 적정, 실용성 또는 실시 가능성에 대해도 실증되어 있지 않다. 또한, 특허 문헌 2 에는, 정량 PCR법에 의한 상세한 발현 패턴의 분석 결과가 기재되어 있지만, 발현비에 편차가 있어, 정상 조직에 있어서 결장암조직보다 높은 발현을 나타낸다 경우가 있다 (표 7). 또한, 정량 PCR 에 사용된 프라이머 (표 6) 는 단백질의 코딩 도메인에 포함되지 않는다. SLC6A6 의 복수의 스플라이스 변이체가 존재하기 때문에, 이 프라이머에 의해 증폭되는 영역을 측정에 이용해도, SLC6A6 단백질의 발현량을 정확하게 반영하지 않는 경우가 있다. 따라서, 유전자 레벨은 아니고 단백질 레벨로 표적 분자를 검출할 필요가 있으며, 그러기 위해서는 특정 아미노산 서열과 입체 구조를 인식하는 모노클로날 항체가 필수적이다. 또한, 변이체의 존재도 고려해, 단백질 레벨에서의 검사에 대한 유용성을 상세하게 검토하지 않으면 안 된다.

SLC6A6 에 대한 항체로서, HPA015028 (ATLAS), sc-166640 (SantaCruz) 이 공지되어 있다.

sc-166640 항체는 모노클로날 항체이며, SLC6A6 의 아미노산 잔기 397~424의 영역에 결합한다. 이 영역은, 막관통 영역으로부터 세포 내에 걸쳐서 있기 때문에, 이 항체를 이용해 살아 있는 세포를 검출할 수 없다. 또한, 면역 염색을 실시하는 경우, 세포의 고정화와 세포막의 투과 처리에 의해, SLC6A6 단백질이 변성되기 때문에, 항체의 검출 감도가 저하한다. 게다가, N-말단으로부터 201번째, 또는 360번째 위치에서 출발하는 부분이 결손된 SLC6A6 의 변이체를 검출할 수 없다는 문제가 있다.

HPA015028 는 폴리클로날 항체이다. SLC6A6 의 세포외 도메인인 아미노산 잔기 145~213 을 대장균에서 발현시켜 정제하고, 수득된 정제 폴리펩티드를 이용해 토끼를 면역화시키고, 그 후 친화도 정제에 의해 상기 항체를 수득한다.

그러나, 막 단백질은, 세포막 상에서 기능하기 위해서 막상에서 특징적인 입체 구조를 형성하고 있고, 세포외 도메인의 일부분을 제작하더라도 본래의 입체 구조를 형성하지 않는다는 것이 일반적으로 알려져 있다. 따라서, 이와 같은 막 단백질의 일부분을 항원으로서 이용하여 폴리클로날 항체를 제작했을 경우, 본래의 입체 구조에 반응하는 항체가 수득되는 비율이 낮고, 항체의 역가도 낮다는 문제가 있다.

항체를 목적 단백질의 검출이나 질환의 검사 툴로서 이용하려면, 계속적이고 균질적인 생산과 공급이 필수적이기 때문에, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 일반적으로, SLC6A6 와 같은 막 단백질, 특히 복수회 막 단백질의 경우, 이를 가용화하는 것이 어렵고, 세포외 도메인이 작다는 등의 이유로부터, 항체를 제작하는 것이 곤란하다. 면역화한 동물의 말초 혈액 등으로부터 폴리클로날 항체가 성공적으로 수득된다고 하더라도, 항체 생산 세포를 성공적으로 단리할 수 있는 확률은 매우 적은 것이 현상황이다.

이상의 이유로부터, 이들의 종래의 항체는, SLC6A6 를 검출하는 항체로서는 충분하지 않았다.

선행 기술 문헌

특허 문헌

특허 문헌 1: 일본 공개특허공보 2005-46065호

특허 문헌 2: 일본 공표특허공보 2006-515318호

비특허 문헌

비특허 문헌 1: Jama, Vol.269, 1262-7, 1993

비특허 문헌 2: J. Cell Biol. Vol.125, 437-46, 1994

따라서, SLC6A6 를 검출할 수 있으며 암의 검사 툴로서 안정적이며 재현성 좋게 공급할 수 있는 모노클로날 항체, 및 그러한 항체를 사용하는 암 진단용의 간단하고 용이한 정밀도 높은 검사 방법이 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은, 시료 중의 SLC6A6 의 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체, 그러한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공하는 것, 및 그러한 항체를 사용하는 암의 검출 방법을 확립하는 것에 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 연구를 거듭한 결과, SLC6A6 의 세포외 도메인인 아미노산 잔기 143~216 을 인식하는 모노클로날 항체를 제작해, 당해 모노클로날 항체를 사용하는 암 진단용 키트를 개발하는 것에 성공하였다. 이에 따라, 본 발명이 완성되었다.

즉, 본 발명은 이하와 같다:

(1) 천연 SLC6A6 를 인식하는 모노클로날 항체.

(2) SLC6A6의 세포외 도메인의 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체.

(3) 세포외 도메인의 폴리펩티드가 이하의 (a) ~ (c) 에서 선택되는 것 중 적어도 1개로 나타내는, (2) 에 기재된 모노클로날 항체:

(a) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;

(b) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결손 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지고, SLC6A6 의 세포외 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드; 및

(c) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열에 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, SLC6A6 의 세포외 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드.

(4) 수탁 번호가 FERM BP-11413 또는 FERM BP-11414 인 하이브리도마에 의해 생산되는, SLC6A6 에 대한 모노클로날 항체.

(5) 상기 (4) 에 기재된 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프에 결합하는, SLC6A6 에 대한 모노클로날 항체.

(6) 상기 (1) ~ (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체를 생산하는 세포주.

(7) 수탁 번호가 FERM BP-11413 또는 FERM BP-11414 인, SLC6A6 에 대한 항체를 생산하는 세포주.

(8) 상기 (1) ~ (5) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체를 포함하는, SLC6A6 검출용 시약.

(9) 상기 (1) ~ (5) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체를 포함하는, 암의 검출 또는 진단용 키트.

(10) 상기 (1) ~ (5) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체, 상기 (8) 에 기재된 시약 또는 상기 (9) 에 기재된 키트를 이용해, 암을 검출하는 방법.

(11) 생체 시료를 상기 항체 또는 상기 시약 또는 키트 안의 항체와 접촉 시키는 단계를 포함하는, (10) 에 기재된 방법.

(12) 상기 생체 시료가 분편인, (11) 에 기재된 방법.

(13) 상기 암이 대장직장암인, (10) 에 기재된 방법.

본 발명의 모노클로날 항체를 이용하면, SLC6A6 를 유의하게 높게 발현하는 암세포를 여러가지 수단에 의해 높은 감도로 검출할 수 있다. 특히, 대장직장암의 진단에 있어서, SLC6A6 의 발현을 지표로서 이용하여, 분편 등의 생체 유래 시료에 포함되는 살아 있는 암세포를 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다. 또한, 그러한 항체를 계속 제조할 수 있기 때문에, 조기에 대장직장암을 발견하기 위한 검사 키트의 보급을 가능하게 한다. 그리고, 당해 키트를 이용함으로써, 의료 검진 등에 있어서의 암환자의 고정밀도 스크리닝, 암의 조기 발견, 암의 진행 정도의 확인, 치료시의 치료 효과 모니터링, 전이/재발의 예견 등에 유용한 정보를 얻을 수 있고, 따라서, 암에 의한 사망률을 저하시킬 수 있다.

도면의 간단한 설명
도 1 은, SLC6A6 단백질의 세포외 도메인에 대응하는 염기 서열을 프로브로서 사용하여, 제자리 하이브리드화에 의해 조직을 염색한 사진이다.
도 2 는, SLC6A6 단백질의 발현을 웨스턴블롯팅에 의해 분석한 결과이다.
도 3 은, SLC6A6 발현 세포를 이식한 마우스의 항혈청 중의 역가를 ELISA 에 의해 분석한 결과이다.
도 4 는, 4B9b 항체 및 5H12d 항체의 역가를 ELISA 에 의해 분석한 결과이다.
도 5 는, 암세포 추출액에 대한 각종 항체의 반응성을 분석한 결과를 나타내는 도면이다:
A: 암세포 추출액에 대한 5H12d 항체의 반응성의 분석 결과;
B: 암세포 추출액에 대한 4B9b 항체의 반응성의 분석 결과;
C: 암세포 추출액에 대한 폴리클로날 항체의 반응성의 분석 결과.
도 6 은, 3 종류의 암세포를, 4B9b 항체 및 5H12d 항체로 염색한 사진이다.
도 7 은, 4B9b 항체 및 5H12d 항체를 이용해, 대장직장암 조직의 면역 염색을 실시한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은, 이하의 형태로 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 요지의 범위 내에서 적절히 변형해 실시할 수 있다.

본 발명은, SLC6A6 (용질 담체 패밀리 6 (신경전달물질 수송체, 타우린), 멤버 6) 으로 불리는 분자 또는 이의 세포외 도메인을 인식하는 모노클로날 항체이며, 이 항체는, 특히 대장직장암을 검출하기 위해서 사용할 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체를 수득하려면, 면역원으로서 본래의 입체 구조를 갖는, 인간 SLC6A6 의 전체 길이 단백질, 또는 이의 세포외 도메인인 아미노산 잔기 143~216 (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 7 로 나타내는 염기 서열로 인코딩됨) 를 포함한 부분 단백질 (이하, 총칭해 "단백질" 로 지칭함) 을 사용한다. 본래의 입체 구조를 갖는 형태로 수득하기 위해서, 바람직하게는, 전체 길이의 단백질을 세포막에 발현하는 세포를 조제한다.

일반적으로는, 항체를 제작하려면 항원에 아쥬반트 등을 혼합한 것을 투여해 동물을 면역화하는 반면, 본 발명에서는, 면역 효율을 높이기 위해서 전이성 암세포를 동물 내에 이식해 동물을 면역화한다. 즉, 목적 항원으로서 인간 SLC6A6 를 발현하는 전이성 암세포를 비인간 실험동물에게 이식하고 인그래프트하여 목적 항원에 의해 상기 실험동물을 면역화한다. 전이성 암세포란, 실험동물에게 이식했을 경우에 원격 전이를 볼 수 있는 암세포이며, 예를 들어, 골, 폐, 림프절, 피부, 간장, 흉막, 뇌, 유방, 유선, 방광, 대장, 또는 결장으로부터 수립된 전이성을 갖는 암세포 등을 들 수 있다. 또한, 전이성 암세포를 직접 면역에 사용함으로써, 기능적인 입체 구조 및 번역 후 변형을 유지 한 채로 항원을 면역화하는 것이 가능하다. 따라서, 지금까지 취득이 곤란한 단백질에 대한 항체를 유도할 수 있다. 본 발명에서는 암세포가 항원을 발현하는 역할을 담당하고 있어 본래의 입체 구조 (생체 환경에서 갖는 구조를 의미함) 를 갖는 항원에 대한 항체를 얻을 수 있다. 따라서, 단리된 단백질을 입체적으로 재구축 시키는 등의 처리를 행할 필요가 없고, 항원에 대해 충분한 중화 능력을 가지는 항체를 유도할 수 있다.

