WO2015129919A1

WO2015129919A1 - 抗ｓｌｃ６ａ６抗体および当該抗体を含むがん治療用医薬組成物

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Publication number: WO2015129919A1
Application number: PCT/JP2015/056269
Authority: WO
Inventors: 弘匡秋山; 正也大津; 成樹向畑; 賢介大瀬; 洋子岡部; 康文村上
Original assignee: 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ
Priority date: 2014-02-25
Filing date: 2015-02-25
Publication date: 2015-09-03
Also published as: JP2017077182A

Abstract

　本発明は、がん特異的で副作用の少ない新たな医薬組成物の提供に関する。本発明により、従来の抗体よりも親和性が高く、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６又はＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を含む医薬組成物を提供することができる。

Description

抗ＳＬＣ６Ａ６抗体および当該抗体を含むがん治療用医薬組成物

　本発明は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体、および当該モノクローナル抗体を含むがん治療用医薬組成物に関する。

　がんは世界的にも死因の上位を占めており、中でも大腸がんは、がんの死亡率において上位に位置する疾患である。日本でも大腸がんの患者数は近年急激に増加しており、年間約６万人が大腸がんに罹患し、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さとなっている。大腸がんは、大腸のみにとどまる場合には５年生存率は約９０％以上であり、早期発見が治癒率の高さに繋がるがんとして知られている。それにもかかわらず大腸がんが死亡数の多いがんである理由は、高い罹患率に加え、リンパ節への転移が起きると５年生存率が７０％、肺や肝臓へ遠隔転移すると２５％以下と、がんの進行に伴って急激に死亡率が悪化する点が挙げられる。これら大腸がんに対する治療法としては、外科治療と化学療法が一般的であるが、近年の分子標的薬の出現によって、がん特異的な新たな治療法が模索されるようになった。

　大腸がんに対する分子標的薬として日本で承認された抗体医薬品としては、アバスチンやアービタックスが知られている。これらは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）や上皮成長因子（ＥＧＦ）という増殖因子をターゲットとした抗体医薬品である。アバスチンは治癒切除が不可能な進行・再発の大腸がんでの使用が承認されており、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ受容体との結合を抑制することで血管新生を抑制して、腫瘍組織への栄養を絶つという作用機序で働く。

　アービタックスは、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、ＥＧＦによる細胞増殖シグナルが働かないようにすることでがん細胞の増殖を停止させることを狙いとする。また、抗体ががん細胞の表面に結合することで、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどによる抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によりがん細胞を死滅させる作用機序も働いていると言われている。

　このように、抗体に代表される分子標的薬は、がんを特異的に認識すればがん細胞を殺傷する点で優れた物質である。しかし、抗体が正常細胞にも結合した場合、重篤な副作用を示す場合がある。例えば、乳がん治療薬であるハーセプチンは頭痛や無力症、吐き気・嘔吐だけでなく、間質性肺炎や骨髄抑制、肝障害、腎障害、脳血管障害を引き起こす場合がある。また、組織染色では、正常な心筋細胞とも強く反応し重篤な心障害を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。さらに、ハーセプチンはＨｅｒ２を標的とした抗体医薬品であるため、Ｈｅｒ２を発現している患者にしか奏効性を示さないという課題が残されている。

　大腸がん治療薬であるアバスチンでは、副作用として出血、血栓症、消化管穿孔、創傷治療の遅延、血圧上昇などが挙げられ、このうち血栓症と消化管穿孔は生命にかかわる副作用である（非特許文献２）。アービタックスでは、副作用としては皮膚障害等が知られており、生命を脅かすものではないが痒みや白色の膿泡等が起き、患者への精神的、肉体的な負担が存在する（非特許文献３）。また、ＥＧＦＲ下流のシグナル変化（例えばＫ−ｒａｓ変異）によるがん化には作用を示さないという問題も存在している。

　したがって、がんに対する抗体医薬品は、重篤な副作用が発生することや、奏効性を示す患者が限定されるなどの課題が残されており、がん特異的な分子標的及び副作用が少ない医薬品の新たな開発が求められている。

　がん細胞は、正常細胞に比べ、高い増殖力や細胞分裂の回数に制限がない、周辺組織への浸潤や転移を起こすという特徴を持っている。近年、がん組織の中のがん細胞全てがこのような性質を持つのではなく、一部の限られた細胞がこのような性質を持つと考えられるようになった。すなわち、これらの一部のがん細胞は、自らと全く同じ細胞を作り出す自己複製能と、多種類の細胞に分化しうる多分化能という、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞に共通して見られる特徴を有し、これらの特徴によってがん組織中で自己複製により自分と同じ細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数のがん細胞を生み出すもとになっていると考えられている。このような一部のがん細胞は、がん幹細胞と呼ばれており、がんはこの幹細胞様の細胞から発生・進行するという仮説（がん幹細胞仮説）が提唱されている。

　がん幹細胞は、がんの再発や転移の主要な原因と考えられており、がん治療においてがん幹細胞を標的にすることの重要性が指摘されている。しかし、腫瘍組織内におけるがん幹細胞の比率はわずかしかなく、がん幹細胞のみをターゲットとした治療薬では、がん細胞全体を殺傷することが出来ないとも考えられている。すなわち、正常組織に比べ、がん幹細胞で極めて高く発現しており、かつ、一般的ながん細胞でも発現しているようなマーカーを標的とする新たな治療法の開発が、がん医療にとって重要な課題である。

　現在のところ、がん幹細胞マーカーとしては、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４４などの分子マーカーが知られている（非特許文献４）が、これらに対する抗体は、一部のがん幹細胞に結合するにしか過ぎず、治療薬として有効性がないといわれている。また、ＬＧＲ５はＲ−スポンジンと相互作用し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルを活性化する機構を持っており、がん幹細胞マーカーとして利用できる可能性が示唆されている（特許文献１）。

　ＳＬＣ６Ａ６（ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　６（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ），ｍｅｍｂｅｒ　６）は、６２０アミノ酸からなる１２回膜貫通型の膜タンパク質であり、ＮＣＢＩ（米国生物工学情報センター）にＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［ＲｅｆＳｅｑ］ＩＤ：ＮＭ＿００３０４３、ＮＰ＿００３０３４．２として登録されている（配列番号１：塩基配列（ＣＤＳ：２９６~２１５８）、配列番号２：アミノ酸配列）。ＳＬＣ６Ａ６はタウリンの細胞内への取り込みに関与しており、ナトリウムイオン及びクロライドイオンとともにタウリンを共輸送する。膜タンパク質には、リガンドと結合する受容体だけでなく、アミノ酸や糖等の低分子化合物を能動的あるいは受動的に輸送する輸送タンパク質（以下、トランスポーターと記載する）も存在する。

　国際公開第２０１２／０２９９９０号（特許文献２）には、ＳＬＣ６Ａ６が大腸がんに発現し、その細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体によって、大腸がんを検出でき、診断薬として利用できることが示されている。さらに、特許文献２は、ＳＬＣ６Ａ６の遺伝子は、５症例の大腸がん組織全てで発現している一方で、５症例の正常組織には遺伝子の転写がみられないことをｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で明らかにしている。さらに、取得されたモノクローナル抗体の２種類のクローン（４Ｂ９ｂ及び５Ｈ１２ｄ）は、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質の１４５番目~２１３番目までのアミノ酸残基の間にエピトープが存在することが記載されている。

特表２０１０−５３２１６９号公報国際公開第２０１２／０２９９９０号

Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，９４，１０１６−１０２０，２００６Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２１，６０−６５，２００３Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２，１２０１−１２０８，２００４ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＯＬＯＧＹ，１３８，２１５１−２１６２，２０１０

　一般的にがんの手術による治療は、転移巣の治療が困難であるばかりでなく、侵襲と合併症の併発を伴うことが問題である。また、化学療法や放射線治療は副作用が問題となっている。さらに、既存の抗体医薬品は副作用の発生に加えて、奏効性を全く示さないがんが存在する。そこで、がん特異的な分子標的及び副作用の少ない新たな医薬品の開発が求められていた。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、国際公開第２０１２／０２９９９０号（ＷＯ２０１２／０２９９９０）（前掲　特許文献２）記載の抗ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体よりもネイティブなＳＬＣ６Ａ６への親和性を高めた新たなモノクローナル抗体を取得した。本発明者は、ＳＬＣ６Ａ６が、通常のがん細胞よりもがんの再発や転移の主要な原因であるがん幹細胞に高く発現しているという知見を見出した。また本発明者は、当該抗体が、驚くべきことに抗腫瘍効果を示すことを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき本発明を完成させた。

　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］
（ａ）配列番号２４に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２５番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２８に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、
（ｃ）配列番号３２に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２８番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、
（ｄ）配列番号３６に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１３１番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、
（ｅ）配列番号４０に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２９番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、または
（ｆ）配列番号４４に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域
を含有する、抗体または抗原結合断片。
［２］
（ｇ）配列番号２６に示すアミノ酸配列の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、
（ｈ）配列番号３０に示すアミノ酸配列の４６~５７番目、７３~７９番目および１１２~１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、
（ｉ）配列番号３４に示すアミノ酸配列の４８~５８番目、７４~８０番目および１１３~１２０番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、
（ｊ）配列番号３８に示すアミノ酸配列の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、
（ｋ）配列番号４２に示すアミノ酸配列の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、または
（ｌ）配列番号４６に示すアミノ酸配列の４６~５７番目、７３~７９番目および１１２~１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域
を含有する、抗体または抗原結合断片。
［３］
　［１］に記載の重鎖可変領域および［２］に記載の軽鎖可変領域を含む、［１］または［２］に記載の抗体または抗原結合断片。
［４］
　配列番号２４に示すアミノ酸配列の２１~１３５番のアミノ酸配列、配列番号２８に示すアミノ酸配列の２１~１３６番のアミノ酸配列、配列番号３２に示すアミノ酸配列の２１~１３８番のアミノ酸配列、配列番号３６に示すアミノ酸配列の２１~１４１番のアミノ酸配列、配列番号４０に示すアミノ酸配列の２１~１３９番のアミノ酸配列および配列番号４４に示すアミノ酸配列の２１~１３６番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含有する、抗体または抗原結合断片。
［５］
　配列番号２６に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列、配列番号３０に示すアミノ酸配列の２３~１３０番のアミノ酸配列、配列番号３４に示すアミノ酸配列の２５~１３１番のアミノ酸配列、配列番号３８に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列、配列番号４２に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列および配列番号４６に示すアミノ酸配列の２３~１３０番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、抗体または抗原結合断片。
［６］
　［４］に記載の重鎖可変領域および［５］に記載の軽鎖可変領域を含有する、［４］または［５］に記載の抗体または抗原結合断片。
［７］
　配列番号２４、２８、３２、３６、４０および４４からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む重鎖を含有する、［１］~［６］のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
［８］
　配列番号２６、３０、３４、３８、４２および４６からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する、［１］~［７］のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
［９］
　ヒト−マウスキメラ抗体または抗原結合断片である、［１］~［８］のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
［１０］
　配列番号２４に示すアミノ酸配列の２１~１３５番のアミノ酸配列、配列番号２８に示すアミノ酸配列の２１~１３６番のアミノ酸配列、配列番号３２に示すアミノ酸配列の２１~１３８番のアミノ酸配列、配列番号３６に示すアミノ酸配列の２１~１４１番のアミノ酸配列、配列番号４０に示すアミノ酸配列の２１~１３９番のアミノ酸配列および配列番号４４に示すアミノ酸配列の２１~１３６番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする単離された核酸。
［１１］
　重鎖可変領域および重鎖定常領域をコードする、［１０］に記載の核酸。
［１２］
　配列番号２６に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列、配列番号３０に示すアミノ酸配列の２３~１３０番のアミノ酸配列、配列番号３４に示すアミノ酸配列の２５~１３１番のアミノ酸配列、配列番号３８に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列、配列番号４２に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列および配列番号４６に示すアミノ酸配列の２３~１３０番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする単離された核酸。
［１３］
　重鎖可変領域および軽鎖定常領域をコードする、［１２］に記載の核酸。
［１４］
　［１０］~［１３］のいずれか１項に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
［１５］
　［１４］に記載のベクターが導入された宿主細胞。
［１６］
　［１５］に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトＳＬＣ６Ａ６に対する抗体または抗原結合断片の製造方法。
［１７］
　［１］~［９］のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、医薬組成物。
［１８］
　がんを治療するための［１７］に記載の医薬組成物。
［１９］
　がんが、大腸がん、乳がんまたは子宮がんである、［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］
　がんが大腸がんである、［１８］に記載の医薬組成物。

