JP2017077182A - 抗slc6a6抗体を用いたがん治療用医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】がん特異的で副作用の少ない新たな医薬組成物の提供。【解決手段】従来の抗体よりも親和性が高く、ネイティブなSLC6A6又はSLC6A6の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を含む医薬組成物。【選択図】なし
Description
本発明は、SLC6A6の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体および当該モノクローナル抗体を含む、がん治療用医薬組成物に関する。
がんは世界的にも死因の上位を占めており、中でも大腸がんは、がんの死亡率において上位に位置する疾患である。日本でも大腸がんの患者数は近年急激に増加しており、年間約6万人が大腸がんに罹患し、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く3番目の多さとなっている。大腸がんは、大腸のみにとどまる場合には5年生存率は約90%以上であり、早期発見が治癒率の高さに繋がるがんとして知られている。それにもかかわらず大腸がんが死亡数の多いがんである理由は、高い罹患率に加え、リンパ節への転移が起きると5年生存率が70%、肺や肝臓へ遠隔転移すると25%以下と、がんの進行に伴って急激に死亡率が悪化する点が挙げられる。これら大腸がんに対する治療法としては、外科治療と化学療法が一般的であるが、近年の分子標的薬の出現によって、がん特異的な新たな治療法が模索されるようになった。
大腸がんに対する分子標的薬として日本で承認された抗体医薬品としては、アバスチンやアービタックスが知られている。これらは、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)や上皮成長因子(EGF)という増殖因子をターゲットとした抗体医薬品である。アバスチンは治癒切除が不可能な進行・再発の大腸がんでの使用が承認されており、VEGFに結合し、VEGF受容体との結合を抑制することで血管新生を抑制して、腫瘍組織への栄養を絶つという作用機序で働く。
アービタックスは、EGF受容体(EGFR)に結合し、EGFによる細胞増殖シグナルが働かないようにすることでがん細胞の増殖を停止させることを狙いとする。また、抗体ががん細胞の表面に結合することで、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)やマクロファージなどによる抗体依存性細胞障害(ADCC、Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)によりがん細胞を死滅させる作用機序も働いていると言われている。
このように、抗体に代表される分子標的薬は、がんを特異的に認識すればがん細胞を殺傷する点で優れた物質である。しかし、抗体が正常細胞にも結合した場合、重篤な副作用を示す場合がある。例えば、乳がん治療薬であるハーセプチンは頭痛や無力症、吐き気・嘔吐だけでなく、間質性肺炎や骨髄抑制、肝障害、腎障害、脳血管障害を引き起こす場合がある。また、組織染色では、正常な心筋細胞とも強く反応し重篤な心障害を引き起こすことが知られている(非特許文献2)。さらに、ハーセプチンはHer2を標的とした抗体医薬品であるため、Her2を発現している患者にしか奏効性を示さないという課題が残されている。
大腸がん治療薬であるアバスチンでは、副作用として出血、血栓症、消化管穿孔、創傷治療の遅延、血圧上昇などが挙げられ、このうち血栓症と消化管穿孔は生命にかかわる副作用である(非特許文献3)。アービタックスでは、副作用としては皮膚障害等が知られており、生命を脅かすものではないが痒みや白色の膿泡等が起き、患者への精神的、肉体的な負担が存在する(非特許文献4)。また、EGFR下流のシグナル変化(例えばK−ras変異)によるがん化には作用を示さないという問題も存在している。
したがって、がんに対する抗体医薬品は、重篤な副作用が発生することや、奏効性を示す患者が限定されるなどの課題が残されており、がん特異的な分子標的及び副作用が少ない医薬品の新たな開発が求められている。
がん細胞は、正常細胞に比べ、高い増殖力や細胞分裂の回数に制限がない、周辺組織への浸潤や転移を起こすという特徴を持っている。近年、がん組織の中のがん細胞全てがこのような性質を持つのではなく、一部の限られた細胞がこのような性質を持つと考えられるようになった。すなわち、これらの一部のがん細胞は、自らと全く同じ細胞を作り出す自己複製能と、多種類の細胞に分化しうる多分化能という、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞に共通して見られる特徴を有し、これらの特徴によってがん組織中で自己複製により自分と同じ細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数のがん細胞を生み出すもとになっていると考えられている。このような一部のがん細胞は、がん幹細胞と呼ばれており、がんはこの幹細胞様の細胞から発生・進行するという仮説(がん幹細胞仮説)が提唱されている。
現在のところ、がん幹細胞マーカーとしては、CD133、CD24、CD44などの分子マーカーが知られている(非特許文献1)が、これらに対する抗体は、一部のがん幹細胞に結合するにしか過ぎず、治療薬として有効性がないといわれている。また、LGR5はR-スポンジンと相互作用し、Wnt/β-カテニンシグナルを活性化する機構を持っており、がん幹細胞マーカーとして利用できる可能性が示唆されている(特許文献1)。
がん幹細胞は、がんの再発や転移の主要な原因と考えられており、がん治療においてがん幹細胞を標的にすることの重要性が指摘されている。しかし、腫瘍組織内におけるがん幹細胞の比率はわずかしかなく、がん幹細胞のみをターゲットとした治療薬では、がん細胞全体を殺傷することが出来ないとも考えられている。すなわち、正常組織に比べ、がん幹細胞で極めて高く発現しており、かつ、一般的ながん細胞でも発現しているようなマーカーを標的とする新たな治療法の開発が、がん医療にとって重要な課題である。
ところで、SLC6A6(solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, taurine), member 6)は、620アミノ酸からなる12回膜貫通型の膜タンパク質であり、NCBI(米国生物工学情報センター)にReference Sequences [RefSeq] ID:NM_003043、NP_003034.2として登録されている(配列番号1:塩基配列(CDS:296〜2158)、配列番号2:アミノ酸配列)。SLC6A6はタウリンの細胞内への取り込みに関与しており、ナトリウムイオン及びクロライドイオンとともにタウリンを共輸送する。膜タンパク質には、リガンドと結合する受容体だけでなく、アミノ酸や糖等の低分子化合物を能動的あるいは受動的に輸送する輸送タンパク質(以下、トランスポーターと記載する)も存在する。
国際公開公報第2012/029990号(特許文献2)には、SLC6A6が大腸がんに発現し、その細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体によって、大腸がんを検出でき、診断薬として利用できることが示されている。さらに、特許文献2は、SLC6A6の遺伝子は、5症例の大腸がん組織全てで発現している一方で、5症例の正常組織には遺伝子の転写がみられないことをin situハイブリダイゼーション法で明らかにしている。さらに、取得されたモノクローナル抗体の2種類のクローン(4B9b及び5H12d)は、SLC6A6タンパク質の145番目〜213番目までのアミノ酸残基の間にエピトープが存在することが記載されている。
GASTROENTEROLOGY, 138, 2151-2162, 2010
British Journal of Cancer, 94, 1016-1020, 2006
Cancer Research,57, 4593-4599, 1997
Journal of Clinical Oncology, 22, 1201-1208, 2004
Cell Division, 2, 11, 2007
一般的にがんの手術による治療は、転移巣の治療が困難であるばかりでなく、侵襲と合併症の併発を伴うことが問題である。また、化学療法や放射線治療は副作用が問題となっている。さらに、既存の抗体医薬品は副作用の発生に加えて、奏効性を全く示さないがんが存在する。そこで、がん特異的な分子標的及び副作用の少ない新たな医薬品の開発が求められていた。
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、国際公開公報第2012/029990号(WO2012/029990)記載の抗SLC6A6モノクローナル抗体よりもネイティブなSLC6A6への親和性を高めた新たなモノクローナル抗体を取得した。本発明者は、SLC6A6が、通常のがん細胞よりもがんの再発や転移の主要な原因であるがん幹細胞に高く発現しているという知見を見出した。また本発明者は、当該抗体が、驚くべきことに抗腫瘍効果を示すことを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[1]
(a)配列番号24に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜125番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(b)配列番号28に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(c)配列番号32に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜128番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(d)配列番号36に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜131番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(e)配列番号40に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜129番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、または
(f)配列番号44に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域
を含有する、抗体または抗原結合断片。
[2]
(g)配列番号26に示すアミノ酸配列の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(h)配列番号30に示すアミノ酸配列の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(i)配列番号34に示すアミノ酸配列の48〜58番目、74〜80番目および113〜120番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(j)配列番号38に示すアミノ酸配列の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(k)配列番号42に示すアミノ酸配列の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、または
(l)配列番号46に示すアミノ酸配列の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域
を含有する、抗体または抗原結合断片。
[3]
[1]に記載の重鎖可変領域および[2]に記載の軽鎖可変領域を含む、[1]または[2]に記載の抗体または抗原結合断片。
[4]
配列番号24に示すアミノ酸配列の21〜135番のアミノ酸配列、配列番号28に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列、配列番号32に示すアミノ酸配列の21〜138番のアミノ酸配列、配列番号36に示すアミノ酸配列の21〜141番のアミノ酸配列、配列番号40に示すアミノ酸配列の21〜139番のアミノ酸配列および配列番号44に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含有する、抗体または抗原結合断片。
[5]
配列番号26に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号30に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列、配列番号34に示すアミノ酸配列の25〜131番のアミノ酸配列、配列番号38に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号42に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列および配列番号46に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、抗体または抗原結合断片。
[6]
[4]に記載の重鎖可変領域および[5]に記載の軽鎖可変領域を含有する、[4]または[5]に記載の抗体または抗原結合断片。
[7]
配列番号24、28、32、36、40および44からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含有する、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
[8]
配列番号26、30、34、38、42および46からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する、[1]〜[7]のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
[9]
ヒト−マウスキメラ抗体または抗原結合断片である、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
[10]
配列番号24に示すアミノ酸配列の21〜135番のアミノ酸配列、配列番号28に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列、配列番号32に示すアミノ酸配列の21〜138番のアミノ酸配列、配列番号36に示すアミノ酸配列の21〜141番のアミノ酸配列、配列番号40に示すアミノ酸配列の21〜139番のアミノ酸配列および配列番号44に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする単離された核酸。
[11]
重鎖可変領域および重鎖定常領域をコードする、[10]に記載の核酸。
[12]
配列番号26に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号30に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列、配列番号34に示すアミノ酸配列の25〜131番のアミノ酸配列、配列番号38に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号42に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列および配列番号46に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする単離された核酸。
[13]
重鎖可変領域および軽鎖定常領域をコードする、[12]に記載の核酸。
[14]
[10]〜[13]のいずれか1項に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
[15]
[14]に記載のベクターが導入された宿主細胞。
[16]
[15]に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトSLC6A6に対する抗体または抗原結合断片の製造方法。
[17]
[1]〜[9]のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、医薬組成物。
[18]
がんを治療するための[17]に記載の医薬組成物。
[19]
がんが、大腸がん、乳がんまたは子宮がんである、[18]に記載の医薬組成物。
[20]
がんが大腸がんである、[18]に記載の医薬組成物。
[1]
(a)配列番号24に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜125番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(b)配列番号28に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(c)配列番号32に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜128番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(d)配列番号36に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜131番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(e)配列番号40に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜129番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、または
(f)配列番号44に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域
を含有する、抗体または抗原結合断片。
[2]
(g)配列番号26に示すアミノ酸配列の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(h)配列番号30に示すアミノ酸配列の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(i)配列番号34に示すアミノ酸配列の48〜58番目、74〜80番目および113〜120番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(j)配列番号38に示すアミノ酸配列の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(k)配列番号42に示すアミノ酸配列の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、または
(l)配列番号46に示すアミノ酸配列の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域
を含有する、抗体または抗原結合断片。
[3]
[1]に記載の重鎖可変領域および[2]に記載の軽鎖可変領域を含む、[1]または[2]に記載の抗体または抗原結合断片。
[4]
配列番号24に示すアミノ酸配列の21〜135番のアミノ酸配列、配列番号28に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列、配列番号32に示すアミノ酸配列の21〜138番のアミノ酸配列、配列番号36に示すアミノ酸配列の21〜141番のアミノ酸配列、配列番号40に示すアミノ酸配列の21〜139番のアミノ酸配列および配列番号44に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含有する、抗体または抗原結合断片。
[5]
配列番号26に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号30に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列、配列番号34に示すアミノ酸配列の25〜131番のアミノ酸配列、配列番号38に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号42に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列および配列番号46に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、抗体または抗原結合断片。
[6]
[4]に記載の重鎖可変領域および[5]に記載の軽鎖可変領域を含有する、[4]または[5]に記載の抗体または抗原結合断片。
[7]
配列番号24、28、32、36、40および44からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含有する、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
[8]