세포는, 실험동물에게 이식했을 경우에 원격 전이로 발전되는 전이성을 갖는 세포를 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 인간의 유방암으로부터 수립된 MCF7 유래의 MCF7-14 (국제 공개 제 WO2008/093886호, 수탁 번호: FERM BP-10944) 를 사용한다. 전이성이 세포에 본래 갖춰진 것 외에도, 당업자가 고려하는 수단에 의해, 후천적이나 인위적으로 전이성을 가지도록 조제한 세포를 사용할 수 있다.

세포에서 항원의 발현은, 당업계 익히 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 항원 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터를 구축해, 수득된 발현 벡터를 세포에 도입하는 것으로, 세포에서 목적 항원 단백질을 발현시킬 수 있다.

상기와 같은 면역원을, 마우스 및 래트 등의 실험동물에게 투여한다. 바람직하게는, BALB/c-nu/nu 와 같은 BALB/c 계통이나 C57BL/6 또는 ICR 계통의 면역 부전 마우스를 사용한다.

면역원의 투여 방법은, 면역원이 장기간 실험동물의 체내에 머물어, 면역 반응이 일으켜지는 수단에 의해 실시한다. 예를 들어, 단백질-발현된 세포를 사용한 경우에는, 그 세포를 실험동물에게 이식한다. 세포를 이식하는 부위에 대해서는, 이식한 세포가 인그래프트되기 쉬운 기관이나 조직이 선택될 수 있다. MCF7-14 를 사용한 경우에는, 당해 세포가 유래하는 MCF7 의 1차 병변에 속하는 유선이나, 유방암의 전이가 빈번히 발생하는 림프절, 간장, 폐, 골, 뇌 등의 부위, 림프절의 근방의 조직, 지방조직 등이 바람직하다. 이 경우, 이식한 세포가 인그래프트되기 쉽게, Matrigel (Becton, Dickinson and Company) 등의 베이스 재료를 이용하는 것이 바람직하다.

면역원을 투여한 후, 실험동물을 사육해, 혈액 중의 항체 값의 상승이나 비장의 증대 등을 지표로서 이용하여, 면역이 진행한 것을 확인한다. 혈액 중의 항체의 분석 방법으로서는, ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 를 이용하는 것이 바람직하다.

면역 후, 당업계에 익히 공지된 방법에 따라, 모노클로날 항체를 취득한다. 예를 들어, 면역화된 실험동물의 비장이나 림프절 등에서 항체 생산 세포를 채취해, 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 만든다. 목적하는 특이성 및 친화성을 가진 항체를 생산하고 있는 클론을 선별하고 배양해, 상청액 안의 항체를 정제한다. 이 외에도, 마우스의 복강 내에 하이브리도마 세포를 투여해, 마우스의 복수를 출발 재료로서 사용하여 항체를 정제할 수 있다.

하이브리도마 세포를 제작하지 않는 방법에 의해, 항체를 취득하는 일도 가능하다. 예를 들어, 비장이나 림프절 등에서 채취한 항체 생산 세포에, 유전자 (테로머라제, SV40 라지 T 항원, HPV 의 E6 또는 E7, 아데노바이러스의 E1A, hTERT, bmi-1, c-myc) 를 도입하거나, 바이러스 (Epstein-Barr 바이러스 (EBV), 인유두종바이러스 (HPV), SV40) 를 감염시키는 것 등을 실시하는 것으로 항체 생산 세포를 불사멸화시켜, 상기 서술한 방법과 마찬가지로 클론을 선별하고 항체를 정제한다. 대안적으로는, 면역화한 동물의 비장이나 림프절로부터, 단백질을 인식하는 H 사슬, L 사슬 등의 항체 유전자를 클로닝해, 유전자가 목적 항체-유사 분자를 인코딩하도록 유전자를 재조합 처리하여, 동물세포나 바이러스, 효모, 박테리아 등의 숙주에서 발현시켜, 선별을 거치는 것으로, SLC6A6 의 세포외 도메인에 결합하는 항체 및 항체-유사 분자를 제작할 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 생산하는 세포주도 제공한다.

한편, 면역화한 실험동물의 비장이나 림프절 등에서 채취한 항체 생산 세포 또는 제조된 하이브리도마 세포로부터, 항체 유전자를 추출해, SLC6A6 의 세포외 도메인에 특이적인 항체-유사 분자를 제작할 수 있다. 구체적으로는, 상기 서술한 방법과 마찬가지로, 항체 유전자를 단리하고, 공지된 기술에 의해 적절히 유전자를 재조합하고, 다른 세포에 도입해 발현시킨다.

본 발명에 있어서는, 여러 가지의 유전자 공학적 및 단백질 공학적인 수법에 의해, 모노클로날 항체의 일부인 항체 단편, 저분자화 항체, 유전자 재조합 항체, 항체-유사 분자, 예컨대 변형된 항체를 제작할 수 있다. 구체적으로는, H 사슬, L 사슬, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, sdFv, sc(Fv)2, (scFv)2, DiAbody, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중 특이성 항체와 같은 다중 특이성 항체, 표지 항체 등을 예로 들 수 있다. 각 경우, SLC6A6 의 세포외 도메인에 대한 결합능을 가지고 있는 분자이면, 본 발명의 모노클로날 항체에 포함된다.

본 발명의 모노클로날 항체는, 천연 SLC6A6 를 인식할 수 있다. 단어 "천연" 이란, 그 단백질이 생체 내의 환경에서 갖는 입체 구조 상태에 있는 것을 말한다.

또한, 본 발명의 모노클로날 항체는, SLC6A6 의 세포외 도메인을 인식할 수 있다. 특히, 상기 모노클로날 항체는 세포외 도메인으로서 SLC6A6 의 아미노산 잔기 143~216 의 영역 (SEQ ID NO: 8) 을 인식할 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체는, SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 결합 활성이 유지되는 범위, 즉 결합 대상의 폴리펩티드가 SLC6A6 의 세포외 도메인으로서의 기능을 갖는 한, SEQ ID NO: 8 에 기재된 아미노산 서열의 1개 또는 몇 개 (예를 들어 2~20개, 바람직하게는 2~10개, 보다 바람직하게는 2, 3, 4 또는 5개) 의 아미노산이 치환, 결손 또는 삽입된 돌연변이형 폴리펩티드, SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열에 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한, 본 발명의 모노클로날 항체는, SLC6A6 의 세포외 도메인으로서의 기능을 갖는 폴리펩티드로서, SEQ ID NO: 7 에 기재된 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드; SEQ ID NO: 7 에 기재된 염기 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드; SEQ ID NO: 7 에 기재된 염기 서열에 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 돌연변이형 폴리펩티드; 또는 SEQ ID NO: 7 에 기재된 염기 서열과 고도의 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 염기 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 돌연변이형 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체일 수 있다. 여기서, 하이브리드화는, 공지된 방법 (예를 들어, Molecular Cloning 2nd Ed (Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)) 에 따라 실시할 수 있다. 고도의 엄격한 조건이란, 이른바 특이적 하이브리드 (hybrid) 가 형성되며 비특이적 하이브리드 (hybrid) 는 형성되지 않는 조건을 말하며, 예를 들어, 나트륨 농도가 10 mM~300 mM, 바람직하게는 20 mM~100 mM 이며, 온도가 25℃~70℃, 바람직하게는 42℃~55℃ 인 조건을 말한다.

SLC6A6 의 세포외 도메인은, 타우린과의 결합 및 타우린의 세포 내부로의 수송을 담당하는 것으로 추측된다. 돌연변이형 폴리펩티드가 SLC6A6 의 세포외 도메인으로서의 기능을 갖는지 여부는, 동물세포 등에서 돌연변이형 폴리펩티드를 강제 발현시켜, 타우린의 흡수를 활성화 방법 (문헌 [J.Membr.Biol Vol.76, 1-15, 1983] 에 기재된 방법) 으로 분석함으로써 확인할 수 있는 것으로 여겨진다.

대안적으로는, 본 발명의 모노클로날 항체는 SLC6A6 에 결합하기 때문에, 상기 돌연변이형 폴리펩티드에 본 발명의 모노클로날 항체가 결합할 수 있는 경우, SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 항체의 결합 활성이 유지됨을 나타내며, 즉, SLC6A6 의 세포외 도메인으로서의 기능을 갖는 폴리펩티드에 포함된다.

돌연변이형 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드와 본 발명의 모노클로날 항체와의 결합은, ELISA, 면역 침강, 웨스턴블롯팅 등에 의해 확인할 수 있다.

또한, SLC6A6 의 세포외 도메인은, 암세포에 있어서 발현이 상승하는 마커 단백질의 세포 표면 부위이다. 돌연변이형 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드가 SLC6A6 의 세포외 도메인으로서의 기능을 갖는지 여부는, 정상세포와 암세포에 있어서의 상기 폴리펩티드의 발현을, 면역 염색, ELISA, 면역 침강, 웨스턴블롯팅 등으로 비교함으로써 확인할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체가 천연 SLC6A6 를 인식하는 것도, 상기 방법을 이용함으로써 확인할 수 있으나, 생체내에 있어서의 입체 구조를 갖는 SLC6A6 와 본 발명의 모노클로날 항체와의 결합을 검출할 수 있는 방법이면, 상기 방법으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 모노클로날 항체는, SLC6A6 에 대해, 종래의 항체보다 높은 친화성을 갖는다.

