CN103842504A - 上皮性卵巢癌标志物检测用抗体和上皮性卵巢癌判定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗体或其片段,其能够特异地识别和检测对上皮性卵巢癌特异性高的癌标志物。本发明提供上皮性卵巢癌判定用抗β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3抗体,将糖转移酶β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3作为上皮性卵巢癌标志物,所述抗体将该酶的由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的一部分作为表位来识别。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测上皮性卵巢癌标志物的抗β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3抗体、产生上述抗体的杂交瘤以及使用上述抗体的上皮性卵巢癌判定方法。
背景技术
卵巢癌与妇科癌中的乳癌、子宫癌相比是发生率低的癌,但是,近年其发生率、死亡率均有增加的倾向。通常由于卵巢癌基本没有发病初期阶段的主观症状,所以发现时大多其症状已经发展,因此,其预见性不良,成为妇科癌中死亡率最高的疾病。已知卵巢癌因发病部位不同,包括了由卵巢的表层上皮细胞产生的表层上皮性·间质性瘤(以下,称为“上皮性卵巢癌”)、由胚细胞产生的胚细胞瘤等。其中上皮性卵巢癌在全部卵巢癌中占约90%,特别是在40岁以后的中老年较为多见。因此,在早期阶段发现上皮性卵巢癌在该疾病的治疗上变得重要。
但是,由于卵巢是不与外界相接的脏器,不能像子宫那样不进行开腹或者穿孔即可通过内视镜进行检查或采取细胞。此外,上皮性卵巢癌如果不是在症状发展而卵巢出现肥大后,则通过触诊而发现其通常是困难的。因此,通常的检查·诊断方法中将上皮性卵巢癌漏诊的情况较多。虽然回声检查、MRI、CT等对上皮性卵巢癌的早期发现比较有效,但是存在检查自身是大规模的且检查费用是高额的,以及良性、恶性的诊断精度不是很高的问题。
鉴于上述背景,近年来肿瘤标志物受到瞩目。肿瘤标志物是指癌细胞产生的物质、或与癌细胞反应由周边的细胞产生的物质,由于其在体液中的存在量反映了肿瘤的有无、其预兆,因此成为癌判定和治疗方针决定等的鉴别子。此外,由于能够从体液进行检查,所以具有侵袭性比较低、检查也简便,费用也低廉等优点。
作为上皮性卵巢癌的肿瘤标志物,目前为止,已知由CA125、CA602、CA130、CA72-4、CA546、CA19-9、STN等蛋白质构成的肿瘤标志物(非专利文献1~6)。使用这些肿瘤标志物的癌判定方法中,通常是,测定健康人和上皮性卵巢癌患者的该肿瘤标志物在血清中的浓度,基于其量差来判定有无罹患癌。
但是,这些蛋白质包含如下特异性的问题,即,像CA125这样在子宫内膜症等癌以外的妇科良性疾病中显示阳性,像CA72-4、CA19-9和STN这样在卵巢癌以外的胃、大肠等各种消化器官癌中显示阳性等。此外,由于上皮性卵巢癌因组织类型不同进一步分类为浆液性、明细胞性、粘液性、和类内膜性,标志物的反应性因组织类型不同而不同,偶有发现不能完全反映癌的发展的问题。例如,CA125、CA602和CA546等卵巢癌标志物中,由于在粘液性卵巢癌中的阳性率低,所以存在即使该组织类型变为发展期也难以被检测出来等的问题。
专利文献1公开了将源自癌相关人群的半乳糖转移酶(GAT)作为肿瘤标志物的、用于诊断以卵巢癌为代表的癌的单克隆抗体,产生其的杂交瘤以及使用其的样本中的源自癌相关人群的半乳糖转移酶的测定方法。此外,专利文献2公开了将糖转移酶即β1,3-半乳糖转移酶5、β1,3-半乳糖转移酶4、和N-乙酰基葡萄糖胺6-O-硫酸转移酶2作为肿瘤标志物的在早期检测妇科癌的方法。上述专利文献1和2中作为肿瘤标志物使用的糖转移酶,是合成与糖蛋白质、糖脂或蛋白多糖等结合的糖链的酶,通常作为局限于高尔基体的膜蛋白质而固定在高尔基体膜上。因此,没有分泌到细胞外,因而在健康人的体液中基本没有被检测出来。但是,卵巢癌中,已知通过某种蛋白酶表达量的增加,糖转移酶被异常切断,并被排出到细胞外。其结果是,在体液中检测到有意义的量的糖转移酶片段。
专利文献1中的糖转移酶、β1,4-半乳糖转移酶在糖转移酶中表达量非常高,向细胞外的分泌量也较多。因此,健康人也显示约200ng/mL的血中浓度,仅通过酶活性无法判别良性疾病和癌。因此,专利文献1中,着眼于在卵巢癌细胞培养上清和卵巢癌患者腹水中存在被异常切断的该糖转移酶片段,通过使用仅识别该片段的抗体,尝试构筑卵巢癌特异性高的测定体系。但是,利用该测定体系的市售的临床诊断试剂盒中,存在即使健康女性也显示阳性的例子(非专利文献7),因此,GAT现在主要作为卵巢癌的复发监控来使用,基本不将其用作早期发现用的标志物。
专利文献2公开了以下测定法,即基于通常癌组织中以糖转移酶为代表的多种蛋白质的表达出现亢进或者降低的报告,尝试从妇科癌患者血中检测成为候补标志物的蛋白质,结果发现2种糖转移酶测定的有用性。但是,这种情况下,报告了这些糖转移酶的表达或合成产物,与其说是与妇科癌相关,倒不如说是与消化器官癌相关。之后,尽管确认在卵巢癌细胞株有表达(非专利文献8),但是并没有卵巢癌或者其它妇科癌与消化器官癌的表达量的比较研究的报告。
综上所述,专利文献1和2公开了基本没有考虑卵巢癌的糖转移酶的表达,仅着眼于来自卵巢癌患者的体液中的检测,将偶尔能够测定的糖转移酶片段作为卵巢癌标志物。因此,认为其作为卵巢癌标志物的特异性存在问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平3-259093
专利文献2:WO2009/028417
非专利文献
非专利文献1:Bast R.C.Jr.et al.,1983,N.Engl.J.Med.,309:883-887
非专利文献2:Suzuki M.et al.,1990,Nippon Gan Chiryo GakkaiShi,.25:1454-1460
非专利文献3:Inaba N.et al.,1989,Nippon Gan Chiryo Gakkai Shi,24:2426-2435
非专利文献4:Ohuchi N.et al.,1988,Gan To Kagaku Ryoho,152767-2772
非专利文献5:Nozawa S.et al.,1996,Nippon Rinsho,54:1665-1673
非专利文献6:Charpin C.et al.,1982,Int.J.Gynecol.Pathol.,1:231-245
非专利文献7:Konica Minolta公司,GAT测试试剂盒附带文书
非专利文献8:Seko A.et al.,2009,Tumor Biol.,30:43-50
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗体或其片段,其能够特异地识别对上皮性卵巢癌特异性高的肿瘤标志物,并将其定量和/或定性地检测。
此外,本发明提供一种通过使用上述抗体或其片段定量和/或定性地检测上皮性卵巢癌标志物,从而简便、以比较低的侵袭性且以高正确诊断率判定受试者是否罹患上皮性卵巢癌的方法。
本发明人等进行了深入研究,结果发现与健康人相比,糖转移酶β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3(以下,本说明书中常常将该酶简称为“B3GNT3”)较多存在于上皮性卵巢癌患者的试样中。本发明是基于该知识的发明,提供以下内容。
(1)一种上皮性卵巢癌标志物检测用抗体,其特征在于,其将由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的一部分作为表位进行识别。
(2)根据(1)所述的抗体,其是单克隆抗体。
(3)根据(2)所述的抗体,其由国际受领编号为FERM ABP-11494或FERM ABP-11495的杂交瘤产生。
(4)一种上皮性卵巢癌标志物检测用重组抗体,其特征在于,含有上述(1)~(3)中任一项所述的抗体中的至少1组的对应的轻链互补链决定区域和重链互补链决定区域。
(5)一种上皮性卵巢癌标志物检测用抗体片段,其特征在于,是上述(1)~(3)中任一项所述的抗体或(4)所述的重组抗体的片段,具有特异地识别B3GNT3的活性。
(6)一种产生(2)所述的抗体的杂交瘤。
(7)根据(6)所述的杂交瘤,国际受领编号是FERM ABP-11494。
(8)根据(6)所述的杂交瘤,国际受领编号是FERM ABP-11495。
(9)一种上皮性卵巢癌判定方法,其特征在于,对源自受试者的试样中存在的B3GNT3多肽片段进行定量和/或定性地检测,基于该检测结果,判定该受试者有无罹患上皮性卵巢癌。
(10)根据(9)所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,所述B3GNT3多肽片段的定量检测结果中B3GNT3多肽片段的定量值在规定的值以上时,判定该受试者罹患上皮性卵巢癌的可能性高。
(11)根据(9)或(10)所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,所述B3GNT3多肽片段是由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的全部或一部分。
(12)根据(9)~(11)中任一项所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,使用选自(1)~(3)中的任一项所述的抗体、(4)所述的重组抗体和(5)所述的抗体片段中的至少1种的抗体、重组抗体和/或抗体片段检测B3GNT3多肽片段。
(13)根据(12)所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,使用识别B3GNT3多肽片段上的不同表位的2种抗体、重组抗体和/或抗体片段。
(14)根据(9)~(13)中任一项所述的上皮性卵巢癌判定方法,进一步对所述试样中存在的β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B(以下,本说明书中常常将该酶简称为“MGAT5B”)多肽片段进行定量和/或定性地检测,基于该检测结果和(9)~(13)中任一项所述的检测结果,判定受试者有无罹患上皮性卵巢癌。
(15)根据(14)所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,所述MGAT5B多肽片段的定量检测结果中MGAT5B多肽片段的定量值在规定的值以上时,判定该受试者罹患上皮性卵巢癌的可能性高。
(16)根据(14)或(15)所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,使用选自将由序列号3所示的氨基酸序列构成的多肽的一部分作为表位识别的抗MGAT5B抗体、含有该抗MGAT5B抗体中存在的至少1组的对应的轻链CDR和重链CDR的抗MGAT5B重组抗体、和具有特异地识别MGAT5B活性的抗MGAT5B抗体或抗MGAT5B重组抗体的片段中的至少1种的抗体、重组抗体和/或抗体片段,检测MGAT5B多肽片段。
(17)根据(16)所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,所述抗MGAT5B抗体由国际受领编号为FERM ABP-11496、FERMABP-11497、FERM ABP-11498或FERM ABP-11499的杂交瘤产生。
(18)根据(9)~(17)中任一项所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,所述试样是体液、腹腔清洗液或组织。
本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国特许出愿2011-163299号的说明书和/或附图记载的内容。