　また、本発明の別の態様において、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域内の立体構造をとるエピトープに結合するモノクローナル抗体、および当該抗体またはその抗原結合断片を含む、がん治療用医薬組成物を提供する。
　ここで、前記エピトープは、以下の（ａ）~（ｃ）から選択される少なくとも１つに示されるポリペプチドを含む：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列に７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド。

　本発明により、従来の抗体よりも高い親和性を有するＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体または抗原結合断片、当該抗体または抗原結合断片を含む医薬組成物が提供される。当該抗体はキメラ化され得るため、ヒトに適用された際の副作用を軽減することができる。また、当該抗体は、がん細胞株（例えば大腸がん細胞株）に対しＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有するため、ヒトがん患者に投与した場合にも生体内でそれらの活性により抗がん作用を持つことが期待され、当該医薬組成物は、がん治療用医薬組成物、例えば大腸がん治療用医薬組成物として有用である。

　また、ＳＬＣ６Ａ６は、正常組織に比べ、がん幹細胞で極めて高く発現しており、かつ、一般的ながん細胞でも発現しているため、本発明によって、がん幹細胞を主な対象としつつ、がん幹細胞だけを標的とするのでなく、がん細胞全体をも標的とする新たながんの治療薬または治療法が提供される。

モノクローナル抗体クローン２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２及び４３０に関して、２種類の大腸がん細胞（ＨＴ−２９及びＬｏＶｏ）を免疫組織染色した図である。ハイブリドーマ細胞が生産するモノクローナル抗体の活性を、ヒト腎臓上皮細胞である２９３Ｔ細胞を用いてＦＡＣＳで解析した結果を示す図である。大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６）を用いて、抗体クローン２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２、及び４３０をＦＡＣＳ解析した図である。２種類の大腸がん細胞（ＳＷ４８０及びＨＴ−２９）を用いて、抗体クローン２０５、４１９、４０２、及び４３０をＦＡＣＳ解析した図である。５１症例の大腸がん組織（Ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ）と８症例の正常大腸粘膜（Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ）を、抗ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体（抗体クローン４１９）で免疫組織染色した結果（代表例）である。乳がん及び子宮がんの組織（Ｃａｎｃｅｒ）と、それぞれ正常臓器の組織（Ｎｏｒｍａｌ）を免疫組織染色した結果である。抗体クローン４０２が大腸がん細胞膜上のＳＬＣ６Ａ６に結合する反応が、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域の部分タンパク質（大腸菌組換え体）によって競争阻害されることを解析した結果である。図８Ａは、抗体クローン４０２と、４０２ヒト−マウスキメラ抗体の活性を比較した結果である。　図８Ｂは、抗体クローン４０２ヒト−マウスキメラ抗体と、抗体クローン４Ｂ９ｂのマウスＩｇＧ化抗体（ｃｈｉｍｅｒａ　４Ｂ９ｂ）について、ＦＡＣＳを用いて抗体の活性を解析した図である。抗体クローン４０２のヒト−マウスキメラ抗体が、ヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６）及び乳がん細胞（ＭＣＦ７）の増殖に影響することを示す図である。抗体クローン４０２のヒト−マウスキメラ抗体（ｃ４０２　ｍＡｂ）と、抗体クローン４Ｂ９ｂのマウスＩｇＧ化抗体（ｃ４Ｂ９ｂ）との抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性を、（ａ）ＨＣＴ１１６、（ｂ）ＨＴ−２９、（ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（ｄ）ＳＫ−ＢＲ３のがん細胞で比較した結果を示す図である。実験結果は３回実験を行った平均値と標準偏差を示している。抗体クローン４０２のヒト−マウスキメラ抗体（ｃ４０２　ｍＡｂ）と抗体クローン４Ｂ９ｂのマウスＩｇＧ化抗体（ｃｈｉｍｅｒａ　４Ｂ９ｂ）との補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性を、ＨＣＴ１１６のがん細胞で比較した結果を示す図である。実験結果は１２回実験を行った平均値と標準偏差を示している。図１１Ａは、抗体クローン２０５、４０２および４１９のヒト−マウスキメラ抗体（ｃ２０５　ｍＡｂ、ｃ４０２　ｍＡｂおよびｃ４１９　ｍＡｂ）の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性を、Ｆｃγ受容体の活性化を指標にし、ＨＣＴ１１６およびＨＴ−２９のがん細胞で比較した結果を示す図である。実験結果は３回実験を行った平均値と標準偏差を示している。　図１１Ｂは、抗体クローン２０５、４０２および４１９のヒト−マウスキメラ抗体（ｃ２０５　ｍＡｂ、ｃ４０２　ｍＡｂおよびｃ４１９　ｍＡｂ）の補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性を、ＨＣＴ１１６およびＨＴ−２９のがん細胞で比較した結果を示す図である。実験結果は３回実験を行った平均値と標準偏差を示している。抗体クローン４０２のヒト−マウスキメラ抗体（４０２　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｍＡｂ）が、ヌードマウスの皮下に移植したヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６細胞）の増殖を抑制することを示す図である。なお、図中、ｃｏｎｔｒｏｌは、生理食塩水を投与した場合の結果である。ヒト大腸がん細胞にＳＬＣ６Ａ６を一過性に発現させた場合のＳｉｄｅ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞の数を解析した結果である。線で囲んだ画分がＳＰ細胞を示し、各パネル中の数字はＳＰ細胞が含まれる割合（％）を示す。ＳＬＣ６Ａ６の遺伝子を過剰発現させることで、ＳＰ細胞の数が増加することを示す図である。ＳＰ細胞及び非ＳＰ細胞の集団において、ＳＬＣ６Ａ６の発現量を比較解析した結果を示す図である。タウリンを培地に添加した場合のＳＰ細胞の割合を解析した結果を示す図である。

　以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で適宜変形して実施することができる。
　なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１４−０３３６７５号明細書（２０１４年２月２５日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

　本発明は、膜タンパク質であるＳＬＣ６Ａ６が、がんの組織において過剰発現されるタンパク質であり、処置の対象として有用なマーカーであるという知見に基づくものである。さらに、ＳＬＣ６Ａ６が、通常のがん細胞よりも、がんの再発や転移の主要な原因であるがん幹細胞に高く発現しているという知見に基づくものである。本発明において、従来の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体よりも高い親和性を有する抗体が提供される。本発明の医薬組成物は、がん、特に大腸がん、乳がん、子宮がんの治療に有用である。また、本発明は、当該抗体、抗原結合断片、およびそれらを含有する医薬組成物、並びに当該抗体を産生するハイブリドーマ細胞、当該抗体および断片を製造するための核酸、組換え発現ベクター、および細胞に関する。

　ＳＬＣ６Ａ６（ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　６（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ），ｍｅｍｂｅｒ　６）は、１２回膜貫通型の膜タンパク質であり、その細胞外領域はタウリンとの結合及びタウリンの細胞内部への輸送を担っていることが推測されている。

　本発明は、膜タンパク質であるＳＬＣ６Ａ６が、がんの組織において過剰発現されるタンパク質であり、通常のがん細胞よりも、がんの再発や転移の主要な原因であるがん幹細胞に高く発現しているという知見に基づくものである。さらに、本発明は、ＳＬＣ６Ａ６に高い親和性を有する抗体が、抗がん作用を有するとの知見に基づくものである。

　本発明は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。ＳＬＣ６Ａ６は大腸がん等のがん細胞で発現するため、この抗体は、大腸がん等のがん細胞に特異的に結合する。また、本発明における抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、従来の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体よりも高い親和性でＳＬＣ６Ａ６に結合し得る。

　また、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、抗がん作用を有するため、がんの治療に使用することができる。したがって、本発明は、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、がん、特に大腸がん、乳がん、子宮がんの治療に有用である。

１．本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体
　本発明のモノクローナル抗体（以下「本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体」ともいう）は、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することができる。「ネイティブな」とは、そのタンパク質が生体内の環境で有するインタクトな立体構造の状態にあることをいう。

　また、本発明の別の態様において、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域を認識することができる。詳しくは、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域内の立体構造の少なくとも一部をエピトープとして認識する。特に、細胞外領域として、ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基１４３~２１６の領域（配列番号４）を認識することができる。

　本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれる範囲、すなわち結合対象のポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有する限りにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列の１個もしくは数個（例えば２~２０個、好ましくは２~１０個、より好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入が行われている変異型ポリペプチド、配列番号４に示すアミノ酸配列に７０％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９８％以上の同一性を有する変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。

　また、本発明の別の態様において、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドであって、配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、配列番号３に記載の塩基配列に７０％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドにコードされる変異型ポリペプチドまたは配列番号３に記載の塩基配列と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドにコードされる変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。ここで、ハイブリダイゼーションは、公知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従って行うことができる。高ストリンジェントな条件は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が１０ｍＭ~３００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ~１００ｍＭであり、温度が２５℃~７０℃、好ましくは４２℃~５５℃での条件をいう。あるいは、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体はＳＬＣ６Ａ６に結合するものであるから、上記変異型ポリペプチドにおいて、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体が結合することができるものは、抗体の配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれることを示し、すなわちＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドに含まれる。

　変異型ポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、動物細胞などで変異型ポリペプチドを強制発現させ、タウリンの取り込みをａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ（Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ，７６，１−１５，１９８３）で解析することにより確認することができると考えられる。
　あるいは、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体はＳＬＣ６Ａ６に結合するものであるから、上記変異型ポリペプチドにおいて、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体が結合することができるものは、抗体の配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれることを示し、すなわちＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドに含まれる。

　ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域は、がん細胞において発現が上昇するマーカータンパク質の細胞表面部位である。変異型ポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、正常細胞とがん細胞における変異型ポリペプチドの発現を、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳなどで比較することにより確認することができる。

　また、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域は、がん細胞において発現が上昇するマーカータンパク質の細胞表面部位である。変異型ポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、正常細胞とがん細胞における変異型ポリペプチドの発現を、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳなどで比較することにより確認することができる。