종래의 항체는, 세포외 도메인을 인식하지 않고, 따라서, 생세포에 결합할 수 없는, 검출 시그널이 매우 약한, 균질인 항체를 안정적으로 생산할 수 없는 등의 이용하기 어려운 점이 있었다. 반면, 본 발명의 모노클로날 항체는, 종래의 항체와 달리 세포외 도메인을 인지하고, 종래의 항체보다 높은 친화성을 갖는 세포외 도메인을 갖는다. 따라서, 본 발명의 항체는 암세포 표면에 존재하는 SLC6A6 를 보다 높은 감도로 검출할 수 있고, 시료 중에 미량으로 포함되는 세포를 파악할 수 있다. 결과적으로, 암을 조기에 발견하는 것이 가능하다 (도 5 참조).

본 발명의 모노클로날 항체는, slc6a6 의 mRNA 변이체에 의해 인코딩되는 단백질도 인식한다 (도 5 참조). 전체 길이의 SLC6A6 뿐만 아니라, 일부를 결손한 돌연변이체에도 결합할 수 있으며, 따라서, 종래의 항체와 비교해, SLC6A6 를 발현하는 암세포를 광범위하게 검출하는 것이 가능하다.

본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 세포주 (하이브리도마) 로서, "4B9b" 및 "5H12d" 가 있다. 둘 모두, Bio Matrix Research, Inc. (105, Higashifukai, Nagareyama-shi Chiba, 270-0101) 가, 2010년 7월 21 일자로, 'International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology' (Chuo 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566) 에 부다페스트 조약 하에 기탁했다. 그 수탁 번호는, "4B9b" 에 대해서는 "FERM BP-11413" 이며, "5H12d" 에 대해서는 "FERM BP-11414" 이다 (원기탁일: 2010년 7월 21일). 본 발명은, 본 하이브리도마 및 이들이 생산하는 항체를 제공한다. 본 하이브리도마를 배양 함으로써, 균질인 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.

이들의 특징을 갖는 본 발명의 모노클로날 항체는, 통상적인 모노클로날 항체의 제조법과는 상이한, 상기 서술한 바와 같은 단백질을 발현하는 세포를 인그래프트하는 면역법을 이용해, 효율적으로 수득될 수 있다. SLC6A6 와 같은 막 단백질, 특히 복수회 막관통형의 단백질에 대한 항체는, 당업자에 있어서 일반적으로 실시되고 있는 제법에서는 하기 이유로 인해 제작이 곤란하다:

(1) 항원으로서 막 단백질을 조제할 때에, 계면활성제를 사용하면 막 단백질의 입체 구조가 무너지는 한편, 계면활성제를 사용하지 않는 경우에는 막 단백질이 소수성 영역끼리 응집하며;

(2) 세포 표면의 발현 수준이 낮거나, 또는 세포외 도메인이 작기 때문에, 결과적으로, 면역 반응이 일어나지 않음.

본 발명자들에 의한 항체의 제법 (특히 면역 방법) 으로 연구를 실시하였으며, 결과적으로, 본 발명의 모노클로날 항체는 종래의 항체에 대해 우수한 특징을 획득한 것이다.

본 발명의 모노클로날 항체는, 이하의 특징을 갖는다:

본 발명의 항체는, SLC6A6 가 본래 갖는 입체 구조를 기초로 제작되었기 때문에, 천연 SLC6A6 를 인식할 수 있다. 따라서, 같은 에피토프를 인식하는 종래의 항체 (HPA015028) 와 비교해 검출 감도가 매우 높고, 종래의 항체에서는 검출이 곤란함 미량의 SLC6A6 를 충분히 검출할 수 있다. 또한, SLC6A6 의 막 내 및 세포 내의 영역을 인식하는 종래의 모노클로날 항체 (sc-166640) 에 비해, 본 발명의 항체의 인식 부위는 세포외 부위이고, 따라서, 생세포에 결합할 수 있고, 간편한 전처리 후 시료 중의 암세포를 검출하는 것이 가능하다. 게다가, 본 발명의 항체는, 면역 염색, 웨스턴블롯팅, ELISA 등 여러가지 검출 방법에 있어서, 정성적 및/또는 정량적으로 SLC6A6 또는 암세포를 검출할 수 있어 세포나 조직 등에 있어서는, 발현하는 부위를 명료하게 구별할 수 있다. 또한, 종래의 항체는 폴리클로날 항체이며, 균질인 항체를 계속 적으로 생산하는 것이 곤란했지만, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이고, 따라서, 항체를 양호한 재생력으로 대량 생산하는 것이 가능하다. 이들의 특징으로부터, 본 발명의 항체는 암의 검출에 유용하고, 검사 키트 등의 형태로 진단에 이용함으로써, 암의 조기 발견을 실현할 수 있다.

또한, 본 발명은, 수탁 번호가 FERM BP-11413 또는 FERM BP-11414 인 하이브리도마에 의해 생산되는, SLC6A6 에 대한 모노클로날 항체 그 자체에 한정되지 않고, 이들의 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프에 결합하는 생성물은 본 발명의 SLC6A6 에 대한 모노클로날 항체에 포함된다. 여기서 말하는 "에피토프" 란, 상기 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프 (이는 SLC6A6 의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 143~216 또는 이들 영역의 일부일 수 있음) 를 지칭한다.

본 발명의 모노클로날 항체를 이용하면, 종래의 항체와는 달리, 시료 중의 세포의 형태나 성질을 변경하지 않으면서, 생세포나 현탁액에 부유한 세포에 있어서, SLC6A6 의 발현을 검출하는 것이 가능하다.

단백질의 검출에 있어서, 막관통 영역 또는 세포내 영역을 인식하는 항체를 사용하는 경우에는, 포르말린이나 메탄올 등에 의해, 조직 절편이나 세포 등의 시료를 고정화하고, 계면활성제로 세포막의 투과 처리를 실시하는 것이 일반적이다. 그러나, 이와 같은 처리에서는, 단백질은 변성되고 본래의 입체 구조가 무너지기 때문에, 검출 감도가 저하한다. 또한, 항원의 활성화나, 고정화 조건의 엄밀한 컨트롤에 의한 검출 감도의 향상이 필요하게 되어, 항체의 염색 조건이 제한되어 버린다. 반면, 본 발명의 항체는, 종래의 항체와 마찬가지로 고정화한 조직 절편이나 세포막을 파괴한 시료에 있어서도 SLC6A6 를 검출할 수 있고, 그러한 처리를 하지 않는 세포막 상에 있는 SLC6A6 도, 높은 감도로 검출할 수 있다. 따라서, 항체를 적용할 수 있는 검출 수단의 범위가 넓다.

본 발명의 모노클로날 항체는, SLC6A6 를 발현하지만 세포의 검출에 사용할 수 있다. 본 발명은, 본 발명의 모노클로날 항체를 사용하여 암을 검출하는 방법, 본 발명의 모노클로날 항체를 포함한 SLC6A6 검출용 시약, 및 본 발명의 모노클로날 항체를 포함하는 암의 검출 또는 진단용 키트를 제공한다. 표적 암은, 정상 조직과 비교해 종양 세포에 있어서 SCL6A6 가 유의하게 높게 발현하는 임의의 암일 수 있으며, 대장직장암, 위암, 방광암, 신장암, 자궁암, 유방암이 적합하다.

본 발명의 검출 방법에 있어서 피검대상이 되는 시료는, 검사 대상의 암과 밀접하게 관계가 있는 생체 시료이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 대장직장암, 위암을 검사하는 경우, 암조직, 체액, 배설물 등을 이용할 수 있으며, 분편이 특히 바람직하다. 방광암, 신장암의 경우에는 암조직이나 뇨 등을 이용할 수 있으며, 자궁암이나 유방암의 경우에는 생리 용품이나 모유 등도 이용 가능하다. 어느 생체 재료도 적절한 전처리를 실시하여 적합화시킬 수 있다.

분편을 시료로 하는 경우, 특허 문헌 1 에 기재된 방법으로 조제하는 것이 바람직하다. 본 방법은, 분편으로부터 암세포를 효율적으로 회수할 수 있는 방법이다. 구체적으로는, 스토마커 백에 분편과 버퍼를 넣어 분편 현탁액을 제작한다. 이 현탁액을, 다단식 필터 장치로 여과해, 최종 필터의 구경을 10 ㎛ 이하로 하여, 세포를 최종 필터 상에 포획한다. 그 중에서, Ber-EP4 항체 결합 자기 비즈 (Dynabeads Epithelial Enrich, Dynal) 를 이용해 세포를 회수한다. 이 외에도, Percoll 원심분리법 (일본 공표특허공보 평 H11-511982호) 을 포함하는, 당업자가 통상 이용하고 있는 세포의 효율적인 회수 방법을 이용하면 된다.

대장직장암을 비롯한 여러가지 암에 있어서, 체액을 이용해 조기에 발견할 수 있는 종양 마커는 아직 확립되어 있지 않다. 일반적인 마커는, 심지어 암이 진행된 경우에도 거짓 음성을 나타낸 경우가 있다. 반면, 본 발명의 항체를 이용하면, 암이 진행하기 전에, 체액이나 배설물에 포함되는, 마커로서의 SLC6A6 를 발현하는 미량인 세포를 검출 및/또는 측정할 수 있다.

본 발명의 검출 방법은, 본 발명의 모노클로날 항체를 사용하는 것이며, 생체 시료와 본 발명의 모노클로날 항체 (하이브리도마로부터 생산된 항체, 또는 본 발명의 시약 또는 키트 안에 포함되는 항체) 를 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한, "접촉" 이란 용어는, 본 발명의 항체와 피험대상인 생체 시료 (필요에 따라 적절한 전처리를 한 것) 가 반응하는 조건하에 두는 것을 의미하고, 반응용 웰에 항체와 생체 시료를 혼합하는 것, 피검시료인 조직이나 세포에 항체를 첨가하는 것, 피검시료 또는 항체 중 어느 하나를, 다른 하나를 흡착시킨 멤브레인에 첨가하는 것, 피검시료 또는 항체 중 어느 하나를, 다른 하나를 고정시킨 수지와 같은 담체에 첨가하는 것 모두 "접촉" 에 포함된다.

또한, 검출 기술로서, 항원 항체 반응의 특이성을 이용해 SLC6A6 를 측정 또는 검출하는 임의의 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소 면역 측정법 (EIA), 형광 면역 측정법 (FIA), 방사 면역 측정법 (RIA), 화학 발광 면역 측정법 (CIA), 면역비탁법, 면역비법, 라텍스 응집법, 라텍스비탁법, 적혈구 응집 반응, 입자 응집 반응, 웨스턴블롯팅, 면역 염색, 면역 침강법, 면역크로마토법, ELISA 등을 이용할 수 있다.