根据本发明的抗体和/或其片段,能够特异地识别·检测作为上皮性卵巢癌标志物的糖转移酶B3GNT3多肽片段。
根据本发明的杂交瘤,能够稳定供给抗B3GNT3单克隆抗体,该抗B3GNT3单克隆抗体能够特异地识别和检测作为上皮性卵巢癌标志物的糖转移酶B3GNT3。
根据本发明的上皮性卵巢癌判定方法,能够简便、以比较低的侵袭性、且以高正确诊断率检测上皮性卵巢癌。由此,能够在早期判定受试者是否罹患上皮性卵巢癌。
附图说明
图1示出验证由实施例1得到的源自杂交瘤的抗B3GNT3单克隆抗体(a:GT117-2抗体,b:GT117-3抗体)的抗原特异性的Western印迹的结果。泳道1示出FLAG-B3GNT3多肽片段,泳道2示出经过酶处理切断·除去FLAG Tag的B3GNT3多肽片段,泳道3示出由大肠杆菌表达B3GNT3的培养上清,泳道4示出健康人的血清。
图2示出利用了抗B3GNT3单克隆抗体的通过Western印迹检测受试者试样和卵巢癌细胞株培养上清中的B3GNT3多肽片段的结果。泳道1示出精制重组B3GNT3多肽片段,泳道2示出从卵巢癌患者采取的腹腔清洗液,泳道3~5示出卵巢癌细胞株的培养上清(分别源自RMG-I细胞株、源自RMG-V细胞株、源自RMUG-S细胞株)。
图3示出FLAG-B3GNT3多肽片段经抗B3GNT3抗体免疫沉淀后,由各种抗体检测的Western印迹的结果(a:抗FLAG抗体,b:GT117-2抗体、c:GT117-3抗体)。泳道1示出作为对照的FLAG-B3GNT3多肽片段,泳道2示出与健康人血清混合的FLAG-B3GNT3多肽片段通过GT117-2抗体免疫沉淀的试样,泳道3示出与健康人血清混合的FLAG-B3GNT3多肽片段通过GT117-3抗体免疫沉淀后的试样,泳道4示出未免疫沉淀的与健康人血清混合的FLAG-B3GNT3多肽片段。
图4示出使用抗B3GNT3抗体的卵巢癌细胞株的免疫染色。a是使用GT117-2抗体,b是使用GT117-3抗体,而后c是使用作为阳性对照的MAb8628抗体,对上皮性卵巢癌细胞株RMUG-S进行免疫染色的染色图。
图5示出采用使用了GT117-2抗体和GT117-3抗体的夹心CLEIA法测定浓度标准品的B3GNT3多肽片段的标准曲线。
图6示出采用使用了GT117-2抗体和GT117-3抗体的夹心CLEIA法测定从受试者采取的腹腔清洗液中的本发明的上皮性卵巢癌标志物B3GNT3多肽片段的浓度而得到的值。
图7示出从上皮性卵巢癌患者采取的腹腔清洗液的B3GNT3多肽片段测定值、和已有的卵巢癌标志物CA125(a)或GAT(b)测定值的相关性。
图8示出从上皮性卵巢癌患者采取的腹腔清洗液的CA125测定值和GAT测定值的相关性。
图9示出采用使用了对各自特异的抗体的夹心CLEIA法测定从受试者采取的腹腔清洗液中的本发明的上皮性卵巢癌标志物B3GNT3多肽片段和其它的上皮性卵巢癌标志物MGAT5B多肽片段的浓度,并综合指标化而得的值。
具体实施方式
1.上皮性卵巢癌标志物检测用抗体
1-1.定义和构成
本发明的第1实施方式是上皮性卵巢癌标志物检测用抗体。本发明的抗体的特征在于,其是用于检测上皮性卵巢癌标志物的抗体,识别上皮性卵巢癌标志物所含有的表位,并与之特异地结合。
本发明中“上皮性卵巢癌标志物”是指,用于检测上皮性卵巢癌的生物学的标志物,是作为显示被检测人罹患上皮性卵巢癌的指标的生物体内物质。本发明中的上皮性卵巢癌标志物,具体而言是β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3多肽片段。
“β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3(B3GNT3)”,是作为膜蛋白质而局部存在于高尔基体膜并以β1-3键将N-乙酰基葡萄糖胺转移的糖转移酶的一种,具有延长O-结合型糖链核心1结构的功能(Yeh JC.et al.,2001,Cell,105:957-969)。B3GNT3在N末端侧含有1个膜贯通区域,在高尔基体内部具有作为酶活性区域的C末端区域。本发明的B3GNT3是登录在GenBank Accession NO.NP-055071.1的由372个氨基酸组成的源自人的野生型B3GNT3,具体而言是由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽。或者也可以是序列号2中第328位的His残基置换为Arg残基的源自人的野生型B3GNT3(GenBank Accession NO.NP-055071.2)。应予说明,本说明书中,B3GNT3包含野生型B3GNT3和其天然突变体。
本说明书中B3GNT3的“天然突变体”是存在于自然界的突变体,其是在构成序列号2所示的野生型B3GNT3的氨基酸序列中含有1~10个、优选1~5个、更优选1~4个、1~3个、或者1或2个氨基酸的缺失、置换、增加或插入的突变体,或者是显示与序列号2所示的氨基酸序列有约90%以上、优选约95%以上、更优选约98%以上的同源性的多肽。其中,“同源性”是指,将序列号2所示的氨基酸序列和对象氨基酸序列按照使两氨基酸序列达到最高的一致度的方式并根据需要导入空位进行整列(比对)时,包含上述空位数量时的、对象氨基酸序列相同氨基酸残基数相对于序列号2所示的氨基酸序列全部氨基酸残基数的比例(%)。该同源性,可使用BLASTP、FASTA的蛋白质检索系统进行确定。作为天然突变体的具体例,可举出基于SNP(单碱基多态性)等多态性的突变体、拼接突变体等。其中,B3GNT3的天然突变体,没有必要一定具有与野生型B3GNT3同等的酶活性。对于糖转移酶的情形,有报告通过仅将1个氨基酸置换而显著丧失其活性的天然突变体的存在(Nishihara S.et al.,1993,Biochem.Biophys.Res.Commun.196:624-631)。
本说明书中“B3GNT3多肽片段”是指,上皮性卵巢癌细胞中通过蛋白酶从高尔基体膜异常切断而最终释放到细胞外的源自B3GNT3的多肽片段,是指如上所述可作为上皮性卵巢癌标志物发挥功能的多肽。具体而言,是由B3GNT3中除含有膜贯通区域的N末端区域以外的位于高尔基体内部的C末端侧区域的全部或其一部分构成的多肽,例如,对于序列号2所示的人B3GNT3而言,是由序列号1所示的第38位(将起始蛋氨酸作为第1位)的谷氨酸残基以后的氨基酸序列全部或一部分构成的多肽,以及源自该多肽的片段。
本发明的“上皮性卵巢癌检测用抗体”,是将上述上皮性卵巢癌标志物即B3GNT3多肽片段作为抗原而诱导得到的抗体。因此,本说明书中,“上皮性卵巢癌标志物检测用抗体”经常书写为“抗B3GNT3抗体”。抗B3GNT3抗体能够将上皮性卵巢癌标志物的一部分作为表位进行识别和结合,对其特异地检测。具体而言,以由序列号1所示的氨基酸序列组成的氨基酸的一部分作为表位。其中所述的“一部分”是指由5~15个、优选5~10个、更优选6~10个的连续的氨基酸组成的一个或者多个区域。
本发明的抗B3GNT3抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体的任一种。为了能够更特异地检测,优选单克隆抗体。作为抗B3GNT3单克隆抗体的具体例,例如,可举出由国际受领编号为FERM ABP-11494或FERM ABP-11495的杂交瘤产生的抗B3GNT3抗体。关于这些抗体,将在“(3)抗B3GNT3单克隆抗体的制作”这一项详述。
本发明的抗B3GNT3抗体可进行修饰。其中所述“修饰”包括像糖基化这样对抗原特异性结合活化所必要的功能上的修饰、或对抗体检测所必要的标识。抗体标识中,例如,可举出用荧光色素(FITC、罗丹明、德克萨斯红、Cy3、Cy5)、荧光蛋白质(例如,PE、APC、GFP)、酶(例如,辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或生物素或者(链霉菌)亲和素进行的标识。
此外,也可改变抗B3GNT3抗体上的修饰。例如,为了调整抗B3GNT3抗体对作为靶抗原的上皮性卵巢癌标志物的亲和性,也可以改变抗B3GNT3抗体的糖基化。具体而言,例如可举出以下的改变,即抗B3GNT3抗体的框架区域(FR:Framework region)中,对构成糖基化部位的氨基酸残基中导入置换而除去糖基化部位,由此使该部位的糖基化丧失。
本发明的抗B3GNT3抗体具有与上皮性卵巢癌标志物的解离常数为10-8M以下、优选10-9M以下、更优选10-10M以下的高亲和性。上述解离常数可使用本领域公知的技术进行测定。例如,也可以通过BIAcore系统(GE Healthcare公司)使用速度评价试剂盒软件进行测定。
本发明的抗B3GNT3抗体的球蛋白类型,没有特别限定,IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgY的任一个均可,优选IgG和IgM。此外,本发明的抗B3GNT3抗体的来源生物种类,没有特别限定。可以是源自包含鸟和哺乳动物的所有动物源。例如,可举出小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、山羊、驴、羊、骆驼、马、鸡、或人等。
本发明的抗B3GNT3多克隆抗体或抗B3GNT3单克隆抗体可利用后述的制造方法得到。此外,如果是抗B3GNT3单克隆抗体,也可以基于其氨基酸序列,利用化学合成法或利用重组DNA技术进行制备。进一步地,抗B3GNT3单克隆抗体也可如前述那样从杂交瘤得到。此外,也可以利用由各制造商(例如,Novus Biologicals公司)市售的抗B3GNT3抗体。
1-2.抗B3GNT3抗体的制作
本发明的抗B3GNT3抗体即抗B3GNT3多克隆抗体和抗B3GNT3单克隆抗体、以及产生抗B3GNT3单克隆抗体的杂交瘤,可利用以下记载的方法制作。但是,并不局限于下述方法,也可以使用本领域公知的其它的所有方法进行制作。
(1)免疫原的制备
制备作为免疫原的上皮性卵巢癌标志物。本发明中能够作为免疫原使用的上皮性卵巢癌标志物,例如是具有序列号1所示的氨基酸序列的人B3GNT3多肽片段的全部或一部分、或者其突变体的多肽片段的全部或一部分。
作为免疫原的B3GNT3多肽片段,例如,可以使用化学合成法或DNA重组技术进行制备。
使用化学合成法制备时,例如,也可以基于序列号1的氨基酸序列信息,利用该技术领域公知的方法,例如固相肽合成法等,化学合成作为免疫原使用的适当的B3GNT3多肽片段。
使用DNA重组技术制备时,将编码B3GNT3的cDNA(B3GNT3cDNA)重组到适当的表达系统,使其表达,能够得到B3GNT3多肽片段。以下,关于B3GNT3多肽片段的制备方法,举出具体例进行说明。
(B3GNT3cDNA的制备)
B3GNT3cDNA可利用公知的技术,例如,cDNA克隆法进行制备。具体而言,首先,制作人cDNA文库。人cDNA文库,可从表达B3GNT3基因等的人成纤维细胞(neuroblastoma cell line SK-N-MC)等按照常规方法提取总RNA之后,经低聚dT纤维素柱处理回收Poly A(+)RNA,将其作为模板通过RT-PCR法进行制作。此外,也可利用市售的人cDNA文库。
接下来,从人cDNA文库分离目标B3GNT3cDNA克隆。具体而言,使用基于B3GNT3基因序列而适当设计的引物和/或探针,可利用杂交筛选法、表达筛选法、抗体筛选法等公知的筛选法进行分离。B3GNT3基因序列在GenBank数据库中以Accession No.NM_014256被登录。此外,设计上述引物时,将编码序列号1所示的氨基酸序列的B3GNT3基因区域包含于扩增片段。可以在正向/逆向引物的5’末端侧导入作为分离后的克隆用的适当的限制部位、蛋白质精制用的Tag序列(FLAG、HA、His、myc、GFP等)。此外,设计上述探针时,B3GNT3基因中,需留意将编码序列号1所示的氨基酸序列的核酸序列包含于扩增区域内。将B3GNT3cDNA克隆分离后,也可根据需要通过PCR法等核酸扩增法进行扩增。
关于上述cDNA克隆技术的详细内容,例如,由于已被记载于Sambrook,J.et.al.,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory ManualSecond Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,可以将其作为参考。
