JP2017039743A - フラッシュ・グロー型の1,2−ジオキセタン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】化学発光のフラッシュ特性およびグロー特性を有する化合物。当該化合物を用いて光を生成し、酵素、抗原、および/または核酸を検出および/または定量する方法。および、これらの化合物に関するキット。
【選択図】図5
Description
本発明は、診断プラットフォームの検出試薬に関する。
化学発光技術は、臨床診断プラットフォームにおける検出試薬として広範囲に使用されている。直接的な化学発光標識(アクリジニウムエステルまたはイソルミノール等)は、トリガー溶液添加後、速やかにフラッシュ化学発光信号を生成するため、検出時間が短い。酵素連結化学発光基質(1,2-ジオキセタンまたはルミノール等)は、添加後のインキュベーション時間は長いが、超高感度検出および大きな基質試薬安定性を得られる。フラッシュ化学発光信号ならびに/または超高感度検出および大きな基質試薬安定性を得られる酵素基質が必要とされる。
を有する化合物を提供するもので、
式中、AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、またはAおよびBは一緒になって、ハロゲンにより置換されたポリシクロアルキルを形成し;
であり;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;R2は、T上に酸素アニオンを生じさせる酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;かつR3は、水素または電子供与基であり;ただしR1が置換されない場合、R3は電子供与基であり;
である場合は
である。
であり得、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル(分岐状または直鎖)、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、R2は、
であり得る。
Eは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;Lは、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく;Nucは酸素原子もしくは硫黄原子であり;かつ、Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル(glucosiduransyl)、または
であり、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Zは、
であり得る。
であり得、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、R2は、
であり得る。
一部の実施形態では、R2は、E-L-Nuc-Zであり得、式中、Eは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Z基の酵素的切断に際してNuc基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し;Lは連結基であり;Nucは求核原子であり;Zは酵素により切断可能な基であり;式中
Eは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;
Lは、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく;
Nucは酸素原子もしくは硫黄原子であり;かつ
Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Zは、
であり得る。
であり得、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、R2は、
であり得る。
Eは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;
Lは、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換され得;
Nucは酸素原子もしくは硫黄原子であり;かつ
Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル(分岐状または直鎖)、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Zは、
であり得る。
を有する化合物を提供し、
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;かつ
R3は、水素または電子供与基である。
であり得、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、R2は、
であり得る。
Eは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;
Lは、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく;
Nucは酸素原子もしくは硫黄原子であり;かつ
Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Zは、
であり得る。
を有する化合物を提供し、
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;
R3は、水素または電子供与基であり;
R4およびR5は独立して、H、F、Cl、Br、I、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、1〜20個の炭素原子を含むアルコキシ、6〜14個の炭素原子を含むアリール、6〜14個の炭素原子を含むアリールオキシ、2〜21個の炭素原子を含むエステル、3〜30個の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、3〜30個の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、2〜21個の炭素原子を含むアルキルアミド、7〜15個の炭素原子を含むアリールアミド、2〜21個の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、7〜15個の炭素原子を含むアリールカルバモイル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、6〜14個の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、3〜60個の炭素原子を含むトリアルキルシリル、18〜42個の炭素原子を含むトリアリールシリル、7〜32個の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、6〜14個の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルスルホニル、6〜14個の炭素原子を含むアリールスルホニル、2〜20個の炭素原子を含むアルキルチオおよび6〜14個の炭素原子を含むアリールチオからなる群より選択され;かつ
Xは、硫黄原子、酸素原子、もしくは窒素原子である。
であり得、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、R2は、
であり得る。
Eは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;
Lは、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく;
Nucは酸素原子もしくは硫黄原子であり;かつ
Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、Hまたは1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル(分岐状または直鎖)、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Zは、
であり得る。
を有する化合物を提供し、
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;かつ
R3は、水素または電子供与基である。
であり得、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、R2は、
であり得る。