이와 같은 검출에 사용하는 디바이스로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 마이크로 웰 플레이트, 어레이, 칩, 플로우 사이토미터, 표면 플라즈몬 공명 장치, 면역크로마토그래피 스트립 등을 이용할 수 있다. 이와 같은 디바이스를 사용할 때, 발색량, 형광량, 발광량 등의 시그널을 검출의 지표로 하여, 암의 존재 유무, 암 진행 등의 관계를 나타낼 수 있다.

본 발명의 검출 방법을, 효소 면역 측정법이나 형광 면역 측정법에 의해 실시하는 경우에는, 예를 들어, 분편으로부터 회수했지만 세포를 포함한 세포나 환자보다 채취한 조직으로부터 제작한 절편 등, 상기 서술한 시료를 적절히 전처리 한 샘플을 마이크로 웰 플레이트나 슬라이드 글라스 등의 고상에 고정화해, 면역학적 반응을 실시한다. 대안적으로는, 튜브 내에서 세포 현탁액을 항체와 반응시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 모노클로날 항체를 비즈나 마이크로 웰 플레이트에 고정화해, 세포와 반응시키는 방법도 이용할 수 있다.

이 경우, 본 발명의 모노클로날 항체를 효소나 형광 물질로 표지함으로써 그 반응을 형광 시그널로서 직접 검출할 수 있다. 대안적으로는 본 발명의 모노클로날 항체에 결합하는 표지된 2차 항체를 사용하여 시그널을 간접적으로 검출할 수 있다. 표지 물질로서는, 퍼옥시다아제 (POD), 알칼리포스파타아제, β-갈락토시다아제, 비오틴-아비딘 복합체 등, 당업자가 통상 사용하는 물질을 이용할 수 있다. 또한, 검출 방법은, 경합법, 샌드위치법 또는 직접 흡착법 등, 어느 방법을 이용해도 된다. 또한, 반응 강도 및 반응시킨 샘플 중 전체 세포에서 항체와 결합한 세포의 비율을 측정해, 미리 설정한 기준치나 지표와 비교함으로써, 암에 걸린 가능성을 판정한다.

검출에 사용하는 항체는, 통상적인 모노클로날 항체일 수 있고, SLC6A6 의 세포외 도메인에 대한 결합능을 가지고 있는 분자이면, 파파인 처리에 의해 얻어지는 Fab, 또는 펩신 처리에 의해 얻어지는 F(ab')2 또는 F(ab') 등의, 항체 단편, 저분자화 항체, 유전자 재조합 항체, 변형된 항체와 같은 항체-유사 분자의 형태일 수 있다.

본 발명의 검출 방법에 따르면, 정상인으로부터 유래하는 시료와 암환자로부터 유래하는 시료를 구별할 수 있으며, 따라서, 특정의 시료에 있어서, 암에 걸린 가능성을 판정할 수 있다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 검출 방법을 이용해 암의 검출을 실시하기 위한, 본 발명의 항체를 포함하는 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트를 이용해, 피험자로부터 채취한 시료 중에 포함되는 SLC6A6 를 검출함으로써, 암에 걸렸는지 여부를 진단할 수 있다. 표적 암은, 정상 조직과 비교해 종양 세포에서 SLC6A6 가 유의하게 높게 발현하는 임의의 암일 수 있다. 이의 예로는 대장직장암, 위암, 방광암, 신장암, 자궁암, 유방암을 들 수 있으며, 특히 대장직장암이 적합하다.

본 발명의 키트를 구성하는 재료는, 본 발명의 모노클로날 항체를 포함하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 효소 면역 측정법에 의해 검출하는 경우에는, 본 발명의 모노클로날 항체외, 효소 및 기질, 각종 완충액, 반응액, 표준 물질등을 구비하면 된다. 시약은, 고정화된 상태, 수용액, 동결건조 상태로 제공되어 사용전에 적절한 상태로 조제된다.

본 발명의 키트를 사용함으로써, 의료 검진에서 암환자의 스크리닝, 암의 진행 정도의 확인, 치료시의 치료 효과 모니터링, 전이/재발의 예견 등에 유용한 정보가 수득된다.

실시예

실시예 1: SLC6A6 유전자의 발현 분석

새로운 암세포 특이적막 단백질을 동정하고, 진단 등에 사용하는 항체를 제작하는 목적으로, 새로운 막 단백질 마커의 동정을 실시했다. 5 종류의 대장직장암 배양 세포주 (HT29, HCT116, DLD1, LOVO, SW480) 에서 발현하고, 2 종류의 정상세포 (대장 내시경 검사를 받은 정상인 2명 유래의 정상 대장 박리 세포) 에서는 발현하지 않는 유전자를 DNA 마이크로어레이에 의해 동정했다.

180개 수득된 후보 유전자 중에서, 정량적 PCR법에 의해 5 증례의 암환부와 정상부가 2배 이상의 차이가 나는 유전자 25개를 선택하였다. 유전자 중에서, 제자리 하이브리드화 방법에 의해, 암부 특이적으로 전사가 보여지는 복수의 유전자를 동정했다. 이들 중, 도쿄 대학 시스템 생물 의학 연구실의 데이터베이스 (http://www.lsbm.org/) 에서 공개되고 있는 39 종류의 정상 조직 중 임의의 것에서 발현되지 않는 유전자를 조사하였고, 용질 담체 패밀리 6 (신경전달물질 수송체, 타우린, SLC6A6) 유전자를 동정했다.

SLC6A6 유전자의 암부 및 정상부에서의 발현을 확인하기 위해서, mRNA (NM_003043) 의 5461-5878 (418 bp) 에 위치하는 서열에 대한 프로브를 제작해, 제자리 하이브리드화 방법에 의해 조직을 분석했다.

대장직장암 조직의 파라핀 절편 (Genostaff Co. Ltd.) 을 자일렌 처리한 후, 에탄올 및 PBS 의 순서로 수화를 실시해, 파라포름알데히드로 15분간 고정했다. 7㎍/㎖ Protreinase K (Roche) 로 30분간 처리해, 4% 파라포름알데히드 용액으로 재고정했다. 0.25% 무수 초산 및 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) 으로 10분간 아세틸화하고, 에탄올로 탈수했다. 300 ng/㎖ 프로브 (Genostaff Co. Ltd.) 를 포함한 하이브리드화 반응액 (Genostaff Co.Ltd.) 과 60℃ 에서 16시간 반응시킨 후, 5× 세정액 (Genostaff Co.Ltd.) 으로 60℃ 에서 20분간, 50% 포름아미드/2× 세정액으로 60℃ 에서 20분간 세정하였다. RNaseA 로 37℃ 에서 30분간 처리했다.

2× 세정액, TBS-T 로 세정한 후, 0.5% 블로킹 반응액 (Roche) 및 20% 열처리 양혈청 (Sigma) 과 순차적으로 반응시켰다. AP-표지된 항-DIG 항체 (Roche) 와 2시간의 반응을 실시해, PBS로 세정하였다. 그 후, NBT/BCIP 용액 (Roche) 중에서 발색시켰다. Kernechtrot 용액 (Mutoh) 으로 대비 염색 후, 탈수 처리해, Malinol (Mutoh) 로 봉입하였다. 그 후, 현미경으로 관찰을 실시했다.

도 1 에 결과를 나타냈다. 도 1 에 나타내듯이, 대장직장암의 암부는, 정상부와 비교해 특이적으로 염색되었다.

실시예 2: 모노클로날 항체의 제작과 암세포의 검출

(1) 세포

MCF7-14 로서, 수탁 번호: FERM BP-10944 를 계대배양하여 수득된 세포주를 사용하였다. HT-29, SW480 및 LOVO는, 국립 암연구 센터동 병원에서 입수했다.

MCF7-14를, 10% (v/v) 혈청 (Hyclone 사제) 을 포함한 RPMI1640 배지 (Sigma 사제) 로 배양 및 계대를 실시하고, 나머지의 세포는 DMEM 배지 (Sigma 사제) 로 배양 및 계대를 실시했다. 각각 80% 콘플루언스를 넘지 않게 37℃, 5% CO₂ 하에서 48~72 시간 배양 및 계대를 실시했다.

(2) SLC6A6 유전자의 클로닝

MCF7-14 를 배양해, Qiagen 사의 RNeasy Mini 키트를 이용해, 총 RNA 를 추출했다. 추출한 총 RNA 2 ㎍ 으로부터, SuperScript III 역전사효소 (Invitrogen) 를 이용해, 50℃ 에서 1시간 동안 역전사 (RT) 반응으로 처리하여 cDNA 를 합성하고, 85℃ 에서 5분간의 가열에 의해, 반응을 정지시켰다. 수득된 cDNA 를 주형으로 하여, 이하의 프라이머를 이용해 PCR 반응을 수행하였다:

프라이머 서열

진행방향:

역방향:

PCR 반응은, 95℃ 에서 10분간의 프리인큐베이션을 수행하고, 다음으로 95℃ 에서 15초간의 변성, 및 60℃ 에서 1분간의 어닐링/신장의 사이클을 40 사이클 실시해, 유전자 단편을 증폭했다.

수득된 증폭 단편을, 프라이머 상에 배치한 제한 효소 (BamHI 및 XbaI) 를 이용해, pEF6 벡터 (Invitrogen 사제) 에 혼입시켰다. 증폭 단편을 DNA 시퀀싱에 의해 확인했는데, 데이터베이스와 같은 유전자 서열이 혼입되어 C-말단에 c-myc tag 서열이 부가되어 있는 것을 확인했다.

(3) SLC6A6 과잉 발현주의 제작

상기 (2) 로 제작한 플라스미드를, FUGENE6 (Roche Applied Science) 를 이용해 MCF7-14 세포에 도입했다. 당해 키트에 첨부된 자료에 기초하여 조작하였다.

Blasticidin S 히드로클로라이드가 10 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가한 실시예 2 (1) 에 기재된 배지로 세포를 배양해, 3~5일 마다 배지를 교환하고, 약제 내성을 가지는 세포를 선택했다. 수득된 내성주 중에서 SLC6A6 를 과잉 발현하고 있는 세포를 선택하기 위해, 배양한 MCF7-14 및 유전자 도입한 세포 각각을 80% 콘플루언스가 되도록 96 웰 플레이트에 심어 37℃ 에서 5% CO₂ 하에서 16시간 배양했다.

배양 상청액을 제거한 후, 10% (v/v) 중성 완충 포르말린 용액 (WAKO 사제) 을 100㎕ 첨가하고, 10분간 실온에서 반응시켰다. 포르말린 용액을 제거한 후, PBS (-) 로 3회 세정하고, 풍건시킴으로써 각각의 세포를 고정화한 플레이트를 제작했다.