　本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体とエピトープまたは変異型ポリペプチドとの結合は、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。

　また、本発明の別の態様において、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、ｓｌｃ６ａ６のｍＲＮＡバリアントがコードするタンパク質をも認識する。全長のＳＬＣ６Ａ６だけでなく、一部を欠損した変異体にも結合することができるため、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞と広範に結合することが可能である。

　本発明において、「抗体」は、２つの重鎖及び２つの軽鎖よりなる免疫グロブリン分子である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）よりなる。この重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３よりなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）よりなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬよりなる。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、更に、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存されている領域と相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域よりなる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲよりなり、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置されている。

　本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、完全長であってもよいし、抗原結合断片であってもよい。完全長である場合、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、ＷＯ２０１２／０２９９９０（前掲　特許文献２）に記載されるサブクラスＩｇＭのＳＬＣ６Ａ６抗体とは異なり、サブクラスＩｇＧである。したがって、免疫組織染色及び／またはフローサイトメーターによる解析において、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体はＳＬＣ６Ａ６へのより高い親和性を有する。

　本発明において、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）は、抗原（例えば、ＳＬＣ６Ａ６）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により遂行され得ることが知られている。抗体の「抗原結合部分」の例として、限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ断片、Ｆｖ、ｄＡｂ、ＣＤＲ、ｓｃＦｖ、ディアボディなどが挙げられる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片等の抗体部分は、慣用の技術、例えば、それぞれ、全抗体のパパイン又はペプシン消化を用いて、完全長抗体から調製することができる。また、抗体及び抗原結合断片は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。

　本発明においては、種々の遺伝子工学的およびタンパク質工学的な手法により、モノクローナル抗体の一部である抗原結合断片もしくは抗体断片、低分子化抗体、遺伝子組換え抗体、抗体修飾物などの抗体様分子、またはモノクローナル抗体が融合したタンパク質を作製することができる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）_２、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）_２、（ｓｃＦｖ）_２、ディアボディ、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体などが挙げられる。いずれも、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域への結合能を有している分子であれば、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体に含まれる。

　本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体が認識するＳＬＣ６Ａ６は、検出対象となる細胞集団において、正常細胞では発現せず、がん細胞で発現し、さらにがん細胞に比べがん幹細胞で発現の高い分子マーカーである。したがって、当該抗体は、がん及びがん幹細胞の両方に結合し、かつがん幹細胞により多く結合する。

　本発明における「がん細胞」とは、正常細胞に比べ、高い増殖力や細胞分裂の回数に制限がない、周辺組織への浸潤や転移を起こすなどの特徴を持っている細胞集団のことをいう。

　本発明における「がん幹細胞」とは、がん細胞のうち幹細胞の性質を有する細胞である。幹細胞とは細胞分裂を経ても分化能を維持している細胞のことをいう。がん幹細胞は、ヘキスト蛍光色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）で染色し、フローサイトメトリーを利用してＵＶレーザー（波長約３５０ｎｍ）を励起光に用いて検出すると、Ｓｉｄｅ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）画分に濃縮される細胞として認識される。ＳＰ画分とは、ヘキスト蛍光色素によって染色されるＭａｉｎ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＭＰ）画分に対して、ＡＢＣトランスポーターなどを介して色素を細胞外に排出することで染色されない画分または染色の弱い画分のことを指す（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１７８，４，１８０５−１８１３，２０１１）。

　本発明における「正常細胞」とは、生体または組織の活動において、正常な機能を有する細胞のことを指す。正常細胞は、体性幹細胞を含んでもよいが、好ましくは成熟細胞である。

　本発明の別の態様において、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、がん幹細胞により強く結合するものであり、かつ１または複数のがん種のがん細胞に結合することが出来る。好ましくは、当該がん種およびがん細胞は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸および末梢血単核球などの細胞または組織由来の１または複数のがん種であり、より好ましくは大腸がん、乳がん、子宮がんのがん細胞である。

　さらに、本発明の別の態様において、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、正常細胞においては結合しない。好ましくは、例えば、心臓、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、骨髄、大腸および末梢血単核球などの少なくとも１つ以上において、正常細胞に結合しない。

　本発明の好ましい態様において、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、以下細胞株（ハイブリドーマ）から産生される：
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　２０４」（以下「２０４」という）；
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　２０５」（以下「２０５」という）；
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　３０３」（以下「３０３」という）；
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　４１９」（以下「４１９」という）；
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　４０２」（以下「４０２」という）；
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　４２２」（以下「４２２」という）；または
「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　４３０」（以下「４３０」という）。
　本発明は、これらのハイブリドーマおよびこれらが産生する抗体を提供する。当該ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。

　本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、好ましくは、以下に示す重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくは軽鎖ＣＤＲ、または重鎖可変領域（ＶＨ）もしくは軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する。重鎖可変領域は、以下に示すＶＨから選択することができ、また、軽鎖可変領域も以下に示すＶＬから選択することができる。

　「２０５」の産生する抗体は、配列番号２４の２１~１３５番目のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２６の２１~１２７番目のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
　また、「２０５」の産生する抗体は、配列番号２４の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２５番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＨ、および配列番号２６の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＬを含む。

　「４０２」の産生する抗体は、配列番号２８の２１~１３６番目のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３０の２３~１３０番目のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
　また、「４０２」の産生する抗体は、配列番号２８の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＨ、および配列番号３０の４６~５７番目、７３~７９番目および１１２~１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＬを含む。

　「４１９」の産生する抗体は、配列番号３２の２１~１３８番目のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３４の２５~１３１番目のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
　また、「４１９」の産生する抗体は、配列番号３２の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２８番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＨ、および配列番号３４の４８~５８番目、７４~８０番目および１１３~１２０番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＬを含む。

　「３０３」の産生する抗体は、配列番号３６の２１~１４１番目のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３８の２１~１２７番目のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
　また、「３０３」の産生する抗体は、配列番号３６の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１３１番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＨ、および配列番号３８の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＬを含む。

　「４２２」の産生する抗体は、配列番号４０の２１~１３９番目のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４２の２１~１２７番目のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
　また、「４２２」の産生する抗体は、配列番号４０の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２９番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＨ、および配列番号４２の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＬを含む。

　「４３０」の産生する抗体は、配列番号４４の２１~１３６番目のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４６の２３~１３０番目のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
　また、「４３０」の産生する抗体は、配列番号４４の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＨ、および配列番号４６の４６~５７番目、７３~７９番目および１１２~１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含むＶＬを含む。

　本発明の一態様において好ましい抗体は、ハイブリドーマ「４１９」、「４０２」または「４３０」の産生するモノクローナル抗体である。

　また、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、重鎖が配列番号２４、２８、３２、３６、４０または４４で示されるアミノ酸配列を含み、または軽鎖が配列番号２６、３０、３４、３８、４２または４６で示されるアミノ酸配列を含む。

　本発明の一態様において、本発明は、少なくとも配列番号２４、２８、３２、３６、４０または４４で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列を含む重鎖、および少なくとも配列番号２６、３０、３４、３８、４２または４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列を含む軽鎖を含む抗体またはその抗原結合部分を提供する。

　さらに、本発明の別の態様において、本発明は、
配列番号２４の２１~１３５番目のアミノ酸配列、
配列番号２８の２１~１３６番目のアミノ酸配列、
配列番号３２の２１~１３８番目のアミノ酸配列、
配列番号３６の２１~１４１番目のアミノ酸配列、
配列番号４０の２１~１３９番目のアミノ酸配列、または
配列番号４４の２１~１３６番目のアミノ酸配列と
少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号２６の２１~１２７番目のアミノ酸配列、
配列番号３０の２３~１３０番目のアミノ酸配列、
配列番号３４の２５~１３１番目のアミノ酸配列、
配列番号３８の２１~１２７番目のアミノ酸配列、
配列番号４２の２１~１２７番目のアミノ酸配列、または
配列番号４６の２３~１３０番目のアミノ酸配列と
少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体またはその抗原結合部分を提供する。

　さらに、本発明の別の態様において、本発明は、
配列番号２４の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２５番目のアミノ酸配列、
配列番号２８の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２６番目のアミノ酸配列、
配列番号３２の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２８番目のアミノ酸配列、
配列番号３６の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１３１番目のアミノ配列、
配列番号４０の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２９番目のアミノ配列または
配列番号４４の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２６番目のアミノ配列と
少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含み、配列番号２６の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ酸配列、
配列番号３０の４６~５７番目、７３~７９番目および１１２~１１９番目のアミノ酸配列、
配列番号３４の４８~５８番目、７４~８０番目および１１３~１２０番目のアミノ酸配列、
配列番号３８の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ配列、
配列番号４２の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ配列または
配列番号４６の４６~５７番目、７３~７９番目および１１２~１１９番目のアミノ配列と、
少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む、抗体またはその抗原結合部分を提供する。

　また、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４または４６のアミノ酸配列と所定の同一性を有するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３または４５の塩基配列と所定の同一性、例えば、少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する塩基配列によってコードされてもよい。

　本発明の別の態様において、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、キメラ抗体である。「キメラ抗体」は、重鎖定常領域および軽鎖の定常領域がヒトに由来し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がヒト以外（例、マウス）に由来する抗体を意味する。本明細書において、定常領域がヒトに由来し、可変領域がマウスに由来する抗体または抗原結合断片を、ヒト−マウスキメラ抗体または抗原結合断片と称することもある。

　これらの特徴を有する本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、通常のモノクローナル抗体の製法とは異なり、ＷＯ２０１０／０９８４７１に開示されるように、膜タンパク質を発現させた細胞を生着させる免疫法を用いて得ることができる。一方で、当業者において一般的に実施されている製法によっては、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体の作製は困難であることが予想される。その理由としては：
（１）抗原として膜タンパク質を調製する際に、界面活性剤を使用すると膜タンパク質の立体構造が崩れ、その一方、界面活性剤を使用しない場合は膜タンパク質が疎水性領域同士で凝集する；
（２）細胞表面の発現量が低い、または細胞外領域が小さいために免疫応答が起こらない；
などの理由による。
　本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、本発明者らが抗体の製法（特に免疫方法）に工夫を施した結果、従来の抗体に対して優れた特徴を獲得したものである。

　本発明の一態様において、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、以下の特徴を有する。本発明の抗体は、ＳＬＣ６Ａ６が本来有する立体構造をもとに作製されたために、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することができる。そのため、同じエピトープを認識する従来の抗体（ＨＰＡ０１５０２８）と比較して結合力が非常に高く、従来の抗体では困難であった細胞膜上のＳＬＣ６Ａ６と十分に結合することができる。また、ＳＬＣ６Ａ６の膜内および細胞内の領域を認識する従来のモノクローナル抗体（ｓｃ−１６６６４０）に対して、本発明の抗体の認識部位は細胞外であるため、生きた細胞に結合することができる。そのため、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞を標的とする治療薬として有効である。

　加えて、従来の抗体はポリクローナル抗体であり、均質な抗体を継続的に生産することが困難であったが、本発明の抗体はモノクローナル抗体であるため、再現性よく量産することが可能である。これらの特徴から、本発明の抗体は、がんの治療に利用することが出来る。