配列番号26、30、34、38、42および46からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する、[1]〜[7]のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
[9]
ヒト−マウスキメラ抗体または抗原結合断片である、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
[10]
配列番号24に示すアミノ酸配列の21〜135番のアミノ酸配列、配列番号28に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列、配列番号32に示すアミノ酸配列の21〜138番のアミノ酸配列、配列番号36に示すアミノ酸配列の21〜141番のアミノ酸配列、配列番号40に示すアミノ酸配列の21〜139番のアミノ酸配列および配列番号44に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする単離された核酸。
[11]
重鎖可変領域および重鎖定常領域をコードする、[10]に記載の核酸。
[12]
配列番号26に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号30に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列、配列番号34に示すアミノ酸配列の25〜131番のアミノ酸配列、配列番号38に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号42に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列および配列番号46に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする単離された核酸。
[13]
重鎖可変領域および軽鎖定常領域をコードする、[12]に記載の核酸。
[14]
[10]〜[13]のいずれか1項に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
[15]
[14]に記載のベクターが導入された宿主細胞。
[16]
[15]に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトSLC6A6に対する抗体または抗原結合断片の製造方法。
[17]
[1]〜[9]のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、医薬組成物。
[18]
がんを治療するための[17]に記載の医薬組成物。
[19]
がんが、大腸がん、乳がんまたは子宮がんである、[18]に記載の医薬組成物。
[20]
がんが大腸がんである、[18]に記載の医薬組成物。
また、本発明の別の態様において、SLC6A6の細胞外領域内の立体構造をとるエピトープに結合するモノクローナル抗体、および当該抗体またはその抗原結合断片を含む、がん治療用医薬組成物を提供する。
ここで、前記エピトープは、以下の(a)〜(c)から選択される少なくとも1つに示されるポリペプチドを含む:
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、SLC6A6の細胞外領域として機能するポリペプチド
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列に70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SLC6A6の細胞外領域として機能するポリペプチド。
ここで、前記エピトープは、以下の(a)〜(c)から選択される少なくとも1つに示されるポリペプチドを含む:
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、SLC6A6の細胞外領域として機能するポリペプチド
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列に70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SLC6A6の細胞外領域として機能するポリペプチド。
本発明により、従来の抗体よりも高い親和性を有するSLC6A6モノクローナル抗体または抗原結合断片、当該抗体または抗原結合断片を含む医薬組成物が提供される。当該抗体はキメラ化され得るため、ヒトに適用された際の副作用を軽減することができる。また、当該抗体は抗腫瘍作用を有するため、当該医薬組成物は、特に大腸がん治療用医薬組成物として有用である。
また、SLC6A6は、正常組織に比べ、がん幹細胞で極めて高く発現しており、かつ、一般的ながん細胞でも発現しているため、本発明によって、がん幹細胞を主な対象としつつ、がん幹細胞だけを標的とするのでなく、がん細胞全体をも標的とする新たながんの治療薬または治療法が提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。なお。本発明は、以下の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で適宜変形して実施することができる。
本発明は、SLC6A6に高い親和性で結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。また、本発明は、当該抗体、抗原結合断片、およびそれらを含有する医薬組成物、並びに当該抗体を産生するハイブリドーマ細胞、当該抗体および断片を製造するための核酸、組換え発現ベクター、および細胞に関する。
SLC6A6(solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, taurine), member 6)は、12回膜貫通型の膜タンパク質であり、その細胞外領域はタウリンとの結合及びタウリンの細胞内部への輸送を担っていることが推測されている。
本発明は、膜タンパク質であるSLC6A6が、がんの組織において過剰発現されるタンパク質であり、通常のがん細胞よりも、がんの再発や転移の主要な原因であるがん幹細胞に高く発現しているという知見に基づくものである。さらに、本発明は、SLC6A6に高い親和性を有する抗体が、抗がん作用を有するとの知見に基づくものである。
本発明は、SLC6A6の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。SLC6A6は大腸がん等のがん細胞で発現するため、この抗体は、大腸がん等のがん細胞に特異的に結合する。また、本発明における抗SLC6A6抗体は、従来の抗SLC6A6抗体よりも高い親和性でSLC6A6に結合し得る。
また、本発明の抗SLC6A6抗体は、抗がん作用を有するため、がんの治療に使用することができる。したがって、本発明は、本発明の抗SLC6A6抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、がん、特に大腸がん、乳がん、子宮がんの治療に有用である。
1.本発明の抗SLC6A6抗体
本発明のモノクローナル抗体(以下「本発明の抗SLC6A6抗体」ともいう)は、ネイティブなSLC6A6を認識することができる。「ネイティブな」とは、そのタンパク質が生体内の環境で有するインタクトな立体構造の状態にあることをいう。
本発明のモノクローナル抗体(以下「本発明の抗SLC6A6抗体」ともいう)は、ネイティブなSLC6A6を認識することができる。「ネイティブな」とは、そのタンパク質が生体内の環境で有するインタクトな立体構造の状態にあることをいう。
また、本発明の別の態様において、本発明の抗SLC6A6抗体は、SLC6A6の細胞外領域を認識することができる。詳しくは、本発明の抗SLC6A6抗体は、SLC6A6の細胞外領域内の立体構造の少なくとも一部をエピトープとして認識する。特に、細胞外領域として、SLC6A6のアミノ酸残基143〜216の領域(配列番号4)を認識することができる。
本発明の抗SLC6A6抗体は、配列番号4に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれる範囲、すなわち結合対象のポリペプチドがSLC6A6の細胞外領域としての機能を有する限りにおいて、配列番号4に示すアミノ酸配列の1個もしくは数個(例えば2〜20個、好ましくは2〜10個、より好ましくは2、3、4または5個)のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入が行われている変異型ポリペプチド、配列番号4に示すアミノ酸配列に70%以上、好ましくは80%以上、90%以上、95%以上、あるいは98%以上の同一性を有する変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。
また、本発明の別の態様において、本発明の抗SLC6A6抗体は、SLC6A6の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドであって、配列番号3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、配列番号3に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、配列番号3に記載の塩基配列に70%以上、好ましくは80%以上、90%以上、95%以上、98%以上、あるいは99%以上の同一性を有するポリヌクレオチドにコードされる変異型ポリペプチドまたは配列番号3に記載の塩基配列と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドにコードされる変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。ここで、ハイブリダイゼーションは、公知の方法(例えば、Molecular Cloning 2nd Ed (Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に従って行うことができる。高ストリンジェントな条件は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が10 mM〜300 mM、好ましくは20 mM〜100 mMであり、温度が25℃〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう。あるいは、本発明の抗SLC6A6抗体はSLC6A6に結合するものであるから、上記変異型ポリペプチドにおいて、本発明の抗SLC6A6抗体が結合することができるものは、抗体の配列番号4のアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれることを示し、すなわちSLC6A6の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドに含まれる。
変異型ポリペプチドがSLC6A6の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、動物細胞などで変異型ポリペプチドを強制発現させ、タウリンの取り込みをactivation method(J. Membr. Biol , 76, 1-15, 1983)で解析することにより確認することができると考えられる。また、SLC6A6の細胞外領域は、がん細胞において発現が上昇するマーカータンパク質の細胞表面部位である。変異型ポリペプチドがSLC6A6の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、正常細胞とがん細胞における変異型ポリペプチドの発現を、免疫染色、ELISA、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、FACSなどで比較することにより確認することができる。
本発明の抗SLC6A6抗体とエピトープまたは変異型ポリペプチドとの結合は、ELISA、免疫沈降、ウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
また、本発明の別の態様において、本発明の抗SLC6A6抗体は、slc6a6のmRNAバリアントがコードするタンパク質をも認識する。全長のSLC6A6だけでなく、一部を欠損した変異体にも結合することができるため、SLC6A6を発現するがん細胞と広範に結合することが可能である。
本発明において、「抗体」は、2つの重鎖及び2つの軽鎖よりなる免疫グロブリン分子である。各重鎖は、重鎖可変領域(VH)及び重鎖定常領域(CH)よりなる。この重鎖定常領域は、3つのドメインCH1、CH2及びCH3よりなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)及び軽鎖定常領域(CL)よりなる。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLよりなる。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、更に、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる比較的保存されている領域と相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域よりなる。各VH及びVLは、3つのCDRと4つのFRよりなり、アミノ末端からカルボキシ末端までFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順で配置されている。
本発明の抗SLC6A6抗体は、完全長であってもよいし、抗原結合断片であってもよい。完全長である場合、本発明の抗SLC6A6抗体は、WO2012/029990公報に記載されるサブクラスIgMのSLC6A6抗体とは異なり、サブクラスIgGである。したがって、免疫組織染色及び/またはフローサイトメーターによる解析において、本発明の抗SLC6A6抗体はSLC6A6へのより高い親和性を有する。
本発明において、抗体の「抗原結合部分」(又は単に「抗体部分」)は、抗原( 例
えば、SLC6A6)に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により遂行され得ることが知られている。抗体の「抗原結合部分」の例として、限定されるわけではないが、Fab、F(ab´)2、Fd断片、Fv、dAb、CDR、scFv、ディアボディなどが挙げられる。Fab及びF(ab´)2断片等の抗体部分は、慣用の技術、例えば、それぞれ、全抗体のパパイン又はペプシン消化を用いて、完全長抗体から調製することができる。また、抗体及び抗原結合断片は、標準的な組換えDNA技術を用いて得ることができる。
えば、SLC6A6)に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により遂行され得ることが知られている。抗体の「抗原結合部分」の例として、限定されるわけではないが、Fab、F(ab´)2、Fd断片、Fv、dAb、CDR、scFv、ディアボディなどが挙げられる。Fab及びF(ab´)2断片等の抗体部分は、慣用の技術、例えば、それぞれ、全抗体のパパイン又はペプシン消化を用いて、完全長抗体から調製することができる。また、抗体及び抗原結合断片は、標準的な組換えDNA技術を用いて得ることができる。
本発明においては、種々の遺伝子工学的およびタンパク質工学的な手法により、モノクローナル抗体の一部である抗原結合断片もしくは抗体断片、低分子化抗体、遺伝子組換え抗体、抗体修飾物などの抗体様分子、またはモノクローナル抗体が融合したタンパク質を作製することができる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば、H鎖、L鎖、Fv、Fab、Fab´、F(ab´)2、scFv、sdFv、sc(Fv)2、(scFv)2、ディアボディ、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体などが挙げられる。いずれも、SLC6A6の細胞外領域への結合能を有している分子であれば、本発明の抗SLC6A6抗体に含まれる。
本発明の抗SLC6A6抗体が認識するSLC6A6は、検出対象となる細胞集団において、正常細胞では発現せず、がん細胞で発現し、さらにがん細胞に比べがん幹細胞で発現の高い分子マーカーである。したがって、当該抗体は、がん及びがん幹細胞の両方に結合し、かつがん幹細胞により多く結合する。
本発明における「がん細胞」とは、正常細胞に比べ、高い増殖力や細胞分裂の回数に制限がない、周辺組織への浸潤や転移を起こすなどの特徴を持っている細胞集団のことをいう。
本発明における「がん幹細胞」とは、がん細胞のうち幹細胞の性質を有する細胞である。幹細胞とは細胞分裂を経ても分化能を維持している細胞のことをいう。がん幹細胞は、ヘキスト蛍光色素(Hoechst33342)で染色し、フローサイトメトリーを利用してUVレーザー(波長約350nm)を励起光に用いて検出すると、Side Population(SP)画分に濃縮される細胞として認識される。SP画分とは、ヘキスト蛍光色素によって染色されるMain Population(MP)画分に対して、ABCトランスポーターなどを介して色素を細胞外に排出することで染色されない画分または染色の弱い画分のことを指す(The American Journal of Pathology, 178, 4, 1805-1813, 2011)。
本発明における「正常細胞」とは、生体または組織の活動において、正常な機能を有する細胞のことを指す。正常細胞は、体性幹細胞を含んでもよいが、好ましくは成熟細胞である。
本発明の別の態様において、本発明の抗SLC6A6抗体は、がん幹細胞により強く結合するものであり、かつ1または複数のがん種のがん細胞に結合することが出来る。好ましくは、当該がん種およびがん細胞は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸および末梢血単核球などの細胞または組織由来の1または複数のがん種であり、より好ましくは大腸がん、乳がん、子宮がんのがん細胞である。
さらに、本発明の別の態様において、本発明の抗SLC6A6抗体は、正常細胞においては結合しない。好ましくは、例えば、心臓、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、骨髄、大腸および末梢血単核球などの少なくとも1つ以上において、正常細胞に結合しない。
本発明の好ましい態様において、本発明の抗SLC6A6抗体は、以下細胞株(ハイブリドーマ)から産生される:
「Mouse-Mouse hybridoma 204」(以下「204」という);
「mouse-mouse hybridoma 205」(以下「205」という);
「Mouse-Mouse hybridoma 303」(以下「303」という);
「mouse-mouse hybridoma 419」(以下「419」という);
「Mouse-Mouse hybridoma 402」(以下「402」という);
「mouse-mouse hybridoma 422」(以下「422」という);または
「mouse-mouse hybridoma 430」(以下「430」という)。
本発明は、これらのハイブリドーマおよびこれらが産生する抗体を提供する。当該ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
「Mouse-Mouse hybridoma 204」(以下「204」という);
「mouse-mouse hybridoma 205」(以下「205」という);
「Mouse-Mouse hybridoma 303」(以下「303」という);
「mouse-mouse hybridoma 419」(以下「419」という);
「Mouse-Mouse hybridoma 402」(以下「402」という);
「mouse-mouse hybridoma 422」(以下「422」という);または
「mouse-mouse hybridoma 430」(以下「430」という)。
本発明は、これらのハイブリドーマおよびこれらが産生する抗体を提供する。当該ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
本発明の抗SLC6A6抗体は、好ましくは、以下に示す重鎖相補性決定領域(CDR)もしくは軽鎖CDR、または重鎖可変領域(VH)もしくは軽鎖可変領域(VL)を有する。重鎖可変領域は、以下に示すVHから選択することができ、また、軽鎖可変領域も以下に示すVLから選択することができる。
「205」の産生する抗体は、配列番号24の21〜135番目のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号26の21〜127番目のアミノ酸配列を含むVLを含む。
また、「205」の産生する抗体は、配列番号24の50〜54番目、69〜86番目および118〜125番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号26の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
