CN110095604A - Caveolin-1蛋白阳性外泌体作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供Caveolin‑1蛋白阳性外泌体作为标志物在非小细胞肺癌诊断中的应用。本发明发现Caveolin‑1蛋白阳性外泌体可以作为非小细胞肺癌早期诊断、鉴别诊断的生物标志物，具有良好的诊断效能。

Description

Caveolin-1蛋白阳性外泌体作为非小细胞肺癌诊断标志物的 应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及外泌体Caveolin-1蛋白作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用。

背景技术

肺癌已经成为世界范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，且呈上升趋势。从临床治疗角度出发，结合生物学特性可将肺癌分为两大类:小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。大多数非小细胞肺癌缺乏神经内分泌特性，组织学上包括腺癌(AD，40％)，鳞癌(SQC，30％)、大细胞癌(10％)等其他类型，对放疗和化疗的敏感性明显低于小细胞肺癌。NSCLC发现率低，一般I期～III a期可以通过手术或辅助放化疗达到临床治愈，肺癌的“狡猾”在于它经常发展到晚期才表现出临床症状，往往由于其他疾病需要就诊时被发现，导致70％～80％的肺癌患者就诊时已是中、晚期，失去了治愈机会，五年生存率很低，因此肺癌的早期诊断至关重要，寻找能用于肺癌早期诊断的分子标志物具有重要意义。

目前，临床上对于非小细胞的初筛依赖于CT、胸片和血清传统肺癌筛查标志物(NSE、Cyfra21-1、SCC、CEA)，但存在以下缺点:1.肺癌早期仅无症状的肺结节，只有病灶大时胸片才能发现，并且在影像学上表现与肺癌相似的肺部疾病很多，很多微小的肺结节很难及时准确诊断，敏度低且特异性差。2.血清传统肺癌筛查标志物数值的高低虽然与肿瘤相关，但一般来说，主要是将检测值和影像学资料和组织活检所结合进行诊断，如果有非常明显的增高，只能说癌症的可疑度也会相应增大。

肿瘤标志物检测具有无创、简便、快捷、可重复性强等明显的优点，它在肿瘤的早期诊断、病理分型、疗效评估及预后检测中分发挥重要的作用，是科研及临床研究的热点之一。但目前传统非小细胞肺癌筛查标志物中尚未有一种标志物能单独用于临床疾病诊断，这些肿瘤标志物在其诊断的特异度和灵敏度上有一定的局限性，需结合影像学、痰细胞学、组织病理学等才能进一步明确诊断，因此寻找敏感度高、特意度高、且无创、简便，快捷的肺癌诊断标志物在非小细胞肺癌肺癌的筛查、诊断、预后评估、疗效监测、复发预测方面具有重要意义。

外泌体作为一种细胞外囊泡，是由细胞所分泌包含有内容物的膜性结构，细胞把特异的生物活性分子通过外泌体运输到相应的受体细胞并调节受体细胞的生物功能。这种由外泌体介导的细胞间信息传递在一些生理和病理过程中扮演着十分重要的作用，而外泌体特异性膜蛋白成分与其内部包裹的蛋白和核酸物质为外泌体作为生物标志物成为可能。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供Caveolin-1蛋白阳性外泌体作为标志物在制备肺癌诊断试剂中的应用，用于解决现有技术中肺癌诊断的特异度和灵敏度差、操作繁琐等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供用于检测Caveolin-1蛋白阳性外泌体的物质在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断肺癌和/或评估肺癌风险。

可选地，所述试剂盒用于检测上述Caveolin-1蛋白阳性外泌体的粒子数。

可选地，所述试剂盒还用于检测总外泌体的粒子数。

可选地，所述Caveolin-1蛋白阳性外泌体存在于血清中。

可选地，所述Caveolin-1蛋白阳性外泌体粒子数占总外泌体粒子数的百分比与肺癌的发生呈负相关。

可选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。

可选地，所述试剂盒中含有Anti-Caveolin-1抗体，该抗体可以从市场上购买得到。

可选地，所述试剂盒通过纳米流式分析法、质谱分析法、酶联免疫吸附法(ELISA)、微流控法中的至少一种检测所述Caveolin-1蛋白阳性外泌体，前述检测Caveolin-1蛋白阳性外泌体的方法仅仅是部分列举，其他用于检测Caveolin-1蛋白阳性外泌体的方法也在本发明的保护范围中。