　また、ＳＬＣ６Ａ６に対する抗体または抗原結合断片は、上記ハイブリドーマ２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２または４３０により産生されるＳＬＣ６Ａ６に対するマウスモノクローナル抗体そのものに限られず、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープ（ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸配列のうち、第１４５番目から第２１３番目までのアミノ酸残基のほか、これらの領域の一部であってもよい。）を指す。

　したがって、上記ハイブリドーマ２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２または４３０により産生されるＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体のヒト−マウスキメラ抗体も、本発明の範囲に含まれる。例えば、
ヒト−マウスキメラ抗体２０５は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、ヒト−マウスキメラ抗体４０２は、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、ヒト−マウスキメラ抗体４１９は、配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、ヒト−マウスキメラ抗体３０３は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、ヒト−マウスキメラ抗体４２２は、配列番号４０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであり、ヒト−マウスキメラ抗体４３０は、配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものである。

　本発明の一態様において好ましい抗体は、ハイブリドーマ「４１９」、「４０２」または「４３０」により産生されるマウスモノクローナル抗体に重鎖可変領域および軽鎖可変領域が由来するヒト−マウスキメラ抗体である。

　本発明の抗体は、組換え手段により調製され、発現される遺伝子組換え抗体または抗原結合断片であってもよい。例えば、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってもよい。本発明の組換え抗体は、ＷＯ２０１０／０９８４７１に記載された方法を用いて得られた抗体の重鎖および軽鎖の組換え発現によって製造することができる。例えば、ヒト−マウスキメラ抗体であれば、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、その重鎖（Ｈ鎖）定常領域をヒトＩｇＧのＨ鎖定常領域遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。ヒト化抗体は、例えば、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から単離した抗体の抗原結合部位の遺伝子をヒト由来の抗体分子に移植することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにＳＬＣ６Ａ６タンパク質をＷＯ２０１０／０９８４７１に開示される方法を用いて免疫することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体が融合したタンパク質は、抗原に結合する抗体の可変領域とその他のタンパク質を既存の遺伝子組み換えの手法を用いることにより作製することが出来る。あるいは、モノクローナル抗体とタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することが出来る。

　遺伝子組換え抗体を発現させるには、例えば、該抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を有する組換え発現ベクターを、宿主細胞に導入し、当該ベクターが導入された宿主細胞を培養する。当該宿主細胞の培養物から目的の抗体を回収することができる。これらの核酸、組換え発現ベクター、当該ベクターが導入された宿主細胞、当該宿主細胞を用いる抗体または抗原結合断片の製造方法は、本発明に含まれる。抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子を入手し、これらの核酸を発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入するには、当分野で標準的な組換えＤＮＡ方法（Ｓａｍｂｒｏｏｃｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．など）を採用することができる。

　ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片は、当分野で標準的な組換えＤＮＡ方法によって、例えば、Ｆａｂ遺伝子、ｓｃＦｖ遺伝子、完全長抗体遺伝子とするために、さらに操作することができる。

　また、ＶＨをコードする核酸（例えばＤＮＡ）は、ＶＨをコードするＤＮＡと重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードするＤＮＡと発現可能に結合することによって、完全長の重鎖遺伝子へと変換することができる。ヒト、マウス等由来の重鎖定常領域の核酸配列は、当分野で公知である。

　ＶＨをコードする核酸としては、例えば、配列番号２４に示すアミノ酸配列の２１~１３５番のアミノ酸配列、配列番号２８に示すアミノ酸配列の２１~１３６番のアミノ酸配列、配列番号３２に示すアミノ酸配列の２１~１３８番のアミノ酸配列、配列番号３６に示すアミノ酸配列の２１~１４１番のアミノ酸配列、配列番号４０に示すアミノ酸配列の２１~１３９番のアミノ酸配列、および配列番号４４に示すアミノ酸配列の２１~１３６番のアミノ酸配列からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域をコードする単離された核酸が挙げられる。

　また、ＶＬをコードする核酸（例えばＤＮＡ）は、ＶＬをコードするＤＮＡと軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードするＤＮＡと発現可能に結合することによって、完全長の軽鎖遺伝子へと変換することができる。ヒト、マウス等由来の軽鎖定常領域の核酸配列は、当分野で公知である。

　ＶＬをコードする核酸としては、例えば、配列番号２６に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列、配列番号３０に示すアミノ酸配列の２３~１３０番のアミノ酸配列、配列番号３４に示すアミノ酸配列の２５~１３１番のアミノ酸配列、配列番号３８に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列、配列番号４２に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列および配列番号４６に示すアミノ酸配列の２３~１３０番のアミノ酸配列からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域をコードする単離された核酸が挙げられる。

　ここで、ＶＨおよびＶＬコードする核酸が、例えばマウスに由来する核酸であり、重鎖及び軽鎖定常領域をコードする核酸がヒトに由来する核酸を使用すれば、ヒト−マウスキメラの抗体または抗原結合断片を取得することができる。これらの核酸も本発明の範囲に含まれる。

　本発明の抗体または抗原結合断片を発現するには、上記のとおり得た部分または完全長の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現ベクターに挿入する。重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入するか、あるいは、両遺伝子とも同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は標準的な方法によって、発現ベクター内に挿入することができる。また、発現ベクターには、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促すシグナルペプチドをコードさせることもできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよいし、異種のシグナルペプチドであってもよい。また、発現ベクターはその他の調節配列を含有していてもよく、当業者であれば公知の技術に基づき、調節配列を選択し、発現ベクターに導入することができる。

　本発明の組換え抗体を発現するのに好ましい哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、３Ｔ３細胞などが挙げられる。抗体重鎖および軽鎖をコードする組換え発現ベクターを公知の遺伝子導入方法によって、好ましい宿主細胞に導入する。得られた形質転換体を培養し、培養物から目的の抗体または抗原結合断片を回収する。公知の精製技術により、抗体または抗原結合断片を精製してもよい。

　さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの、殺腫瘍活性または腫瘍抑制活性を有するエフェクター細胞に対して特異的な抗原結合領域を含むことが望ましい。
　ここで、「殺腫瘍活性」とは、腫瘍細胞を破壊または死滅させる活性を意味し、「腫瘍抑制活性」とは腫瘍細胞の数を減少させる活性または腫瘍細胞の増殖速度を抑制させる活性を意味する。

　エフェクター細胞に対して特異的な抗原結合領域を含む本発明のモノクローナル抗体ががん細胞に結合すると、エフェクター細胞が当該抗体に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性によりがん細胞を死滅させることが可能となる。
　同様に、このような領域を含む本発明のモノクローナル抗体ががん細胞に結合すると、補体系が活性化し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性によってがん細胞を死滅させることが可能となる。

２．本発明の医薬組成物
　本発明において、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体（抗原結合断片を含む）を含む医薬組成物が提供される。本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、がん細胞に発現するＳＬＣ６Ａ６を認識する。本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体を含む本発明の医薬組成物は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞を殺傷するために使用することが可能である。すなわち、本発明の医薬組成物は、がん治療用医薬組成物、好ましくは大腸がん治療用医薬組成物として有用である。また、本発明の医薬組成物は、がん治療剤としても使用することができる。

　本発明において、がんの治療には、がん細胞を殺傷すること、がんの大きさを減少させること、がんの増殖速度を抑制もしくは停止させること、またはがんの進行を抑制もしくは停止させることなどが含まれる。

　本発明の医薬組成物の治療対象のがんの種類は特に限定されず、ＳＬＣ６Ａ６を発現していればよく、例えば、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器がん、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、乳がん、肝がん（肝臓がん）、膵臓がん、睾丸腫瘍、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がん、皮膚黒色腫などが挙げられる。好ましくは、大腸がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、子宮がん、乳がんであり、さらに好ましくは大腸がん、乳がん、子宮がんである。

　本発明の医薬組成物の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、または患部への直接投与などが挙げられる。

　本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。

　本発明の医薬組成物を非経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
　非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。

　各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した活性成分（本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体またはその抗原結合断片）のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形剤や添加剤を上記活性成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。

　非経口剤の投与量（１日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した活性成分は、適用対象（患者）の体重１ｋｇあたり１ｍｇ~１５ｍｇ／日であることが好ましく、より好ましくは２−１２ｍｇ／日である。

　経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。

　本発明の医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。

　本発明は、がん、例えば大腸がんを治療するための本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体を含むキットを提供する。本発明のキットは、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体を含むものであれば、それを構成する材料は特に限定されない。本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体のほか、水、緩衝液、容器、シリンジ、取扱説明書などを具備すればよい。本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体は、水溶液、凍結乾燥状態などにて提供され、使用前に適切な状態に調製してもよい。本発明のキットを用いることにより、がんを効果的に治療することが可能となる。

　また、本発明は、本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体を対象（例えば、ヒト）に投与することを含む、がんの治療方法も提供する。また、本発明は、がんの治療に使用するための本発明の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体をも提供する。抗ＳＬＣ６Ａ６抗体の投与量、投与方法などは、本発明の医薬組成物の記載を参照することができる。

　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（１）細胞
　ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１１６、Ｃｏｌｏ３２０及びＷｉＤｒはＤＳファーマより入手した。Ｃａｃｏ−２、ＣＯＬＯ２０１、ＨＣＴ１５、ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、２９３Ｔ、およびＭＤＡ−ＭＢ２３１はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ受託番号　ＨＴＢ−２６）より入手した。

　ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＳＷ６２０、ＤＬＤ−１、Ｃｏｌｏ２０１、およびＣｏｌｏ３２０を、１０％（ｖ／ｖ）の血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で、ＷｉＤｒはＥ−ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ＨＣＴ１１６はＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＳＷ４８０、２９３Ｔ及び残りの細胞はＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で、それぞれ８０％コンフルエントを越えないよう３７℃、５％ＣＯ_２下で４８~７２時間培養および継代を行った。

（２）免疫用細胞
　ＷＯ２０１２／０２９９９０（前掲　特許文献２）の実施例２に記載されたのと同じ方法で、ｐＥＦ６ベクターにヒトＳＬＣ６Ａ６遺伝子を組み込んだ発現用ベクターを作製した。このＳＬＣ６Ａ６発現ベクターを、ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュ社製）を用いてＭＤＡ−ＭＢ２３１へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。ブラストサイジンＳ塩酸塩が１０μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し、３~５日毎に培地を交換して薬剤耐性を持つ細胞を選択した。得られた耐性株の中からＳＬＣ６Ａ６を過剰発現している細胞を選び出すため、遺伝子導入を行っていない細胞、及び遺伝子導入した細胞それぞれを８０％コンフルエントとなるよう９６ウエルプレートに植え、３７℃、５％ＣＯ_２下で１６時間培養した。

　培養上清を除去後、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン溶液（ＷＡＫＯ社製）を１００μＬ添加し、１０分間室温で反応させた。ホルマリン溶液を除去後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、風乾させることで各々の細胞を固定化したプレートを作製した。

　抗ｃ−ｍｙｃ抗体（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社製、クローン９Ｅ１０）をＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ　７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈し、一次抗体として固定化プレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。

　二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで５０００倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。

　最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルソフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を５０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ　５．０）に希釈し、この溶液の１００００分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して、シグナルを観察し、遺伝子導入を行っていないＭＤＡ−ＭＢ２３１よりもシグナルの高い株を選択し、最も発現が顕著であったクローンを免疫用の細胞として用いた。