また、「205」の産生する抗体は、配列番号24の50〜54番目、69〜86番目および118〜125番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号26の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
「402」の産生する抗体は、配列番号28の21〜136番目のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号30の23〜130番目のアミノ酸配列を含むVLを含む。
また、「402」の産生する抗体は、配列番号28の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号30の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
また、「402」の産生する抗体は、配列番号28の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号30の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
「419」の産生する抗体は、配列番号32の21〜138番目のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号34の25〜131番目のアミノ酸配列を含むVLを含む。
また、「419」の産生する抗体は、配列番号32の50〜54番目、69〜86番目および118〜128番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号34の48〜58番目、74〜80番目および113〜120番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
また、「419」の産生する抗体は、配列番号32の50〜54番目、69〜86番目および118〜128番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号34の48〜58番目、74〜80番目および113〜120番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
「303」の産生する抗体は、配列番号36の21〜141番目のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号38の21〜127番目のアミノ酸配列を含むVLを含む。
また、「303」の産生する抗体は、配列番号36の50〜54番目、69〜86番目および118〜131番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号38の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
また、「303」の産生する抗体は、配列番号36の50〜54番目、69〜86番目および118〜131番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号38の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
「422」の産生する抗体は、配列番号40の21〜139番目のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号42の21〜127番目のアミノ酸配列を含むVLを含む。
また、「422」の産生する抗体は、配列番号40の50〜54番目、69〜86番目および118〜129番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号42の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
また、「422」の産生する抗体は、配列番号40の50〜54番目、69〜86番目および118〜129番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号42の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
「430」の産生する抗体は、配列番号44の21〜136番目のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号46の23〜130番目のアミノ酸配列を含むVLを含む。
また、「430」の産生する抗体は、配列番号44の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号46の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
また、「430」の産生する抗体は、配列番号44の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVH、および配列番号46の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含むVLを含む。
本発明の一態様において好ましい抗体は、ハイブリドーマ「419」、「402」または「430」の産生するモノクローナル抗体である。
また、本発明の抗SLC6A6抗体は、重鎖が配列番号24、28、32、36、40または44で示されるアミノ酸配列を含み、または軽鎖が配列番号26、30、34、38、42または46で示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様において、本発明は、少なくとも配列番号24、28、32、36、40または44で示されるアミノ酸配列と少なくとも70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有するアミノ配列を含む重鎖、および少なくとも配列番号26、30、34、38、42または46で示されるアミノ酸配列と少なくとも70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有するアミノ配列を含む軽鎖を含む抗体またはその抗原結合部分を提供する。
さらに、本発明の別の態様において、本発明は、
配列番号24の21〜135番目のアミノ酸配列、
配列番号28の21〜136番目のアミノ酸配列、
配列番号32の21〜138番目のアミノ酸配列、
配列番号36の21〜141番目のアミノ酸配列、
配列番号40の21〜139番目のアミノ酸配列、または
配列番号44の21〜136番目のアミノ酸配列と
少なくとも75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有するアミノ配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号26の21〜127番目のアミノ酸配列、
配列番号30の23〜130番目のアミノ酸配列、
配列番号34の25〜131番目のアミノ酸配列、
配列番号38の21〜127番目のアミノ酸配列、
配列番号42の21〜127番目のアミノ酸配列、または
配列番号46の23〜130番目のアミノ酸配列と
少なくとも75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有するアミノ配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体またはその抗原結合部分を提供する。
配列番号24の21〜135番目のアミノ酸配列、
配列番号28の21〜136番目のアミノ酸配列、
配列番号32の21〜138番目のアミノ酸配列、
配列番号36の21〜141番目のアミノ酸配列、
配列番号40の21〜139番目のアミノ酸配列、または
配列番号44の21〜136番目のアミノ酸配列と
少なくとも75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有するアミノ配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号26の21〜127番目のアミノ酸配列、
配列番号30の23〜130番目のアミノ酸配列、
配列番号34の25〜131番目のアミノ酸配列、
配列番号38の21〜127番目のアミノ酸配列、
配列番号42の21〜127番目のアミノ酸配列、または
配列番号46の23〜130番目のアミノ酸配列と
少なくとも75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有するアミノ配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体またはその抗原結合部分を提供する。
さらに、本発明の別の態様において、本発明は、
配列番号24の50〜54番目、69〜86番目および118〜125番目のアミノ酸配列、
配列番号28の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列、
配列番号32の50〜54番目、69〜86番目および118〜128番目のアミノ酸配列、
配列番号36の50〜54番目、69〜86番目および118〜131番目のアミノ配列、
配列番号40の50〜54番目、69〜86番目および118〜129番目のアミノ配列または
配列番号44の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ配列と
少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有するアミノ配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含み、
配列番号26の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列、
配列番号30の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列、
配列番号34の48〜58番目、74〜80番目および113〜120番目のアミノ酸配列、
配列番号38の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ配列、
配列番号42の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ配列または
配列番号46の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ配列と、
少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有するアミノ配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む、抗体またはその抗原結合部分を提供する。
配列番号24の50〜54番目、69〜86番目および118〜125番目のアミノ酸配列、
配列番号28の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列、
配列番号32の50〜54番目、69〜86番目および118〜128番目のアミノ酸配列、
配列番号36の50〜54番目、69〜86番目および118〜131番目のアミノ配列、
配列番号40の50〜54番目、69〜86番目および118〜129番目のアミノ配列または
配列番号44の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ配列と
少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有するアミノ配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含み、
配列番号26の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列、
配列番号30の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列、
配列番号34の48〜58番目、74〜80番目および113〜120番目のアミノ酸配列、
配列番号38の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ配列、
配列番号42の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ配列または
配列番号46の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ配列と、
少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有するアミノ配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む、抗体またはその抗原結合部分を提供する。
また、配列番号24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44または46のアミノ酸配列と所定の同一性を有するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43または45の塩基配列と所定の同一性、例えば、少なくとも75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%の同一性を有する塩基配列によってコードされてもよい。
本発明の別の態様において、本発明の抗SLC6A6抗体は、キメラ抗体である。「キメラ抗体」は、重鎖定常領域および軽鎖の定常領域がヒトに由来し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がヒト以外(例、マウス)に由来する抗体を意味する。本明細書において、定常領域がヒトに由来し、可変領域がマウスに由来する抗体または抗原結合断片を、ヒト−マウスキメラ抗体または抗原結合断片と称することもある。
これらの特徴を有する本発明の抗SLC6A6抗体は、通常のモノクローナル抗体の製法とは異なり、WO2010/098471に開示されるように、膜タンパク質を発現させた細胞を生着させる免疫法を用いて得ることができる。一方で、当業者において一般的に実施されている製法によっては、本発明の抗SLC6A6抗体の作製は困難であることが予想される。その理由としては:
(1)抗原として膜タンパク質を調製する際に、界面活性剤を使用すると膜タンパク質の立体構造が崩れ、その一方、界面活性剤を使用しない場合は膜タンパク質が疎水性領域同士で凝集する;
(2)細胞表面の発現量が低い、または細胞外領域が小さいために免疫応答が起こらない;
などの理由による。
本発明の抗SLC6A6抗体は、本発明者らが抗体の製法(特に免疫方法)に工夫を施した結果、従来の抗体に対して優れた特徴を獲得したものである。
(1)抗原として膜タンパク質を調製する際に、界面活性剤を使用すると膜タンパク質の立体構造が崩れ、その一方、界面活性剤を使用しない場合は膜タンパク質が疎水性領域同士で凝集する;
(2)細胞表面の発現量が低い、または細胞外領域が小さいために免疫応答が起こらない;
などの理由による。
本発明の抗SLC6A6抗体は、本発明者らが抗体の製法(特に免疫方法)に工夫を施した結果、従来の抗体に対して優れた特徴を獲得したものである。
本発明の一態様において、本発明の抗SLC6A6抗体は、以下の特徴を有する。本発明の抗体は、SLC6A6が本来有する立体構造をもとに作製されたために、ネイティブなSLC6A6を認識することができる。そのため、同じエピトープを認識する従来の抗体(HPA015028)と比較して結合力が非常に高く、従来の抗体では困難であった細胞膜上のSLC6A6と十分に結合することができる。また、SLC6A6の膜内および細胞内の領域を認識する従来のモノクローナル抗体(sc−166640)に対して、本発明の抗体の認識部位は細胞外であるため、生きた細胞に結合することができる。そのため、本発明の抗SLC6A6抗体は、SLC6A6を発現するがん細胞を標的とする治療薬として有効である。
加えて、従来の抗体はポリクローナル抗体であり、均質な抗体を継続的に生産することが困難であったが、本発明の抗体はモノクローナル抗体であるため、再現性よく量産することが可能である。これらの特徴から、本発明の抗体は、がんの治療に利用することが出来る。
また、SLC6A6に対する抗体または抗原結合断片は、上記ハイブリドーマ204、205、303、419、402、422または430により産生されるSLC6A6に対するマウスモノクローナル抗体そのものに限られず、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本発明の抗SLC6A6抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープ(SLC6A6のアミノ酸配列のうち、第145番目から第213番目までのアミノ酸残基のほか、これらの領域の一部であってもよい。)を指す。
したがって、上記ハイブリドーマ204、205、303、419、402、422または430により産生されるSLC6A6に対するモノクローナル抗体のヒト−マウスキメラ抗体も、本発明の範囲に含まれる。例えば、
ヒト−マウスキメラ抗体205は、配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、
ヒト−マウスキメラ抗体402は、配列番号28で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、
ヒト−マウスキメラ抗体419は、配列番号32で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、
ヒト−マウスキメラ抗体303は、配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、
ヒト−マウスキメラ抗体422は、配列番号40で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、
ヒト−マウスキメラ抗体430は、配列番号44で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものである。
ヒト−マウスキメラ抗体205は、配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、
ヒト−マウスキメラ抗体402は、配列番号28で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、
ヒト−マウスキメラ抗体419は、配列番号32で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、
ヒト−マウスキメラ抗体303は、配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、
ヒト−マウスキメラ抗体422は、配列番号40で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、
ヒト−マウスキメラ抗体430は、配列番号44で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものである。
本発明の一態様において好ましい抗体は、ハイブリドーマ「419」、「402」または「430」により産生されるマウスモノクローナル抗体に重鎖可変領域および軽鎖可変領域が由来するヒト−マウスキメラ抗体である。
本発明の抗体は、組換え手段により調製され、発現される遺伝子組換え抗体または抗原結合断片であってもよい。例えば、本発明の抗SLC6A6抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってもよい。本発明の組換え抗体は、WO2010/098471に記載された方法を用いて得られた抗体の重鎖および軽鎖の組換え発現によって製造することができる。例えば、ヒト−マウスキメラ抗体であれば、SLC6A6タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、その重鎖(H鎖)定常領域をヒトIgGのH鎖定常領域遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。ヒト化抗体は、例えば、SLC6A6タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から単離した抗体の抗原結合部位の遺伝子をヒト由来の抗体分子に移植することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにSLC6A6タンパク質をWO2010/098471に開示される方法を用いて免疫することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体が融合したタンパク質は、抗原に結合する抗体の可変領域とその他のタンパク質を既存の遺伝子組み換えの手法を用いることにより作製することが出来る。あるいは、モノクローナル抗体とタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することが出来る。