可选地，采用的诊断装置可以为纳米流式分析仪，可检测得到Caveolin-1蛋白阳性外泌体粒子数占总外泌体粒子数的百分比。

本发明还提供外泌体Caveolin-1蛋白和/或Caveolin-1蛋白阳性外泌体作为生物标志物在制备或筛选肺癌诊断试剂盒中的应用。

如上所述，本发明的Caveolin-1蛋白阳性外泌体作为标志物在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用，至少具有以下有益效果：本发明发现Caveolin-1蛋白阳性外泌体可以作为非小细胞肺癌早期诊断、鉴别诊断的生物标志物，具有良好的诊断效能。

附图说明

图1显示为本发明实施例的外泌体电镜鉴定结果图。

图2显示为本发明实施例的外泌体粒径鉴定结果图。

图3显示为本发明实施例的外泌体WB鉴定结果图。

图4显示为本发明实施例的外泌体免疫电镜图。

图5显示为本发明实施例的纳米流式分析结果图。

图6显示为本发明实施例的Caveolin-1蛋白阳性外泌体百分数分布散点图。

图7显示为本发明实施例的分析诊断效能的ROC曲线图。

图8显示为本发明实施例的纳米流式分析结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

血清Caveolin-1蛋白阳性外泌体百分数分析实验

1、仪器与试剂耗材

仪器：高速离心机、贝克曼MAX-XP台式超速离心机、TLA120.2离心机转头、离心机配套离心管、NanoFCM纳米流式分析仪。

试剂耗材：1.5ml离心管，PBS，Anti-Caveolin-1抗体[EPR15554](Phycoerythrin)(购自Abcam公司)，纳米流式分析仪质控品(200nm standard blue FL PS)，超纯水。

外泌体鉴定仪器与耗材：Nanosight NS300纳米粒度分析仪、电子显微镜H-7650HITACHI microscope、垂直电泳仪及转膜装置、ChemiDocCRS成像仪、PBS、2％磷钨酸、Anti-Caveolin-1(610406,BD)、Goat-Anti-Mouse IgG/Gold(bs-0296G-Gold 10nm,Bioss)、30％聚丙烯酰胺、PVDF膜、甲醇、SDS、TEMED、脱脂奶粉。

2、标本的收集

标本来自于非小细胞肺癌患者、良性肺部疾病(肺部良性肿瘤、非肿瘤性肺部疾病)、健康体检者标本。

3、血清分离外泌体

3.1分离血清：

将全血3,500r 10min离心，吸取0.5～1ml上清，得到血清(血浆)，所需血清标本量为0.5～1ml。

3.2血清预处理

a)将血清用PBS稀释至1ml；

b)2,000g 30min 4℃离心，后吸取上清移入新1.5ml离心管中；

c)10,000g 30min 4℃离心，后吸取上清移入新1.5ml离心管中；

3.3超高速离心法分离血清外泌体与其鉴定

a)将预处理后的血清转移至离心管(TLA120.2转头配套离心管)中，将血清用PBS稀释至合适体积

b)54,000r，24min，4℃离心；

c)弃掉上清，用100μlPBS重悬底部沉淀，后加PBS至合适体积；

d)54,000r，24min，4℃离心；

e)弃掉上清，用200ulPBS重悬底部沉淀即为外泌体，4℃短期保存。

f)透射电子显微镜观察外泌体形态结构：取10-20μl外泌体样本重悬液滴于电镜专用有膜铜网上，室温静置2min，用滤纸从侧面吸干液体，滴加20μl 2％磷钨酸染液于铜网上，室温负染10min，吸干磷钨酸，用蒸馏水滴在铜网上清洗1-2次，用滤纸吸干蒸馏水，室温风干10min，制样后上机检测，结果如图1所示，可见其符合外泌体的形态特性。

g)Nanosight NS300检测外泌体浓度及粒径分布：用1ml注射器吸取1ml外泌体稀释液缓缓推入管道，待液流稳定后，用nanoparticle tracking analysis(NTA)3.2软件进行分析，结果图2所示，可见其符合外泌体的粒径特性。

h)外泌体Western Blot：在外泌体中按蛋白样品：SDS缓冲液＝4:1的体积比加入5*SDS缓冲液，进行SDS－PAGE电泳、转膜、封闭后，分别加入CD63、TSG101、CD9一抗稀释液，塑料膜封闭，4℃冰箱摇床上孵育过夜后孵育二抗1h，利用ChemiDocXRS显像系统扫描条带，分析各条带显示的蛋白表达水平，结果图3所示，可见其表达外泌体的特征性蛋白CD63、TSG101和CD9。

i)外泌体免疫电镜：取200μl外泌体加入4μlAnti-Caveolin-1，37℃孵育30min后加入10μl金标二抗，37℃孵育30min，54,000r，24min，4℃离心两次除抗体，透射电子显微镜观察外泌体形态。结果如图4所示，显示Caveolin-1蛋白存在于外泌体膜表面。