（３）細胞の移植
　１０ｃｍシャーレに９０％コンフルエントになるまで培養した細胞を、トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて回収し、ＰＢＳ（−）（０．０１Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、０．１３８Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ、ｐＨ　７．４）で２回洗浄した。洗浄後の細胞を最終濃度が８．６×１０^７細胞／ｍＬとなるようグロースファクターリデューストマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に懸濁し、移植するまで氷上で保存した。

　生理食塩水に３．５％（ｗ／ｖ）となるよう抱水クロラール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解して、３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を調製した。６~８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＬｃｌ−ｎｕ／ｎｕ系統（日本クレア社製））の腹腔内に３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を０．２ｍＬ投与して麻酔した。マウスの第４乳腺に、マトリゲルに懸濁した細胞を１乳腺あたり１×１０^６個、２４Ｇの注射針を用いて乳腺からはみ出さないよう移植した。１匹のマウスに対して、２箇所の移植となるように、胴体左右両方の第４乳腺にそれぞれ移植を行った。

（４）スクリーニング用ＳＬＣ６Ａ６部分タンパク質の発現と精製
　実施例１（２）に記載のｐＥＦ６ベクターに導入したＳＬＣ６Ａ６全長遺伝子から、細胞外領域であるアミノ酸残基１４３~２１６の領域（配列番号４）をコードするＤＮＡ（配列番号３）をｐＥＴ３２ベクターにサブクローニングした。以下のプライマーを用いてＰＣＲを行なった。
プライマー配列

　ＰＣＲ反応は、９４℃、２分間のプレインキュベーションを行なった後、９８℃、１０秒間のデナチュレーション、５８℃、３０秒間のアニーリング、および６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ）を用いて、ｐＥＴ３２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へ組み込んだ。

　増幅断片の塩基配列をＤＮＡシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ細胞外領域の遺伝子配列が組み込まれ、Ｃ末端にＨｉｓ　ｔａｇ配列が付加されていることを確認した。

　このベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換し、１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）　トリプトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）　ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社製））で培養した。培地の濁度が６００ｎｍの波長で０．６となった後、１ｍＭ　ＩＰＴＧ（ＷＡＫＯ社製）を加え、１６時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、ＳＬＣ６Ａ６細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。

　約１０ｍｇのサンプルをＢｕｆｆｅｒ　Ａ（１Ｍ塩酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、１０ｍＭ　ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製））に溶解し、３７℃で１時間反応させた。反応物を１ＬのＢｕｆｆｅｒ　Ｂ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．４ｍＭ　酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ｐＨ８．５）に緩やかに加え、４℃で１８時間撹拌した。溶解したサンプルをＮｉ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ社製）に供し、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｃ（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２００ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）で溶出した。Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含まないＢｕｆｆｅｒ　Ｃに透析して、精製したＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域部分タンパク質を得た。

（５）抗血清の解析
　上記（４）で得た組換えタンパク質１０μｇ／ｍｌを１００μＬずつ、ＭａｘｉＳｏｒｐ　９６　ｗｅｌｌプレート（ヌンク社製）に入れ、室温で１時間プレートに吸着させた。吸着後、ウエルをＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で洗浄した後、５％となるようＴＢＳ−Ｔで希釈したスキムミルク（ＧＩＢＣＯ社製）を入れ、３０分室温でブロッキングを行った。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、マウスの尾静脈より回収した血漿をＴＢＳ−Ｔで１／２０００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。

　最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルトフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を５０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ　５．０）に希釈し、この溶液の１００００分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して抗体の力価を解析し、細胞融合に用いるマウスの選択に利用した。

（６）細胞融合
　マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８（ＡＴＣＣ受託番号　ＣＲＬ−１５８０）と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、１×１０^８個の脾臓細胞と０．２５×１０^８個の骨髄腫株とを混合し、ＥＰ　Ｂｕｆｆｅｒ（０．３Ｍ　Ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ_２、０．１ｍＭ　ＭｇＣｌ_２）に細胞密度が０．２５×１０^８個／ｍＬとなるよう懸濁し、電気融合装置ＬＦ２０１（ネッパジーン社製）で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。

　融合後の細胞をＨＡＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、各ウエル１００μＬとなるよう３０枚の９６ウエルプレートに散布した。途中、ＨＡＴ培地を２００μＬ添加し、１１~１６日間培養後に顕微鏡下で観察すると、１ウエルあたり５~１２個のコロニーが形成された。

（７）モノクローナル抗体の取得
　移植３~７ヶ月後にマウスから脾臓細胞を取り出し、上記（６）に記載の方法でハイブリドーマ細胞を作製した。ＳＬＣ６Ａ６を認識する抗体を選択するために、上記（５）記載の方法を用いてクローンの選択を行った。一次抗体としては、細胞の培養上清を用い、二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ１ポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識、抗マウスＩｇＧ２ａポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識、抗マウスＩｇＧ２ｂポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（Ｂｅｔｈｙｌ社製）をそれぞれ等量混合し、ＴＢＳＴで１０００００倍希釈した溶液を用い、サブクラスＩｇＧのクローンのみが検出されるようにして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択した。

　取得したモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を、１０ｃｍ　ｄｉｓｈ　１０枚に９０％コンフルエントとなるよう培養し、ＨＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とＥＸ　ＣＥＬＬ　Ｓｐ２／０（ニチレイバイオサイエンス社製）とを１：１で混合した培地で１０日間培養を行った。培養上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムを用いて精製した。培養上清１００ｍＬに対し、０．５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに対し、培養液を１~３ｍｌ／ｍｉｎの流速で通過させた後、６ｍＬの洗浄バッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＫＣｌ）で洗浄した。次に、１ｍＬの溶出バッファー（０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　（ｐＨ２．５）あるいは０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ３．０））で抗体タンパク質を溶出させ、３Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いてｐＨ７．０~７．４の間になるよう中和した。Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをＰＢＳに置換した。得られた７つのハイブリドーマのクローンから得られた抗体クローンおよびＷＯ２０１２／０２９９９０（前掲　特許文献２）に記載の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体である「４Ｂ９ｂ」及び「５Ｈ１２ｄ」のサブクラスおよび上記（５）記載の方法で測定したＥＬＩＳＡの結果を表１にまとめる。

（８）免疫細胞染色
　上記（７）で得られた７種類の抗体クローン「２０４」「２０５」、「３０３」、「４１９」、「４０２」、「４２２」及び「４３０」と、大腸がん細胞（ＨＴ−２９及びＬｏＶｏ）との反応性を解析した。また、比較対象として、ＷＯ２０１２／０２９９９０（前掲　特許文献２）に記載の抗ＳＬＣ６Ａ６抗体である「４Ｂ９ｂ」及び「５Ｈ１２ｄ」を同様に解析した。以下では、ハイブリドーマ細胞が作る抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。

　抗体「４Ｂ９ｂ」を産生するハイブリドーマ「４Ｂ９ｂ」は、株式会社バイオマトリックス研究所（〒２７０−０１０１　千葉県流山市東深井１０５番地）により、受託番号「ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１３」として、２０１０年７月２１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６　茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託されている。また、「５Ｈ１２ｄ」を産生するハイブリドーマ「５Ｈ１２ｄ」は、株式会社バイオマトリックス研究所（〒２７０−０１０１　千葉県流山市東深井１０５番地）により、受託番号「ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４１４」として、２０１０年７月２１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６　茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託されている（上記日付はいずれも原寄託日を示す）。

　ＨＴ−２９及びＬｏＶｏを８０％コンフルエントとなるよう培養し、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　Ｔｙｐｅ　Ｉ−Ａ（新田ゼラチン社製）でコートしたカバーガラス上へ播種した。２日間培養後、１０％中性緩衝ホルマリン（ＷＡＫＯ社製）を用いて細胞を固定した。カバーガラスを０．３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水で２０分間処理した後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、５％（ｗ／ｖ）Ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋを含むＴＢＳＴで処理した後、上記（７）で精製した抗体を１０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、４℃、１６時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識あるいは抗マウスＩｇＭポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識で室温３０分間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｈｉｅｌｄ社製）でカバーガラスを封入した。

　図１は、各抗体について同一条件で蛍光強度を解析した結果を示す。全てのクローン（２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２および４３０）でシグナルが観察され、特にクローン２０４、２０５、３０３、４１９、および４０２で明確にシグナルが観察された。４Ｂ９ｂや５Ｈ１２ｄのようなサブクラスＩｇＭの抗体と比較した場合、クローン２０５、３０３、４１９抗体のシグナルは明らかに高く、親和性が高いという結果が示された。本実施例により、従来のＳＬＣ６Ａ６抗体よりも力価の高いクローンが取得できたことが示された。

ＦＡＣＳ解析
　ヒト胎児腎臓細胞である２９３Ｔを９０％コンフルエントとなるよう培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、スクレーパーで剥がし、１．５ｍＬチューブに回収した。２０４、２０５及び４１９抗体をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようチューブに添加し、６０分間反応させた。比較対象として、４Ｂ９ｂを同様の濃度で添加し、反応させた。細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識されたＧｏａｔ−Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで１／１０００希釈して添加し、３０分間反応させた。ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄後、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ社製）で解析を行った。結果を図２に示す。

　図２に示すように、２０４、２０５及び４１９抗体は、４Ｂ９ｂよりも強く２９３Ｔ細胞に反応した。２９３Ｔ細胞はＳＬＣ６Ａ６を発現することから、本発明のＳＬＣ６Ａ６抗体は、ネイティブな構造のＳＬＣ６Ａ６を認識することが示された。また、本発明のＳＬＣ６Ａ６抗体は、従来のＳＬＣ６Ａ６抗体よりも高い親和性でネイティブなＳＬＣ６Ａ６に結合し得ることが示された。

ＦＡＣＳ解析
　実施例１（７）で得られたモノクローナル抗体に関して、ヒト大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６に対して、抗体クローン２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２及び４３０抗体との反応性を実施例２と同様の方法で解析した。結果を図３に示す。

　図３から、ヒト大腸がん細胞ＨＣＴ１１６に対し、抗体クローン２０４、２０５、３０３、４１９、４０２、４２２及び４３０抗体が明確に反応することが示された。

　ヒト大腸がん細胞であるＳＷ４８０及びＨＴ−２９に対して、抗体クローン２０５、４１９、４０２及び４３０抗体との反応性を実施例２と同様の方法で解析した。結果を図４に示す。

　図４から、２種類の細胞株に対しても、抗体クローン２０５、４１９、４０２及び４３０抗体が明確に反応することが示された。

　モノクローナル抗体を治療薬として利用する場合には、タンパク質のネイティブな構造をより強く認識する抗体が好ましい。これは、がん組織において細胞は生きた状態で存在し、よってがん細胞が発現するＳＬＣ６Ａ６もネイティブな構造を保持しているためである。すなわち、実施例１（５）あるいは（８）で示した方法よりも、実施例３のＦＡＣＳ解析の方が、治療薬に適した抗体クローンを選択するのに適切な方法である。