(B3GNT3表达载体的制备)
接下来,将上述得到的B3GNT3cDNA克隆重组到表达载体。具体而言,例如,可举出利用质粒或病毒的表达载体。表达载体,根据表达宿主,可利用大肠杆菌用表达载体(例如,pET21α系、pGEX4T系、pUC118系、pUC119系、pUC18系、pUC19系)、源自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如,pUB110系、pTP5系)、源自酵母的表达载体(例如,YEp13系、YEp24系、YCp50系)、昆虫细胞用表达载体(例如,杆状病毒)、动物细胞用表达载体(例如,pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)。表达载体,通常可含有作为调节元件的例如启动子、终止子、增强子、多聚腺苷酸化信号序列、复制起始点、选择标志物等。此外,作为目标cDNA片段的克隆用,为了以多克隆部位、与容易精制的标识肽(Tag)的融合多肽进行表达,也可以使用在cDNA片段的插入部位的5’末端侧或3’末端侧具有Tag序列的载体。也可以使用在插入部位的5’末端侧具有编码分泌信号序列的序列的载体。由此,能够将表达的成熟多肽分泌到细胞外。这样的表达载体、其它的表达系,由于市售有来自各制造商(Takara Bio公司、第一化学药品、AgilentTechnologies公司、Merck公司、Qiagen公司、Promega公司、RocheDiagnostics公司、Life Technologies公司、GE Healthcare公司等)的有用的制品,也可以利用这些制品。要将B3GNT3cDNA插入表达载体,将精制的B3GNT3cDNA用适当的限制酶进行切断,插入到表达载体侧对应的适当的限制部位而与载体连接即可。根据需要,在重组到表达载体前,可使用适当的质粒等对B3GNT3cDNA进行亚克隆。
关于上述cDNA克隆技术的详细内容,例如,由于已被记载于Sambrook,J.et.al.,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory ManualSecond Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,可以其作为参考。
(宿主细胞中B3GNT3多肽片段的表达)
接下来,将得到的B3GNT3表达系统(例如,B3GNT3表达载体)导入宿主细胞,使其表达作为免疫原的目标B3GNT3多肽片段。
使用的宿主细胞,是适合于B3GNT3表达载体的制备所使用的表达载体的宿主细胞,只要能表达B3GNT3即可,无特别限定。例如,使用大肠杆菌用表达载体时,可使用大肠杆菌(Escherichia coli),使用源自枯草芽孢杆菌的表达载体时,可使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),使用源自酵母的表达载体时,可使用酵母(例如,出芽酵母:Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母:Schizosaccharomyces pombe),使用昆虫细胞用表达载体时,可使用昆虫细胞(例如,Sf细胞),使用动物细胞用表达载体时,可使用哺乳动物细胞(例如,HEK293、HeLa、COS、CHO、BHK)等。此外,也可利用无细胞翻译系统。B3GNT3表达载体向宿主细胞的导入方法,按照向各宿主细胞导入DNA的公知的方法即可,无特别限定。例如,作为向细菌导入该载体的方法,可举出热休克法、钙离子法、电穿孔法等。这些技术,均是本领域公知的,已被记载于以Sambrook,J.et.al.,(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual Second Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York为代表的各种文献中。此外,作为向动物细胞导入B3GNT3表达载体的方法,例如,优选使用lipofectin试剂法(PNAS(1989)Vol.86,6077)、电穿孔法、磷酸钙法(Virology(1973)Vol.52,456-467)、DEAE-Dextran法等。此外,也可以使用Lipofectamin2000(Life Technologies公司)这样的市售的核酸导入剂。利用以上操作,能够得到B3GNT3表达用转化体。
作为培养的培养基,当得到的B3GNT3表达用转化体是大肠杆菌、酵母菌等微生物时,只要是含有微生物能同化的碳源、氮源、无机盐类等,能够高效进行转化体的培养的培养基即可,可以使用天然培养基、合成培养基的任一个。例如,如果是大肠杆菌用,可举出LB培养基。培养通常在振荡培养或通气搅拌培养等有氧的条件下在37℃进行6~24小时即可。培养期间,pH优选保持在中性附近。根据需要也可以在培养基中添加氨苄西林、四环素等抗生素。
此外,B3GNT3表达用转化体是哺乳类细胞等时,可以在适合于各自细胞的培养基中进行培养。培养基可以含有血清或可以不含有血清,更优选在无血清培养基中培养。
当B3GNT3表达载体例如是含有阻遏基因和操纵子等的蛋白质表达诱导型载体时,有必要对上述转化体进行规定的处理,诱导B3GNT3多肽片段的表达。由于表达诱导的方法因载体中含有的蛋白质表达控制系统不同而不同,所以可以进行适合于该系统的诱导处理。例如,以细菌为宿主的蛋白质表达诱导型载体中,最为常见的被利用的蛋白质表达控制系统是由lac阻遏基因和lac操纵子组成的系统。该系统,能够利用IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-Galactoside)处理诱导表达。含有该系统的具有B3GNT3表达载体的转化体中,为了使作为目标的B3GNT3表达,可在培养基中添加适当量(例如,终浓度为1mM)的IPTG。
(B3GNT3多肽片段的回收)
接下来,将在宿主细胞内生产的B3GNT3多肽片段从细胞内或培养上清回收。生产的B3GNT3多肽片段在菌体内或细胞内蓄积时,将该菌体或细胞破碎提取蛋白质。此外,B3GNT3多肽片段在菌体外或细胞外被生产时,可直接使用培养液或者可以通过离心分离等除去菌体或细胞而使用其上清。然后,通过使用常见的蛋白质的精制方法,可将B3GNT3多肽片段进行分离精制。B3GNT3多肽片段作为与标识肽(Tag)的融合肽进行表达时,例如,可利用适合于各标识肽的亲和色谱法。此外,以没有标识肽的B3GNT3多肽片段表达时,例如,可利用硫酸铵盐析法、凝胶色谱法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、等电点色谱法等。或者也可以将上述二种以上的精制方法进行适宜组合来分离精制。
最终,是否已将目标B3GNT3多肽片段回收,可通过SDS-PAGE等进行确认。应予说明,由上述方法制备的重组B3GNT3多肽片段,保持了作为糖转移酶的活性,是可溶型的。
(2)对动物的免疫和抗B3GNT3多克隆抗体的制作
将得到的B3GNT3多肽片段作为免疫原,能够得到特异地识别该多肽的抗B3GNT3多克隆抗体。
首先,将B3GNT3多肽片段溶解于缓冲液制备免疫原溶液。此时,为了高效地进行免疫,必要时可以添加佐剂。对于佐剂,例如,可单独或混合使用弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝凝胶、百日咳疫苗、Titer Max Gold(Vaxel公司)、GERBU佐剂(GERBUBiotechnik公司)等。
接下来,将制备的免疫原溶液给予哺乳动物进行免疫。免疫所用的动物无特别限定。例如可使用非人的哺乳动物,更具体而言,小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、山羊、驴、羊、骆驼以及马等。本发明中,举出使用小鼠的方法为例,以下作具体说明。
作为免疫原溶液的给予方法,例如,可举出使用FIA或者FCA的皮下注射、使用FIA的腹腔内注射、或使用生理盐水的静脉注射,并不局限于此,此外也可以利用其它的皮内注射、肌肉内注射进行给予。免疫原的1次给予量,根据免疫动物的种类、给予途径等进行适宜确定,小鼠时,通常对4~10周龄的每个个体以约50~200μg给予。此外,免疫间隔无特别限定,可以是数日到数周间隔,优选1~4周间隔。初次免疫后,优选进行追加免疫,其次数是2~6次,优选3~4次。初次免疫之后,优选从免疫的小鼠的眼底等采血,利用ELISA法等进行血清中的抗体值的测定。如果抗体值充分上升,则将免疫原溶液注射入静脉内或腹腔内,可将其作为最终免疫。最终免疫优选不使用佐剂。最终免疫后第3~10天,优选第3天,从免疫的小鼠采血,按照公知的方法(Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,1988)处理血清从而得到抗B3GNT3多克隆抗体。
(3)抗B3GNT3单克隆抗体的制作
抗B3GNT3单克隆抗体的制作,可按照Keller&Milstein的方法进行制备(Nature256:495-497(1975))。例如,将从上述免疫的动物得到的抗体产生细胞与骨髓瘤(Myeloma)细胞进行细胞融合从而制备杂交瘤,从得到的杂交瘤选择产生抗B3GNT3单克隆抗体的克隆进行制备。以下,举出具体例进行说明,本发明的抗体的制作并不局限于以下方法。
(抗体产生细胞的采取)
首先,从上述免疫的小鼠采取抗体产生细胞。采取优选在最终免疫之日起2~5日后。作为抗体产生细胞,可举出脾细胞、淋巴结细胞、末梢血细胞等,优选脾细胞或局部淋巴结细胞。从小鼠采取抗体产生细胞的方法,可按照本领域公知的技术进行。
(杂交瘤的制作)
接下来,将抗体产生细胞和骨髓瘤(Myeloma)细胞进行细胞融合,从而能够制作生产抗B3GNT3单克隆抗体的杂交瘤。
作为用于细胞融合的骨髓瘤细胞,只要是源自小鼠的通常能够获得的细胞系细胞,是在体外能够增殖的骨髓瘤细胞即可无特别限定,为了在后述工序中能够简便地选拔杂交瘤,优选具有药剂选择性,具有在未融合的状态下在选择培养基中不能生存,仅在与抗体产生细胞融合的状态下能够生长的性质的骨髓瘤细胞。
骨髓瘤细胞,优选使用已经公知的多种细胞株,例如P3(P3x63Ag8.653)(Kearney J.F.et al.,1979,J.Immunol.,123:1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Yelton D.E.et al.,1978,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,81:1-7)、NS-1(Kohler G.et al.,1976,Eur.J.Immunol.,6:511-519)、MPC-11(Margulies D.H.et al.,1976,Cell,8:405-415)、SP2/0(Shulman M.et al.,1978,Nature,276:269-270)、FO(de St.Groth S.F.et al.,1980,J.Immunol.Methods,35:1-21)、S194(Trowbridge I.S.1978,J.Exp.Med.,148:313-323)、R210(Galfre G.etal.,1979,Nature,277:131-133)等。这些细胞株从理化学研究所生物资源中心、ATCC(American Type Culture Collection)或ECACC(European Collection of Cell Cultures)能够得到,关于这些细胞株的培养和传代,可按照公知的方法(例如,Antibodies:A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory,1988、Selected Methods inCellular Immunology W.H.Freeman and Company,1980)进行培养。应予说明,选择培养基中,例如,可举出HAT培养基(RPMI1640培养基中添加100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素以及10%胎牛血清(FBS)、10-4M次黄嘌呤、1.5×10-5M胸苷和4×10-7M氨基蝶呤的培养基)。
