SU1138742A1

SU1138742A1 - Способ определени фибронектина

Info

Publication number: SU1138742A1
Application number: SU823529749A
Authority: SU
Inventors: Геннадий Андреевич Ермолин; Виктор Элизарович Котелянский; Евгений Евгеньевич Ефремов; Марина Алексеевна Глухова; Людмила Вениаминовна Курманова; Михаил Анатольевич Черноусов; Мадис Лесбитович Метсис
Original assignee: Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР
Priority date: 1982-12-29
Filing date: 1982-12-29
Publication date: 1985-02-07

Abstract

СПОСОБ ОПРЕДЕЖНИЯ ФИБРОНЕКТИНА путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, с последующим определением св завшегос с сорбентом фибронектина, отличающий тем, что, с целью повышени точности способа при определении биологически активного фибронектина, в качестве иммуносорбента используют полистирол, обработанный раствором желатина при рН 8,010 ,0, вз того в концентрации 10 12 мкг/нл. W

Description

со

00

и

1

Изобретение относитс к иммунохимии и может быть использовано в клинике дл определени дефицита фибронектина в биологических жидкост х организма, вы влени гипер- фибронектинемии, а также дл количественного определени фибронектина в процессе его промьшленного производства.

Известен способ определени фибронектина с помощью ракетного иммунофореза, предусматривающий нанесение контрольного и исследуемого образца в лунки пластин из гел агарозы, содержащей антитела к фиб- ронектину, и осуществление эдектрофореза в течение 12-16 ч при . После ЭТОГО гели отмывают 3-4 дн , высушивают, окрашивают, измер ют вы соту образовавшихс ракет и по высоте определ ют содержание фибро- нектина

Недостатками указанного способа вл ютс длительность определени и низка производительность (не более 20-25 анализов в день). Кроме того, этим способом определ ют только сз ммарный фибронектин без учета его биологической активности, характеризующей состо ние факторов неспецифической защиты организма.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату вл етс способ определени фибро- нектина путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, представл ющим собой бактериальные клетки, обработанные глутаровым альдегидом и О,1-0,5%-ньм раствором желатина, с последующим определением св завшегос с сорбентом фибро- нектина по агглютинации, осуществл емым визуально или путем микроскопи ровани .2,

Чувствительность определени 0,125 мкг фибронектина, при этом определ етс фибронектин, сохранивший биологическую активность, т.е. способность св зыватьс с желатином

Недостатком способа вл етс невысока точность определени , обусловленна тем, что при постановке, агглютинационной пробы готов т р д разведений исследуемой сыворотки (1:1-1:356) и оценку результатов осуществл ют путем визуального наблюдени или с помощью микроскопи87422

ровани , что не исключает субъективной оценки.

Точность и воспроизводимость определени фибронектина зависит 5 также от свойств и спецификации примен емого иммуносорбента, полученного на основе бактериальных клеток.

Целью изобретени вл етс повы- 10 шение точности способа при определении биологически активного фибрО нектина.

Указанна цель достигаетс тем, . что согласно способу определени J5 фибронектина путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, с последующим, определением сврзав- шегос с сорбентом фибронектина, 20 причем в качестве иммуносорбента используют полистирол, обработанный раствором при 8,0-10,0, вз того в концентрации 10-12 мкг/мл.

Это позвол ет не только коли- 5 чественно определить фибронектин,

обладающий биологической активностью, но и значительно повысить точность определени за счет использовани сорбента, обладающего заранее за- Q данными, стандартными свойствами, что создает реальные предпосылки дл автоматизации определени .

Определение св завшегос с сорбентом фибронектина можно осуществл ть иммуноферментным методом.

Способ обычно осуществл ют следующим образом.

Полистирол при рН 8,0-10,0 обрабатывают раствором желатина при концентрации 10-12 мкг/мл в течение 15-24 ч при 4°С. Полученный иммуносорбент многократно отмывают водой с 0,05% Твин 20, затем нанос т образцы плазмы крови и инкубируют их 30 мин при . После отмывки несв завшихс белков на образовавшийс комплекс полистирол-жела- тин-фибррнектин нанос т антитела к фибронектину , ковалентно св занные с ферментом, инкубируют 30 мин при 37°С, отмывают, добавл ют соответствующую субстратную смесь и по интенсивности окраски определ ют содержание фибронектина в исследуемой пробе.

5 Предлагаемым способом можно определить биологически активный фибронектин в количестве от 5 до 800 иг/мл. Врем проведени анализа не превьш1ает

1,5-2 Ч-, если учесть, что полисти- роловые плашки или пробирки можно заранее обрабатывать желатином и хранить до использовани .

Пример . В лунки нового титровального планшета ;5л серологических реакций заливают по 200 мкл раствора желатина в карбонатном буфере рН 9,6 (содержание белка 10 мкг/мл). Планшет инкубируют в течение 24 ч при , затем многократно отмывают водопроводной водой с 0,05% Твин 20 и внос т в лунки по 200 мкл исследуемых образцов плазмы крови, разведенных 1:1000 фосфатно-солевым буфером рН 7,2. Образец инкубируют в лунках в течение 30 мин при , Лунки снова отмывают и в каждую добавл ют по 200 мкл конъюгата противофибронектиновых антител с пероксидазой, разведенного 1:2500. Конъюгат инкубируют 30 мин при , затем отмьшают лунки и каждую лунку заполн ют

200 мкл субстратной смеси, состо щей из 0,0015%-ного раствора с 0,01% ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буфере; рН 4,7, После инкубации в течение 10 мин при 37 С реакцию останавливают добавлением в лунки 501 мкл 50%-ной серной кислоты . Интенсивность развившейс , окраски субстратной смеси измер ют фотометрически при / - 492 им.

Предлагаемый способ прост и доступен дл освоени . Использу заранее заготовленные микротитровальные

планшеты, обработанные желатином, можно провести определение за 1,52 ч, что позвол ет отнести предла- raeMbrii cnoco6 к методам экспрессанализа .

Следует отметить также возможность унификации предлагаемого способа , его высокую чувствительность и точность.

Claims

(54>‘(57:)^: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРОНЕКТИНА путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, с последующим определением связавшегося с сорбентом фибронектина, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа при определении биологически активного фибронектина, в качестве иммуносорбента используют полистирол, обработанный раствором желатина при pH 8,ΟΙ О, О, взятого в концентрации 1012 мкг/мл.