항-c-myc 항체 (Santa Cruz 사제, 클론 9E10) 를 TBS-T (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween20, pH 7.4) 를 이용해 1 ㎍/㎖ 로 희석하고, 1차 항체로서 이를 고정화 플레이트에 1 웰 당 100㎕ 의 양으로 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 각 웰을 200㎕ 의 TBS-T 로 3회 세정했다.

2차 항체로서, 항마우스 IgG 폴리클로날 항체-HRP 표지 (BETHYL 사제) 를 TBS-T 로 5,000배 희석했다. 상기 항체의 희석액을 1 웰 당 100㎕ 의 부피로 첨가하고, 실온에서 30분 반응시켰다. 각 웰을 200㎕의 TBS-T로 3회 세정했다.

최종 농도 0.5 mg/㎖ 가 되도록, 오르토페닐렌디아민 (Sigma 사제) 을 50 mM의 탄산-시트르산 버퍼 (pH 5.0) 로 희석하고, 10,000 분의 1 의 부피의 35% (w/w) 수성 과산화수소 (WAKO 사제) 와 혼합하였다. 이 혼합물을 기질 용액으로서 각 웰에 100㎕ 의 부피로 첨가하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 25㎕의 3N 황산 (WAKO 사제) 을 거기에 첨가하는 것으로 반응을 정지시켰다. 492 nm 에서의 흡광도를 플레이트 리더 (SpectraMaxPure384, Molecular Devices 사제) 로 측정해, 시그널을 관찰해, MCF7-14보다 시그널의 높은 3 종류의 균주를 선택했다.

(4) 웨스턴블롯

상기 (3) 에서 수득된 3 종류의 세포를 10 cm 샬레에 90% 콘플루언스가 될 때까지 배양하고, PBS (-) (0.01 M 나트륨-포스페이트 버퍼, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4) 로 2회 세정했다. 세포에, 2×RIPA 버퍼 (0.1 M Tris, 0.3 M EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 2% (w/v) 나트륨 데옥시콜레이트, 0.2% (w/v) 나트륨 도데실 술페이트) 를 200㎕ 첨가하고 1분간 빙상에 방치하였다. 그 후, 스크레이퍼로 세포 용액을 회수했다. 초음파 파쇄기 (Branson 사제) 로 30초간 세포를 파쇄해, 추출액을 얻었다. 각각의 세포에 대해 추출액을 제작해, Bradford 방법에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 그 후, 같은 단백질 양이 되도록 조제해, SDS-PAGE 로 처리했다. 전기영동 후, 트랜스-블롯 SD 셀 (Bio-Rad 사제) 을 이용해 제조자가 권장하는 프로토콜에 따라 PVDF 멤브레인 (PIERCE 사제) 에 단백질을 전사했다. TBS-T 에서 5% (w/v) 가 되도록 용해한 스킴 밀크를 이용해, 실온에서 30분간 블로킹을 실시해, TBS-T로 2회 세정을 실시했다. c-myc 항체를 TBS-T 를 이용해 1 ㎍/㎖ 로 희석해, 실온에서 1시간 동안 멤브레인과 반응시켰다. TBS-T 로 3회 세정 후, 2차 항체로서 항마우스 IgG 폴리클로날 항체-HRP 표지 (BETHYL 사제) 를 TBS-T 로 10,000 배 희석했다. 멤브레인과 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, TBS-T 로 3회 세정했다. 멤브레인을 Immobilon (Millipore 사제) 에 담근 후, 랩핑하고, LAS-3000 (Fujifilm Corporation) 으로 시그널을 검출했다.

결과를 도 2 에 나타낸다.

도 2 는, SLC6A6 유전자를 도입한 세포 (1~3), 및 유전자를 도입하고 있지 않는 세포 (4) 에 관해서, 단백질 발현을 분석한 결과이다. 가장 발현이 현저한 클론 1 을 이하의 실험에 사용하였다.

(5) 세포의 이식

10 cm 샬레에 90% 콘플루언스가 될 때까지 배양한 세포를, 트립신 (GIBCO사제) 을 이용해 회수한 후, PBS (-) (0.01 M 나트륨-포스페이트 버퍼, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4) 로 2회 세정했다. 세정 후, 세포를 최종 농도가 8.6×10⁷ 세포/㎖ 가 되도록 Growth Factor Reduced Matrigel (Becton Dickinson 사제) 에서 현탁하고, 이식할 때까지 빙상에서 보존했다.

생리 식염수에 3.5% (w/v) 가 되도록 클로랄 히드레이트 (Sigma 사제) 을 용해하고, 3.5% 클로랄 히드레이트 생리 식염수 용액을 조제했다. 6~8주령의 누드 마우스 (BALB/cALcl-nu/nu 계통 (CLEA Japan, Inc. 사제)) 의 복강 내에 3.5% 클로랄 히드레이트 생리 식염수 용액을 0.2 ㎖ 투여해 마취했다. 각 마우스의 제 4 유선에, Matrigel 에 현탁한 세포를 1 유선 당 1×10⁶ 개의 양으로, 24G 의 주사바늘을 이용해 유선으로부터 초과하지 않게 이식했다. 1 마리의 마우스에 대해, 2개소의 이식이 되도록, 동체 좌우 양쪽의 제 4 유선에 각각 이식을 실시했다.

(6) 스크리닝용 SLC6A6 부분 단백질의 발현과 정제

실시예 2 의 (3) 에 기재된 pEF6 벡터에 도입한 SLC6A6 전체 길이 유전자로부터, 세포외 도메인인 아미노산 잔기 143~216 의 영역 (SEQ ID NO: 8) 을 pET32 벡터에 서브클로닝했다. 이하의 프라이머를 이용해 PCR를 행했다.

프라이머 서열

진행방향:

역방향:

PCR 반응은, 94℃ 에서 2분간의 프리인큐베이션을 수행한 후, 98℃ 에서 10초간의 변성, 58℃ 에서 30초간의 어닐링, 및 68℃ 에서 30초간의 신장의 사이클을 30 사이클 실시해, 유전자 단편을 증폭했다.

수득된 증폭 단편을, 프라이머 상에 배치한 제한 효소 (EcoRI 및 BamHI) 를 이용해, pET32 벡터 (Novagen 사제) 에 혼입시켰다.

증폭 단편의 염기 서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인했는데, 데이터베이스와 같은 세포외 도메인의 유전자 서열이 혼입되어 C-말단에 His tag 서열이 부가되고 있는 것을 확인했다.

이 벡터로 BL21 (DE3) (Invitrogen 사제) 를 형질전환하고, 1% (w/v) 의 글루코오스를 포함한 LB 배지 (1% (w/v) 트립톤 (Sigma 사제), 0.5% (w/v) 효모 추출물 (Sigma 사제), 0.5% (w/v) NaCl (Sigma 사제)) 로 배양했다. 배지의 탁도가 600 nm 에서 0.6 이 된 후, 1 mM IPTG (WAKO 사제) 를 첨가하고, 16시간 동안 배양을 실시했다. 세포를 원심분리에 의해 회수한 후, 초음파 파쇄를 실시해, SLC6A6 의 세포외 도메인을 포함한 분획을 불용성 단백질로서 얻었다.

약 10 mg의 샘플을 버퍼 A (1 M 염산 구아니딘 (Sigma 사제), 10 mM DTT (Sigma 사제), 10 mM EDTA (Sigma 사제)) 에 용해하고, 37℃ 에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 1L의 버퍼 B (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.4 mM 산화형 글루타티온 (Sigma 사제), pH 8.5) 에 천천히 첨가하고, 혼합물을 4℃ 에서 18시간 교반했다. 용해한 샘플을 Ni 세파로오스 칼럼 (GE 사제) 에 제공해, 버퍼 C (50 mM 인산 칼륨 완충액, 150 mM NaCl, 200 mM 이미다졸, pH 8.0) 으로 용출했다. 이미다졸을 포함하지 않는 버퍼 C 에 투석해, 정제한 SLC6A6 의 세포외 도메인 부분 단백질을 얻었다.

(7) 항혈청의 분석

100㎕ 의 상기 (6) 에서 수득된 재조합 단백질 (10㎍/㎖) 또는 100㎕ 의 PBS를, MaxiSorp 96-웰 플레이트 (Nunc 사제) 에 넣어 실온에서 1시간 동안 플레이트에 흡착시켰다. 흡착 후, 웰을 TBS-T (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween20, pH 7.4) 로 세정한 후, 5% 가 되도록 TBS-T 에 용해한 스킴 밀크 (GIBCO 사제) 를 넣어 30분 동안 실온에서 블로킹을 실시했다. 각 웰을 200㎕의 TBS-T로 3회 세정하였다. 그 후, 상기 (5) 로 이식한 마우스의 꼬리 정맥으로부터 회수한 혈장을 TBS-T 로 1/2000 배 희석하고, ELISA 플레이트의 1 웰 당 100㎕ 를 첨가하고, 실온으로 1시간 반응시켰다. 각 웰을 200㎕ 의 TBS-T 로 3회 세정했다.

2차 항체로서, 항마우스 IgG 폴리클로날 항체-HRP 표지 (BETHYL 사제) 를 TBS-T로 5,000 배 희석했다. 상기 항체의 희석액을 1 웰 당 100㎕ 의 부피로 첨가하고, 실온에서 30분 반응시켰다. 각 웰을 200㎕ 의 TBS-T 로 3회 세정했다.

최종 농도 0.5 mg/㎖ 가 되도록 오르토페닐렌디아민 (Sigma 사제) 을 50 mM 의 탄산-시트르산 버퍼 (pH 5.0) 로 희석해, 이 용액의 10,000 분의 1 부피의 35% (w/w) 수성 과산화수소 (WAKO 사제) 와 혼합하였다. 이 혼합액을 기질 용액으로서 각 웰에 100㎕ 첨가하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 25㎕의 3 N 황산 (WAKO 사제) 을 첨가하는 것으로 반응을 정지시켰다. 492 nm 에서의 흡광도를 플레이트 리더 (SpectraMaxPure384, Molecular Devices 사제) 로 측정해, 항체의 역가를 분석했다 (도 3).

(8) 세포 융합

상기 (7) 로 항혈청 중의 역가를 확인할 수 있는 마우스의 비장 유래의 임파구를, 50% (v/w) 폴리에틸렌 글리콜 4000 (Sigma 사제) 을 이용해, 종래 방법으로 마우스 골수종주 P3X63-Ag8 (ATCC 수탁 번호 CRL-1580) 와 융합시켰다.