要将上述骨髓瘤细胞和抗体产生细胞进行细胞融合,将上述得到的脾细胞和骨髓瘤细胞清洗后,在MEM、DMEM、RPMI1640培养基等动物细胞培养用培养基、市售的克隆用或细胞融合用培养基(优选不含有血清的培养基)中,将骨髓瘤细胞和抗体产生细胞以混合比1:1~1:10进行混合,在细胞融合促进剂的存在下在30~37℃接触1~15分钟即可。作为细胞融合促进剂,可以约10~80%的浓度使用平均分子量为1500~4000Da的聚乙二醇(以下,写为“PEG”)等。此外,也可以使用聚乙烯醇或仙台病毒这样的融合促进剂、融合病毒。通常优选使用平均分子量为1500Da的PEG。为了提高融合效率,根据需要,可以合用二甲基亚砜等辅助剂。进一步地,也可以使用利用了电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置将抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行融合(Nature,1977,Vol.266,550-552)。
细胞融合处理后,在用于骨髓瘤细胞融合的培养基(例如,RPMI1640培养基)将细胞清洗后,制备细胞悬浮液,接下来,将细胞悬浮液例如用含有FBS的RPMI1640培养基等进行适当稀释后,以1×104左右加入到96孔板上,向各孔中添加选择培养基,以后可适当地交换选择培养基进行培养。培养温度是20~40℃,优选为约37℃。骨髓瘤细胞是HGPRT缺陷株或胸苷激酶(TK)缺陷株时,可使用含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的选择培养基(HAT培养基),从而能够选择性地仅使抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的杂交瘤生长、增殖,因此,从在选择培养基中培养开始后约10日前后起可将生长的细胞选择作为杂交瘤。
接下来,在增殖的杂交瘤的培养上清中,筛选是否含有作为目标的抗B3GNT3单克隆抗体。对于杂交瘤的筛选,例如采取培养杂交瘤的孔中含有的培养上清的一部分,可利用以与作为免疫原使用的B3GNT3多肽片段的结合活性为指标的酶免疫测定法(ELISA法等)、放射免疫测定法(RIA)等进行筛选。进一步地,为了得到稳定产生单克隆抗体的杂交瘤,进行抗体产生杂交瘤的克隆。作为克隆的方法,可按照极限稀释法、荧光激发细胞分选仪法等通常的方法进行,没有特别限定。通过将以上的筛选法与克隆法组合,能够建立最终的抗B3GNT3单克隆抗体产生细胞即杂交瘤。
根据需要可进行交差反应性的试验。即,验证对含有其它的糖转移酶等的其它蛋白质的结合活性,仅选择产生显示可接受的交差反应性的抗体的杂交瘤。可接受的交差反应性是指,在作为目标的用途中可忽视程度的单克隆抗体的非特异性结合活性。
作为利用上述筛选法选拔的抗B3GNT3单克隆抗体产生杂交瘤的具体例,可举出GT117-2(国内保藏编号:FERM P-22095;国际受领编号:FERM ABP-11494)或GT117-3(国内保藏编号:FERM P-22096;国际受领编号:FERM ABP-11495)。这些杂交瘤,于2011年4月4日,国内保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6),于同日国际保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)。
这些杂交瘤细胞株优选使用在RPMI1640中添加10%FBS的培养基在37℃进行培养。
(抗B3GNT3单克隆抗体的回收)
抗B3GNT3单克隆抗体能够通过惯用的技术进行回收。例如,作为从建立的杂交瘤中回收的方法,可采用通常的细胞培养法或腹水形成法等。细胞培养法中,将抗B3GNT3单克隆抗体产生杂交瘤在含有10%FBS的RPMI1640培养基、MEM培养基或无血清培养基等动物细胞培养培养基中,例如在37℃、5%CO2浓度下培养2~10天时间,从该培养上清中取得抗体。腹水形成法时,在与Myeloma细胞来源的哺乳动物同种系的动物(上述方法的情形是小鼠)的腹腔内给予抗B3GNT3单克隆抗体产生杂交瘤约1000万个,使该杂交瘤大量增殖。然后,1~2周时间后采取腹水或血清,从而进行回收。利用这样的方法,从作为上述抗B3GNT3单克隆抗体产生杂交瘤的具体例而举出的GT117-2或GT117-3,分别能够得到“GT117-2抗体”或“GT117-3抗体”。
需要精制抗体的情况下,可适宜使用公知的方法进行精制。例如,可使用离子交换色谱法、利用了蛋白质A或蛋白质G等的亲和色谱法、凝胶色谱法、硫酸铵盐析法等进行精制。
1-3.上皮性卵巢癌检测试剂
由于本发明的抗B3GNT3抗体、后述的上皮性卵巢癌标志物检测用重组抗体和/或上皮性卵巢癌标志物检测用抗体片段与上皮性卵巢癌标志物特异地反应,所以可用作上皮性卵巢癌检测试剂中的有效成分。通过使用该检测试剂,检测从受试者采取的试样中含有的上皮性卵巢癌标志物,能够判定受试者罹患上皮性卵巢癌。
本发明的检测试剂,可在使用了免疫学方法的任何手段中利用。例如,可与全自动免疫学测定装置用试剂(CLEIA)组合使用,从而简便且迅速地检测上皮性卵巢癌。关于这一内容,将在第4实施方式详述。此外,上皮性卵巢癌检测试剂,也可以作为上皮性卵巢癌组织染色用进行利用。例如,在开腹手术时、由针刺得到的组织中,利用免疫染色检测上皮性卵巢癌标志物的有无,由此能够判定有无罹患上皮性卵巢癌。此外,使用采取的组织的提取物,利用Western印迹等方法检测上皮性卵巢癌标志物的有无,由此能够判定有无罹患上皮性卵巢癌。
1-4.效果
本发明的抗B3GNT3抗体,能够识别、结合作为上皮性卵巢癌标志物的糖转移酶B3GNT3的高尔基体内区域。因此,使用本发明的抗B3GNT3抗体,能够高效地从受试者的试样检测上皮性卵巢癌标志物。
2.上皮性卵巢癌标志物检测用重组抗体
2-1.定义和构成
本发明的第2实施方式是上皮性卵巢癌标志物检测用重组抗体。本发明的重组抗体特征在于,含有至少一组第1实施方式记载的上皮性卵巢癌标志物检测用抗体中的对应的轻链互补链决定区域(CDR:Complementarity determining region)和重链CDR。本说明书中,“上皮性卵巢癌标志物检测用重组抗体”经常书写为“抗B3GNT3重组抗体”。
本说明书中上述“重组抗体”是指,例如嵌合抗体、人源化抗体和合成抗体。
“嵌合抗体”是指,某一抗体中,将轻链和重链的恒定区域(C区域:Constant region)用其它抗体的轻链和重链的C区域置换而成的抗体。例如,小鼠抗人B3GNT3单克隆抗体即GT117-2抗体或GT117-3抗体中,将其轻链和重链的C区域置换成适当的人抗体的C区域而得的抗体。即,包含CDR的可变区域(V区域:Variable region)源自GT117-2抗体或GT117-3抗体,C区域源自人抗体。
“人源化抗体”也称为重构(reshaped)人抗体,是仅将人以外的哺乳动物、例如抗人B3GNT3小鼠抗体的轻链V区域(VL)和重链V区域(VH)中的CDR置换为适当的人抗体的CDR而得到的镶嵌抗体。例如,将编码源自GT117-2抗体或GT117-3抗体的各CDR区域(CDR1~CDR3)的DNA序列置换为编码源自人抗体的对应各CDR的DNA序列而制备重组抗体基因,通过将其表达,可得到模仿其特定的抗体性质的重组抗体。制备人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。例如,可举出使用按照在CDR和FR两者的末端区域具有重叠部分的方式制作的多个低聚核苷酸作为引物,利用PCR法合成按照小鼠抗体的CDR和人抗体的框架区域(FR)连接的方式设计的DNA序列的方法(欧州专利申请公开号EP125023号公报)。
“合成抗体”是指,通过使用化学方法或重组DNA法合成的抗体。例如,介由具有适当长度的序列的连接肽等,将特定抗体的一个以上的VL和一个以上的VH进行人工连接的单倍体多肽分子、或多聚体多肽。作为这样的多肽的具体例,可举出单链Fv(scFv:single chain Fragmentof variable region)(参照Pierce Catalog and Handbook,1994-1995,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)或四链抗体(tetrabody)等。免疫球蛋白分子中,VL和VH通常位于不同的多肽链(轻链和重链)上。单链Fv是将这样2个多肽链上的V区域通过足够长度的柔软性链接物进行连接而具有包含于1条多肽链的结构的合成抗体片段。单链Fv内两V区域能够相互自组装,形成1个功能性抗原结合部位。单链Fv可通过使用公知技术将编码其的重组DNA插入噬菌体基因组并将其表达而得到。双链抗体是具有以单链Fv的二聚体结构为基础的结构的分子(Holliger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。例如,上述链接物的长度短于约12个氨基酸残基时,单链Fv内的2个可变部位不能自组装,但可通过形成双链抗体,即通过2个单链Fv相互作用,从而一侧Fv链的VL与另一侧Fv链的VH能够组装,能够形成2个功能性抗原结合部位(Marvin et al.,2005,Acta Pharmacol.Sin.26:649-658)。另外,在单链Fv的C末端追加半胱氨酸残基,从而能够形成双Fv链之间的二硫键,也能够形成稳定的双链抗体(Olafsen et al.,2004,Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27)。这样,双链抗体是二价的抗体片段,但各自的抗原结合部位不需要与同一表位结合,具有各自可以识别·特异地结合不同的表位的双重特异性。三链抗体和四链抗体与双链抗体同样地具有以单链Fv结构为基础的三聚体和四聚体结构。分别是三价和四价的抗体片段,也可以是多重特异性抗体。
2-2.抗B3GNT3重组抗体的制作
抗B3GNT3重组抗体可以使用由第1实施方式制作的抗B3GNT3抗体,按照本领域公知的DNA克隆技术进行制作。例如,上述各自引用的文献之外,可参照Sambrook,J.et.al.,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual Second Ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York。
2-3.效果
本发明的抗B3GNT3重组抗体,与第1实施方式的抗B3GNT3抗体同样,能够特异识别·结合作为上皮性卵巢癌标志物的糖转移酶B3GNT3的高尔基体内区域。因此,通过使用本发明的抗B3GNT3重组抗体,能够高效地从受试者的试样中检测上皮性卵巢癌标志物。
3.上皮性卵巢癌标志物检测用抗体片段
3-1.定义和构成
本发明的第3实施方式是上皮性卵巢癌标志物检测用抗体片段。
本发明的“抗体片段”是指上述实施方式1记载的抗B3GNT3抗体、或实施方式2记载的抗B3GNT3重组抗体的部分区域,具有与该抗体具有的B3GNT3特异性识别·结合活性实质同等的活性的多肽链或其复合体。具体而言,是指包含至少一个实施方式1的抗B3GNT3抗体或实施方式2的抗B3GNT3重组抗体所含有的抗原结合部位的抗体部分区域,即具有至少1组的VL和VH的多肽链或其复合体。例如,如果是实施方式1的抗B3GNT3抗体,可举出使用多种肽酶将该抗体切断而生成的多个充分附有特征的片段。作为具体的例子,可举出Fab、F(ab')2、Fab'等。Fab是利用木瓜蛋白酶在与铰链部的二硫键相比靠近N末端侧将IgG分子切断而生成的片段,由以下多肽和轻链构成,该多肽由VH和构成H链C区域(重链恒定区域:以下简写为“CH”)的3个区域(CH1、CH2、CH3)中与VH邻接的CH1构成。F(ab')2是利用胃蛋白酶在与铰链部的二硫键相比靠近C末端侧将IgG分子切断而生成的Fab'二聚体。Fab'具有与Fab相比多少含有铰链部、H链略长但实质上与Fab同等的结构。Fab'可通过将F(ab')2在温和条件下还原,将铰链区域的二硫连接切断而得到。这些抗体片段,由于均包含抗原结合部位,所以具有与抗原(即,本发明中的B3GNT3)特异结合的能力。