遺伝子組換え抗体を発現させるには、例えば、該抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を有する組換え発現ベクターを、宿主細胞に導入し、当該ベクターが導入された宿主細胞を培養する。当該宿主細胞の培養物から目的の抗体を回収することができる。これらの核酸、組換え発現ベクター、当該ベクターが導入された宿主細胞、当該宿主細胞を用いる抗体または抗原結合断片の製造方法は、本発明に含まれる。抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子を入手し、これらの核酸を発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入するには、当分野で標準的な組換えDNA方法(Sambroockら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, N.Y.など)を採用することができる。
VHおよびVLをコードするDNA断片は、当分野で標準的な組換えDNA方法によって、例えば、Fab遺伝子、scFv遺伝子、完全長抗体遺伝子とするために、さらに操作することができる。
また、VHをコードする核酸(例えばDNA)は、VHをコードするDNAと重鎖定常領域(CH1、CH2およびCH3)をコードするDNAと発現可能に結合することによって、完全長の重鎖遺伝子へと変換することができる。ヒト、マウス等由来の重鎖定常領域の核酸配列は、当分野で公知である。
VHをコードする核酸としては、例えば、配列番号24に示すアミノ酸配列の21〜135番のアミノ酸配列、配列番号28に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列、配列番号32に示すアミノ酸配列の21〜138番のアミノ酸配列、配列番号36に示すアミノ酸配列の21〜141番のアミノ酸配列、配列番号40に示すアミノ酸配列の21〜139番のアミノ酸配列、および配列番号44に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む少なくとも1つの重鎖可変領域をコードする単離された核酸が挙げられる。
また、VLをコードする核酸(例えばDNA)は、VLをコードするDNAと軽鎖定常領域(CL)をコードするDNAと発現可能に結合することによって、完全長の軽鎖遺伝子へと変換することができる。ヒト、マウス等由来の軽鎖定常領域の核酸配列は、当分野で公知である。
VLをコードする核酸としては、例えば、配列番号26に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号30に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列、配列番号34に示すアミノ酸配列の25〜131番のアミノ酸配列、配列番号38に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号42に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列および配列番号46に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む少なくとも1つの軽鎖可変領域をコードする単離された核酸が挙げられる。
ここで、VHおよびVLコードする核酸が、例えばマウスに由来する核酸であり、重鎖及び軽鎖定常領域をコードする核酸がヒトに由来する核酸を使用すれば、ヒト−マウスキメラの抗体または抗原結合断片を取得することができる。これらの核酸も本発明の範囲に含まれる。
本発明の抗体または抗原結合断片を発現するには、上記のとおり得た部分または完全長の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現ベクターに挿入する。重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入するか、あるいは、両遺伝子とも同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は標準的な方法によって、発現ベクター内に挿入することができる。また、発現ベクターには、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促すシグナルペプチドをコードさせることもできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよいし、異種のシグナルペプチドであってもよい。また、発現ベクターはその他の調節配列を含有していてもよく、当業者であれば公知の技術に基づき、調節配列を選択し、発現ベクターに導入することができる。
本発明の組換え抗体を発現するのに好ましい哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、COS細胞、293細胞、HeLa細胞、3T3細胞などが挙げられる。抗体重鎖および軽鎖をコードする組換え発現ベクターを公知の遺伝子導入方法によって、好ましい宿主細胞に導入する。得られた形質転換体を培養し、培養物から目的の抗体または抗原結合断片を回収する。公知の精製技術により、抗体または抗原結合断片を精製してもよい。
2.本発明の医薬組成物
本発明において、本発明の抗SLC6A6抗体(抗原結合断片を含む)を含む医薬組成物が提供される。本発明の抗SLC6A6抗体は、がん細胞に発現するSLC6A6を認識する。本発明の抗SLC6A6抗体を含む本発明の医薬組成物は、SLC6A6を発現するがん細胞を殺傷するために使用することが可能である。すなわち、本発明の医薬組成物は、がん治療用医薬組成物、好ましくは大腸がん治療用医薬組成物として有用である。また、本発明の医薬組成物は、がん治療剤としても使用することができる。
本発明において、本発明の抗SLC6A6抗体(抗原結合断片を含む)を含む医薬組成物が提供される。本発明の抗SLC6A6抗体は、がん細胞に発現するSLC6A6を認識する。本発明の抗SLC6A6抗体を含む本発明の医薬組成物は、SLC6A6を発現するがん細胞を殺傷するために使用することが可能である。すなわち、本発明の医薬組成物は、がん治療用医薬組成物、好ましくは大腸がん治療用医薬組成物として有用である。また、本発明の医薬組成物は、がん治療剤としても使用することができる。
本発明において、がんの治療には、がん細胞を殺傷すること、がんの大きさを減少させること、がんの増殖速度を抑制もしくは停止させること、またはがんの進行を抑制もしくは停止させることなどが含まれる。
本発明の医薬組成物の治療対象のがんの種類は特に限定されず、SLC6A6を発現していればよく、例えば、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器がん、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、乳がん、肝がん(肝臓がん)、膵臓がん、睾丸腫瘍、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がん、皮膚黒色腫などが挙げられる。好ましくは、大腸がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、子宮がん、乳がんであり、さらに好ましくは大腸がん、乳がん、子宮がんである。
本発明の医薬組成物の投与方法は、経口投与、非経口投与(例えば、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など)、または患部への直接投与などが挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、投与対象(患者)の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。
本発明の医薬組成物を非経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤(点滴を含む)、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。
非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤(点滴を含む)、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。
各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した活性成分(本発明の抗SLC6A6抗体またはその抗原結合断片)のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形剤や添加剤を上記活性成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
非経口剤の投与量(1日あたり)は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した活性成分は、適用対象(患者)の体重1kgあたり1mg〜15mg/日であることが好ましく、より好ましくは2−12mg/日である。
経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。
本発明の医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および/または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、がん、例えば大腸がんを治療するための本発明の抗SLC6A6抗体を含むキットを提供する。本発明のキットは、本発明の抗SLC6A6抗体を含むものであれば、それを構成する材料は特に限定されない。本発明の抗SLC6A6抗体のほか、水、緩衝液、容器、シリンジ、取扱説明書などを具備すればよい。本発明の抗SLC6A6抗体は、水溶液、凍結乾燥状態などにて提供され、使用前に適切な状態に調製してもよい。本発明のキットを用いることにより、がんを効果的に治療することが可能となる。
また、本発明は、本発明の抗SLC6A6抗体を対象(例えば、ヒト)に投与することを含む、がんの治療方法も提供する。また、本発明は、がんの治療に使用するための本発明の抗SLC6A6抗体をも提供する。抗SLC6A6抗体の投与量、投与方法などは、本発明の医薬組成物の記載を参照することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
(1)細胞
DLD−1、HCT116、Colo320及びWiDrはDSファーマより入手した。Caco−2、COLO201、HCT15、HT−29、LOVO、SW480、SW620、293T、およびMDA−MB231はAmerican Type Culture Collection(ATCC受託番号 HTB−26)より入手した。
DLD−1、HCT116、Colo320及びWiDrはDSファーマより入手した。Caco−2、COLO201、HCT15、HT−29、LOVO、SW480、SW620、293T、およびMDA−MB231はAmerican Type Culture Collection(ATCC受託番号 HTB−26)より入手した。
MDA−MB231、SW620、DLD−1、Colo201、およびColo320を、10%(v/v)の血清(Hyclone社製)を含むRPMI1640培地(Sigma社)で、WiDrはE−MEM培地(Sigma社)、HCT116はMcCoy’s5A培地(Sigma社)、HT−29、LoVo、SW480、293T及び残りの細胞はDMEM培地(Sigma社)で、それぞれ80%コンフルエントを越えないよう37℃、5%CO2下で48〜72時間培養および継代を行った。
(2)免疫用細胞
WO2012/029990公報実施例2に記載されたのと同じ方法で、pEF6ベクターにヒトSLC6A6遺伝子を組み込んだ発現用ベクターを作製した。このSLC6A6発現ベクターを、FUGENE6(ロシュ社製)を用いてMDA−MB231へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。ブラストサイジンS塩酸塩が10μg/mLとなるよう培地に添加し、3〜5日毎に培地を交換して薬剤耐性を持つ細胞を選択した。得られた耐性株の中からSLC6A6を過剰発現している細胞を選び出すため、遺伝子導入を行っていない細胞、及び遺伝子導入した細胞それぞれを80%コンフルエントとなるよう96ウエルプレートに植え、37℃、5%CO2下で16時間培養した。
WO2012/029990公報実施例2に記載されたのと同じ方法で、pEF6ベクターにヒトSLC6A6遺伝子を組み込んだ発現用ベクターを作製した。このSLC6A6発現ベクターを、FUGENE6(ロシュ社製)を用いてMDA−MB231へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。ブラストサイジンS塩酸塩が10μg/mLとなるよう培地に添加し、3〜5日毎に培地を交換して薬剤耐性を持つ細胞を選択した。得られた耐性株の中からSLC6A6を過剰発現している細胞を選び出すため、遺伝子導入を行っていない細胞、及び遺伝子導入した細胞それぞれを80%コンフルエントとなるよう96ウエルプレートに植え、37℃、5%CO2下で16時間培養した。
培養上清を除去後、10%(v/v)中性緩衝ホルマリン溶液(WAKO社製)を100μL添加し、10分間室温で反応させた。ホルマリン溶液を除去後、PBS(−)で3回洗浄し、風乾させることで各々の細胞を固定化したプレートを作製した。
抗c−myc抗体(santa cruz社、クローン9E10)をTBS−T(25mM Tris、150mM NaCl、0.05%(v/v) Tween20、pH 7.4)で1μg/mLに希釈し、一次抗体として固定化プレートへ1ウエルあたり100μL添加し、室温で1時間反応させた。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した。
二次抗体として、抗マウスIgGポリクローナル抗体−HRP標識(BETHYL社製)をTBS−Tで5000倍に希釈した。前記抗体の希釈液を1ウエルあたり100μL添加し、室温で30分反応させた。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した。
最終濃度0.5mg/mLとなるようオルソフェニレンジアミン(Sigma社製)を50mMの炭酸−クエン酸バッファー(pH 5.0)に希釈し、この溶液の10000分の1量の35%(w/w)過酸化水素水(WAKO社製)を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに100μL入れ、室温で10分間反応させた。25μLの3N硫酸(WAKO社製)を添加することで反応を停止させた。492nmの吸収をプレートリーダー(SpectraMaxPure384、モレキュラーデバイス社製)で測定して、シグナルを観察し、遺伝子導入を行っていないMDA−MB231よりもシグナルの高い株を選択し、最も発現が顕著であったクローンを免疫用の細胞として用いた。
(3)細胞の移植
10cmシャーレに90%コンフルエントになるまで培養した細胞を、トリプシン(GIBCO社)を用いて回収し、PBS(−)(0.01M sodium−phosphate buffer、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH 7.4)で2回洗浄した。洗浄後の細胞を最終濃度が8.6×107細胞/mLとなるようグロースファクターリデューストマトリゲル(Becton Dickinson社製)に懸濁し、移植するまで氷上で保存した。
10cmシャーレに90%コンフルエントになるまで培養した細胞を、トリプシン(GIBCO社)を用いて回収し、PBS(−)(0.01M sodium−phosphate buffer、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH 7.4)で2回洗浄した。洗浄後の細胞を最終濃度が8.6×107細胞/mLとなるようグロースファクターリデューストマトリゲル(Becton Dickinson社製)に懸濁し、移植するまで氷上で保存した。
生理食塩水に3.5%(w/v)となるよう抱水クロラール(Sigma社製)を溶解して、3.5%抱水クロラール生理食塩水溶液を調製した。6〜8週齢のヌードマウス(BALB/cALcl−nu/nu系統(日本クレア社製))の腹腔内に3.5%抱水クロラール生理食塩水溶液を0.2mL投与して麻酔した。マウスの第4乳腺に、マトリゲルに懸濁した細胞を1乳腺あたり1×106個、24Gの注射針を用いて乳腺からはみ出さないよう移植した。1匹のマウスに対して、2箇所の移植となるように、胴体左右両方の第4乳腺にそれぞれ移植を行った。
(4)スクリーニング用SLC6A6部分タンパク質の発現と精製
実施例1(2)に記載のpEF6ベクターに導入したSLC6A6全長遺伝子から、細胞外領域であるアミノ酸残基143〜216の領域(配列番号4)をコードするDNA(配列番号3)をpET32ベクターにサブクローニングした。以下のプライマーを用いてPCRを行なった。
プライマー配列
Forward: ATAGGATCCGGCCTGGGCCACATATCACCTG(配列番号5)
Reverse: TATGAATTCGCTTTCAGAGAGCCTGGGTGGTC(配列番号6)
実施例1(2)に記載のpEF6ベクターに導入したSLC6A6全長遺伝子から、細胞外領域であるアミノ酸残基143〜216の領域(配列番号4)をコードするDNA(配列番号3)をpET32ベクターにサブクローニングした。以下のプライマーを用いてPCRを行なった。
プライマー配列
Forward: ATAGGATCCGGCCTGGGCCACATATCACCTG(配列番号5)
Reverse: TATGAATTCGCTTTCAGAGAGCCTGGGTGGTC(配列番号6)
PCR反応は、94℃、2分間のプレインキュベーションを行なった後、98℃、10秒間のデナチュレーション、58℃、30秒間のアニーリング、および68℃、30秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素(EcoRI及びBamHI)を用いて、pET32ベクター(Novagen社)へ組み込んだ。
増幅断片の塩基配列をDNAシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ細胞外領域の遺伝子配列が組み込まれ、C末端にHis tag配列が付加されていることを確認した。
このベクターでBL21(DE3)(Invitrogen社)を形質転換し、1%(w/v)のグルコースを含むLB培地(1%(w/v) トリプトン(Sigma社)、0.5%(w/v)Yeast extract(Sigma社)、0.5%(w/v) NaCl(Sigma社))で培養した。培地の濁度が600nmの波長で0.6となった後、1mM IPTG(WAKO社)を加え、16時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、SLC6A6細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
約10mgのサンプルをBuffer A(1M塩酸グアニジン(Sigma社)、10mM DTT(Sigma社)、10mM EDTA(Sigma社))に溶解し、37℃で1時間反応させた。反応物を1LのBuffer B(50mM Tris、150mM NaCl、5%グリセロール、0.4mM 酸化型グルタチオン(Sigma社)、pH8.5)に緩やかに加え、4℃で18時間撹拌した。溶解したサンプルをNi sepharoseカラム(GE社)に供し、Buffer C(50mMリン酸カリウム緩衝液、150mM NaCl、200mM Imidazole、pH8.0)で溶出した。Imidazoleを含まないBuffer Cに透析して、精製したSLC6A6の細胞外領域部分タンパク質を得た。
(5)抗血清の解析
上記(4)で得た組換えタンパク質10μg/mlを100μLずつ、MaxiSorp 96 wellプレート(ヌンク社)に入れ、室温で1時間プレートに吸着させた。吸着後、ウエルをTBS−T(TBS−T(25mM Tris、150mM NaCl、0.05%(v/v) Tween20、pH 7.4)で洗浄した後、5%となるようTBS−Tで希釈したスキムミルク(GIBCO社)を入れ、30分室温でブロッキングを行った。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した後、マウスの尾静脈より回収した血漿をTBS−Tで1/2000倍に希釈し、ELISAプレートへ1ウエルあたり100μL添加し、室温で1時間反応させた。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した。
上記(4)で得た組換えタンパク質10μg/mlを100μLずつ、MaxiSorp 96 wellプレート(ヌンク社)に入れ、室温で1時間プレートに吸着させた。吸着後、ウエルをTBS−T(TBS−T(25mM Tris、150mM NaCl、0.05%(v/v) Tween20、pH 7.4)で洗浄した後、5%となるようTBS−Tで希釈したスキムミルク(GIBCO社)を入れ、30分室温でブロッキングを行った。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した後、マウスの尾静脈より回収した血漿をTBS−Tで1/2000倍に希釈し、ELISAプレートへ1ウエルあたり100μL添加し、室温で1時間反応させた。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した。