其中，步骤f)～g)为外泌体的鉴定步骤，证明分离外泌体的方法的可行性，不需每次分析都鉴定。

3.4外泌体Caveolin-1蛋白的标记

a)将分离到的200ul外泌体加入1ul的Anti-Caveolin-1；

b)37℃温育30min。

3.5除游离抗体

a)将与抗体孵育好的外泌体转移至离心管(TLA120.2转头配套离心管)中，用PBS稀释至1ml；

b)54,000r 24min 4℃离心；

c)弃掉上清，用100μlPBS重悬底部沉淀，后加PBS至合适体积；

d)54,000r 24min 4℃离心；

e)弃掉上清，用50ulPBS重悬底部沉淀，纳米流式检测前4℃避光保存与运输。

3.6纳米流式分析仪检测

3.6.1系统启动：Load超纯水(150ul)，初始化4min；

3.6.2日常质控：上样质控品(200nm standard blue FL PS)，仪器参数488nmLaser power：10mW,SS Decay：0.2％，调节信号强度及均一性，采集并保存数据；

3.6.3仪器检测参数的调节：同批次检测样本需保证仪器检测参数一致(进样压力、激发强度、荧光衰减等)；

3.6.4上样：Load样本(50ul)1min；

3.6.5采样：压力1.0kPa下采样1min，保存数据；

3.6.6阈值设置：手动上下调整阈值线直至颗粒信号能与背景信号良好区分。

3.6.7结果分析

利用工具栏中的圈门工具选中直线以上的部分，如图8所示，红色区域为标记Caveolin-1荧光的外泌体粒子，黑色区域为总的外泌体粒子，两区域分界明显，及在两区域中间划门即可。

从图8可知，目标蛋白阳性的外泌体粒子数为155，外泌体粒子总数为1671；目标蛋白阳性的外泌体粒子数所占外泌体粒子总数比例为9.3％，即Caveolin-1阳性外泌体粒子百分数为9.3％。

图5显示为健康体检者及非小细胞肺癌患者血清Caveolin-1阳性外泌体纳米流式分析结果图，A：健康体检者，B：非小细胞肺癌患者。从图中可知，非小细胞肺癌患者血清Caveolin-1阳性外泌体粒子百分数明显低于健康体检者。

图6显示为非小细胞肺癌患者与良性肺部疾病患者、健康体检者血清Caveolin-1阳性外泌体纳米流式分析结果图(**p<0.01)，从图中可知，血清Caveolin-1阳性外泌体粒子百分数不仅能有效区分肺癌患者与健康体检者，而且还能鉴别肺癌与良性肺部疾病患者。

图7显示为ROC曲线图，从图中可知，血清Caveolin-1阳性外泌体粒子百分数在非小细胞肺癌早期诊断、鉴别诊断中具有很好的诊断效能(Early-lung cancer非小细胞肺癌早期；lung cancer非小细胞肺早期加晚期)。

综上所述，本发明发现Caveolin-1阳性外泌体百分数在非小细胞肺癌早期诊断、鉴别诊断中具有良好的诊断效能，可以作为非小细胞肺癌的生物标志物。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.用于检测Caveolin-1蛋白阳性外泌体的物质在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断肺癌和/或评估肺癌风险。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒用于检测所述Caveolin-1蛋白阳性外泌体的粒子数。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还用于检测总外泌体的粒子数。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述Caveolin-1蛋白阳性外泌体存在于血清中。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述Caveolin-1蛋白阳性外泌体粒子数占总外泌体粒子数的百分比与肺癌的的发生呈负相关。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肺癌为非小细胞肺癌。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒中含有Anti-Caveolin-1抗体。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒通过纳米流式分析法、质谱分析法、酶联免疫吸附法(ELISA)、微流控法中的至少一种检测所述Caveolin-1蛋白阳性外泌体。

9.外泌体Caveolin-1蛋白和/或Caveolin-1蛋白阳性外泌体作为生物标志物在制备或筛选肺癌诊断试剂中的应用。