3-2.效果
本发明的上皮性卵巢癌标志物检测用抗体片段与第1实施方式的抗B3GNT3抗体同样地能够特异识别·结合作为上皮性卵巢癌标志物的糖转移酶B3GNT3的高尔基体内区域。因此,通过使用本发明的上皮性卵巢癌标志物检测用抗体片段,能够高效地从受试者的试样中检测上皮性卵巢癌标志物。
4.上皮性卵巢癌判定方法
本发明的第4实施方式是上皮性卵巢癌判定方法。本发明的上皮性卵巢癌判定方法是,将源自受试者的试样中存在的上皮性卵巢癌标志物定量和/或定性地检测,基于该检测结果,判定该受试者有无罹患上皮性卵巢癌。
4-1.定义和构成
本说明书中“受试者”是指,本发明的方法中用于检查的人,即提供后述的试样的人。优选的受试者是有罹患上皮性卵巢癌可能的人或上皮性卵巢癌患者。应予说明,本说明书中的“健康人”是指在上皮性卵巢癌方面健康的广义的健康人,即,上皮性卵巢癌非罹患者。因此,只要没有罹患上皮性卵巢癌,也可以是其它疾病,例如,罹患胃癌、子宫癌等的人。优选没有罹患任何疾病的狭义的健康人,即健康人。
“试样”是指,从上述受试者采取的、直接用于本发明的方法的物质,例如体液、腹腔清洗液或组织。“体液”是指,直接从受试者采取的液体状的生物体试样。例如,可举出血液(包括血清、血浆和间质液)、淋巴液、脊髓液、腹水、胸腔积液、痰、泪液、鼻腔分泌物、唾液、尿、阴道液、精液等。“组织”包括切片和提取物。本发明的方法中,优选的试样是血液、淋巴液、腹水等体液、或腹腔清洗液。
试样的采取可按照本领域公知的方法进行。例如,如果是血液、淋巴液,可按照公知的采血方法得到。具体而言,如果是末梢血,可在末梢部的静脉等进行注射采取。此外,如果是腹水或腹腔清洗液,则利用在腹部超声断层法导引下避开肠道的穿刺抽吸进行采取,或开腹时向腹腔内注入生理盐水约100mL而通过从道格拉斯窝利用注射器等的抽吸进行采取。如果是组织,可直接穿刺脏器采取或手术中从切除的部位采取。对于试样而言,对从受试者采取的试样根据需要稀释或者浓缩,或添加肝素这样的抗凝剂。或者,如果是组织时,也可以在用石蜡这样的固定化剂进行固定等前处理后使用。此外,也可以不进行这样的前处理而直接使用。
试样可以在采取后立即利用,也可以利用冷冻保存一定时间后,根据需要进行解冻等处理来利用。本发明的方法中,作为试样使用血清或腹腔清洗液时,上皮性卵巢癌标志物的检测中,通常,具有10μL~100μL的容量就足够了。
本发明的方法中,应检测的上皮性卵巢癌标志物是上述实施方式1记载的B3GNT3多肽片段。具体而言,是位于高尔基体内区域、由与B3GNT3的C末端侧相当的氨基酸序列构成的多肽片段。例如,如果是人B3GNT3,相当于由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的全部或一部分。
4-2.上皮性卵巢癌标志物的检测方法
检测试样中的上皮性卵巢癌标志物的方法,只要是能够检测作为多肽的该标志物的公知方法即可,可使用任意的方法。优选采用使用了特异识别上皮性卵巢癌标志物并与其结合的抗体的免疫学反应的检测方法(免疫学检测法)。
上皮性卵巢癌标志物特异性抗体(以下记为“抗上皮性卵巢癌标志物抗体”)可使用上述实施方式1记载的抗B3GNT3抗体(包含抗B3GNT3多克隆抗体和抗B3GNT3单克隆抗体)、实施方式2记载的抗B3GNT3重组抗体、和/或实施方式3记载的抗体片段。具体而言,例如,可举出实施方式1记载的小鼠抗人B3GNT3单克隆抗体即GT117-2抗体或GT117-3抗体。
作为检测源自被检验者的试样中存在的上皮性卵巢癌标志物的量的免疫学检测法,例如,可举出酶免疫测定法(包括ELISA法、EIA法)、荧光免疫测定法、放射免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法、表面等离子共振法(SPR法)、石英晶体微天平(QCM)法、免疫比浊法、胶乳凝集免疫测定法、胶乳比浊法、红细胞凝集反应、粒子凝集反应法、胶体金法、毛细管电泳法、Western印迹法或免疫组织化学法(免疫染色法)。这些方法均是公知的方法,原则上可按照本领域通常方法进行。
通过上述酶免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法或发光免疫测定法这样的使用了标识的免疫学测定法实施本发明的上皮性卵巢癌标志物的测定时,优选将上述抗上皮性卵巢癌标志物抗体等固相化或将试样中的成分(即,上皮性卵巢癌标志物)固相化,来进行它们的免疫学反应。
作为固相载体,可使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、胶乳、明胶、琼脂糖、纤维素、琼脂糖凝胶、玻璃、金属、陶瓷或磁性体等材质形成的珠子、微孔板、试管、棒或试验片等形状的不溶性载体。固相化可按照在固相载体上将上述抗上皮性卵巢癌标志物抗体或上皮性卵巢癌标志物利用物理吸附法、化学键合法或它们的联合使用等公知的方法进行结合来实现。
作为标识抗上皮性卵巢癌标志物抗体的标识子,酶免疫测定法的情况下,可举出过氧化酶(POD)、碱性磷酸酶、β-半乳糖酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶或生物素(或者亲和素)等。此外,荧光免疫测定法的情况下,可举出荧光素异氰酸酯、四甲基罗丹明异氰酸酯、取代罗丹明异氰酸酯、二氯三嗪异氰酸酯、Alexa或AlexaFluoro等。进一步地,放射免疫测定法的情况下,可举出氚、碘125或碘131等。此外,发光免疫测定法可使用NADH、FMNH2、荧光素酶系、鲁米诺-过氧化氢-POD系、吖啶酯系或二氧杂环丁烷化合物系等。
对于标识物质和抗体的结合法而言,酶免疫测定法的情况下可使用戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法或过碘酸法等公知的方法,放射免疫测定法的情况下可使用氯胺T法、Bolton-Hunter法等公知的方法。测定的操作法可利用公知的方法(Current protocols in ProteinSciences,1995,John Wiley&Sons Inc.;Current protocols inImmunology,2001,John Wiley&Sons Inc.)进行。
免疫学测定法中包括标识抗上皮性卵巢癌标志物抗体,将试样中的上皮性卵巢癌标志物直接检测并定量的直接检测方法;或通过使用标识的二次抗体从而间接检测并定量的间接检测方法,本发明中可以是任意一种。
直接检测方法的情况下,例如,将试样中的多肽片段固相化,与标识的抗上皮性卵巢癌标志物抗体接触,形成本发明的上皮性卵巢癌标志物/标识抗上皮性卵巢癌标志物抗体的复合体。接下来,将未结合的标识抗体清洗分离,由结合的标识抗体量或未结合的标识抗体量检测试样中的上皮性卵巢癌标志物,此外能够测定其含量。
间接检测方法的情况下,使试样中的上皮性卵巢癌标志物与一次抗体即抗上皮性卵巢癌标志物抗体反应(一次反应),进一步地使标识二次抗体反应(二次反应)。一次反应和二次反应可以颠倒顺序进行,也可以同时进行。此外,标识二次抗体可以是特异识别·结合一次抗体的抗体,也可以是识别·结合上皮性卵巢癌标志物的抗体。利用一次反应和二次反应,形成由固相化的上皮性卵巢癌标志物/抗上皮性卵巢癌标志物抗体/标识二次抗体组成的复合体或固相化的抗上皮性卵巢癌标志物抗体/上皮性卵巢癌标志物/标识二次抗体的复合体。
间接检测方法中,形成固相化的抗上皮性卵巢癌标志物抗体/上皮性卵巢癌标志物/标识二次抗体的复合体的方法被称为夹心法,是利用能与同一抗原同时结合的不同的2种抗体,即,识别同一抗原上的不同表位的2种以上的单克隆抗体(或如果是多克隆抗体也可以是1种)检测目标抗原的方法。对于夹心法而言,经常使用将2种抗体的一种抗体固相化、将另一抗体标识化来检测目标抗原的所谓的夹心ELISA法,该方法也优选用于本发明的方法中。复合体形成后,将试样中含有的上皮性卵巢癌标志物以外的蛋白质和未结合的标识二次抗体清洗分离,由结合标识二次抗体量或未结合标识二次抗体量检测试样中的上皮性卵巢癌标志物,此外可测定其含量。从对试样中的上皮性卵巢癌标志物不牺牲灵敏度而高精度地测定的角度出发,优选利用使用夹心法进行的间接检测方法。该方法可适用于使用了已有的自动免疫检测装置的自动化。
示出检测本发明的上皮性卵巢癌标志物的优选实施方式的一例。首先,将本发明的抗上皮性卵巢癌标志物抗体(例如,GT117-2抗体或GT117-3抗体的任意一个)作为一次抗体固定于不溶性载体。固定化后,将未固定化抗体的固相表面利用与作为抗原的上皮性卵巢癌标志物无关的蛋白质(例如,胎牛血清、牛血清白蛋白、明胶等)或蔗糖、化学合成聚合物等非蛋白质的封闭剂进行封闭。然后,将固定化的一次抗体与受试者的试样接触。接下来,将识别·结合在上皮性卵巢癌标志物上与一次抗体不同的表位的抗上皮性卵巢癌标志物抗体(在上述情况下,是GT117-2抗体或GT117-3抗体的另一种)作为二次抗体进行接触。应予说明,二次抗体使用按照上述方法标识的标识二次抗体。之后,进行清洗,除去未结合的标识二次抗体后,从载体上结合的标识二次抗体检测源自标识的信号。
4-3.上皮性卵巢癌的罹患判定
对上述源自受试者的试样中存在的上皮性卵巢癌标志物进行定量和/或定性地检测,基于其检测结果进行受试者上皮性卵巢癌罹患的判定。
上皮性卵巢癌标志物的定性检测,例如,可举出利用免疫组织化学法或Western印迹法等进行的检测。
将上皮性卵巢癌标志物定量地、例如利用免疫学测定方法检测时,基于其定量测定结果进行。B3GNT3多肽片段的定量值在规定的值以上时,判定该受试者罹患上皮性卵巢癌的可能性高。
本说明书中,“定量值”是指,利用上述的测定方法得到的值,可以是浓度这样的绝对值,或者可以是每单位试样的上皮性卵巢癌标志物所致的信号强度这样的相对值。
本发明人等发现的上皮性卵巢癌标志物即糖转移酶B3GNT3多肽片段通常在源自健康人的试样中几乎检测不到。因此,作为对象的B3GNT3多肽片段被检测到时,原则上,可判定该受试者罹患上皮性卵巢癌的可能性高。
谋求更高精度的判定时,优选利用定量值的方法。即,按照上述测定方法,B3GNT3多肽片段的定量值被检测出在规定的值以上的值时,可判定该受试者罹患上皮性卵巢癌的可能性高。“规定值”是指能够将上皮性卵巢癌患者和健康人分离的定量值,例如,临界值。具体而言,例如,如果是使用本发明的抗上皮性卵巢癌标志物抗体时,可举出后述的临界值。
但是,使用的抗上皮性卵巢癌标志物抗体即使极少也具有交差反应性,在有可能检测到其它的糖转移酶的情况下,在健康人、上皮性卵巢癌以外的癌患者中因夹杂物而不能排除非特异性反应的情况下,存在仅通过检测上皮性卵巢癌标志物的有无而无法正确判定的可能性。
因此,例如,如果使用的抗上皮性卵巢癌标志物抗体可能具有交差反应性,则通过使用上述的夹心法检测上皮性卵巢癌标志物,在提高其特异性的同时,能够显著降低因夹杂物而发生的非特异性反应。应予说明,本发明的GT117-2抗体和GT117-3抗体被确认为没有交差反应性。
此外,本发明的上皮性卵巢癌标志物具有在健康人也被检测出的可能性的情况下,源自受试者的试样中的上皮性卵巢癌标志物的测定值与健康人的该值进行比较,是统计学上有意义的高值,可以以此为基础进行判断。上皮性卵巢癌标志物的测定值,可利用使用上述定量方法测定的上皮性卵巢癌标志物的定量值。此时,如果将受试者和健康人的试样中期待没有量的差异的公知蛋白质作为内部对照使用,能够修正受试者和健康人的定量检测结果,因此能够得到更正确的上皮性卵巢癌标志物的量。作为这样的内部对照用蛋白质,例如,可举出白蛋白。