二次抗体として、抗マウスIgGポリクローナル抗体−HRP標識(BETHYL社製)をTBS−Tで5000倍に希釈した。前記抗体の希釈液を1ウエルあたり100μL添加し、室温で30分反応させた。各ウエルを200μLのTBS−Tで3回洗浄した。
最終濃度0.5mg/mLとなるようオルトフェニレンジアミン(Sigma社製)を50mMの炭酸−クエン酸バッファー(pH 5.0)に希釈し、この溶液の10000分の1量の35%(w/w)過酸化水素水(WAKO社製)を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに100μL入れ、室温で10分間反応させた。25μLの3N硫酸(WAKO社製)を添加することで反応を停止させた。492nmの吸収をプレートリーダー(SpectraMaxPure384、モレキュラーデバイス社製)で測定して抗体の力価を解析し、細胞融合に用いるマウスの選択に利用した。
(6)細胞融合
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株P3X63−Ag8(ATCC受託番号 CRL−1580)と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、1×108個の脾臓細胞と0.25×108個の骨髄腫株とを混合し、EP Buffer(0.3M Mannitol、0.1mM CaCl2、0.1mM MgCl2)に細胞密度が0.25×108個/mLとなるよう懸濁し、電気融合装置LF201(ネッパジーン社製)で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株P3X63−Ag8(ATCC受託番号 CRL−1580)と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、1×108個の脾臓細胞と0.25×108個の骨髄腫株とを混合し、EP Buffer(0.3M Mannitol、0.1mM CaCl2、0.1mM MgCl2)に細胞密度が0.25×108個/mLとなるよう懸濁し、電気融合装置LF201(ネッパジーン社製)で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。
融合後の細胞をHAT培地(Invitrogen社製)に懸濁し、各ウエル100μLとなるよう30枚の96ウエルプレートに散布した。途中、HAT培地を200μL添加し、11〜16日間培養後に顕微鏡下で観察すると、1ウエルあたり5〜12個のコロニーが形成された。
(7)モノクローナル抗体の取得
移植3〜7ヶ月後にマウスから脾臓細胞を取り出し、上記(6)に記載の方法でハイブリドーマ細胞を作製した。SLC6A6を認識する抗体を選択するために、上記(5)記載の方法を用いてクローンの選択を行った。一次抗体としては、細胞の培養上清を用い、二次抗体としては、抗マウスIgG1ポリクローナル抗体−HRP標識、抗マウスIgG2aポリクローナル抗体−HRP標識、抗マウスIgG2bポリクローナル抗体−HRP標識(Bethyl社)をそれぞれ等量混合し、TBSTで100000倍希釈した溶液を用い、サブクラスIgGのクローンのみが検出されるようにして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
移植3〜7ヶ月後にマウスから脾臓細胞を取り出し、上記(6)に記載の方法でハイブリドーマ細胞を作製した。SLC6A6を認識する抗体を選択するために、上記(5)記載の方法を用いてクローンの選択を行った。一次抗体としては、細胞の培養上清を用い、二次抗体としては、抗マウスIgG1ポリクローナル抗体−HRP標識、抗マウスIgG2aポリクローナル抗体−HRP標識、抗マウスIgG2bポリクローナル抗体−HRP標識(Bethyl社)をそれぞれ等量混合し、TBSTで100000倍希釈した溶液を用い、サブクラスIgGのクローンのみが検出されるようにして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
取得したモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を、10cm dish 10枚に90%コンフルエントとなるよう培養し、HT培地(Invitrogen社製)とEX CELL Sp2/0(ニチレイバイオサイエンス社製)とを1:1で混合した培地で10日間培養を行った。培養上清を回収し、ProteinGカラムを用いて精製した。培養上清100mLに対し、0.5 mLのProteinGカラム(GEヘルスケア社)を用いた。PBSで平衡化したProteinGカラムに対し、培養液を1〜3 ml/minの流速で通過させた後、6mLの洗浄バッファー(25mM Tris−HCl(pH7.4)、140 mM NaCl、10 mM KCl)で洗浄した。次に、1 mLの溶出バッファー(0.1M Glycine (pH2.5))で抗体タンパク質を溶出させ、3M Tris−HCl(pH7.4)を用いてpH7.0〜7.4の間になるよう中和した。Amicon Ultra 30(Millipore社)を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをPBSに置換した。得られた7つのハイブリドーマのクローンから得られた抗体クローンおよびWO2012/029990公報記載の抗SLC6A6抗体である「4B9b」及び「5H12d」のサブクラスおよび上記(5)記載の方法で測定したELISAの結果を表1にまとめる。
(8)免疫細胞染色
上記(7)で得られた7種類の抗体クローン「204」「205」、「303」、「419」、「402」、「422」及び「430」と、大腸がん細胞(HT−29及びLoVo)との反応性を解析した。また、比較対象として、WO2012/029990公報記載の抗SLC6A6抗体である「4B9b」及び「5H12d」を同様に解析した。以下では、ハイブリドーマ細胞が作る抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。
上記(7)で得られた7種類の抗体クローン「204」「205」、「303」、「419」、「402」、「422」及び「430」と、大腸がん細胞(HT−29及びLoVo)との反応性を解析した。また、比較対象として、WO2012/029990公報記載の抗SLC6A6抗体である「4B9b」及び「5H12d」を同様に解析した。以下では、ハイブリドーマ細胞が作る抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。
抗体「4B9b」を産生するハイブリドーマ「4B9b」は、株式会社バイオマトリックス研究所(〒270−0101 千葉県流山市東深井105番地)により、受託番号「FERM BP−11413」として、2010年7月21日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305−8566 茨城県つくば市東1−1−1 中央第6)にブダペスト条約に基づき国際寄託されている。また、「5H12d」を産生するハイブリドーマ「5H12d」は、株式会社バイオマトリックス研究所(〒270−0101 千葉県流山市東深井105番地)により、受託番号「FERM BP−11414」として、2010年7月21日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305−8566 茨城県つくば市東1−1−1 中央第6)にブダペスト条約に基づき国際寄託されている(上記日付はいずれも原寄託日を示す)。
HT−29及びLoVoを80%コンフルエントとなるよう培養し、Cellmatrix Type I−A(新田ゼラチン社)でコートしたカバーガラス上へ播種した。2日間培養後、10%中性緩衝ホルマリン(WAKO社)を用いて細胞を固定した。カバーガラスを0.3%(v/v)過酸化水素水で20分間処理した後、TBSTで3回洗浄し、5%(w/v)Skim milkを含むTBSTで処理した後、上記(7)で精製した抗体を10μg/mLとなるよう添加し、4℃、16時間反応させた。TBSTで3回洗浄した後、二次抗体として抗マウスIgGポリクローナル抗体−AlexaFluor488標識あるいは抗マウスIgMポリクローナル抗体−AlexaFluor488標識で室温30分間反応させた。TBSTで3回洗浄した後、Mounting Medium(Vector Shield社)でカバーガラスを封入した。
図1は、各抗体について同一条件で蛍光強度を解析した結果を示す。全てのクローン(204、205、303、419、402、422および430)でシグナルが観察され、特にクローン204、205、303、419、および402で明確にシグナルが観察された。4B9bや5H12dのようなサブクラスIgMの抗体と比較した場合、クローン205、303、419抗体のシグナルは明らかに高く、親和性が高いという結果が示された。本実施例により、従来のSLC6A6抗体よりも力価の高いクローンが取得できたことが示された。
FACS解析
ヒト胎児腎臓細胞である293Tを90%コンフルエントとなるよう培養した。細胞をPBSで2回洗浄した後、スクレーパーで剥がし、1.5mLチューブに回収した。204、205及び419抗体をそれぞれ最終濃度10μg/mLとなるようチューブに添加し、60分間反応させた。比較対象として、4B9bを同様の濃度で添加し、反応させた。細胞をPBS+2%FBSで2回洗浄後、AlexaFluor488標識されたGoat−Anti− mouse IgG(Invitrogen社)をPBS+2%FBSで1/1000希釈して添加し、30分間反応させた。PBS+2%FBSで2回洗浄後、FACS Verse(BD社)で解析を行った。結果を図2に示す。
ヒト胎児腎臓細胞である293Tを90%コンフルエントとなるよう培養した。細胞をPBSで2回洗浄した後、スクレーパーで剥がし、1.5mLチューブに回収した。204、205及び419抗体をそれぞれ最終濃度10μg/mLとなるようチューブに添加し、60分間反応させた。比較対象として、4B9bを同様の濃度で添加し、反応させた。細胞をPBS+2%FBSで2回洗浄後、AlexaFluor488標識されたGoat−Anti− mouse IgG(Invitrogen社)をPBS+2%FBSで1/1000希釈して添加し、30分間反応させた。PBS+2%FBSで2回洗浄後、FACS Verse(BD社)で解析を行った。結果を図2に示す。
図2に示すように、204、205及び419抗体は、4B9bよりも強く293T細胞に反応した。293T細胞はSLC6A6を発現することから、本発明のSLC6A6抗体は、ネイティブな構造のSLC6A6を認識することが示された。また、本発明のSLC6A6抗体は、従来のSLC6A6抗体よりも高い親和性でネイティブなSLC6A6に結合し得ることが示された。
FACS解析
実施例1(7)で得られたモノクローナル抗体に関して、ヒト大腸がん細胞であるHCT116に対して、抗体クローン204、205、303、419、402、422及び430抗体との反応性を実施例2と同様の方法で解析した。結果を図3に示す。
実施例1(7)で得られたモノクローナル抗体に関して、ヒト大腸がん細胞であるHCT116に対して、抗体クローン204、205、303、419、402、422及び430抗体との反応性を実施例2と同様の方法で解析した。結果を図3に示す。
図3から、ヒト大腸がん細胞HCT116に対し、抗体クローン204、205、303、419、402、422及び430抗体が明確に反応することが示された。
ヒト大腸がん細胞であるSW480及びHT−29に対して、抗体クローン205、419、402及び430抗体との反応性を実施例2と同様の方法で解析した。結果を図4に示す。
図4から、2種類の細胞株に対しても、抗体クローン205、419、402及び430抗体が明確に反応することが示された。
モノクローナル抗体を治療薬として利用する場合には、タンパク質のネイティブな構造をより強く認識する抗体が好ましい。これは、がん組織において細胞は生きた状態で存在し、よってがん細胞が発現するSLC6A6もネイティブな構造を保持しているためである。すなわち、実施例1(5)あるいは(8)で示した方法よりも、実施例3のFACS解析の方が、治療薬に適した抗体クローンを選択するのに適切な方法である。
免疫組織染色
51症例の大腸がん組織と8症例の正常大腸粘膜をマウス抗体(クローン205)を用いて免疫組織染色を行った。パラフィン固定後、薄切したヒト大腸がん組織(US Biomax社)をキシレンで脱パラフィン処理し、エタノールで親水化した。得られた組織を0.3%(v/v)過酸化水素水で20分間処理した後、TBSTで3回洗浄し、1mg/mLのProteinase Kで37℃、15分間処理し、抗原賦活化を行った。ヒストファインSAB−POユニバーサルキット(ニチレイ社)を用い、添付のプロトコールに従って染色を行った。一次抗体の反応では、10μg/mLの205抗体を添加し、37℃、1時間反応させた。発色の際には、ImmPACT DAB Substrate(Vector社)で5分間発色させた。蒸留水で水洗後、Hematoxylin(WAKO)を用いて核を染色し、流水洗浄後、エタノール、キシレンの順に処理して、封入した。
51症例の大腸がん組織と8症例の正常大腸粘膜をマウス抗体(クローン205)を用いて免疫組織染色を行った。パラフィン固定後、薄切したヒト大腸がん組織(US Biomax社)をキシレンで脱パラフィン処理し、エタノールで親水化した。得られた組織を0.3%(v/v)過酸化水素水で20分間処理した後、TBSTで3回洗浄し、1mg/mLのProteinase Kで37℃、15分間処理し、抗原賦活化を行った。ヒストファインSAB−POユニバーサルキット(ニチレイ社)を用い、添付のプロトコールに従って染色を行った。一次抗体の反応では、10μg/mLの205抗体を添加し、37℃、1時間反応させた。発色の際には、ImmPACT DAB Substrate(Vector社)で5分間発色させた。蒸留水で水洗後、Hematoxylin(WAKO)を用いて核を染色し、流水洗浄後、エタノール、キシレンの順に処理して、封入した。
図5は、大腸がん組織(Colon cancer)と正常組織(Normal Tissue)とを染色した結果(代表例)を掲載した。染色像として、強陽性に染まっている場合を+++、陽性に染まっている場合を++、正常と区別される弱陽性を+とし、染色されていない場合または正常組織を−と記載した。なお、判断がつかない場合を+/−と記載した。大腸がん組織においては、弱陽性と陽性と強陽性とを合わせると、本発明のSLC6A6抗体により約84%(43症例)が染色された。表2は、実施例4で用いたサンプルの由来および結果についてまとめた表である。
免疫組織染色
上記、実施例4に記載した方法と同様に、マウス抗体(205クローン)を用いて乳がん及び子宮がんのがん組織(Cancer)、及び正常組織(Normal)を免疫組織染色した。その結果を図6に示す。乳がん及び子宮がんにおいても、本発明のSLC6A6抗体によって、がん部が明確に染色されることが示された。乳がんでは3症例中3症例で陽性(100%)であり、子宮がんでは3症例中2症例が強陽性(66%)であることが示された。
上記、実施例4に記載した方法と同様に、マウス抗体(205クローン)を用いて乳がん及び子宮がんのがん組織(Cancer)、及び正常組織(Normal)を免疫組織染色した。その結果を図6に示す。乳がん及び子宮がんにおいても、本発明のSLC6A6抗体によって、がん部が明確に染色されることが示された。乳がんでは3症例中3症例で陽性(100%)であり、子宮がんでは3症例中2症例が強陽性(66%)であることが示された。
競合阻害試験
上記で得られたモノクローナル抗体の中で、抗体クローン402がSLC6A6の細胞外ドメインに結合しているか解析を行った。10μg/mLの抗体クローン402と実施例1(4)で作製したSLC6A6の細胞外領域部分タンパク質15 μg/mLとを混合し、37℃で1時間反応させた。組み換えタンパク質を加えていないサンプルをコントロールとして同様に準備した。ガラス上で培養したHCT116細胞と4℃で1時間反応した後、実施例1(8)記載の方法で二次抗体と反応させ、検出を行った。結果を図7に示す。図7において「Visible」は、可視光による画像である。
上記で得られたモノクローナル抗体の中で、抗体クローン402がSLC6A6の細胞外ドメインに結合しているか解析を行った。10μg/mLの抗体クローン402と実施例1(4)で作製したSLC6A6の細胞外領域部分タンパク質15 μg/mLとを混合し、37℃で1時間反応させた。組み換えタンパク質を加えていないサンプルをコントロールとして同様に準備した。ガラス上で培養したHCT116細胞と4℃で1時間反応した後、実施例1(8)記載の方法で二次抗体と反応させ、検出を行った。結果を図7に示す。図7において「Visible」は、可視光による画像である。
図7は、HCT116に抗体クローン402が結合して生じる蛍光が、SLC6A6の細胞外領域部分タンパク質を添加した場合に消失することを示している。このことから、抗体クローン402は、SLC6A6の細胞外領域と反応することが示された。すなわち、抗体クローン402はSLC6A6の細胞外領域と特異的に反応することが示された。
キメラ抗体の作製
(1)遺伝子のクローニング
実施例1で得られたハイブリドーマ細胞を培養し、Qiagen社のRNeasy Miniキットを用いて、total RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 2μgから、SuperScript III reverse transcriptase(Invitrogen)を用いて、逆転写(RT)反応を50℃で1時間行ってcDNAを合成し、85℃、5分間の加熱により、反応を停止させた。得られたcDNAを鋳型とし、以下のプライマーを用い、KOD PLUS(TOYOBO社)を用いたPCR反応を行なうことで、目的の遺伝子を増幅した。
(1)遺伝子のクローニング
実施例1で得られたハイブリドーマ細胞を培養し、Qiagen社のRNeasy Miniキットを用いて、total RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 2μgから、SuperScript III reverse transcriptase(Invitrogen)を用いて、逆転写(RT)反応を50℃で1時間行ってcDNAを合成し、85℃、5分間の加熱により、反応を停止させた。得られたcDNAを鋳型とし、以下のプライマーを用い、KOD PLUS(TOYOBO社)を用いたPCR反応を行なうことで、目的の遺伝子を増幅した。
抗体のH鎖可変領域断片を増幅するために、配列番号7と配列番号8、配列番号9のプライマーを用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、56℃、15秒間のアニーリング、68℃、45秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
Long: 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ (配列番号7)
Short: 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(配列番号8)
mIgG2a_CH1_reverse:5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTTG-3’(配列番号9)
Long: 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ (配列番号7)
Short: 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(配列番号8)
mIgG2a_CH1_reverse:5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTTG-3’(配列番号9)
抗体のL鎖リーダー配列及び可変領域断片を増幅するために、配列番号7と配列番号8、配列番号10のプライマーを用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、56℃、15秒間のアニーリング、68℃、45秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)により断片を得た。
mIgkappa_R3: 5’-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTCACT-3’(配列番号10)
mIgkappa_R3: 5’-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTCACT-3’(配列番号10)
精製したPCR増幅断片を10mM dNTP Mix(インビトロジェン社)及び2×GoTaq Maxter Mix(Promega社)と混合し、70℃、15分間反応後、4℃、2分間氷冷することで、3’末端へdAを付加した。その後、pGEM−T−Easy Vector System(Promega社)を用い、いわゆるTAクローニング法によりH鎖断片及びL鎖断片をクローニングした。