Eは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;
Lは、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく;
Nucは酸素原子もしくは硫黄原子であり;かつ
Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Zは、
であり得る。
を有する化合物を提供する工程;該化合物を切断可能な酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程;該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程;ならびに、該反応混合物に光を生成させる工程を含む光の生成方法を提供するが;ただし、酵素複合体が固相を含み、抗原が固相に固定化され、抗原がタンパク質である場合、固相は膜またはマイクロアッセイではないものとする。
[本発明1001]
以下の構造を有する化合物:
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、かつ
AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルを形成する場合には、形成された基は、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、あるいはAおよびBは一緒になって、ハロゲンにより置換されたポリシクロアルキルを形成し;
であり;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、T上に酸素アニオンを生じさせる酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;かつ
R3は、水素または電子供与基であり;ただしR1が非置換の場合、R3は電子供与基であり;
ここで、
である場合は
である。
[本発明1002]
AまたはBのうちの少なくとも1つが、
である、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
AおよびBが全体として、
である、本発明1001の化合物。
[本発明1004]
R1が、1つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルキルである、本発明1001の化合物。
[本発明1005]
R1が、1〜2個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜2個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルである、本発明1001の化合物。
[本発明1006]
R1が、メチルまたは1,1,1-トリフルオロエチルである、本発明1005の化合物。
[本発明1007]
である、本発明1001の化合物。
[本発明1008]
である、本発明1001の化合物。
[本発明1009]
OR2が、ホスフェート、アセテート、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-D-ガラクトシド、β-D-ガラクトシド、α-D-グルコシド、β-D-グルコシド、α-D-マンノシド、β-D-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-D-グルクロニド、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル(分岐鎖または直鎖)、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである、本発明1001の化合物。
[本発明1010]
R2が、
である、本発明1009の化合物。
[本発明1011]
R2がE-L-Nuc-Zであり、式中、Eは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Z基の酵素的切断に際してNuc基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し;Lは連結基であり;Nucは求核原子であり;かつ、Zは酵素により切断可能な基であり、ここで
Eが、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;
Lが、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく;
Nucは酸素原子または硫黄原子であり;かつ
Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである、本発明1001の化合物。
[本発明1012]
Zが、
である、本発明1011の化合物。
[本発明1013]
前記電子供与基が、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルコキシ、または3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルコキシである、本発明1001の化合物。
[本発明1014]
前記電子供与基が、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、本発明1001の化合物。
[本発明1015]
前記電子供与基が、1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、本発明1001の化合物。
[本発明1016]
前記電子供与基が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシおよびブチルオキシからなる群より選択される、本発明1001の化合物。
[本発明1017]
前記酵素部分によって切断可能な結合の切断により、25℃で光が生成され、これが約15分未満で最大に達する、本発明1001の化合物。
[本発明1018]
前記光の生成が約10分未満で最大に達する、本発明1017の化合物。
[本発明1019]
前記光の生成が約5分未満で最大に達する、本発明1017の化合物。
[本発明1020]
前記酵素部分によって切断可能な結合の切断により、37℃で光が生成され、これが約15分未満で最大に達する、本発明1001の化合物。
[本発明1021]
前記光の生成が約10分未満で最大に達する、本発明1020の化合物。
[本発明1022]
前記光の生成が約5分未満で最大に達する、本発明1020の化合物。
[本発明1023]
である、本発明1001の化合物。
[本発明1024]
(a)本発明1001の化合物を提供する工程;
(b)該化合物を切断可能な酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程;
(c)該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程;ならびに、
(d)該反応混合物に光を生成させる工程
を含む、光の生成方法。
[本発明1025]
25℃での光の生成が約15分未満で最大に達する、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記光の生成が約10分未満で最大に達する、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記光の生成が約5分未満で最大に達する、本発明1025の方法。
[本発明1028]
37℃での光の生成が約15分未満で最大に達する、本発明1024の方法。
[本発明1029]
前記光の生成が約10分未満で最大に達する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記光の生成が約5分未満で最大に達する、本発明1028の方法。
[本発明1031]
前記酵素部分が加水分解酵素を含む、本発明1024の方法。
[本発明1032]
前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、またはノイラミニダーゼである、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記酵素部分が酵素である、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程をさらに含み、該光の生成が前記酵素の存在を示し、該生成された光の量が試料中に存在する該酵素の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記光の生成が約10分未満で最大に達する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記光の生成が約5分未満で最大に達する、本発明1034の方法。