“统计学上有意义”是指,将源自受试者和健康人各自的试样中含有的上皮性卵巢癌标志物的量的差异进行统计学处理时,两者间有显著差异。具体而言,例如,可举出危险率(显著水平)小于5%、小于1%或小于0.1%的情况。统计学处理的检测方法可适宜使用能够判断显著性有无的公知的检测方法,没有特别限定。例如,可使用student t检验方法、多重比较检验方法。“统计学上有意义的高值”具体而言是指在多样本分析中,按照将由常规方法而设定的灵敏度和特异度最适化的方式把能够将上皮性卵巢癌罹患者和健康人等分离的值设定为临界值,比该临界值高的情况。
例如,本发明中,上述夹心法中将GT117-2抗体和GT117-3抗体作为抗上皮性卵巢癌标志物抗体使用时,将上皮性卵巢癌罹患者和健康人分离的临界值是24ng/mL(引出卵巢癌患者vs有播种胃癌患者腹腔清洗液的ROC曲线时的最佳区分点),优选35ng/mL(有播种胃癌患者腹腔清洗液的上方95%tile)、更优选58ng/mL(卵巢癌患者腹腔清洗液的下方95%tile)。因此,受试者的试样中的上皮性卵巢癌标志物的定量值比该临界值高时,可判定该受试者罹患上皮性卵巢癌。
此外,在本发明的上皮性卵巢癌标志物即B3GNT3多肽片段的基础上,进一步利用二个以上的其它上皮性卵巢癌标志物,也能够判定上皮性卵巢癌的罹患。通过从受试者的试样中检测不同的多个上皮性卵巢癌标志物,能够进一步降低假阳性率和假阴性率,能够进行精度更高的罹患判定。
上述“其它的上皮性卵巢癌标志物”是用于检测上皮性卵巢癌的B3GNT3多肽片段以外的生物学的标志物,只要是成为显示被检验者罹患上皮性卵巢癌的指标的生物体内物质即可,没有特别限定。由于本申请发明的上皮性卵巢癌标志物是源自糖转移酶的多肽,所以同样也可以是源自糖转移酶的多肽。作为B3GNT3以外的源自糖转移酶的多肽,且能够成为上皮性卵巢癌标志物的多肽,例如,可举出基于β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B(以下,本说明书中经常简写为“MGAT5B”)、专利文献2中记载的β1,3-半乳糖转移酶5、β1,3-半乳糖转移酶4和N-乙酰基葡萄糖胺6-O-硫酸转移酶2各自的多肽片段。其中可优选将基于MGAT5B的多肽片段与基于B3GNT3的多肽片段组合利用。
“β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B(MGAT5B)”是本发明人等与B3GNT3同时新发现的能够成为上皮性卵巢癌标志物的糖转移酶。已知以膜蛋白质形式局部存在于高尔基体膜,是N-结合型糖链的合成酶的一种,通过β1-6键将N-乙酰基葡萄糖胺转移(Kaneko M.et al.,2003,FEBS Letters,554:515-519)。与B3GNT3同样,在N末端侧含有1个膜贯通区域,在高尔基体内部具有作为酶活性区域的C末端区域。因此,与MGAT5B或其天然突变体的C末端区域相当的多肽区域的全部或一部分成为“其它的上皮性卵巢癌标志物”。MGAT5B是登录在GenBankAccessionNO.NP_653278的由790个氨基酸组成的源自人的野生型MGAT5B,具体而言,是由序列号4所示的氨基酸序列构成的多肽。其中,成为其它的上皮性卵巢癌标志物的区域是由序列号3所示的氨基酸序列构成的多肽区域的全部或一部分所形成的MGAT5B多肽片段。
此外,作为特异识别MGAT5B多肽片段并与其结合的抗体,可举出将序列号3所示的MGAT5B的氨基酸序列的一部分作为表位识别的抗MGAT5B抗体。作为具体例,可举出GT131-2抗体、GT131-7抗体、GT131-12抗体和GT131-18抗体。分别产生这些抗MGAT5B抗体的杂交瘤GT131-2、GT131-7、GT131-12和GT131-18,于2011年4月4日国内保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6),并于同日国际保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)。各杂交瘤的国际受领编号为GT131-2:FERM ABP-11496(国内保藏编号;FERM P-22097)、GT131-7:FERM ABP-11497(国内保藏编号;FERMP-22098)、GT131-12:FERM ABP-11498(国内保藏编号;FERMP-22099)和GT131-18:FERM ABP-11499(国内保藏编号;FERMP-22100)。此外,也可利用含有抗MGAT5B抗体的轻链CDR和重链CDR的重组抗体,以及具有识别MGAT5B活性的、抗MGAT5B抗体或含有抗MGAT5B抗体轻链CDR和重链CDR的重组抗体的片段。使用这些抗体、重组抗体、或抗体片段,按照与上述的抗B3GNT3抗体等同样的方法,定量和/或定性地从同一受试者的试样中检测上皮性卵巢癌标志物即可。
在本发明的上皮性卵巢癌标志物的基础上、从同一受试者的试样中检测上述MGAT5B多肽片段这样的其它上皮性卵巢癌标志物时的对受试者的上皮性卵巢癌的罹患判定,当均能检测到上皮性卵巢癌标志物时,能够判定该受试者罹患上皮性卵巢癌的可能性更高。仅检测到一种上皮性卵巢癌标志物,没有检测到另一上皮性卵巢癌标志物时,由于考虑到某一标志物的检测结果出现错误,所以此时可以对各自的标志物使用夹心法再次检测、和/或验证各标志物的定量值是否是超过临界值的值。其结果,基于可信度更高的标志物的结果判定该受试者的上皮性卵巢癌的罹患即可。或者,也可以使用同样的方法从试样中检测第二个的其它上皮性卵巢癌标志物,由3个上皮性卵巢癌标志物的检测结果出发,基于更多的结果进行判定。
通过定量和/或定性地检测不同的二个以上的上皮性卵巢癌标志物,从而在进一步降低假阴性率和/或假阳性率的同时,能够提高其判定精度。
实施例
<实施例1:抗B3GNT3抗体和产生该抗体的杂交瘤的制作>
1.免疫原的选择和制备
成为免疫原的B3GNT3基因,通过对于公知糖转移酶全部186种而言将卵巢癌细胞株RMG-I、RMG-II、RMG-V(以上为明细胞性)、RMUG-S(粘液性)和末梢血细胞、大肠、肝脏、胃的正常组织的转录产物利用实时PCR法进行解析来选择。具体而言,对于卵巢癌细胞株和正常组织各自的转录量,通过平均值的比较和最大值的比较进行排序,选择高位的糖转移酶作为候补卵巢癌标志物。B3GNT3是其中的一个,其平均值是12位、最大值是6位,均比GAT(平均值14位和最大值13位)和β1,3-半乳糖转移酶4(平均值32位和最大值17位)靠前,进而在CA125、GAT等成为阴性的倾向高的粘液性卵巢癌细胞株(RMUG-S)中也检测到高转录量,所以选择其作为对卵巢癌特异的有力标志物候补。
为了B3GNT3基因的表达,制作以pIRESpuro3(Clontech公司)为基础的表达载体。首先,将pIRESpuro3用NruI和BamHI切断。另一方面,将pFC3(Promega公司)用FspI和BamHI切断,将得到的片段重组到上述NruI/BamHI切断的pIRESpuro3,得到pIRES-F-puro3。pIRES-F-puro3,在源自pFC3的表达启动子的下游具有前胰蛋白酶原(MSALLILALVGAAVA:序列号5)和FLAG Tag序列(DYKDDDDK:序列号6),进一步在其下游含有作为多克隆部位的EcoRI和EcoRV。
含有人B3GNT3基因序列全长(序列号7)的质粒,可通过非专利文献(Shiraishi N.et al.,2001,J.Biol.Chem.276:3498-3507)记载的方法得到。将其作为模板,使用引物A(taggaattccGAGCAGCCAC:序列号8)和引物B(cgcggatccTCAGTAGATCT:序列号9)通过PCR进行扩增。PCR是将在94℃进行30秒、接着在55℃进行30秒、然后在68℃进行30秒作为1个循环,进行30个循环。将扩增产物使用Qiagen公司Minielute Kit进行精制后,用EcoRI和BamHI消化,插入到同样消化的pIRES-F-puro3(pIRES-F-puro3-B3GNT3)。得到的质粒pIRES-F-puro3-B3GNT3编码由序列号1所示的B3GNT3的第38位Gln~第372位Tyr组成的区域,和在其N末端侧连接有前胰蛋白酶原、FLAG和LAAANSE(链接序列)的融合蛋白质(可溶型B3GNT3多肽片段)。应予说明,前胰蛋白酶原序列在由细胞分泌时被切断。
将pIRES-F-puro3-B3GNT3导入大肠杆菌DH5α,亚克隆之后,利用常规方法使用Lipofectamin2000转染到HEK293T。在10μg/mL嘌呤霉素下进行选择,得到恒定表达株。目标可溶型B3GNT3多肽片段用Anti-FLAG M2Affinity Gel(A2220;Sigma公司)回收后,进行SDS-PAGE,使用单克隆抗体Anti-FLAG M2Antibody Affinity purified(F1804;Sigma公司)通过Western印迹确认表达。
为了大量制备可溶型B3GNT3多肽片段,在1500mL的培养基(DMEM high glucose、10%FBS、10μg/mL嘌呤霉素、500U/mL青霉素、10μg/mL链霉素)中在37℃进行培养。在15%confluent开始培养,约2天时间培养后,在70%confluent的状态下回收培养上清。
得到的培养上清,使用Nalgene公司PES Bottle Top Filter0.45μmcut-off除去不溶性残渣。试样中添加Sigma公司的anti-FLAG M2Affinity Gel1.5mL,在4℃搅拌放置。回收树脂后,装到空柱,用PBS25mL清洗后,使用溶解于PBS的浓度为1g/mL的SIGMA公司制FLAG肽1mL进行洗脱。洗脱后馏分通过超滤浓缩为500μL,接下来,将其供给预先由缓冲液(20mM Tris-HCl、50mM NaCl、pH8.0)平衡了的Superdex20010/300GL(GE Healthcare公司)凝胶过滤柱。每250μL分别取馏分,将各馏分进行电泳,取得含有可溶型B3GNT3多肽片段的馏分。将馏分收集后,一边将溶剂置换为PBS一边将其浓缩为2.5mg/mL的溶液,将其作为可溶型B3GNT3多肽片段标准品。将其作为免疫原使用。
2.免疫和细胞融合
将上述制备的免疫原即可溶型B3GNT3多肽片段50μg溶解于0.1mL的生理盐水后,加入弗氏完全佐剂0.1mL充分混合,制备乳剂。将0.2mL的乳剂注射于Balb/c小鼠(9周龄雌)的背面皮下。初次免疫开始1周后,向在0.05mL的生理盐水中溶解有25μg免疫原的免疫原溶液中添加0.05mL的铝佐剂,将充分混合的乳剂注射于上述小鼠的腹腔内。进一步地,从初次免疫开始4周时间后,将生理盐水0.1mL中溶解有免疫原50μg的溶液注射于腹腔内,此外从初次免疫开始5周时间后,将生理盐水0.05mL中溶解有免疫原25μg的溶液注射于腹腔内。
从最终免疫开始3天后摘出小鼠的脾脏,用RPMI1640培养基清洗取出的脾细胞。将1.2×108个的脾细胞悬浮液和3×107个的小鼠骨髓瘤细胞(P3/X63-Ag8.U1)悬浮液混合,离心分离后,除去培养基。缓慢加入加温至37℃的聚乙二醇/RPMI1640培养基2mL,轻轻搅拌进行融合。然后,离心分离将培养基除去,加入20%S-Clone/Cloning Medium(三光纯药)和60mL的含有10%FBS的RPMI1640培养基。接下来,对96孔板每1个孔分别注入0.1mL。4小时后向各孔加入0.1mL制备为通常的2倍浓度的HAT培养基(HAT培养基×1浓度:0.1mM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸苷、20%S-Clone、含有10%FBS的RPMI1640培养基)。各孔的培养基,在融合后第2天和第4天进一步逐次进行半量交换。培养10天后,约80%的孔中确认杂交瘤的生长。
3.杂交瘤的选择
杂交瘤培养上清中的抗体的检索是,将上述“1.免疫原的选择和制备”制备的B3GNT3多肽片段作为抗原,使用ELISA法验证。首先,将抗原以PBS中1μg/mL的浓度吸附于ELISA用微孔板,通过含有5%蔗糖和5%Tween20的PBS封闭后,使杂交瘤培养上清反应。进一步地,使过氧化酶标识山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体反应,作为底物使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB),测定450nm的吸光度从而检测目标抗体。结果表明,总计18个孔中得到抗体产生杂交瘤。将这些杂交瘤转移至从HAT培养基中去除氨基蝶呤的HT培养基,进一步地转移至含有10%FBS的RPMI1640培养基进行培养。