(i)H鎖発現ベクターの構築
まず、ヒトIgG1のH鎖定常領域を増幅するために、配列番号11で示されるオリゴDNAを化学合成し、配列番号12と配列番号13のプライマーでPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、68℃、60秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)を行ってヒトIgG1のH鎖定常領域断片を得た。
まず、ヒトIgG1のH鎖定常領域を増幅するために、配列番号11で示されるオリゴDNAを化学合成し、配列番号12と配列番号13のプライマーでPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、68℃、60秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)を行ってヒトIgG1のH鎖定常領域断片を得た。
hHchain: 5'-GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA-3'(配列番号11)
hCg1_F(EcoRI-NheI): 5’-TTTGAATTCGCTAGCACCAAGGGCCCATC-3’(配列番号12)
hCgI_R(NotI): 5’- TTTGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’ (配列番号13)
hCg1_F(EcoRI-NheI): 5’-TTTGAATTCGCTAGCACCAAGGGCCCATC-3’(配列番号12)
hCgI_R(NotI): 5’- TTTGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’ (配列番号13)
次に、pEF6−myc/HisAベクター(Invitrogen社)のMluI認識配列を破壊し、配列番号14と配列番号15のオリゴヌクレオチドをアニーリング後、制限酵素(KpnI/BamHI)を用いて導入した(このベクターをpEF6−Leaderと呼ぶ。)。
Hchain_signal_top(KpnI-BamHI): 5’-CATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTG-3’ (配列番号14)
Hchain_signal_bottom(KpnI-BamH): 5’-GGATCCACGCGTAGCAACAGCGACAAGGAAGAGCAAGATGAGGCTCCAACCCATGGTAC-3’ (配列番号15)
Hchain_signal_top(KpnI-BamHI): 5’-CATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTG-3’ (配列番号14)
Hchain_signal_bottom(KpnI-BamH): 5’-GGATCCACGCGTAGCAACAGCGACAAGGAAGAGCAAGATGAGGCTCCAACCCATGGTAC-3’ (配列番号15)
次に、増幅したヒトIgGのH鎖定常領域を制限酵素(EcoRI/NotI)を用いて、pEF6−Leaderに導入した(このベクターをpEF6−hHchain−cloningと呼ぶ。)。
次に、pEF6−hHchain−cloningに205抗体のH鎖可変領域断片を導入するために、TAクローニング法によりクローニングしたH鎖可変領域断片を鋳型にして、配列番号16と配列番号17のプライマーを用いてPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、56℃、15秒間のアニーリング、68℃、45秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)によりH鎖可変領域断片を得た。
Forward: 5'-TTTACGCGTGTCCTGTCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3' (配列番号16)
Reverse : 5'-TTTGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCCT-3’ (配列番号17)
Forward: 5'-TTTACGCGTGTCCTGTCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3' (配列番号16)
Reverse : 5'-TTTGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCCT-3’ (配列番号17)
続いて、増幅したH鎖可変領域断片を制限酵素(MluI/NheI)を用いて、pEF6−hHchain−cloningに導入した(以下、205キメラH鎖発現ベクターと呼ぶ。)。
(ii)L鎖発現ベクターの構築
まず、ヒトkappa鎖定常領域を増幅するために、H鎖の場合と同様にして、配列番号18で示されるオリゴDNAを化学合成し、配列番号19と配列番号20のプライマーでPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、68℃、30秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)を行ってヒトkappa鎖定常領域断片を得た。
まず、ヒトkappa鎖定常領域を増幅するために、H鎖の場合と同様にして、配列番号18で示されるオリゴDNAを化学合成し、配列番号19と配列番号20のプライマーでPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、68℃、30秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)を行ってヒトkappa鎖定常領域断片を得た。
hLchain: 5'-CACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
-3'(配列番号18)
hCk_F(EcoRI-BsiWI): 5'-TTTGAATTCCGTACGGTGGCTGCACCATC-3’(配列番号19)
hCk_R(NotI): 5’-TTTGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTG-3’(配列番号20)
-3'(配列番号18)
hCk_F(EcoRI-BsiWI): 5'-TTTGAATTCCGTACGGTGGCTGCACCATC-3’(配列番号19)
hCk_R(NotI): 5’-TTTGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTG-3’(配列番号20)
次に、pEF1−myc/HisAベクター(Invitrogen社)に、制限酵素(EcoRI/NotI)を用いて、増幅したヒトkappa鎖定常領域を導入した(このベクターをpEF1−hLchain−cloningと呼ぶ。)。
次に、pEF1−hLchain−cloningに205抗体のL鎖シグナル配列と可変部を導入するために、TAクローニング法によりクローニングしたL鎖シグナル配列と可変領域断片を鋳型にして、配列番号21と配列番号22のプライマーでPCR反応(94℃、2分間のデナチュレーションを行ない、続いて、58℃、15秒間のアニーリング、68℃、30秒間のエロンゲーションのサイクルを30サイクル)を行って205抗体のL鎖シグナル配列と可変部断片を得た。
Forward2: 5'-TTTGGATCCACCATGAACATGCTCACTCAGC-3'(配列番号21)
Reverse2 : 5'-TTTCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTG-3’(配列番号22)
Forward2: 5'-TTTGGATCCACCATGAACATGCTCACTCAGC-3'(配列番号21)
Reverse2 : 5'-TTTCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTG-3’(配列番号22)
次に、pEF1−hLchain−cloningに、制限酵素(BamHI/BsiWI)を用いて、増幅したL鎖シグナル配列と可変領域断片を導入した(これを205キメラL鎖発現ベクターと呼ぶ。)。
ヒト‐マウスキメラ化した205抗体のH鎖のDNA配列は配列番号23、アミノ酸配列は配列番号24で示される。L鎖も同様であり、DNA配列は配列番号25、アミノ酸配列は配列番号26で示される。
また、その他の抗体についても同様に、ヒト−マウスキメラ抗体を作製した。ヒト‐マウスキメラ化した402抗体のH鎖のDNA配列は配列番号27、アミノ酸配列は配列番号28で示される。L鎖も同様であり、DNA配列は配列番号29、アミノ酸配列は配列番号30で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した419抗体のH鎖のDNA配列は配列番号31、アミノ酸配列は配列番号32で示される。L鎖も同様であり、DNA配列は配列番号33、アミノ酸配列は配列番号34で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した303抗体のH鎖のDNA配列は配列番号35、アミノ酸配列は配列番号36で示される。L鎖も同様であり、DNA配列は配列番号37、アミノ酸配列は配列番号38で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した422抗体のH鎖のDNA配列は配列番号39、アミノ酸配列は配列番号40で示される。L鎖も同様であり、DNA配列は配列番号41、アミノ酸配列は配列番号42で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した430抗体のH鎖のDNA配列は配列番号43、アミノ酸配列は配列番号44で示される。L鎖も同様であり、DNA配列は配列番号45、アミノ酸配列は配列番号46で示される。
配列番号23:
ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCCAGGTCAAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGAGGAAGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCCAGGTCAAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGAGGAAGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号24:
MGWSLILLFLVAVATRVLSQVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARRKAWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
MGWSLILLFLVAVATRVLSQVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARRKAWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
配列番号25:
ATGAACATGCTCACTCAGCTCCTGGGATTACTGCTGCTCTGGTTTGCAGGTGGTAAATGTGACATTCAGATGACCCAGTCTCCTGCCTCCCAGTCTGCATCTCTGGGAGAAAGTGTCACCATCACATGCCTGGCAAGTCAGACCATTGGTACATGGTTAGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATTTATGCTGCAACCAGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGTAGTGGATCTGGCACAAAATTTTCTTTCAAGATCAGCAGCCTACAGGCTGAAGATTTTGTAAGTTATTACTGTCAACAACTTTACAGTACTCCTCTGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
ATGAACATGCTCACTCAGCTCCTGGGATTACTGCTGCTCTGGTTTGCAGGTGGTAAATGTGACATTCAGATGACCCAGTCTCCTGCCTCCCAGTCTGCATCTCTGGGAGAAAGTGTCACCATCACATGCCTGGCAAGTCAGACCATTGGTACATGGTTAGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATTTATGCTGCAACCAGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGTAGTGGATCTGGCACAAAATTTTCTTTCAAGATCAGCAGCCTACAGGCTGAAGATTTTGTAAGTTATTACTGTCAACAACTTTACAGTACTCCTCTGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号26:
MNMLTQLLGLLLLWFAGGKCDIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
MNMLTQLLGLLLLWFAGGKCDIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
配列番号27:
ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCCAGGTCAAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAAGTATCCTGCACGGCTTCTGGTTATGCATTCACTCAATACAACTTGTACTGGGTGAAGCTCAGACATGGAAAGTGCCCTAAATGGATCGGATCTATTGATCCTTACATTGGTGGTACCACCTACAACCAGCAATTCAAGGACAAGGTCACATTGACTGTTGACAAGTCTTCCAGCACGGCCTACTTGCATCTCAACAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCAATCTATTACTGTGCAAGATGGTGGGACGGATATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCCAGGTCAAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAAGTATCCTGCACGGCTTCTGGTTATGCATTCACTCAATACAACTTGTACTGGGTGAAGCTCAGACATGGAAAGTGCCCTAAATGGATCGGATCTATTGATCCTTACATTGGTGGTACCACCTACAACCAGCAATTCAAGGACAAGGTCACATTGACTGTTGACAAGTCTTCCAGCACGGCCTACTTGCATCTCAACAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCAATCTATTACTGTGCAAGATGGTGGGACGGATATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号28:
MGWSLILLFLVAVATRVLSQVKLQQSGPELVKPGASVKVSCTASGYAFTQYNLYWVKLRHGKCPKWIGSIDPYIGGTTYNQQFKDKVTLTVDKSSSTAYLHLNSLTSEDSAIYYCARWWDGYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
MGWSLILLFLVAVATRVLSQVKLQQSGPELVKPGASVKVSCTASGYAFTQYNLYWVKLRHGKCPKWIGSIDPYIGGTTYNQQFKDKVTLTVDKSSSTAYLHLNSLTSEDSAIYYCARWWDGYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
配列番号29:
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATTTTGTCCAGAGGACAGATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCTTCTCTAGGGGAACGGGTCACCTTGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAATTTCCAGATACTTGCACTGGTACCAGGTGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAACTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGTAACATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGACACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATTTTGTCCAGAGGACAGATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCTTCTCTAGGGGAACGGGTCACCTTGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAATTTCCAGATACTTGCACTGGTACCAGGTGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAACTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGTAACATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGACACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号30:
MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQIVLTQSPAIMSASLGERVTLTCTASSSVISRYLHWYQVKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLELTRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQIVLTQSPAIMSASLGERVTLTCTASSSVISRYLHWYQVKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLELTRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
配列番号31:
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atgggttggagcctcatcttgctcttccttgtcgctgttgctacgcgtgtcctgtccCAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAAGTCTCCTGCAAGGCTTTTGGTTATGCATTCACTAGACACAATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCATGGAAAGTGCCTTGAGTGGATTGGATATATTGATCCTTTCAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGTTTATGGTAACTACGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号32:
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配列番号33:
atgggcatcaaaatggagtcacagattcaggtctttgtattcgtgtttctctggttgtctggtgttgacggaGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGATACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGTCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAATACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