융합한 세포를 HAT 배지 (Invitrogen 사제) 에 현탁하고, 각 웰 당 100㎕ 의 부피가 되도록 20매의 96-웰 플레이트에 살포했다. 배양 도중, 200㎕ 의 HAT 배지를 각 웰에 첨가하였다. 11~16일간 배양 후, 플레이트를 현미경 하에서 관찰하였고, 1 웰 당 1~6개의 콜로니가 형성되었다.

(9) 모노클로날 항체의 취득

이식 7개월 후, 비장 세포를 수집하고, 상기 (8) 에 기재된 방법으로 하이브리도마 세포를 제작했다. SLC6A6 를 인식하는 항체를 선택하기 위해서, 상기 (3) 및 (7) 에 기재된 방법을 이용해 클론의 선택을 실시했다. 1차 항체로서는, 세포의 배양 상청액을 이용하고, 2차 항체로서는, 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체-HRP 표지를 사용하였다.

결과를 도 4 에 나타낸다.

도 4 는, 수득된 클론을 상기 (7) 와 동일한 방법으로 분석한 결과이다. 이하의 분석에서는, 클론 4B9b 와 5H12d 의 2개의 하이브리도마 세포가 생산하는 항체를 이용하였다. 이하에서는, 각각의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항체를 4B9b 항체, 5H12d 항체로 지칭한다.

(10) 웨스턴블롯

4B9b 항체 및 5H12d 항체의 특성을 분석하기 위해서, 3 종류의 대장직장암 세포 (HT29, SW480, LOVO) 를 이용해, 상기 (4) 와 동일한 웨스턴블롯법에 따라 SLC6A6 의 검출을 실시했다. 비교하기 위한 대조군으로서, 폴리클로날 항체 HPA015028 (Atlas 사제) 를 사용하였다. 각 항체를 사용을 위해 정제하였다 (1㎍/㎖).

도 5 에 결과를 나타낸다. SLC6A6 의 전체 길이 단백질의 경우, (i) 의 부근에 밴드가 나타난다. HPA015028 (도 5C) 에 대해, SLC6A6 이 SW480 및 LOVO 에서 성공적으로 검출되었으나, SW480 는 약한 시그널을 나타냈고, LOVO 는 매우 약한 시그널을 나타냈다. HT29 에서는 SLC6A6 의 시그널을 검출할 수 없었다. 4B9b (도 5B) 및 5H12d 항체 (도 5A) 에 대해, 모든 유형의 대장직장암 세포에 있어서도 SLC6A6 가 성공적으로 검출되었으며, 폴리클로날 항체인 HPA015028 보다 현저하게 검출 감도가 높은 것으로 이해된다. 실제로, HPA015028 에서는 볼 수 없었던 HT29 의 시그널도 명료하게 검출할 수 있었다. 또한, HPA015028 와는 달리, C-말단측에서 결손을 갖는 분자량이 작은 변이체의 복수의 밴드 (주로 (ii) 의 부근) 도 관찰되고 있었다. 이로써, 폴리클로날 항체 HPA015028에서는 검출 감도가 낮지만, 본 발명의 모노클로날 항체는 높은 검출 감도를 갖는 것이 명확하게 나타났다.

(11) 면역 염색

4B9b 항체 및 5H12d 항체를 이용해 3 종류의 대장직장암 세포 (HT-29, SW480, LOVO) 의 면역 염색을 실시했다. 세포를 유리 위에 배양하고, 상기 (3) 에 기재된 방법으로 항체를 세포와 반응시켰다. 1차 항체로서는, 4B9b 및 5H12d 의 배양 상청액을 이용하였다. 2차 항체로서는, Alexa488-표지 항-마우스 IgG (Becton Dickinson 사제) 를 1/2500 희석한 것을 이용하였다. 형광 현미경에 의해 관찰을 실시했다 (도 6A~C). 도 6A~C는 위에서부터 아래 방향으로, 형광 시그널 (항체 특이적 반응), Hoechst33342 염색 (핵), merge (중첩) 및 가시광을 나타낸다.

도 6 의 결과로부터, 본 발명의 모노클로날 항체는, 암세포의 면역 염색에 있어서도 SLC6A6 를 인식하고, 따라서, 면역 염색에 의한 SLC6A6 또는 SLC6A6 를 갖는 암세포의 검출에 사용할 수 있는 것으로 나타났다.

(12) 조직 염색

4B9b 항체 및 5H12d 항체를 이용해 면역 염색을 실시했다. 인간 대장직장암 조직 (Biochain) 을 파라핀 고정 후, 슬라이스 절단하였다. 이를 자일렌을 이용해 탈파라핀 처리하고, 에탄올로 친수화했다. 0.3% (v/v) 과산화수소 용액으로 20분간 처리한 후, TBS-T 로 3회 세정하였다. 그 후, 가압 수증기 하에서 (120℃) 10분간 처리해, 항원 활성화를 실시했다. 3% (w/v) BSA를 포함한 PBS 로 처리한 후, 4B9b 항체 및 5H12d 항체 각각과 4℃ 에서 16시간 동안 반응시켰다. TBS-T 로 3회 세정한 후, 퍼옥시다아제-표지 항-마우스 2차 항체 (DAKO사제) 로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBS-T 로 3회 세정한 후, DAB 시약 (DAKO사제) 으로 5분간 발색시켰다. 증류수로 세척 후, Hematoxylin (WAKO 사제) 를 이용해 핵을 염색하였다. 유수 세정하고, 에탄올 및 자일렌의 순서로 처리해, 봉입했다.

도 7 은 2 증례에 대한 면역 염색의 결과 (도 7A~B), 및 암조직과 정상 조직에 대한 면역 염색의 결과 (도 7C) 를 나타낸다. 암부가 특이적으로 염색되고 있는 것으로 나타났다.

본원에 인용된 문헌, 공개 공보, 특허 및 기타 특허 문헌은 본원에 참조로서 포함되어 있다. 또한, 본원에 의해 우선권이 주장되는 일본 특허 출원 제 2010-195926 호 (2010년 9월 1일자로 출원) 의 청구범위, 명세서, 도면 및 요약은 본원에 그 전문이 참조로서 포함되어 있다.

산업상의 이용 가능성

본 발명에 의해, SLC6A6 의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, SLC6A6 를 발현하는 세포의 특이적 검출, 측정에 사용할 수 있다.

본 발명의 검출 방법은, SLC6A6의 발현 수준에 반영되는, 대장직장암을 포함한 각종암의 진단에 이용할 수 있다.

본 발명의 검출 방법 및 검사 키트를 이용해, 피험자로부터 채취된 생체 시료 중의 SLC6A6 를 검출 또는 정량화함으로써, 암에 걸린 것으로 의심되는 환자의 스크리닝, 암의 예측, 상태 및 경과의 판단을 실시하는 것이 가능하다.

서열목록 프리 텍스트

SEQ ID NO: 9: 합성 DNA

SEQ ID NO: 10: 합성 DNA

SEQ ID NO: 11: 합성 DNA

SEQ ID NO: 12: 합성 DNA

International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology FERMBP-11413 20100721 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology FERMBP-11414 20100721