接下来,利用极限稀释法将杂交瘤克隆。按照96孔板中每1个孔为约1个的密度的方式将细胞稀释,并用含有15%FBS的RPMI1640培养基培养。约10天后镜检,确认孔内的集落生长和数量。约14日后回收培养上清0.1mL,使用其以ELISA法选择抗体产生细胞。
此外,用ELISA法确认对免疫原中有可能含有的夹杂物的反应性。将使用上述“1.免疫原的选择和制备”中使用的培养用FBS和与FLAG-B3GNT3多肽片段相同的载体表达得到的任意的不同多肽片段,分别以PBS中2μg/mL的浓度吸附于ELISA用微孔板,用ELISA法将培养上清发生反应的杂交瘤除去。这样,克隆的结果为,得到2个稳定的单克隆抗体产生杂交瘤GT117-2和GT117-3。使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒(AbD Serotec公司),确定由这些杂交瘤产生的单克隆抗体的免疫球蛋白亚类后,其全部为IgG1κ。
从2个上述得到的抗B3GNT3单克隆抗体产生杂交瘤(GT117-2和GT117-3),大量制备单克隆抗体。具体而言,在含有10%FBS的RPMI1640培养基中将杂交瘤展开至100mL,在对数增殖期回收。分散于含有2%FBS、ITS-A(10mg/L胰岛素、6.7mg/L硒酸钠、5.5mg/L转铁蛋白、11.0mg/L丙酮酸钠)的RPMI1640培养基500mL,利用滚瓶进行旋转培养。旋转培养开始第2天~第4天用含有ITS-A的RPMI1640培养基进一步稀释2倍,维持到第10天~第14天。最后,2个滚瓶中得到1L的源自含有1%FBS、ITS-A的RPMI1640培养基的培养上清。通过离心和过滤将细胞除去后,添加NaCl、甘氨酸、叠氮化钠和氢氧化钠,制备成为含有3M NaCl、1.5M甘氨酸、0.1%叠氮化钠的pH8.9的培养上清。然后,通过用相同的缓冲液(含有3M NaCl、1.5M甘氨酸、0.1%叠氮钠pH8.9)平衡化的蛋白质A琼脂糖亲和柱4mL(GE Healthcare公司)使抗体结合。接下来,用柱的20倍量的上述缓冲液清洗柱后,用pH6.0的含有0.1%叠氮化钠的0.1M柠檬酸缓冲液洗脱,由馏分收集器将峰分馏。分馏的峰馏分在回收后用50%饱和硫酸铵盐析,将离心分离后的沉淀物用含有0.15M NaCl、0.1%叠氮化钠的pH8.0的50mM Tris缓冲液溶解。由此,对于2个杂交瘤各自得到约10~40mg的精制IgG。
<实施例2:单克隆抗体的抗原特异性的确认>
针对由实施例1得到的源自杂交瘤的抗B3GNT3单克隆抗体(GT117-2抗体、GT117-3抗体)的抗原特异性进行验证。
(方法)
将由实施例1得到的FLAG-B3GNT3多肽片段2ng、以及该片段经酶处理切断FLAG Tag的B3GNT3多肽片段2ng、用大肠杆菌表达没有Tag的重组B3GNT3多肽片段的培养上清(将在分泌用pET20b载体重组有pIRES-F-puro3-B3GNT3的插入片段而得到的表达用载体导入大肠杆菌BL21株,进行使用IPTG的常规方法的诱导处理得到的上清)5μL、以及混合有多个从健康人得到的血清的健康人混合血清0.1μL,分别在SDS-PAGE还原条件下,使用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,转印到PVDF膜上。用含有5%脱脂牛奶的PBS封闭后,与精制单克隆抗体GT117-2抗体(1μg/mL)和GT117-3抗体(0.5μg/mL)在室温反应90分种。清洗后,与作为二次抗体的HRP标识抗小鼠IgG抗体(GEHealthcare公司)混合在室温反应60分钟。清洗后,利用Western印迹检测试剂(Perkin Elmer公司)通过化学发光进行检测。
(结果)
将结果示于图1。能够确认GT117-2抗体和GT117-3抗体均与FLAG-B3GNT3多肽片段和切断、除去了FLAG Tag的B3GNT3多肽片段结合。但是,对于健康人血清,没有反应。由该结果可证明GT117-2抗体和GT117-3抗体与B3GNT3多肽片段特异地反应,与人血清中包含的其它蛋白质不反应。此外,能够确认GT117-3抗体与大肠杆菌表达培养上清也发生反应。大肠杆菌内表达的重组B3GNT3多肽片段与人细胞内的B3GNT3不同,没有进行糖链修饰。由此可知,GT117-3抗体无论糖链修饰的有无均能够识别目标B3GNT3多肽片段。
<实施例3:利用本发明的抗B3GNT3抗体进行的受试者试样和上皮性卵巢癌细胞株的培养上清中的B3GNT3多肽片段的检测>
确认利用实施例1得到的GT117-3抗体,能够从受试者试样(上皮性卵巢癌患者的腹腔清洗液)和上皮性卵巢癌细胞株的培养上清中检测本发明的上皮性卵巢癌标志物即B3GNT3多肽片段。
(方法)
将从上皮性卵巢癌患者采取的腹腔清洗液、卵巢癌细胞株的培养上清3种(RMG-I、RMG-V、RMUG-S)、以及作为对照的FLAG-B3GNT3多肽片段用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,转印到PVDF膜,用含有5%脱脂牛奶的PBS封闭。与使用生物素标记试剂盒(同仁化学研究所)标识的GT117-3抗体(1μg/mL)在室温反应2小时后,清洗,与HRP标识链霉亲和素(GE Healthcare公司)在室温反应60分钟,进一步地利用清洗后Western印迹检测试剂(Perkin Elmer公司)通过化学发光进行检测。
(结果)
将结果示于图2。从上皮性卵巢癌患者的腹腔清洗液和上皮性卵巢癌细胞株RMG-V以及RMUG-S的培养上清,利用GT117-3抗体检测出被预测为B3GNT3多肽片段的弥散条带(箭头头部)。该结果提示B3GNT3多肽片段由上皮性卵巢癌细胞株分泌,此外具有分泌到上皮性卵巢癌患者的腹腔清洗液中的可能性。能够确认特别是与粘液性卵巢癌细胞株RMUG-S的培养上清强烈反应,实施例1检测的表达量实际上反映了细胞外分泌量,B3GNT3多肽片段以高浓度被分泌。
<实施例4:使用了抗B3GNT3抗体的利用免疫沉淀进行的B3GNT3多肽片段的检测>
(方法)
用含有0.15M NaCl、0.1%叠氮化钠的50mM Tris缓冲液(pH8.0)将健康人混合血清稀释至100倍,将实施例1制备的FLAG-B3GNT3多肽片段以最终浓度为10μg/mL进行添加,将其作为免疫沉淀试样。在该试样各0.5mL中添加单克隆抗体GT117-2抗体或GT117-3抗体2μg、和蛋白质G凝胶(GE Healthcare公司)20μL,用旋转式摇床在4℃混合4小时。通过离心分离废弃样品溶液,将蛋白质G凝胶用上述Tris缓冲液清洗后,加入SDS-PAGE样品缓冲液40μL,在98℃加热5分钟得到免疫沉淀馏分。
接下来,将FLAG-B3GNT3多肽片段、上述GT117-2抗体和GT117-3抗体所致的免疫沉淀馏分、没有免疫沉淀的健康人混合血清和FLAG-B3GNT3多肽片段的混合物分别在SDS-PAGE还原条件下,使用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,转印至PVDF膜。用含有5%脱脂牛奶的PBS封闭后,与HRP标识抗FLAG抗体(M2、Sigma公司)在室温反应1小时。或与使用生物素标记试剂盒(同仁化学研究所)标识的GT117-2抗体(1μg/mL)或GT117-3抗体(0.5μg/mL)在室温反应2小时。清洗后,与HRP标识链霉亲和素(GE Healthcare公司)在室温反应60分钟。将这些PVDF膜清洗后,利用Western印迹检测试剂(Perkin Elmer公司)通过化学发光进行检测。
(结果)
将结果示于图3。作为免疫沉淀试样添加的FLAG-B3GNT3多肽片段可从任意的免疫沉淀馏分检测到。由此显示,本发明的单克隆抗体GT117-2抗体和GT117-3抗体均能够从血清这样的夹杂物多的蛋白质溶液中将B3GNT3多肽片段特异地免疫沉淀。
<实施例5:使用抗B3GNT3抗体的卵巢癌细胞株的免疫染色>
使用实施例1制备的抗B3GNT3单克隆抗体(GT117-2抗体和GT117-3抗体),进行卵巢癌细胞株的免疫染色。
(方法)
向上皮性卵巢癌细胞RMUG-S株添加产生GT117-2杂交瘤的培养上清(含有GT117-2抗体)、产生GT117-3杂交瘤的培养上清(含有GT117-3抗体)、或作为高尔基体反面标志物利用的抗B4GALT1单克隆抗体MAb8628(Uemura M.et al.,1992,Cancer Res.,52:6153-6157),在4℃反应一晚后,使用Anti-mouse alexa488(Life Technologies公司)将与各种糖转移酶结合的抗体反应可视化。将核用Hoechst33342(LifeTechnologies公司)染色,使用Keyence显微镜的BioZero,取得图像。
(结果)
将结果示于图4。a是用GT117-2抗体,b是用GT117-3抗体,c是用染色的阳性对照即抗B4GALT1抗体,将上皮性卵巢癌细胞株RMUG-S分别进行免疫染色的图。由抗体染色的部分用箭头表示、核染色的部分用箭头头部表示。由该结果可确认,无论使用GT117-2抗体和GT117-3抗体的任一个均能将上皮性卵巢癌细胞的上皮性卵巢癌标志物特异地染色。由抗B4GALT1抗体检测的糖转移酶的细胞内局部存在图案和由GT117-2抗体或GT117-3抗体检测的糖转移酶的细胞内局部存在图案是相同的。因此,可认为B3GNT3是局部存在于高尔基体的糖转移酶。该结果表明能够将本发明的GT117-2抗体和GT117-3抗体用于上皮性卵巢癌细胞和组织的染色。
<实施例6:用于夹心ELISA测定系的抗体的选择>
(方法)
将实施例1得到的2种抗B3GNT3抗体(GT117-2抗体和GT117-3抗体)用PBS以成为5μg/mL进行稀释,向ELISA用微孔板以100μL/孔逐一添加。在4℃将各抗体吸附于板一晚之后,将溶液废弃,将孔清洗。接下来,将含有3%牛白蛋白(BSA)的PBS作为封闭液以300μL/孔进行添加,进行封闭。将上述封闭液废弃,清洗后,将制备成0、125、500和2000ng/mL的B3GNT3多肽片段的溶液100μL添加到各孔。37℃反应2小时后,将孔中的溶液废弃,清洗后,使用生物素标记试剂盒(同仁化学研究所)将GT117-2抗体和GT117-3抗体标识化,将标识抗体分别制备为1μg/mL,室温反应2小时,之后,将溶液废弃清洗后,每孔添加辣根过氧化酶(HRP)标识亲和素(Jackson公司)溶液100μL,室温反应1小时。将反应液废弃,清洗后,利用TMB底物液(Pierce公司)显色,测定450nm的吸光度。使用的2种抗B3GNT3单克隆抗体(GT117-2抗体和GT117-3抗体)的组合中,将GT117-3抗体固相化,用GT117-2抗体检测的系统,空白值稳定灵敏度高(未示出数据)。因此,以后的实施例中,作为利用夹心ELISA测定系统检测B3GNT3多肽片段的优选组合,可使用GT117-3抗体作为微孔板固相化用、以及使用GT117-2抗体作为检测用。
<实施例7:高灵敏度夹心CLEIA测定系统的构筑>
为了提高利用实施例6中选择的单克隆抗体GT117-2抗体和GT117-3抗体的组合所带来的夹心ELISA测定系统的灵敏度,研究使用了化学发光的检测系统(化学发光酶免疫测定法,ChemiluminescentEnzyme Immunoassay;CLEIA法)的适用。
(方法)