免疫組織染色
　５１症例の大腸がん組織と８症例の正常大腸粘膜をマウス抗体（クローン２０５）を用いて免疫組織染色を行った。パラフィン固定後、薄切したヒト大腸がん組織（ＵＳ　Ｂｉｏｍａｘ社製）をキシレンで脱パラフィン処理し、エタノールで親水化した。得られた組織を０．３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水で２０分間処理した後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋで３７℃、１５分間処理し、抗原賦活化を行った。ヒストファインＳＡＢ−ＰＯユニバーサルキット（ニチレイ社製）を用い、添付のプロトコールに従って染色を行った。一次抗体の反応では、１０μｇ／ｍＬの２０５抗体を添加し、３７℃、１時間反応させた。発色の際には、ＩｍｍＰＡＣＴ　ＤＡＢ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）で５分間発色させた。蒸留水で水洗後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（ＷＡＫＯ）を用いて核を染色し、流水洗浄後、エタノール、キシレンの順に処理して、封入した。

　図５は、大腸がん組織（Ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ）と正常組織（Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ）とを染色した結果（代表例）を掲載した。染色像として、強陽性に染まっている場合を＋＋＋、陽性に染まっている場合を＋＋、正常と区別される弱陽性を＋とし、染色されていない場合または正常組織を−と記載した。なお、判断がつかない場合を＋／−と記載した。大腸がん組織においては、弱陽性と陽性と強陽性とを合わせると、本発明のＳＬＣ６Ａ６抗体により約８４％（４３症例）が染色された。表２は、実施例４で用いたサンプルの由来および結果についてまとめた表である。

[規則26に基づく補充 28.05.2015]　

免疫組織染色
　上記、実施例４に記載した方法と同様に、マウス抗体（２０５クローン）を用いて乳がん及び子宮がんのがん組織（Ｃａｎｃｅｒ）、及び正常組織（Ｎｏｒｍａｌ）を免疫組織染色した。その結果を図６に示す。乳がん及び子宮がんにおいても、本発明のＳＬＣ６Ａ６抗体によって、がん部が明確に染色されることが示された。乳がんでは３症例中３症例で陽性（１００％）であり、子宮がんでは３症例中２症例が強陽性（６６％）であることが示された。

競合阻害試験
　上記で得られたモノクローナル抗体の中で、抗体クローン４０２がＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインに結合しているか解析を行った。１０μｇ／ｍＬの抗体クローン４０２と実施例１（４）で作製したＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域部分タンパク質１５μｇ／ｍＬとを混合し、３７℃で１時間反応させた。組み換えタンパク質を加えていないサンプルをコントロールとして同様に準備した。ガラス上で培養したＨＣＴ１１６細胞と４℃で１時間反応した後、実施例１（８）記載の方法で二次抗体と反応させ、検出を行った。結果を図７に示す。図７において「Ｖｉｓｉｂｌｅ」は、可視光による画像である。

　図７は、ＨＣＴ１１６に抗体クローン４０２が結合して生じる蛍光が、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域部分タンパク質を添加した場合に消失することを示している。このことから、抗体クローン４０２は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域と反応することが示された。すなわち、抗体クローン４０２はＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域と特異的に反応することが示された。

キメラ抗体の作製
（１）遺伝子のクローニング
　実施例１で得られたハイブリドーマ細胞を培養し、Ｑｉａｇｅｎ社製のＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　２μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を５０℃で１時間行ってｃＤＮＡを合成し、８５℃、５分間の加熱により、反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ　ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、目的の遺伝子を増幅した。

　抗体のＨ鎖可変領域断片を増幅するために、配列番号７と配列番号８、配列番号９のプライマーを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５６℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、４５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。

　抗体のＬ鎖リーダー配列及び可変領域断片を増幅するために、配列番号７と配列番号８、配列番号１０のプライマーを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５６℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、４５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。

　精製したＰＣＲ増幅断片を１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ（インビトロジェン社製）及び２×ＧｏＴａｑ　Ｍａｘｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と混合し、７０℃、１５分間反応後、４℃、２分間氷冷することで、３’末端へｄＡを付加した。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、いわゆるＴＡクローニング法によりＨ鎖断片及びＬ鎖断片をクローニングした。

（ｉ）Ｈ鎖発現ベクターの構築
　まず、ヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域を増幅するために、配列番号１１で示されるオリゴＤＮＡを化学合成し、配列番号１２と配列番号１３のプライマーでＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、６０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）を行ってヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域断片を得た。

　次に、ｐＥＦ６−ｍｙｃ／ＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＭｌｕＩ認識配列を破壊し、配列番号１４と配列番号１５のオリゴヌクレオチドをアニーリング後、制限酵素（ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ）を用いて導入した（このベクターをｐＥＦ６−Ｌｅａｄｅｒと呼ぶ。）。

　次に、増幅したヒトＩｇＧのＨ鎖定常領域を制限酵素（ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ）を用いて、ｐＥＦ６−Ｌｅａｄｅｒに導入した（このベクターをｐＥＦ６−ｈＨｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇと呼ぶ。）。

　次に、ｐＥＦ６−ｈＨｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇに２０５抗体のＨ鎖可変領域断片を導入するために、ＴＡクローニング法によりクローニングしたＨ鎖可変領域断片を鋳型にして、配列番号１６と配列番号１７のプライマーを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５６℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、４５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）によりＨ鎖可変領域断片を得た。

　続いて、増幅したＨ鎖可変領域断片を制限酵素（ＭｌｕＩ／ＮｈｅＩ）を用いて、ｐＥＦ６−ｈＨｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇに導入した（以下、２０５キメラＨ鎖発現ベクターと呼ぶ。）。

（ｉｉ）Ｌ鎖発現ベクターの構築
　まず、ヒトｋａｐｐａ鎖定常領域を増幅するために、Ｈ鎖の場合と同様にして、配列番号１８で示されるオリゴＤＮＡを化学合成し、配列番号１９と配列番号２０のプライマーでＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）を行ってヒトｋａｐｐａ鎖定常領域断片を得た。

　次に、ｐＥＦ１−ｍｙｃ／ＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、制限酵素（ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ）を用いて、増幅したヒトｋａｐｐａ鎖定常領域を導入した（このベクターをｐＥＦ１−ｈＬｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇと呼ぶ。）。

　次に、ｐＥＦ１−ｈＬｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇに２０５抗体のＬ鎖シグナル配列と可変部を導入するために、ＴＡクローニング法によりクローニングしたＬ鎖シグナル配列と可変領域断片を鋳型にして、配列番号２１と配列番号２２のプライマーでＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）を行って２０５抗体のＬ鎖シグナル配列と可変部断片を得た。

　次に、ｐＥＦ１−ｈＬｃｈａｉｎ−ｃｌｏｎｉｎｇに、制限酵素（ＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ）を用いて、増幅したＬ鎖シグナル配列と可変領域断片を導入した（これを２０５キメラＬ鎖発現ベクターと呼ぶ。）。

　ヒト‐マウスキメラ化した２０５抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号２３、アミノ酸配列は配列番号２４で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号２５、アミノ酸配列は配列番号２６で示される。

　また、その他の抗体についても同様に、ヒト−マウスキメラ抗体を作製した。ヒト‐マウスキメラ化した４０２抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号２７、アミノ酸配列は配列番号２８で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号２９、アミノ酸配列は配列番号３０で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した４１９抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号３１、アミノ酸配列は配列番号３２で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号３３、アミノ酸配列は配列番号３４で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した３０３抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号３５、アミノ酸配列は配列番号３６で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号３７、アミノ酸配列は配列番号３８で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した４２２抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号３９、アミノ酸配列は配列番号４０で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号４１、アミノ酸配列は配列番号４２で示される。また、ヒト‐マウスキメラ化した４３０抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号４３、アミノ酸配列は配列番号４４で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号４５、アミノ酸配列は配列番号４６で示される。

配列番号２３：

配列番号２４：

配列番号２５：

配列番号２６：

配列番号２７：

配列番号２８：

配列番号２９：

配列番号３０：

配列番号３１：

配列番号３２：

配列番号３３：

配列番号３４：

配列番号３５：

配列番号３６：

配列番号３７：

配列番号３８：

配列番号３９：

配列番号４０：

配列番号４１：

配列番号４２：

配列番号４３：

配列番号４４：

配列番号４５：

配列番号４６：

　上記で得られた各ヒト−マウスキメラ抗体の可変領域およびＣＤＲ１~３のアミノ酸配列の情報は以下の表３および４に示される。可変領域およびＣＤＲ１~３に記載された数字は、配列番号で示されるアミノ酸配列において該当するアミノ酸の番号を示す。

　マウスＩｇＧ化した抗体「４Ｂ９ｂ」を発現するための、Ｈ鎖発現ベクターおよびＬ鎖発現ベクターは、国際公開第２０１３／１３３４５０号（ＷＯ２０１３／１３３４５０）に記載の方法により取得したものを使用した。

（２）ヒトＩｇＧ化抗体の発現
　抗体タンパク質の発現には、Ｅｘｐｉｉ２９３Ｆ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行った。１２５ｍＬのベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）を用い、２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう調製した細胞溶液３０ｍＬを３７℃、８％ＣＯ_２下で２４時間旋回培養（１２５ｒｐｍ）した。
　次に、８１μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ　２９３　ｒｅａｇｅｎｔを１．４１９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（ＧＩＢＣＯ社製）と混合し、５分間静置した後、抗体のＨ鎖、Ｌ鎖遺伝子それぞれをコードする遺伝子がクローニングされたプラスミドを各１５μｇとなるよう添加し、２０分間室温で静置した。

　上記で準備した２９３Ｆ細胞を２．９×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう、２５．５ｍＬの培地に再懸濁し、プラスミド溶液３ｍＬを添加して培養を開始した。培養開始後２０時間後に１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｉｎｅ　２９３　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　１と１．５ｍＬのｅｎｈａｎｃｅｒ　２を添加し、３日間培養し、培養上清を回収した。

（３）ヒトＩｇＧ化抗体の精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体を用いた抗体の精製は実施例１（７）記載の方法と同様に行うか、ハイドロキシアパタイト担体を用いた精製を行った。
　ハイドロキシアパタイトを用いた精製法では、実施例７（２）記載の方法と同様の方法で培養した培養上清１２ｍｌに対し２５０ｍｇのｃｈｅｒａｍｉｃｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　Ｔｙｐｅ　ＩＩ、２０μｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いた。ハイドロキシアパタイト担体を１０ｍＭリン酸緩衝液（１０ｍＭ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１０ｍＭ　ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ６．７））で平衡化し、抗体タンパク質を含む培養上清の１２ｍＬに対し、３６ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液を添加した。この希釈した培養上清に、平衡化したハイドロキシアパタイト担体を添加し、１８時間４℃で撹拌した。担体をエコノパックカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に充填し、１０倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄した後、１０ｍＭリン酸緩衝液に５０、３００、５００、７００、８００、１０００、１３００ｍＭとなるよう塩化ナトリウムを添加した溶液で分離を実施した。５００~７００ｍＭの塩化ナトリウム濃度の間で溶出してきたタンパク質の９５％以上が抗体タンパク質であった。

（４）免疫細胞染色による活性測定
　実施例２と同様の方法で、ＨＣＴ１１６と、抗体クローン４０２、抗体クローン４０２ヒト−マウスキメラ抗体、及び４Ｂ９ｂマウスＩｇＧ化抗体とを反応させ、ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｕｒを用いて解析した。この際、抗体濃度を１０μｇ／ｍＬとした。二次抗体としては、４０２抗体と４Ｂ９ｂマウスＩｇＧ化抗体の場合は抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識を、キメラ抗体の場合は抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識をそれぞれ用いた。その活性測定の結果を図８Ａと図８Ｂに示した。