[本発明1037]
前記酵素部分が、抗原に結合可能な第1の抗体と、基質が分解されて光を生成するように前記化合物を切断可能な酵素とを含む酵素結合抗体である、本発明1032の方法。
[本発明1038]
前記第1の抗体が、前記酵素に共有結合または非共有結合で結合されている、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記第1の抗体が、標識に共有結合で結合されており、前記酵素が、該標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合されている、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプトアビジンである、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、本発明1039の方法。
[本発明1042]
(a)抗原を含む疑いのある試料を提供する工程;
(b)該抗原に結合可能な第2の抗体を含む固相を提供する工程;
(c)該試料および酵素結合抗体を該固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程;ならびに
(d)前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該抗原の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、工程
をさらに含む、本発明1037の方法。
[本発明1043]
前記光の生成が約10分未満で最大に達する、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記光の生成が約5分未満で最大に達する、本発明1042の方法。
[本発明1045]
未結合の酵素結合抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含む、本発明1042の方法。
[本発明1046]
前記酵素部分が、抗原と、前記化合物が分解されて光を生成するように前記化合物を切断可能な酵素とを含む、酵素結合抗原である、本発明1032の方法。
[本発明1047]
前記抗原が前記酵素に共有結合または非共有結合で結合されている、本発明1046の方法。
[本発明1048]
抗原が標識に共有結合で結合されており、前記酵素が、該標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合されている、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプトアビジンである、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、本発明1048の方法。
[本発明1051]
(a)抗原を含む疑いのある試料を提供する工程;
(b)該抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程;
(c)該試料および酵素結合抗原を該固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程;ならびに
(d)前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、該生成された光の量が、該試料中に存在する該抗原の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、工程
をさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1052]
前記光の生成が約10分未満で最大に達する、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記光の生成が約5分未満で最大に達する、本発明1051の方法。
[本発明1054]
未結合の酵素結合抗原を酵素複合体から除去する工程をさらに含む、本発明1051の方法。
[本発明1055]
前記酵素部分が、核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断可能な酵素とを含む酵素結合オリゴヌクレオチドである、本発明1032の方法。
[本発明1056]
前記オリゴヌクレオチドが前記酵素に共有結合または非共有結合で結合されている、本発明1055の方法。
[本発明1057]
オリゴヌクレオチドが標識に共有結合で結合されており、前記酵素が、該標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合されている、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプトアビジンである、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、本発明1057の方法。
[本発明1060]
(a)核酸を含む疑いのある試料を提供する工程;
(b)該核酸を固相に固定化する工程、
(c)固定化された該核酸と酵素結合オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程;ならびに
(d)前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該核酸の存在を示し、該生成された光の量が試料中に存在する核酸の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する工程
をさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1061]
前記光の生成が約10分未満で最大に達する、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記光の生成が約5分未満で最大に達する、本発明1060の方法。
[本発明1063]
未結合の酵素結合オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含む、本発明1060の方法。
[本発明1064]
前記反応混合物が増強剤をさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1065]
前記増強剤が、ポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記増強剤がアクセプター色素をさらに含む、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記アクセプター色素が、フルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 405、ALEXA FLUOR 430、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、またはALEXA FLUOR 555である、本発明1066の方法。
[本発明1068]
前記ポリマー性第四級アンモニウム塩が、ポリ(塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム)、ポリ[ビニルベンジル(塩化ベンジルジメチルアンモニウム)]、ポリ[ビニル(塩化ベンジルトリブチルアンモニウム)]、ポリ[ビニル(塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム)]またはそれらの組み合わせである、本発明1065の方法。
[本発明1069]
前記ポリマー性第四級ホスホニウム塩が、ポリ(塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム)、ポリ(塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム)、ポリ(塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム)、ポリ(塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム)とポリ(塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム)とを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせである、本発明1065の方法。