将本发明的GT117-3抗体制备为4μg/mL,向荧光测光用96孔微孔板(Nunc公司)以100μL/孔逐一添加,室温固定7小时。将抗体溶液废弃后,用含有0.05%Tween20的PBS清洗,以300μL/孔添加封闭液(0.2%高纯度酪蛋白(I-Block、Life Technologies公司),含有0.1%Tween20、0.15M NaCl的20mM Tris-pH8.0),在4℃封闭一晚。作为浓度标准品,将B3GNT3多肽片段用上述封闭液制备为0、12.5、25、50、100、200、400、800ng/mL。将各浓度标准品10μL与90μL的封闭液同时添加到上述清洗后的微孔板,在37℃反应2小时。反应后,用含有0.05%Tween20的PBS清洗5次,将使用碱性磷酸酶标记试剂盒(同仁化学研究所)进行碱性磷酸酶标识的GT117-2抗体用上述封闭液制备成0.5μg/mL,以100μL/孔添加,在室温、暗处反应1个半小时。反应后,用含有0.05%Tween20的PBS清洗4次,用含有1mM氯化镁的20mM Tris(pH9.8)清洗2次,对1个孔添加化学发光试剂CSPDSubstrate Sapphire-II(Life Technologies公司)100μL,在室温、暗处进行反应,45分钟后测定发光强度。
(结果)
图5示出由浓度标准品的测定值得到的标准曲线。通过使用了本发明的GT117-2抗体和GT117-3抗体的夹心CLEIA法,确认能够以检测灵敏度为约10ng/mL将源自被检验者的试样中的糖转移酶B3GNT3多肽片段进行定量。使用该标准曲线,能够求出从受试者得到的试样中存在的B3GNT3多肽片段的浓度。
<实施例8:上皮性卵巢癌患者的腹腔清洗液等中的B3GNT3多肽片段量的测定>
(方法)
(1)实验例1
使用实施例7得到的B3GNT3多肽片段的标准曲线和夹心CLEIA法,将从上皮性卵巢癌患者采取的腹腔清洗液40例、从作为其对照组的腹腔内有播种的胃癌患者采取的腹腔清洗液55例、以及腹腔内没有播种的胃癌患者的腹腔清洗液159例作为试样,定量测定各自的试样中上皮性卵巢癌标志物(B3GNT3多肽片段)的浓度。关于测定方法的详细内容,按照实施例7记载的方法进行。
(2)比较例1
此外,将上述实验例1中使用的从上皮性卵巢癌患者采取的腹腔清洗液40例作为试样,测定各试样中的已有的卵巢癌标志物CA125和GAT。CA125使用Abnova公司的CA125(Human)ELISA试剂盒(Catalog No.:KA0205),GAT使用KONICA MINOLTA公司的GAT测试试剂盒,按照各自附加的说明书进行测定。将得到的各自的标志物的测定值,与由实验例1得到的卵巢癌患者腹腔清洗液40例的B3GNT3多肽片段的浓度测定值进行比较。
(结果)
将实验例1的结果示于图6,此外将比较例1的结果示于图7和图8。
首先,如图6所示那样,进行测定值(上皮性卵巢癌标志物浓度)的统计解析,结果上述3组中各自具有有意义的差异。特别是与胃癌的2组比较,卵巢癌中显示有意义的高测定值,对于其平均值,卵巢癌患者样本是112.5ng/mL、有播种的胃癌患者样本是21.9ng/mL、没有播种的胃癌患者样本是11.8ng/mL。该结果证明,通过采用使用了本发明的2个抗B3GNT3抗体即GT117-2抗体和GT117-3抗体的夹心CLEIA法,将其临界值设定为24ng/mL,能够由源自受试者的试样以高正确诊断率判定上皮性卵巢癌的罹患。
接下来,如图7所示那样,B3GNT3多肽片段的浓度没有显示出与已有的卵巢癌标志物CA125(a)和GAT(b)的任一个测定值相关。另一方面,如图8所示那样,CA125测定值和GAT测定值之间存在正相关,相关系数是0.65。这些结果提示,本发明的B3GNT3多肽片段的测定值反映了以与已有的卵巢癌标志物不同的机理而分泌的病理状态。
<实施例9:与MGAT5B测定值的组合>
通过将实施例8得到的本发明的上皮性卵巢癌标志物B3GNT3多肽片段的被检验者试样的测定值与基于糖转移酶的其它上皮性卵巢癌标志物的受试者试样的测定值组合,能够更进一步提高该被检验者罹患上皮性卵巢癌的正确诊断率。因此,由实施例8记载的被检验者试样定量测定B3GNT3多肽片段的同时,定量测定作为其它上皮性卵巢癌标志物的糖转移酶MGAT5B的多肽片段的浓度。
(方法)
B3GNT3多肽片段的在受试者试样中的浓度可使用实施例8的实验例1的结果。此外,在MGAT5B的多肽片段的浓度测定中,用与上述实施例8同样的方法,在使用了特异识别MGAT5B多肽片段的2个抗MGAT5B抗体即固相化用GT131-12抗体和检测用GT131-7抗体的夹心CLEIA法中,使用临界值4.0ng/mL。应予说明,如上所述,GT131-12抗体由杂交瘤GT131-12产生,此外GT131-7抗体由杂交瘤GT131-7产生。由于MGAT5B的测定浓度区域是B3GNT3的约1/10,所以由得到的各自测定值、使用“MGAT5B多肽片段浓度测定值×10+B3GNT3多肽片段浓度测定值”来进行统计解析。
(结果)
将结果示于图9。卵巢癌患者组中整体成为接近正态分布的分布。其假阴性变少。此外,对于胃癌患者中显示偏离的高值的2例,通过与MGAT5B测定值组合从而降低,即使是胃癌患者组,其测定值分布也显示更为集中。统计学解析中,没有播种的胃癌患者组和有播种的胃癌患者组的有意义差异变大(P<0.05~P<0.001),以卵巢癌患者组和有播种的胃癌患者组为对象的ROC曲线中最佳临界点的诊断效率从65%改善到74%。
将本说明书中引用的全部发行物、专利以及专利申请直接作为参考而援引入本说明书中。
保藏编号
GT117-2;国内保藏编号:FERM P-22095;国际受领编号:FERMABP-11494
GT117-3;国内保藏编号:FERM P-22096;国际受领编号:FERMABP-11495
GT131-2;国内保藏编号:FERM P-22097;国际受领编号:FERMABP-11496
GT131-7;国内保藏编号:FERM P-22098;国际受领编号:FERMABP-11497
GT131-12;国内保藏编号:FERM P-22099;国际受领编号:FERMABP-11498
GT131-18;国内保藏编号:FERM P-22100;国际受领编号:FERMABP-11499
PCT/RO/134表
Claims (18)
1.一种上皮性卵巢癌标志物检测用抗体,其特征在于,将由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的一部分作为表位进行识别。
2.根据权利要求1所述的抗体,其是单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体,其由国际受领编号为FERMABP-11494或FERM ABP-11495的杂交瘤产生。
4.一种上皮性卵巢癌标志物检测用重组抗体,其特征在于,含有权利要求1~3中任一项所述的抗体中的至少1组的对应的轻链互补链决定区域和重链互补链决定区域。
5.一种上皮性卵巢癌标志物检测用抗体片段,其特征在于,其是权利要求1~3中任一项所述的抗体或权利要求4所述的重组抗体的片段,具有特异地识别β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3的活性。
6.一种杂交瘤,其特征在于,产生权利要求2所述的抗体。
7.根据权利要求6所述的杂交瘤,国际受领编号是FERMABP-11494。
8.根据权利要求6所述的杂交瘤,国际受领编号是FERMABP-11495。
9.一种上皮性卵巢癌判定方法,其特征在于,对源自受试者的试样中存在的β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3多肽片段进行定量和/或定性地检测,基于该检测结果,判定该受试者有无罹患上皮性卵巢癌。
10.根据权利要求9所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,所述β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3多肽片段的定量检测结果中β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3多肽片段的定量值在规定的值以上时,判定该受试者罹患上皮性卵巢癌的可能性高。
11.根据权利要求9或10所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,所述β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3多肽片段是由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽的全部或一部分。
12.根据权利要求9~11中任一项所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,使用选自权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求4所述的重组抗体和权利要求5所述的抗体片段中的至少1种的抗体、重组抗体和/或抗体片段检测β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3多肽片段。
13.根据权利要求12所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,使用识别β1,3-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶3多肽片段上的不同表位的2种抗体、重组抗体和/或抗体片段。
14.根据权利要求9~13中任一项所述的上皮性卵巢癌判定方法,进一步对所述试样中存在的β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B多肽片段进行定量和/或定性地检测,基于该检测结果和权利要求9~12中任一项所述的检测结果,判定受试者有无罹患上皮性卵巢癌。
15.根据权利要求14所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,所述β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B多肽片段的定量检测结果中,β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B多肽片段的定量值在规定的值以上时,判定该受试者罹患上皮性卵巢癌的可能性更高。
16.根据权利要求14或15所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,使用选自将由序列号3所示的氨基酸序列构成的多肽的一部分作为表位进行识别的抗β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B抗体、含有该抗β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B抗体中存在的至少1组的对应的轻链CDR和重链CDR的抗β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B重组抗体、和具有特异地识别β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B的活性的抗β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B抗体或抗β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B重组抗体的片段中的至少1种的抗体、重组抗体和/或抗体片段,检测β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B多肽片段。
17.根据权利要求16所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,所述抗β1,6-N-乙酰基葡萄糖胺转移酶5B抗体由国际受领编号为FERMABP-11496、FERM ABP-11497、FERM ABP-11498或FERM ABP-11499的杂交瘤产生。
18.根据权利要求9~17中任一项所述的上皮性卵巢癌判定方法,其中,所述试样是体液、腹腔清洗液或组织。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140604 |