　図８Ａは、抗体クローン４０２をヒト−マウスキメラ化した場合にも、細胞に対する反応性が失われていないことを示す。すなわち、抗体クローン４０２のヒト−マウスキメラ抗体は、ＳＬＣ６Ａ６に対する結合能が保存されていることが確認された。

　また、上記手法と同様の手法で、ＷＯ２０１２／０２９９９０（前掲　特許文献２）に記載された抗体クローン４Ｂ９ｂと、抗体クローン４０２との比較を行った。その解析結果を図８Ｂに示した。

　ＨＣＴ１１６（ヒト大腸がん細胞）及びＭＣＦ７（ヒト乳がん細胞）を９６ウエルプレートに１ウエルあたり５５×１０^３細胞となるよう添加し、２４時間培養を行った。各ウエルに、０、１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍＬとなるよう抗体を添加し、７２時間培養を行った。生存している細胞の割合をＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を用い測定を行った。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。抗体を添加しないウエルの吸光度を１００％として、抗体を添加した場合の生存率を算出した。その結果を図９に示す。

　抗体クローン４０２のヒト−マウスキメラ抗体を添加することで、ヒト大腸がん細胞及び乳がん細胞の増殖を抑制することが示された。

抗体の細胞傷害活性
（１）抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
　ＰｒｏｔｅｉｎＧで精製しｐＨ３．０の溶出液で溶出した抗体クローン４０２のヒト−マウスキメラ抗体（ｃ４０２　ｍＡｂ）と、４Ｂ９ｂマウスＩｇＧ化抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）をＦｃγ受容体の活性化を指標に評価した。９６ｗｅｌｌプレートに標的細胞（ヒト大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６及びＨＴ−２９、ヒト乳がん細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＳＫ−ＢＲ３）をそれぞれ６．２５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、種々のヒト−キメラ抗体をそれぞれ終濃度０、０．７、２、７、２０μｇ／ｍｌとなるよう各ｗｅｌｌに添加した。次いで、Ｆｃγ受容体とルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するエフェクター細胞を７．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように添加した。６時間培養後、７５μＬのＯＮＥ−Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、マルチプレートリーダーＷａｌｌａｃ　１４２０　ＡＲＶＯｓｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて各ｗｅｌｌのルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図１０Ａ（ａ）ＨＣＴ１１６、（ｂ）ＨＴ−２９、（ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１、（ｄ）ＳＫ−ＢＲ３に示した。実験結果は３回実験を行った平均値と標準偏差を示している。

　抗体クローン４０２ヒト−マウスキメラ抗体の濃度に依存して、エフェクター細胞の活性化が確認され、これらの抗体によりＦｃγ受容体を介したＡＤＣＣ活性が観察された。
　以上の結果から、本実験により抗体クローン４０２ヒト−マウスキメラ抗体がＡＤＣＣ活性を有しており、その活性は、ＷＯ２０１２／０２９９９０（前掲　特許文献２）に記載された抗体由来のマウスＩｇＧ化４Ｂ９ｂよりも高いことが示された。

（２）補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）
　ＨＣＴ１１６細胞に対する４０２ヒト−マウスキメラ抗体（ｃ４０２　ｍＡｂ）の補体依存性細胞傷害活性を解析した。ＨＣＴ１１６細胞を、ＰｒｏｔｅｉｎＧで精製しｐＨ３．０の溶出液で溶出した４０２ヒト−マウスキメラ抗体もしくは４Ｂ９ｂマウスＩｇＧ化抗体を０、５、１０、２０μｇ／ｍＬとなるように試験抗体を添加した２５％ヒト血清（Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ）もしくは非働化により補体活性を失活させた２５％ヒト血清（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ）を含む培地で懸濁し、９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種した。３７℃で２時間培養した後に、ＣＣＫ−８（同仁化学研究所）により４５０ｎｍの吸光度を測定することにより生細胞数を測定した。その結果を図１０Ｂに示す。実験結果は１２回実験を行った平均値と標準偏差を示している。

　抗体クローン４０２ヒト−マウスキメラ抗体の場合では、抗体濃度依存的にＣＤＣ活性が確認された。抗体クローン４０２ヒト−マウスキメラ抗体と４Ｂ９ｂマウスＩｇＧ化抗体を比較した場合、ＣＤＣ活性は４０２ヒト−マウスキメラ抗体の方が、明確に強い活性を示した。

抗体の細胞傷害活性
（１）抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
　ＰｒｏｔｅｉｎＧで精製し、ｐＨ３．０の溶出液で溶出した、抗体クローン２０５、４０２および４１９のヒト−マウスキメラ抗体（ｃ２０５　ｍＡｂ、ｃ４０２　ｍＡｂおよびｃ４１９　ｍＡｂ）の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を、Ｆｃγ受容体の活性化を指標に評価した。９６−Ｗｅｌｌ　Ｗｈｉｔｅ　ｐｌａｔｅに標的細胞（ヒト大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６もしくはＨＴ−２９）をそれぞれ６．２５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように調製した細胞懸濁液を２５μｌ播種し、種々のヒト−キメラ抗体をそれぞれ終濃度０，５，２０μｇ／ｍｌとなるよう各ｗｅｌｌに２５μｌ添加した。次いでＦｃγ受容体とルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するエフェクター細胞を７．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように調製した細胞懸濁液を２５μｌ添加した。６時間培養後、７５μｌのＯＮＥ−Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、マルチプレートリーダーＷａｌｌａｃ　１４２０　ＡＲＶＯｓｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて各ｗｅｌｌのルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図１１Ａに示す。

　抗体クローン２０５および４０２のヒト−マウスキメラ抗体で、濃度依存的に、エフェクター細胞の活性化が確認された。また、抗体クローン２０５と４０２のヒト−マウスキメラ抗体のＡＤＣＣ活性を比較すると、ＨＣＴ１１６細胞では同程度だが、ＨＴ−２９細胞では４０２ヒト−マウスキメラ抗体の方が高い活性が示された。よって、抗体クローン４０２ヒト−マウスキメラ抗体が最も強いＡＤＣＣ活性を有していることが示された。

（２）補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）
　ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ−２９細胞に対するヒト−マウスキメラ抗体の補体依存性細胞傷害活性を解析した。標的細胞（ＨＣＴ１１６、ＨＴ−２９）を、０，１０，５０μｇ／ｍｌになるようにＰｒｏｔｅｉｎＧで精製しｐＨ３．０の溶出液で溶出した抗体クローン２０５、４０２および４１９のヒト−マウスキメラ抗体（ｃ２０５　ｍＡｂ、ｃ４０２　ｍＡｂおよびｃ４１９　ｍＡｂ）を加えた２５％Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍを含む培地で懸濁し、９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種した。３７℃で２時間培養した後に、ＣＣＫ−８（同仁化学研究所）により４５０ｎｍの吸光度を測定することにより生細胞数を測定した。その結果を図１１Ｂに示す。

　２０５、４０２および４１９全てのヒト−マウスキメラ抗体でＣＤＣ活性が認められたが、４０２ヒト−ウスキメラ抗体がＨＣＴ１１６とＨＴ−２９ともに抗体濃度依存的に最も強いＣＤＣ活性が示された。

　ヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６細胞；５×１０^６細胞）をヌードマウス（１群３~４匹、雌）の背部皮下に移植した。抗体クローン４０２ヒト−マウスキメラ抗体を４ｍｇ／ｋｇとなるよう移植当日から腹腔内に投与し、その後実験が終了するまで２~３日間隔で、腹腔内への投与を繰り返した。対照群としては生理食塩水を同様に腹腔内に投与した。腫瘍体積は、（（腫瘍の長径）×（腫瘍の短径）の二乗）÷２で求めた。その結果を図１２に示す。

　図１２は、大腸がん細胞において、抗体クローン４０２ヒト−マウスキメラ抗体を添加することで、腫瘍体積の増加が７日後から明確な減少がみられ、１８日目までの間で明確な腫瘍の縮小効果が観察されたことを示す。すなわち、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体が、すぐれた抗腫瘍効果を有していることが示された。

（１）ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の一過性発現
　実施例１（２）に記載のｐＥＦ６ベクターにＳＬＣ６Ａ６遺伝子を組み込んだ発現用ベクターを、ＦＵＧＥＮＥ６（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＨＣＴ１５及び、ＨＴ−２９、およびＳＷ４８０へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。

（２）ＳＬＣ６Ａ６の過剰発現によるＳｉｄｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞の変化
　幹細胞は、様々な表面マーカーを用いて分離されているが、由来する組織により表面マーカーが異なることや、存在する割合が少ないことから、幹細胞の解析は非常に困難である。そこで、その分離・同定方法として、Ｓｉｄｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞が注目されている。幹細胞は薬剤排出能が高く、様々な物質を細胞外に放出する特性を持っており、この幹細胞の特性を利用してＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の排出を指標に解析する技術が広く用いられている。この技術において、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の染色パターン中、発色が弱い細胞分画が、ＳＰ細胞と呼ばれる。がん細胞に関してもこのようなＳＰ細胞が存在することが明らかになり、ＳＰ細胞は、非ＳＰ細胞に比べ明確に腫瘍形成能が高いことが報告され、がん幹細胞が濃縮される分画として知られるようになった（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２００５，６５，ｐ．６２０７−６２１９）。

　上記、実施例１２（１）記載の方法で遺伝子を導入後、２日目にＤＩＳＳＯＣＩＡＴＩＯＮ　ＢＵＦＦＥＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて細胞を剥離した。ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）に１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２となるよう調製した溶液で、３７℃、１時間細胞を染色し、ＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩを用いてＶｉｏｌｅｔレーザー（励起波長４０７ｎｍ）を用いて解析した。また、ＳＰ分画を同定するために、薬剤排出トランスポーターの阻害剤であるＶｅｒａｐａｍｉｌを３０μｇ／ｍＬ添加した実験を行った。結果を図１３に示す。

　図１３は、コントロールベクター（「Ｍｏｃｋ」）に比べ、ＳＬＣ６Ａ６を一過性発現させた場合（「ＳＬＣ６Ａ６」）にＳＰ細胞の割合が上昇している結果を示す。すなわち、ＳＬＣ６Ａ６は、幹細胞集団が濃縮されるＳＰ分画の増加に直接関与していることが示された。

（１）ＳＰ分画におけるＳＬＣ６Ａ６の発現
　ヒト大腸がん細胞であるＳＷ４８０細胞のＳＰ分画及び非ＳＰ分画（Ｍａｊｏｒ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＭＰ）分画）に関して、ＳＬＣ６Ａ６の発現を解析した。実施例１２（２）記載の方法と同様にＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で細胞を染色し、その後、１μｇ／ｍＬの４３０抗体と細胞を４℃、１時間染色し、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識で染色した後、ＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩを用いて解析を行った。その結果を図１４に示す。