[本発明1070]
AまたはBのうちの少なくとも1つが、
である、本発明1024の方法。
[本発明1071]
AおよびBが全体として、
である、本発明1024の方法。
[本発明1072]
R1が、1つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルキルである、本発明1024の方法。
[本発明1073]
R1が、1〜2個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜2個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルである、本発明1024の方法。
[本発明1074]
R1が、メチルまたは1,1,1-トリフルオロエチルである、本発明1073の方法。
[本発明1075]
である、本発明1024の方法。
[本発明1076]
である、本発明1024の方法。
[本発明1077]
OR2が、ホスフェート、アセテート、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-D-ガラクトシド、β-D-ガラクトシド、α-D-グルコシド、β-D-グルコシド、α-D-マンノシド、β-D-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-D-グルクロニド、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである、本発明1024の方法。
[本発明1078]
R2が、
である、本発明1077の方法。
[本発明1079]
R2がE-L-Nuc-Zであり、式中、Eは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Z基の酵素的切断に際してNuc基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し;Lは連結基であり;Nucは求核原子であり;かつ、Zは酵素により切断可能な基であり;式中、
Eが、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;
Lが、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく;
Nucは酸素原子もしくは硫黄原子であり;かつ
Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである、本発明1024の方法。
[本発明1080]
Zが、
である、本発明1079の方法。
[本発明1081]
前記電子供与基が、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルコキシ、または3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルコキシである、本発明1024の方法。
[本発明1082]
前記電子供与基が、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、本発明1024の方法。
[本発明1083]
前記電子供与基が、1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、本発明1024の方法。
[本発明1084]
前記電子供与基が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシまたはブチルオキシからなる群より選択される、本発明1024の方法。
[本発明1085]
前記化合物が、
である、本発明1024の方法。
[本発明1086]
(a)本発明1001の化合物を提供する工程;
(b)該化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断可能な酵素を含む疑いのある試料を提供する工程;
(c)該試料を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程;ならびに、
(d)該化合物の添加後に該反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該酵素の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該酵素の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、工程
を含む、試料中の酵素の存在および/または量を決定するアッセイ方法。
[本発明1087]
(a)本発明1001の化合物を提供する工程;
(b)抗原を含む疑いのある試料を提供する工程;
(c)該抗原と、該化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断することができる酵素とを含む、酵素結合抗原を提供する工程;
(d)該抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程;
(e)該試料および酵素結合抗原を該固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程;
(f)該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程;ならびに、
(g)該化合物の添加後に該反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該抗原の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、工程
を含む、試料中の抗原の存在および/または量を決定するアッセイ方法。
[本発明1088]
(a)本発明1001の化合物を提供する工程;
(b)核酸を含む疑いのある試料を提供する工程;
(c)該核酸を固相に固定化する工程;
(d)該核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、該化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断可能な酵素とを含む、酵素結合オリゴヌクレオチドを提供する工程;
(e)固定化された該核酸と該酵素結合オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程;
(f)該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程;ならびに、
(g)該化合物の添加後に該反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該核酸の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該核酸の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、工程
を含む、試料中の核酸の存在および/または量を決定するアッセイ方法。
[本発明1089]
(a)本発明1001の化合物、および
(b)緩衝液
を含む、試料中の分析物の存在および/または量を検出するためのキット。
[本発明1090]
以下の構造を有する化合物:
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;かつ
R3は、水素または電子供与基である。
[本発明1091]
以下の構造を有する化合物:
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;
R3は、水素または電子供与基であり;
R4およびR5は独立して、H、F、Cl、Br、I、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、1〜20個の炭素原子を含むアルコキシ、6〜14個の炭素原子を含むアリール、6〜14個の炭素原子を含むアリールオキシ、2〜21個の炭素原子を含むエステル、3〜30個の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、3〜30個の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、2〜21個の炭素原子を含むアルキルアミド、7〜15個の炭素原子を含むアリールアミド、2〜21個の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、7〜15個の炭素原子を含むアリールカルバモイル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、6〜14個の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、3〜60個の炭素原子を含むトリアルキルシリル、18〜42個の炭素原子を含むトリアリールシリル、7〜32個の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、6〜14個の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルスルホニル、6〜14個の炭素原子を含むアリールスルホニル、2〜20個の炭素原子を含むアルキルチオおよび6〜14個の炭素原子を含むアリールチオからなる群より選択され;かつ