SEQUENCE LISTING <110> Bio Matrix Research, Inc. National Cancer Center <120> Antibodies specific for marker of colorectal cancer <130> PCT11-0052 <150> JP2010-195926 <151> 2010-09-01 <160> 12 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 6516 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (296)..(2158) <400> 1 gagagctgcc tgctcagaca acagacacgc gaggtcagga agaagccgct tataaattac 60 cgcttccttc gcgccgccgc caacgccgag ccccgaggac cgcaagccca gaggacaagc 120 tgcgccaaga gggagtgcgg agcgttcacc cagcgggtca gagagcgagc gggcaggcag 180 cccccggccg gcggaacccg gcacagccga gcagagcgcg ggcggcgccg cagccacccc 240 agatccagaa ccagaaccac agcccttctg aggagctccc aaacaaagca aggag atg 298 Met 1 gcc acc aag gag aag ctg cag tgt ctg aaa gat ttc cac aag gac atc 346 Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp Ile 5 10 15 ctg aag ccc tca cca ggg aag agc cca ggc acg cgg cct gag gac gag 394 Leu Lys Pro Ser Pro Gly Lys Ser Pro Gly Thr Arg Pro Glu Asp Glu 20 25 30 gct gag gga aaa cct ccg cag agg gag aag tgg tct agc aag atc gac 442 Ala Glu Gly Lys Pro Pro Gln Arg 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tac aac tct cgc acc gtc atg aac ggc gct ctc gtg 2122 Gly Ala Thr Pro Tyr Asn Ser Arg Thr Val Met Asn Gly Ala Leu Val 595 600 605 aaa ccg acc cac atc att gtg gag acc atg atg tga gctctctcgg 2168 Lys Pro Thr His Ile Ile Val Glu Thr Met Met 610 615 620 gtcgacgggg ccggcggctt tcctgctgtt tactaacatt agattctcat aggaccaggt 2228 ttacagagct ttatatttgc actaggattt tttttttttt gtaattgtca cagaaaatgt 2288 aattgtgggt atgtgtgcgt gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt atcgtgtgtg tgtgttttgt 2348 tttgatttgg gggatatttt gtacaaaaag aaaacccacg ggaagatgtc cgtggagagg 2408 cagagctttc atactgaatt agatgtattt tatgggaatt tggtaaattt ttctttgtat 2468 tttttttttt acatataagt atatatacac ttagagattg tcatatactt ttaccacttg 2528 aattgatctt cttgccagca atagatctca ttttcaaaag caattcttcg gtgctgtgta 2588 gctggcagaa agttctgtcc agtaaacgca ggatggaatt ttcctgggac tctacaccca 2648 tcttaaggtg gtataccttc caaatcctgg ttcagatgga agaaatagca ggagagagga 2708 cccattagct ggcagaccca gggggaagaa aggagggctg tgaggagata cctcattaaa 2768 cttggcttag tgaagaagag agatgccaaa ggaatgaacc aacccttcac ataaaggaga 2828 ctggctgaag ctgaatgagg aggccctata gcagaagtct gattctaaga gcagtagaaa 2888 cttgtaccag aagcaaaatc ccacttttaa ttttgagatg gtgagtggat agtcagtaga 2948 ccgtcagaac cactggccag agagggagct gctagagatc caagaaggct ggcaggagtg 3008 aggctcacaa ctcagcctcg caagaggtgg cagaggcaca ggaggccaca gtccttcctg 3068 gggcattcca ggcagagaag gagcagaggc tctcccggca ggagctgggg tctcagggct 3128 cagatgagtc tgttgcattt gaatggggtc atagcaggtt ctggtcattc cccaagcaac 3188 atctcagcat ctcttaaagt tgcctgcagg aatgaagcat gacatacctg ttgagggact 3248 aggggagtgg tggggaggtg agtggaccaa aggatatagg ccccaggcat gcagatgggc 3308 ccggtgtcgg ggaggggtgc tttctttcct catctcccca ctccccactc tcagcctggg 3368 agactcctgc caagccctca ttaaagatgc caccctgggc tgccctggca cctagcaagg 3428 cacaccaaga acagcttttg agtctgtatc ctccactggg ggaagtgctc ccagttcaga 3488 acaagggcag cccgtggtgc tgacctagga tataacaaag ctcttcactt caaaacccct 3548 gcaatagctg ggtttacaga catttaccac ctgcggaccc aaaagagaag gcctaggaga 3608 gttttctaga aggttgggat tgtcagggtc 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cccaaggcac ctgtctccaa tcagagccct 4508 ctcgcccagc cagccctggc tctgtgtgca gagcatagct ctgcgagtac ctgtgtaata 4568 atgctcaacc ttcatgtctc cgtataaacg aaactttcca tgagagctca tgactctggt 4628 ccacctgtct atagagaatg ggcaaagtcc ttcacctgct ttctgcttgg gatgggtcag 4688 aaatgctgat gcccgcacat agcccagcca gccagatctg gaaaggaagc gagggggttg 4748 tttaaatcaa ttttttaaga tgaagaagtg ggagacactg cgttgagatg ggccatgcta 4808 gggccacaga gatttcctga cggtcaggga gagaagggcc tccagggtcc cctaacccaa 4868 cgcccttgtt gtaaatgagg taactgaggc tcagggaggc actgtgagcc aggaatggat 4928 tttcttgaaa cagctctagc tgcaggttct ccgaggtagg tgcagggaat ggtgagtgtc 4988 taaccagggc tacatccagc aacatcctca aggtcttcct gacaaccaaa gacaagcctt 5048 tatggaaaag gaaatgcgct cccctccatg ttcagggatg aggggagcag cagcagccac 5108 actcccacca tcctcacaga attcctggac ccatgcggtg gctccgtgag ctgggtgact 5168 ccagcctcac ctgcacaccc cagccctgca cggggccctc cttcctccca gcagcccttg 5228 gtgagctagg aattgagatc cctgtttgtg aaagagggaa ctgaggtgca gagaagccag 5288 aggtgtgcca gatccttagg caggatttag 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Pro Leu Thr Tyr Asn Lys Thr Tyr Val Tyr Pro Asn Trp Ala Ile Gly 530 535 540 Leu Gly Trp Ser Leu Ala Leu Ser Ser Met Leu Cys Val Pro Leu Val 545 550 555 560 Ile Val Ile Arg Leu Cys Gln Thr Glu Gly Pro Phe Leu Val Arg Val 565 570 575 Lys Tyr Leu Leu Thr Pro Arg Glu Pro Asn Arg Trp Ala Val Glu Arg 580 585 590 Glu Gly Ala Thr Pro Tyr Asn Ser Arg Thr Val Met Asn Gly Ala Leu 595 600 605 Val Lys Pro Thr His Ile Ile Val Glu Thr Met Met 610 615 620 <210> 3 <211> 1286 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (296)..(898) <400> 3 gagagctgcc tgctcagaca acagacacgc gaggtcagga agaagccgct tataaattac 60 cgcttccttc gcgccgccgc caacgccgag ccccgaggac cgcaagccca gaggacaagc 120 tgcgccaaga gggagtgcgg agcgttcacc cagcgggtca gagagcgagc gggcaggcag 180 cccccggccg gcggaacccg gcacagccga gcagagcgcg ggcggcgccg cagccacccc 240 agatccagaa ccagaaccac agcccttctg aggagctccc aaacaaagca aggag atg 298 Met 1 gcc acc aag gag aag ctg cag tgt ctg aaa gat ttc cac aag gac atc 346 Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp Ile 5 10 15 ctg aag ccc tca cca ggg aag agc cca ggc acg cgg cct gag gac gag 394 Leu Lys Pro Ser Pro Gly Lys Ser Pro Gly Thr Arg Pro Glu Asp Glu 20 25 30 gct gag gga aaa cct ccg cag agg gag aag tgg tct agc aag atc gac 442 Ala Glu Gly Lys Pro Pro Gln Arg Glu Lys Trp Ser Ser Lys Ile Asp 35 40 45 ttt gtg ctc tct gtg gct ggc ggc ttc gtg ggc ttg ggc aac gtc tgg 490 Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Gly Leu Gly Asn Val Trp 50 55 60 65 cgc ttc ccg tac ctc tgc tac aag aat ggt gga ggt gcg ttt ctc ata 538 Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu Ile 70 75 80 ccg tat ttt att ttc ctg ttt ggg agc ggc ctg cct gtg ttt ttc ttg 586 Pro Tyr Phe Ile Phe Leu Phe Gly Ser Gly Leu Pro Val Phe Phe Leu 85 90 95 gag atc atc ata ggc cag tac acc tct gaa ggg ggc atc acc tgc tgg 634 Glu Ile Ile Ile Gly Gln Tyr Thr Ser Glu Gly Gly Ile Thr Cys Trp 100 105 110 gaa aag atc tgc ccc ttg ttc tct ggt atc ggc tat gcc tcc gtt gta 682 Glu Lys Ile Cys Pro Leu Phe Ser Gly Ile Gly Tyr Ala Ser Val Val 115 120 125 att gtg tcc ctc ctg aat gtc tac tac atc gtc atc ctg gcc tgg gcc 730 Ile Val Ser Leu Leu Asn Val Tyr Tyr Ile Val Ile Leu Ala Trp Ala 130 135 140 145 aca tac tac ctg ttc cag tcc ttc cag aag gag ctg ccc tgg gca cac 778 Thr Tyr Tyr Leu Phe Gln Ser Phe Gln Lys Glu Leu Pro Trp Ala His 150 155 160 tgc aac cac agc tgg aac aca cct cac tgc atg gag gac acc atg cgc 826 Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro His Cys Met Glu Asp Thr Met Arg 165 170 175 aag aac aag agt gtc tgg atc acc atc agc tcc acc aac ttc acc tcc 874 Lys Asn Lys Ser Val Trp Ile Thr Ile Ser Ser Thr Asn Phe Thr Ser 180 185 190 cct gtc atc gag ttc tgg gag taa ggccacctca ttgaagcaag gaggaggaca 928 Pro Val Ile Glu Phe Trp Glu 195 200 tgggtggggc agagaggatg gcccacttcc ttatctcctc ccctgggata caggagccac 988 tgtcttcggg ggagtgggag gagggtgcag atctggagat aaatttatgc ctttggccat 1048 agacaggact ggaatcccag ttctgccact tactggctgt ttgaccttag gcaagccact 1108 cctcctttct gagcctcagt ttctttacct gtaagataaa aagaatgaat cattactacc 1168 ctgtgaggca ggtatgcata cttatgttgt ctaaaaatga tacagttttc ttaatgtatt 1228 ttaggaaaaa atatattctg ttattgcaca gagaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1286 <210> 4 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp 1 5 10 15 Ile Leu Lys Pro Ser Pro Gly Lys Ser Pro Gly Thr Arg Pro Glu Asp 20 25 30 Glu Ala Glu Gly Lys Pro Pro Gln Arg Glu Lys Trp Ser Ser Lys Ile 35 40 45 Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Gly Leu Gly Asn Val 50 55 60 Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu 65 70 75 80 Ile Pro Tyr Phe Ile Phe Leu Phe Gly Ser Gly Leu Pro Val Phe Phe 85 90 95 Leu Glu Ile Ile Ile Gly Gln Tyr Thr Ser Glu Gly Gly Ile Thr Cys 100 105 110 Trp Glu Lys Ile Cys Pro Leu Phe Ser Gly Ile Gly Tyr Ala Ser Val 115 120 125 Val Ile Val Ser Leu Leu Asn Val Tyr Tyr Ile Val Ile Leu Ala Trp 130 135 140 Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe Gln Ser Phe Gln Lys Glu Leu Pro Trp Ala 145 150 155 160 His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro His Cys Met Glu Asp 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gca cac tgc aac cac agc tgg aac aca cct cac tgc atg gag gac acc 828 Ala His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro His Cys Met Glu Asp Thr 160 165 170 175 atg cgc aag aac aag agt gtc tgg atc acc atc agc tcc acc aac ttc 876 Met Arg Lys Asn Lys Ser Val Trp Ile Thr Ile Ser Ser Thr Asn Phe 180 185 190 acc tcc cct gtc atc gag ttc tgg gag cgc aac gtg ctg agc ttg tcc 924 Thr Ser Pro Val Ile Glu Phe Trp Glu Arg Asn Val Leu Ser Leu Ser 195 200 205 cct gga atc gac cac cca ggc tct ctg aaa tgg gac ctc gct ctc tgc 972 Pro Gly Ile Asp His Pro Gly Ser Leu Lys Trp Asp Leu Ala Leu Cys 210 215 220 ctt ctt tta gtc tgg cta gtg tgt ttc ttc tgc atc tgg aag ggc gtc 1020 Leu Leu Leu Val Trp Leu Val Cys Phe Phe Cys Ile Trp Lys Gly Val 225 230 235 agg tcc act ggg aag gtc gtc tac ttc aca gcc act ttt cca ttc gcc 1068 Arg Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe Pro Phe Ala 240 245 250 255 atg ctc ctg gtg ctg ctg gtc cga ggg ctg acg ctg ccg ggc gcg ggc 1116 Met Leu Leu Val Leu Leu Val Arg Gly Leu Thr Leu Pro Gly Ala Gly 260 265 270 gca ggc atc aag ttc tat ctg tat cct gac atc acc cgc ctt gag gac 1164 Ala Gly Ile Lys Phe Tyr Leu Tyr Pro Asp Ile Thr Arg Leu Glu Asp 275 280 285 cca cag gtg tgg att gac gct ggg act cag ata ttc ttc tct tat gcc 1212 Pro Gln Val Trp Ile Asp Ala Gly Thr Gln Ile Phe Phe Ser Tyr Ala 290 295 300 atc tgc ctg ggg gct atg acc tcg ctg ggg agc tac aac aag tac aag 1260 Ile Cys Leu Gly Ala Met Thr Ser Leu Gly Ser Tyr Asn Lys Tyr Lys 305 310 315 tat aac tcg tac agg tcc tgg cct ggc ctt cat tgc cta ccc aaa agc 1308 Tyr Asn Ser Tyr Arg Ser Trp Pro Gly Leu His Cys Leu Pro Lys Ser 320 325 330 335 tgt gac aat gat gcc gct gcc cac att ttg gtc cat tct ttt ttt tat 1356 Cys Asp Asn Asp Ala Ala Ala His Ile Leu Val His Ser Phe Phe Tyr 340 345 350 tat gct tct ctt gct tgg act gga tag ccagtttgtt gaagttgaag 1403 Tyr Ala Ser Leu Ala Trp Thr Gly 355 gacagatcac atccttggtt gatctttacc catccttcct aaggaagggt tatcgtcggg 1463 aaatcttcat cgccttcgtg tgtagcatca gctacctgct ggggctgacg atggtgacgg 1523 agggtggcat 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tctttcctca tctccccact ccccactctc agcctgggag actcctgcca 3263 agccctcatt aaagatgcca ccctgggctg ccctggcacc tagcaaggca caccaagaac 3323 agcttttgag tctgtatcct ccactggggg aagtgctccc agttcagaac aagggcagcc 3383 cgtggtgctg acctaggata taacaaagct cttcacttca aaacccctgc aatagctggg 3443 tttacagaca tttaccacct gcggacccaa aagagaaggc ctaggagagt tttctagaag 3503 gttgggattg tcagggtcct ggcccctcag aactggcttg atcaagggcc ttatgtggag 3563 cagaggttgt ctctgaacca ggagagaagg tactatacct ttcaaatccc cagggcagac 3623 acacccccac ccagccccta tttggaccta aactgtgcca tttgaacagt cacttccaag 3683 ctcagtctaa atgaaaccga aacgtgacca cgcacaaagg cagtcactgc ctcgaggggt 3743 gcagaccgca gaattttcac agcaggggct cttggaaccc tggaaacccc cttcttaaat 3803 ttgggaggag gagtatgcct ttggtgtccc cctcccaagg ggcaattctg aaccccatct 3863 ttggcaggca tacatatttc actgtttcca aagctatcta ctctgccaaa caacacccag 3923 tcctattcca aactctcaac gattctatct tgttcctgtt tttctatgta tttatggttg 3983 ccgtttgtgt ctgatttgat tttactgttt tttccctgat tttatggagt agcattgtga 4043 cctgttttcc 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catcctcaag gtcttcctga caaccaaaga caagccttta tggaaaagga 4943 aatgcgctcc cctccatgtt cagggatgag gggagcagca gcagccacac tcccaccatc 5003 ctcacagaat tcctggaccc atgcggtggc tccgtgagct gggtgactcc agcctcacct 5063 gcacacccca gccctgcacg gggccctcct tcctcccagc agcccttggt gagctaggaa 5123 ttgagatccc tgtttgtgaa agagggaact gaggtgcaga gaagccagag gtgtgccaga 5183 tccttaggca ggatttagat gaagtcgccc tggctccaga ctgaccccga ggctctgcgg 5243 ggagtttcca ggcagcagga agtggccttg gatgctctcc ttccaggaca gcataacccc 5303 tgggccatgt gcagctcctt cactgccccc tggatcccca gcataccccc aaagacagtg 5363 gggaaacaca aggggagagc acagcatggc ccctccagcc cacttcaggg cactcttgta 5423 tcacccgggt accgccacac tggtccccca cccagccagc atctcccagc acagcccctc 5483 tccctgggga aatgctctgg gtagccagtc taaaggcaga ggcacctaac tgctccccgc 5543 agcccacccc acccaagatt cagacacaag ccaggaaagg acccaagaga aaatccttca 5603 aggtggcctg aggtcccatc cctccctcag acccatgtgg tcccaggcca ggctgcctgg 5663 gacacggtaa ataccactgt gtgcaaaaat cgaagtacaa aaccacaaga ctaaacaaaa 5723 caaacccaga gagccaaact tgtagaggtg ggcagtccag aaagcagggg gcagccctcc 5783 ccctttcctt ctctccctga tcctcagaat atatattgtt gtaataggaa gcatttttgc 5843 attgttctct tgtgggtgtc actacagaca tgttctggcg tgttctccga gggatggagc 5903 atcctgttat atatttgact tcaaattgag atgttggctt catttttttt ttttacccaa 5963 ttaatctccc aatccctagc aactgtgact ctgtatttag cacaagagaa agctgagaat 6023 gtgggtcttg cctccttcca gaaatatgtc tggctcatca ggacattttt ttaaaacttc 6083 aaaatatttt taagatattt taaactttta taaaaaaaaa atcaaccaac aagagacttt 6143 tctgaggagg aacatttgta tttgaacaag atccttggtg tgtagttcag tcttgcagta 6203 tacaagcttt tgtgtataaa tgttttatga tatgattccc tgtattttgc aggggttttt 6263 ttctcttttg ctttttagat aaatatgtat atcaatattt taaattcatc tttgcttttt 6323 ttagaggagt ttgtaatcac cttataacat gaaaataaac atttcctttt taacatcc 6381 <210> 6 <211> 359 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp 1 5 10 15 Ile Leu Lys Pro Ser Pro Gly Lys Ser Pro Gly Thr Arg Pro Glu Asp 20 25 30 Glu Ala Glu Gly Lys Pro Pro Gln Arg Glu Lys Trp Ser Ser Lys Ile 35 40 45 Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Gly Leu Gly Asn Val 50 55 60 Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu 65 70 75 80 Ile Pro Tyr Phe Ile Phe Leu Phe Gly Ser Gly Leu Pro Val Phe Phe 85 90 95 Leu Glu Ile Ile Ile Gly Gln Tyr Thr Ser Glu Gly Gly Ile Thr Cys 100 105 110 Trp Glu Lys Ile Cys Pro Leu Phe Ser Gly Ile Gly Tyr Ala Ser Val 115 120 125 Val Ile Val Ser Leu Leu Asn Val Tyr Tyr Ile Val Ile Leu Ala Trp 130 135 140 Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe Gln Ser Phe Gln Lys Glu Leu Pro Trp Ala 145 150 155 160 His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro His Cys Met Glu Asp Thr Met 165 170 175 Arg Lys Asn Lys Ser Val Trp Ile Thr Ile Ser Ser Thr Asn Phe Thr 180 185 190 Ser Pro Val Ile Glu Phe Trp Glu Arg Asn Val Leu Ser Leu Ser Pro 195 200 205 Gly Ile Asp His Pro Gly Ser Leu Lys Trp Asp Leu Ala Leu Cys Leu 210 215 220 Leu Leu Val Trp Leu Val Cys Phe Phe Cys Ile Trp Lys Gly Val Arg 225 230 235 240 Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe Pro Phe Ala Met 245 250 255 Leu Leu Val Leu Leu Val Arg Gly Leu Thr Leu Pro Gly Ala Gly Ala 260 265 270 Gly Ile Lys Phe Tyr Leu Tyr Pro Asp Ile Thr Arg Leu Glu Asp Pro 275 280 285 Gln Val Trp Ile Asp Ala Gly Thr Gln Ile Phe Phe Ser Tyr Ala Ile 290 295 300 Cys Leu Gly Ala Met Thr Ser Leu Gly Ser Tyr Asn Lys Tyr Lys Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Tyr Arg Ser Trp Pro Gly Leu His Cys Leu Pro Lys Ser Cys 325 330 335 Asp Asn Asp Ala Ala Ala His Ile Leu Val His Ser Phe Phe Tyr Tyr 340 345 350 Ala Ser Leu Ala Trp Thr Gly 355 <210> 7 <211> 222 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gcctgggcca catactacct gttccagtcc ttccagaagg agctgccctg ggcacactgc 60 aaccacagct ggaacacacc tcactgcatg gaggacacca tgcgcaagaa caagagtgtc 120 tggatcacca tcagctccac caacttcacc tcccctgtca tcgagttctg ggagcgcaac 180 gtgctgagct tgtcccctgg aatcgaccac ccaggctctc tg 222 <210> 8 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Trp Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe Gln Ser Phe Gln Lys Glu Leu Pro 1 5 10 15 Trp Ala His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro His Cys Met Glu Asp 20 25 30 Thr Met Arg Lys Asn Lys Ser Val Trp Ile Thr Ile Ser Ser Thr Asn 35 40 45 Phe Thr Ser Pro Val Ile Glu Phe Trp Glu Arg Asn Val Leu Ser Leu 50 55 60 Ser Pro Gly Ile Asp His Pro Gly Ser Leu 65 70 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 9 aaaggatcca tggccaccaa ggagaagctg c 31 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 10 aaatctagac atcatggtct ccacaatgat gtg 33 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 ataggatccg gcctgggcca catatcacct g 31 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 12 tatgaattcg ctttcagaga gcctgggtgg tc 32