　図１４は、ＳＬＣ６Ａ６でＳＰ及びＭＰ細胞を染色した場合、ＭＰ細胞よりもＳＰ細胞の方が抗体により強く染色されることを示している。つまり、ＳＰ細胞はＭＰ細胞に比べ、ＳＬＣ６Ａ６がより多く発現していることが示された。なお、抗体を添加しない場合は、ＳＰ細胞及びＭＰ細胞ともにシグナルのシフトがみられなかったことから、４３０抗体はＳＬＣ６Ａ６に特異的に反応していることが示された。さらに、ｖｅｒａｐａｍｉｌを添加した場合にはＳＰ細胞は見られなかったため、ＳＰ細胞として分離した分画がＳＰ細胞であることが確認された。

タウリンの添加によるＳＰ細胞の割合
　上記実施例１３で示されるように、ＳＬＣ６Ａ６の発現は、がん幹細胞が濃縮される集団であるＳＰ細胞の形成に直接関与している可能性がある。一方で、ＳＬＣ６Ａ６はタウリンを輸送するトランスポーターであることが報告されている（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ　１９９３，３１８，ｐ．１３９−１４４）。そこで、ＳＬＣ６Ａ６を過剰発現させた細胞に対し、タウリンを作用させた場合、細胞集団におけるＳＰ細胞の割合が変化するかを解析した。

　解析にはヒト大腸がん細胞であるＣｏｌｏ３２０細胞にＳＬＣ６Ａ６を過剰発現させた細胞を用い、培地にタウリンを０．０５、０．１、０．５、１、及び５ｍＭの濃度でそれぞれ添加して２日間培養を行った後、実施例１３（１）記載の方法でＳＰ細胞を解析した。結果を図１５に示す。

　図１５は、Ｃｏｌｏ３２０にベクターのみを導入した細胞であるＣｏｌｏ３２０−Ｍｏｃｋ、及びＳＬＣ６Ａ６を安定的に発現するＣｏｌｏ３２０−ＳＬＣ６Ａ６−ＯＥｘの両方で、タウリンの添加濃度依存的にＳＰ細胞の数が増えることを示している。タウリンの作用は、特にＣｏｌｏ３２０−ＳＬＣ６Ａ６−ＯＥｘで顕著であり、その割合は５ｍＭのタウリンを加えた場合に、加えない場合（０ｍＭ）と比較して約２．５倍（１７．０％から２６．７％）増加していた。すなわち、ＳＬＣ６Ａ６の発現が亢進するとタウリンの取り込みが増加する、あるいは、タウリンの濃度が増加するに従ってＳＰ細胞が増えることを示した。ＳＰ細胞は、がん幹細胞が濃縮される分画であることから、ＳＬＣ６Ａ６ががん細胞の幹細胞化に関与している可能性が示された。

　配列番号１：ヒトＳＬＣ６Ａ６をコードする塩基配列。
　配列番号２：ヒトＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸配列。
　配列番号３：ヒトＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基１４３~２１６のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
　配列番号４：ヒトＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基１４３~２１６のアミノ配列。
　配列番号５：プライマー配列、Ｆｏｒｗａｒｄ
　配列番号６：プライマー配列、Ｒｅｖｅｒｓｅ
　配列番号７：プライマー配列、Ｌｏｎｇ
　配列番号８：プライマー配列、Ｓｈｏｒｔ
　配列番号９：プライマー配列、ｍＩｇＧ２ａ＿ＣＨ１＿ｒｅｖｅｒｓｅ
　配列番号１０：プライマー配列、ｍＩｇｋａｐｐａ＿Ｒ３
　配列番号１１：オリゴＤＮＡ配列、ｈＨｃｈａｉｎ
　配列番号１２：プライマー配列、ｈＣｇ１＿Ｆ（ＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ）
　配列番号１３：プライマー配列、ｈＣｇＩ＿Ｒ（ＮｏｔＩ）
　配列番号１４：プライマー配列、Ｈｃｈａｉｎ＿ｓｉｇｎａｌ＿ｔｏｐ（ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ）
　配列番号１５：プライマー配列、Ｈｃｈａｉｎ＿ｓｉｇｎａｌ＿ｂｏｔｔｏｍ（ＫｐｎＩ−ＢａｍＨ）
　配列番号１６：プライマー配列、Ｆｏｒｗａｒｄ
　配列番号１７：プライマー配列、Ｒｅｖｅｒｓｅ
　配列番号１８：オリゴＤＮＡ配列、ｈＬｃｈａｉｎ
　配列番号１９：プライマー配列、ｈＣｋ＿Ｆ（ＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ）
　配列番号２０：プライマー配列、ｈＣｋ＿Ｒ（ＮｏｔＩ）
　配列番号２１：プライマー配列、Ｆｏｒｗａｒｄ２
　配列番号２２：プライマー配列、Ｒｅｖｅｒｓｅ２
　配列番号２３：ヒト−マウスキメラ２０５抗体の重鎖の塩基配列
　配列番号２４：ヒト−マウスキメラ２０５抗体の重鎖のアミノ酸配列
　配列番号２５：ヒト−マウスキメラ２０５抗体の軽鎖の塩基配列
　配列番号２６：ヒト−マウスキメラ２０５抗体の軽鎖のアミノ酸配列
　配列番号２７：ヒト−マウスキメラ４０２抗体の重鎖の塩基配列
　配列番号２８：ヒト−マウスキメラ４０２抗体の重鎖のアミノ酸配列
　配列番号２９：ヒト−マウスキメラ４０２抗体の軽鎖の塩基配列
　配列番号３０：ヒト−マウスキメラ４０２抗体の軽鎖のアミノ酸配列
　配列番号３１：ヒト−マウスキメラ４１９抗体の重鎖の塩基配列
　配列番号３２：ヒト−マウスキメラ４１９抗体の重鎖のアミノ酸配列
　配列番号３３：ヒト−マウスキメラ４１９抗体の軽鎖の塩基配列
　配列番号３４：ヒト−マウスキメラ４１９抗体の軽鎖のアミノ酸配列
　配列番号３５：ヒト−マウスキメラ３０３抗体の重鎖の塩基配列
　配列番号３６：ヒト−マウスキメラ３０３抗体の重鎖のアミノ酸配列
　配列番号３７：ヒト−マウスキメラ３０３抗体の軽鎖の塩基配列
　配列番号３８：ヒト−マウスキメラ３０３抗体の軽鎖のアミノ酸配列
　配列番号３９：ヒト−マウスキメラ４２２抗体の重鎖の塩基配列
　配列番号４０：ヒト−マウスキメラ４２２抗体の重鎖のアミノ酸配列
　配列番号４１：ヒト−マウスキメラ４２２抗体の軽鎖の塩基配列
　配列番号４２：ヒト−マウスキメラ４２２抗体の軽鎖のアミノ酸配列
　配列番号４３：ヒト−マウスキメラ４３０抗体の重鎖の塩基配列
　配列番号４４：ヒト−マウスキメラ４３０抗体の重鎖のアミノ酸配列
　配列番号４５：ヒト−マウスキメラ４３０抗体の軽鎖の塩基配列
　配列番号４６：ヒト−マウスキメラ４３０抗体の軽鎖のアミノ酸配列

　本発明により、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。また、本発明によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制する核酸が提供される。本発明の抗体は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞と特異的に結合することでがん治療に利用することができる。発現を抑制する核酸は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞の増殖及び転移の進行を抑制することが出来る。

　配列番号５~４２：合成ＤＮＡ／ＰＲＴ

Claims

（ａ）配列番号２４に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２５番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２８に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、
（ｃ）配列番号３２に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２８番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、
（ｄ）配列番号３６に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１３１番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、
（ｅ）配列番号４０に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２９番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、または
（ｆ）配列番号４４に示すアミノ酸配列の５０~５４番目、６９~８６番目および１１８~１２６番目のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む重鎖可変領域
を含有する、抗体または抗原結合断片。
（ｇ）配列番号２６に示すアミノ酸配列の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、
（ｈ）配列番号３０に示すアミノ酸配列の４６~５７番目、７３~７９番目および１１２~１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、
（ｉ）配列番号３４に示すアミノ酸配列の４８~５８番目、７４~８０番目および１１３~１２０番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、
（ｊ）配列番号３８に示すアミノ酸配列の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、
（ｋ）配列番号４２に示すアミノ酸配列の４４~５４番目、７０~７６番目および１０９~１１６番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、または
（ｌ）配列番号４６に示すアミノ酸配列の４６~５７番目、７３~７９番目および１１２~１１９番目のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域
を含有する、抗体または抗原結合断片。
　請求項１に記載の重鎖可変領域および請求項２に記載の軽鎖可変領域を含む、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合断片。
　配列番号２４に示すアミノ酸配列の２１~１３５番のアミノ酸配列、配列番号２８に示すアミノ酸配列の２１~１３６番のアミノ酸配列、配列番号３２に示すアミノ酸配列の２１~１３８番のアミノ酸配列、配列番号３６に示すアミノ酸配列の２１~１４１番のアミノ酸配列、配列番号４０に示すアミノ酸配列の２１~１３９番のアミノ酸配列および配列番号４４に示すアミノ酸配列の２１~１３６番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含有する、抗体または抗原結合断片。
　配列番号２６に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列、配列番号３０に示すアミノ酸配列の２３~１３０番のアミノ酸配列、配列番号３４に示すアミノ酸配列の２５~１３１番のアミノ酸配列、配列番号３８に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列、配列番号４２に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列および配列番号４６に示すアミノ酸配列の２３~１３０番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、抗体または抗原結合断片。
　請求項４に記載の重鎖可変領域および請求項５に記載の軽鎖可変領域を含有する、請求項４または５に記載の抗体または抗原結合断片。
　配列番号２４、２８、３２、３６、４０および４４からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む重鎖を含有する、請求項１~６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
　配列番号２６、３０、３４、３８、４２および４６からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する、請求項１~７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
　ヒト−マウスキメラ抗体または抗原結合断片である、請求項１~８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
　配列番号２４に示すアミノ酸配列の２１~１３５番のアミノ酸配列、配列番号２８に示すアミノ酸配列の２１~１３６番のアミノ酸配列、配列番号３２に示すアミノ酸配列の２１~１３８番のアミノ酸配列、配列番号３６に示すアミノ酸配列の２１~１４１番のアミノ酸配列、配列番号４０に示すアミノ酸配列の２１~１３９番のアミノ酸配列および配列番号４４に示すアミノ酸配列の２１~１３６番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする単離された核酸。
　重鎖可変領域および重鎖定常領域をコードする、請求項１０に記載の核酸。
　配列番号２６に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列、配列番号３０に示すアミノ酸配列の２３~１３０番のアミノ酸配列、配列番号３４に示すアミノ酸配列の２５~１３１番のアミノ酸配列、配列番号３８に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列、配列番号４２に示すアミノ酸配列の２１~１２７番のアミノ酸配列および配列番号４６に示すアミノ酸配列の２３~１３０番のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする単離された核酸。
　重鎖可変領域および軽鎖定常領域をコードする、請求項１２に記載の核酸。
　請求項１０~１３のいずれか１項に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
　請求項１４に記載のベクターが導入された宿主細胞。
　請求項１５に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトＳＬＣ６Ａ６に対する抗体または抗原結合断片の製造方法。
　請求項１~９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、医薬組成物。
　がんを治療するための請求項１７に記載の医薬組成物。
　がんが、大腸がん、乳がんまたは子宮がんである、請求項１８に記載の医薬組成物。
　がんが大腸がんである、請求項１８に記載の医薬組成物。