atgggcatcaaaatggagtcacagattcaggtctttgtattcgtgtttctctggttgtctggtgttgacggaGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGATACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGTCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAATACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
配列番号34:
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配列番号35:
ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGTTTGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAACTTCACCAGGTACTGGATAAACTGGGTGAAGCTGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTTATCCTGCTACTAATGGTATTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTGGACACATTCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGTCTGGCATCTGAGGACTCTGGTCTCTATTACTGTGCAAGATGTAAAACGATGTTGTCACGATGTGCCTGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCCGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGTTTGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAACTTCACCAGGTACTGGATAAACTGGGTGAAGCTGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTTATCCTGCTACTAATGGTATTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTGGACACATTCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGTCTGGCATCTGAGGACTCTGGTCTCTATTACTGTGCAAGATGTAAAACGATGTTGTCACGATGTGCCTGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCCGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号36:
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配列番号37:
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTTCCAGATGTGATATCCAAATGACTCAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACGACACATCAAGATTACACTCAAGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATATGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTTCCAGATGTGATATCCAAATGACTCAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACGACACATCAAGATTACACTCAAGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATATGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号38:
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MMSSAQFLGLLLLCFQGSRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTINCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYDTSRLHSRVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNMLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
配列番号39:
ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGACCTTCACTGAGGATGTCCTGCAAGGCCTCTGGTTACTTTTTCACTGGCAATTCTATGAATTGGGTGAAGAAGACCCATGGACGGAGCCTTGAGTGGATTGGACTTATTGATCTTTCCAATGGTGAAACTCGCTTCAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTTTAACTGTGGACAAGTCATCCGGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAATCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGCAGGTCTGCCATGATTATGCCCTGTTTTTCTCATTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGACCTTCACTGAGGATGTCCTGCAAGGCCTCTGGTTACTTTTTCACTGGCAATTCTATGAATTGGGTGAAGAAGACCCATGGACGGAGCCTTGAGTGGATTGGACTTATTGATCTTTCCAATGGTGAAACTCGCTTCAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTTTAACTGTGGACAAGTCATCCGGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAATCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGCAGGTCTGCCATGATTATGCCCTGTTTTTCTCATTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号40:
MGWSLILLFLVAVATRVLSEVQLQQSGPEVVKPGPSLRMSCKASGYFFTGNSMNWVKKTHGRSLEWIGLIDLSNGETRFNQKFKGKATLTVDKSSGTAYMELLNLTSEDSAVYYCASRSAMIMPCFSHWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
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配列番号41:
atggagacacattctcaggtctttgtatacatgttgctgtggttgtctggtattgaaggaGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAACTTCATGTCCACATCAATTGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGCTACTGCTGTTGCCTGGTTTCAACAGAAACCAGGTCAATCTCCTAAACTCCTAATTTACTGGACGTCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATATGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCCATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCCGATTATTTCTGTCAACAATATGACACCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAGATAAAACgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
atggagacacattctcaggtctttgtatacatgttgctgtggttgtctggtattgaaggaGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAACTTCATGTCCACATCAATTGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGCTACTGCTGTTGCCTGGTTTCAACAGAAACCAGGTCAATCTCCTAAACTCCTAATTTACTGGACGTCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATATGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCCATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCCGATTATTTCTGTCAACAATATGACACCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAGATAAAACgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
配列番号42:
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METHSQVFVYMLLWLSGIEGDIVMTQSHNFMSTSIGDRVNITCKASQDVATAVAWFQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRFTGSGYGTDFTLTISHVQSEDLADYFCQQYDTYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
配列番号43:
ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCGAGATCCAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAGAGTATCCTGCACGGCTTCTGGTTATGCATTCACTCAGTACAACTTGTACTGGGTGAAACTCAGACATGGAAAGTGCCCTAAATGGATCGGATCTATTGATCCTTACATTGGTGGTGCCAACTACAATCAGCAATTCAAGGACAAGGTCACATTGACTGTTGACAAGTCTTCCAGCACGGCCTACTTACATCTCAACAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCAATCTATTACTGTGCAAGATGGTGGGACGGATATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
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配列番号44:
MGWSLILLFLVAVATRVLSEIQLQQSGPEVVKPGTSVRVSCTASGYAFTQYNLYWVKLRHGKCPKWIGSIDPYIGGANYNQQFKDKVTLTVDKSSSTAYLHLNSLTSEDSAIYYCARWWDGYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
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配列番号45:
atggattttcaggtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcattttgtccagaggaCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCTTCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGTTCAAGTGTAAGTTTCAGATACTTGCACTGGTACCAGGTGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAAGTCGCATCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTTTCTCACAATCAGTAACATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGCTCCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGACACgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
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配列番号46:
MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSFRYLHWYQVKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPSRISGSGSGTSYFLTISNMEAEDAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLELTRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
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上記で得られた各ヒト−マウスキメラ抗体の可変領域およびCDR1〜3のアミノ酸配列の情報は以下の表3および4に示される。可変領域およびCDR1〜3に記載された数字は、配列番号で示されるアミノ酸配列において該当するアミノ酸の番号を示す。
(2)ヒトIgG化抗体の発現と精製
6 well plateに90%コンフルエントとなるようCHO細胞を培養し、(1)で作製したH鎖及びL鎖発現用ベクターをCHO細胞へFugene6(Roche社)を用いて導入し、タンパク質の一過性発現を行った。導入条件はメーカー推奨の方法で行った。24時間後にF12培地(GIBCO社)に交換し、4日間培養を行った。培養上清を回収し、遠心分離により細胞を除き、上清を回収した。抗体の精製は実施例1(7)記載の方法と同様に行った。
6 well plateに90%コンフルエントとなるようCHO細胞を培養し、(1)で作製したH鎖及びL鎖発現用ベクターをCHO細胞へFugene6(Roche社)を用いて導入し、タンパク質の一過性発現を行った。導入条件はメーカー推奨の方法で行った。24時間後にF12培地(GIBCO社)に交換し、4日間培養を行った。培養上清を回収し、遠心分離により細胞を除き、上清を回収した。抗体の精製は実施例1(7)記載の方法と同様に行った。
(3)免疫細胞染色による活性測定
実施例2と同様の方法で、HCT116と抗体クローン402、及び抗体クローン402ヒト−マウスキメラ抗体とを反応させ、FACS caliburを用いて解析した。この際、抗体濃度を10μg/mLとした。二次抗体としては、402抗体の場合は抗マウスIgGポリクローナル抗体−Alexa488標識を、キメラ抗体の場合は抗ヒトIgGポリクローナル抗体−Alexa488標識をそれぞれ用いた。活性測定の結果を図8に示した。
実施例2と同様の方法で、HCT116と抗体クローン402、及び抗体クローン402ヒト−マウスキメラ抗体とを反応させ、FACS caliburを用いて解析した。この際、抗体濃度を10μg/mLとした。二次抗体としては、402抗体の場合は抗マウスIgGポリクローナル抗体−Alexa488標識を、キメラ抗体の場合は抗ヒトIgGポリクローナル抗体−Alexa488標識をそれぞれ用いた。活性測定の結果を図8に示した。
図8は、抗体クローン402をヒト−マウスキメラ化した場合にも、細胞に対する反応性が失われていないことを示す。すなわち、抗体クローン402のヒト−マウスキメラ抗体は、SLC6A6に対する結合能が保存されていることが確認された。
HCT116(ヒト大腸がん細胞)及びMCF7(ヒト乳がん細胞)を96ウエルプレートに1ウエルあたり55×103細胞となるよう添加し、24時間培養を行った。各ウエルに、0、12.5、25、50、100μg/mLとなるよう抗体を添加し、72時間培養を行った。生存している細胞の割合をCell Counting Kit(DOJINDO社)を用い測定を行った。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。抗体を添加しないウエルの吸光度を100%として、抗体を添加した場合の生存率を算出した。その結果を図9に示す。
抗体クローン402のヒト−マウスキメラ抗体を添加することで、ヒト大腸がん細胞及び乳がん細胞の増殖を抑制することが示された。
ヒト大腸がん細胞(5×106細胞)をヌードマウス(1群3〜4匹、雌)の背部皮下に移植した。抗体クローン402ヒト−マウスキメラ抗体を4mg/kgとなるよう移植当日から腹腔内に投与し、その後実験が終了するまで3〜4日間隔で、腹腔内への投与を繰り返した。対照群としては生理食塩水を同様に腹腔内に投与した。腫瘍体積は、((腫瘍の長径)×(腫瘍の短径)の二乗)÷2で求めた。その結果を図10に示す。
図10は、大腸がん細胞において、抗体クローン402ヒト−マウスキメラ抗体を添加することで、腫瘍体積の増加が7日後から明確な減少がみられ、18日目までの間で明確な腫瘍の縮小効果が観察されたことを示す。すなわち、SLC6A6の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体が、すぐれた抗腫瘍効果を有していることが示された。
(1)SLC6A6遺伝子の一過性発現
実施例1(2)に記載のpEF6ベクターにSLC6A6遺伝子を組み込んだ発現用ベクターを、FUGENE6(ロシュ社製)を用いてHCT15及び、HT−29、およびSW480へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。
実施例1(2)に記載のpEF6ベクターにSLC6A6遺伝子を組み込んだ発現用ベクターを、FUGENE6(ロシュ社製)を用いてHCT15及び、HT−29、およびSW480へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。
(2)SLC6A6の過剰発現によるSide population細胞の変化
幹細胞は、様々な表面マーカーを用いて分離されているが、由来する組織により表面マーカーが異なることや、存在する割合が少ないことから、幹細胞の解析は非常に困難である。そこで、その分離・同定方法として、Side population(SP)細胞が注目されている。幹細胞は薬剤排出能が高く、様々な物質を細胞外に放出する特性を持っており、この幹細胞の特性を利用してHoechst33342の排出を指標に解析する技術が広く用いられている。この技術において、Hoechst33342の染色パターン中、発色が弱い細胞分画が、SP細胞と呼ばれる。がん細胞に関してもこのようなSP細胞が存在することが明らかになり、SP細胞は、非SP細胞に比べ明確に腫瘍形成能が高いことが報告され、がん幹細胞が濃縮される分画として知られるようになった(Cancer Research 2005, 65, p. 6207-6219)。
幹細胞は、様々な表面マーカーを用いて分離されているが、由来する組織により表面マーカーが異なることや、存在する割合が少ないことから、幹細胞の解析は非常に困難である。そこで、その分離・同定方法として、Side population(SP)細胞が注目されている。幹細胞は薬剤排出能が高く、様々な物質を細胞外に放出する特性を持っており、この幹細胞の特性を利用してHoechst33342の排出を指標に解析する技術が広く用いられている。この技術において、Hoechst33342の染色パターン中、発色が弱い細胞分画が、SP細胞と呼ばれる。がん細胞に関してもこのようなSP細胞が存在することが明らかになり、SP細胞は、非SP細胞に比べ明確に腫瘍形成能が高いことが報告され、がん幹細胞が濃縮される分画として知られるようになった(Cancer Research 2005, 65, p. 6207-6219)。
上記、実施例10(1)記載の方法で遺伝子を導入後、2日目にDISSOCIATION BUFFER(Invitrogen社)を用いて細胞を剥離した。PBS(phosphate buffered saline)に10μg/mLのHoechst33342となるよう調製した溶液で、37℃、1時間細胞を染色し、FACS Canto IIを用いてVioletレーザー(励起波長407nm)を用いて解析した。また、SP分画を同定するために、薬剤排出トランスポーターの阻害剤であるVerapamilを30μg/mL添加した実験を行った。結果を図11に示す。