Claims (13)

1. 천연 SLC6A6 를 인식하는 모노클로날 항체.
2. SLC6A6 의 세포외 도메인의 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체.
3. 제 2 항에 있어서, 세포외 도메인의 폴리펩티드가, 하기의 (a) ~ (c) 로부터 선택되는 것 중 적어도 하나로 나타내는 모노클로날 항체:
   (a) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
   (b) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결손 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지고, SLC6A6 의 세포외 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드; 및
   (c) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열에 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, SLC6A6 의 세포외 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드.
4. 수탁 번호가 FERM BP-11413 또는 FERM BP-11414 인 하이브리도마에 의해 생산되는, SLC6A6 에 대한 모노클로날 항체.
5. 제 4 항에 따른 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프에 결합하는, SLC6A6 에 대한 모노클로날 항체.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체를 생산하는 세포주.
7. 수탁 번호가 FERM BP-11413 또는 FERM BP-11414 인, SLC6A6 에 대한 항체를 생산하는 세포주.
8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체를 포함하는, SLC6A6 검출용 시약.
9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체를 포함하는, 암의 검출 또는 진단용 키트.
10. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체, 제 8 항에 따른 시약 또는 제 9 항에 따른 키트를 이용하여 암을 검출하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 생체 시료를 상기 항체 또는 상기 시약 또는 키트 안의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 생체 시료가 분편인 방법.
13. 제 10 항에 있어서, 암이 대장직장암인 방법.
    

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