図11は、コントロールベクター(「Mock」)に比べ、SLC6A6を一過性発現させた場合(「SLC6A6」)にSP細胞の割合が上昇している結果を示す。すなわち、SLC6A6は、幹細胞集団が濃縮されるSP分画の増加に直接関与していることが示された。
(1)SP分画におけるSLC6A6の発現
ヒト大腸がん細胞であるSW480細胞のSP分画及び非SP分画(Major population(MP)分画)に関して、SLC6A6の発現を解析した。実施例10(2)記載の方法と同様にHoechst33342で細胞を染色し、その後、1μg/mLの430抗体と細胞を4℃、1時間染色し、二次抗体として抗マウスIgGポリクローナル抗体AlexaFluor488標識で染色した後、FACS Canto IIを用いて解析を行った。その結果を図12に示す。
ヒト大腸がん細胞であるSW480細胞のSP分画及び非SP分画(Major population(MP)分画)に関して、SLC6A6の発現を解析した。実施例10(2)記載の方法と同様にHoechst33342で細胞を染色し、その後、1μg/mLの430抗体と細胞を4℃、1時間染色し、二次抗体として抗マウスIgGポリクローナル抗体AlexaFluor488標識で染色した後、FACS Canto IIを用いて解析を行った。その結果を図12に示す。
図12は、SLC6A6でSP及びMP細胞を染色した場合、MP細胞よりもSP細胞の方が抗体により強く染色されることを示している。つまり、SP細胞はMP細胞に比べ、SLC6A6がより多く発現していることが示された。なお、抗体を添加しない場合は、SP細胞及びMP細胞ともにシグナルのシフトがみられなかったことから、430抗体はSLC6A6に特異的に反応していることが示された。さらに、verapamilを添加した場合にはSP細胞は見られなかったため、SP細胞として分離した分画がSP細胞であることが確認された。
タウリンの添加によるSP細胞の割合
上記実施例11で示されるように、SLC6A6の発現は、がん幹細胞が濃縮される集団であるSP細胞の形成に直接関与している可能性がある。一方で、SLC6A6はタウリンを輸送するトランスポーターであることが報告されている(FEBS Letter 1993, 318, p.139-144)。そこで、SLC6A6を過剰発現させた細胞に対し、タウリンを作用させた場合、細胞集団におけるSP細胞の割合が変化するかを解析した。
上記実施例11で示されるように、SLC6A6の発現は、がん幹細胞が濃縮される集団であるSP細胞の形成に直接関与している可能性がある。一方で、SLC6A6はタウリンを輸送するトランスポーターであることが報告されている(FEBS Letter 1993, 318, p.139-144)。そこで、SLC6A6を過剰発現させた細胞に対し、タウリンを作用させた場合、細胞集団におけるSP細胞の割合が変化するかを解析した。
解析にはヒト大腸がん細胞であるColo320細胞にSLC6A6を過剰発現させた細胞を用い、培地にタウリンを0.05、0.1、0.5、1、及び5mMの濃度でそれぞれ添加して2日間培養を行った後、実施例11(1)記載の方法でSP細胞を解析した。結果を図13に示す。
図13は、Colo320にベクターのみを導入した細胞であるColo320−Mock、及びSLC6A6を安定的に発現するColo320−SLC6A6−OExの両方で、タウリンの添加濃度依存的にSP細胞の数が増えることを示している。タウリンの作用は、特にColo320−SLC6A6−OExで顕著であり、その割合は5mMのタウリンを加えた場合に、加えない場合(0mM)と比較して約2.5倍(17.0%から26.7%)増加していた。すなわち、SLC6A6の発現が亢進するとタウリンの取り込みが増加する、あるいは、タウリンの濃度が増加するに従ってSP細胞が増えることを示した。SP細胞は、がん幹細胞が濃縮される分画であることから、SLC6A6ががん細胞の幹細胞化に関与している可能性が示された。
配列番号1:ヒトSLC6A6をコードする塩基配列。
配列番号2:ヒトSLC6A6のアミノ酸配列。
配列番号3:ヒトSLC6A6のアミノ酸残基143〜216のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
配列番号4:ヒトSLC6A6のアミノ酸残基143〜216のアミノ配列。
配列番号5:プライマー配列、Forward
配列番号6:プライマー配列、Reverse
配列番号7:プライマー配列、Long
配列番号8:プライマー配列、Short
配列番号9:プライマー配列、mIgG2a_CH1_reverse
配列番号10:プライマー配列、mIgkappa_R3
配列番号11:オリゴDNA配列、hHchain
配列番号12:プライマー配列、hCg1_F(EcoRI-NheI)
配列番号13:プライマー配列、hCgI_R(NotI)
配列番号14:プライマー配列、Hchain_signal_top(KpnI-BamHI)
配列番号15:プライマー配列、Hchain_signal_bottom(KpnI-BamH)
配列番号16:プライマー配列、Forward
配列番号17:プライマー配列、Reverse
配列番号18:オリゴDNA配列、hLchain
配列番号19:プライマー配列、hCk_F(EcoRI-BsiWI)
配列番号20:プライマー配列、hCk_R(NotI)
配列番号21:プライマー配列、Forward2
配列番号22:プライマー配列、Reverse2
配列番号23:ヒト‐マウスキメラ205抗体の重鎖の塩基配列
配列番号24:ヒト‐マウスキメラ205抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号25:ヒト‐マウスキメラ205抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号26:ヒト‐マウスキメラ205抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号27:ヒト‐マウスキメラ402抗体の重鎖の塩基配列
配列番号28:ヒト‐マウスキメラ402抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号29:ヒト‐マウスキメラ402抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号30:ヒト‐マウスキメラ402抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号31:ヒト‐マウスキメラ419抗体の重鎖の塩基配列
配列番号32:ヒト‐マウスキメラ419抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号33:ヒト‐マウスキメラ419抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号34:ヒト‐マウスキメラ419抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号35:ヒト‐マウスキメラ303抗体の重鎖の塩基配列
配列番号36:ヒト‐マウスキメラ303抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号37:ヒト‐マウスキメラ303抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号38:ヒト‐マウスキメラ303抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号39:ヒト‐マウスキメラ422抗体の重鎖の塩基配列
配列番号40:ヒト‐マウスキメラ422抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号41:ヒト‐マウスキメラ422抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号42:ヒト‐マウスキメラ422抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号43:ヒト‐マウスキメラ430抗体の重鎖の塩基配列
配列番号44:ヒト‐マウスキメラ430抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号45:ヒト‐マウスキメラ430抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号46:ヒト‐マウスキメラ430抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号2:ヒトSLC6A6のアミノ酸配列。
配列番号3:ヒトSLC6A6のアミノ酸残基143〜216のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
配列番号4:ヒトSLC6A6のアミノ酸残基143〜216のアミノ配列。
配列番号5:プライマー配列、Forward
配列番号6:プライマー配列、Reverse
配列番号7:プライマー配列、Long
配列番号8:プライマー配列、Short
配列番号9:プライマー配列、mIgG2a_CH1_reverse
配列番号10:プライマー配列、mIgkappa_R3
配列番号11:オリゴDNA配列、hHchain
配列番号12:プライマー配列、hCg1_F(EcoRI-NheI)
配列番号13:プライマー配列、hCgI_R(NotI)
配列番号14:プライマー配列、Hchain_signal_top(KpnI-BamHI)
配列番号15:プライマー配列、Hchain_signal_bottom(KpnI-BamH)
配列番号16:プライマー配列、Forward
配列番号17:プライマー配列、Reverse
配列番号18:オリゴDNA配列、hLchain
配列番号19:プライマー配列、hCk_F(EcoRI-BsiWI)
配列番号20:プライマー配列、hCk_R(NotI)
配列番号21:プライマー配列、Forward2
配列番号22:プライマー配列、Reverse2
配列番号23:ヒト‐マウスキメラ205抗体の重鎖の塩基配列
配列番号24:ヒト‐マウスキメラ205抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号25:ヒト‐マウスキメラ205抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号26:ヒト‐マウスキメラ205抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号27:ヒト‐マウスキメラ402抗体の重鎖の塩基配列
配列番号28:ヒト‐マウスキメラ402抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号29:ヒト‐マウスキメラ402抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号30:ヒト‐マウスキメラ402抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号31:ヒト‐マウスキメラ419抗体の重鎖の塩基配列
配列番号32:ヒト‐マウスキメラ419抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号33:ヒト‐マウスキメラ419抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号34:ヒト‐マウスキメラ419抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号35:ヒト‐マウスキメラ303抗体の重鎖の塩基配列
配列番号36:ヒト‐マウスキメラ303抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号37:ヒト‐マウスキメラ303抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号38:ヒト‐マウスキメラ303抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号39:ヒト‐マウスキメラ422抗体の重鎖の塩基配列
配列番号40:ヒト‐マウスキメラ422抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号41:ヒト‐マウスキメラ422抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号42:ヒト‐マウスキメラ422抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号43:ヒト‐マウスキメラ430抗体の重鎖の塩基配列
配列番号44:ヒト‐マウスキメラ430抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号45:ヒト‐マウスキメラ430抗体の軽鎖の塩基配列
配列番号46:ヒト‐マウスキメラ430抗体の軽鎖のアミノ酸配列
本発明により、SLC6A6の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。また、本発明によりSLC6A6の発現を抑制する核酸が提供される。本発明の抗体は、SLC6A6を発現するがん細胞と特異的に結合することでがん治療に利用することができる。発現を抑制する核酸は、SLC6A6を発現するがん細胞の増殖及び転移の進行を抑制することが出来る。
配列番号5〜46:合成DNA/PRT
Claims (20)
- (a)配列番号24に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜125番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(b)配列番号28に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(c)配列番号32に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜128番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(d)配列番号36に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜131番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、
(e)配列番号40に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜129番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域、または
(f)配列番号44に示すアミノ酸配列の50〜54番目、69〜86番目および118〜126番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む重鎖可変領域
を含有する、抗体または抗原結合断片。 - (g)配列番号26に示すアミノ酸配列の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(h)配列番号30に示すアミノ酸配列の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(i)配列番号34に示すアミノ酸配列の48〜58番目、74〜80番目および113〜120番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(j)配列番号38に示すアミノ酸配列の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、
(k)配列番号42に示すアミノ酸配列の44〜54番目、70〜76番目および109〜116番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域、または
(l)配列番号46に示すアミノ酸配列の46〜57番目、73〜79番目および112〜119番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む軽鎖可変領域
を含有する、抗体または抗原結合断片。 - 請求項1に記載の重鎖可変領域および請求項2に記載の軽鎖可変領域を含む、請求項1または2に記載の抗体または抗原結合断片。
- 配列番号24に示すアミノ酸配列の21〜135番のアミノ酸配列、配列番号28に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列、配列番号32に示すアミノ酸配列の21〜138番のアミノ酸配列、配列番号36に示すアミノ酸配列の21〜141番のアミノ酸配列、配列番号40に示すアミノ酸配列の21〜139番のアミノ酸配列および配列番号44に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含有する、抗体または抗原結合断片。
- 配列番号26に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号30に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列、配列番号34に示すアミノ酸配列の25〜131番のアミノ酸配列、配列番号38に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号42に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列および配列番号46に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、抗体または抗原結合断片。
- 請求項4に記載の重鎖可変領域および請求項5に記載の軽鎖可変領域を含有する、請求項4または5に記載の抗体または抗原結合断片。
- 配列番号24、28、32、36、40および44からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む重鎖を含有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
- 配列番号26、30、34、38、42および46からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
- ヒト−マウスキメラ抗体または抗原結合断片である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
- 配列番号24に示すアミノ酸配列の21〜135番のアミノ酸配列、配列番号28に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列、配列番号32に示すアミノ酸配列の21〜138番のアミノ酸配列、配列番号36に示すアミノ酸配列の21〜141番のアミノ酸配列、配列番号40に示すアミノ酸配列の21〜139番のアミノ酸配列および配列番号44に示すアミノ酸配列の21〜136番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする単離された核酸。
- 重鎖可変領域および重鎖定常領域をコードする、請求項10に記載の核酸。
- 配列番号26に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号30に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列、配列番号34に示すアミノ酸配列の25〜131番のアミノ酸配列、配列番号38に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列、配列番号42に示すアミノ酸配列の21〜127番のアミノ酸配列および配列番号46に示すアミノ酸配列の23〜130番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする単離された核酸。
- 重鎖可変領域および軽鎖定常領域をコードする、請求項12に記載の核酸。
- 請求項10〜13のいずれか1項に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
- 請求項14に記載のベクターが導入された宿主細胞。
- 請求項15に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトSLC6A6に対する抗体または抗原結合断片の製造方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、医薬組成物。
- がんを治療するための請求項17に記載の医薬組成物。
- がんが、大腸がん、乳がんまたは子宮がんである、請求項18に記載の医薬組成物。
- がんが大腸がんである、請求項18に記載の医薬組成物。
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