Xは、硫黄原子、酸素原子、または窒素原子である。
[本発明1092]
以下の構造を有する化合物:
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;かつ
R3は、水素または電子供与基である。
[本発明1093]
である化合物。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は本明細書において開示される実施形態に限定されていないことを理解されたい。さらに、方法およびキットは、様々な工程または構成要素を「含む」という用語で記載される(「含むが、これらに限定されない」という意味として解釈される)が、方法およびキットはまた、様々な工程および構成要素からも「本質的に成る」または「成る」ことができ、かかる用語は閉じたメンバーの群を本質的に定義すると解釈されるべきである。最後に、本明細書および添付の特許請求の範囲内で使用される、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に指示しない限り複数の指示物を含むものとする。
アクセプター色素は、光を放射する別の分子からエネルギー(特に光)を受け取り、次には、検出可能なエネルギー(やはり好ましくは光)を放射することができる分子を指す。
式中、
AおよびBは独立して、直鎖アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルキル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され得、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、またはAおよびBは一緒になってハロゲンにより置換されたポリシクロアルキルを形成し;
であり;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり得;
R2は、T上に酸素アニオンを生じさせる酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり得;かつ
R3は、水素または電子供与基であり得;ただしR1が置換されない場合、R3は電子供与基であるものとし;
である場合、それは、
であり得る。
AおよびBは独立して、直鎖アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルキル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され得、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり得;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり得;かつ
R3は、水素または電子供与基であり得る。
AおよびBは独立して、直鎖アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルキル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され得、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり得;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり得;
R3は、水素または電子供与基であり得;
R4およびR5は独立して、H、F、Cl、Br、I、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、1〜20個の炭素原子を含むアルコキシ、6〜14個の炭素原子を含むアリール、6〜14個の炭素原子を含むアリールオキシ、2〜21個の炭素原子を含むエステル、3〜30個の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、3〜30個の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、2〜21個の炭素原子を含むアルキルアミド、7〜15個の炭素原子を含むアリールアミド、2〜21個の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、7〜15個の炭素原子を含むアリールカルバモイル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、6〜14個の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、3〜60個の炭素原子を含むトリアルキルシリル、18〜42個の炭素原子を含むトリアリールシリル、7〜32個の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、6〜14個の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルスルホニル、6〜14個の炭素原子を含むアリールスルホニル、2〜20個の炭素原子を含むアルキルチオおよび6〜14個の炭素原子を含むアリールチオからなる群より選択され得;かつ
Xは、硫黄原子、酸素原子、もしくは窒素原子である。
AおよびBは独立して、直鎖アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルキル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され得、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり得;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり得;かつ
R3は、水素または電子供与基であり得る。
であり得る。化合物[1]の一部の実施形態では、AおよびBは全体として、
であり得る。化合物[2]〜[4]の一部の実施形態では、AおよびBは全体として、
であり得る。
ペンタレン、アズレン、ヘプタレン、as-インダセン、s-インダセン、ビフェニレン、ペリレン、アセナフチレン、フェナントレン、アントラセン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン等に加えて、1つまたは複数の非不安定置換基、例えば、1〜20個の炭素原子(両端を含む)を有する分岐状または直鎖アルキル基(例えばメチル、n-ブチルまたはデシル)、1〜7個の炭素原子(両端を含む)を有する分岐状または直鎖ヘテロアルキル基(例えばメトキシ、ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル);1もしくは2つの環を有するアリール基(例えばフェニル);1もしくは2つの環を有するヘテロアリール基(例えばピロリルまたはピラゾリル);環内に3〜7個の炭素原子(両端を含む)を有するシクロアルキル基(例えばシクロヘキシル);環内に3〜6個の炭素原子(両端を含む)を有するヘテロシクロアルキル基(例えばジオキサン);1もしくは2つの環を有するアラルキル基(例えばベンジル);1もしくは2つの環を有するアルカリール基(例えばトリル);電子求引基(1〜7個の炭素原子(両端を含む)を有するペルフルオロアルキル基等、例えばトリフルオロメチル);ハロゲン;CO2H、Z'CO2H、SO3H、NO2、Z'NO2、CN、またはZ'CN(式中、Z'は1〜7個の炭素原子(両端を含む)を有する分岐状または直鎖アルキル基、例えばメチル基、または1もしくは2つの環を有するアリール基(例えばフェニル)である);電子供与基(例えば分岐状または直鎖のC1〜C7アルコキシ基、例えばメトキシまたはエトキシ):1もしくは2つの環を有するアラルコキシ基(例えばフェノキシ);分岐状または直鎖のC1〜C7アルコキシ基(例えばメトキシまたはエトキシ);1もしくは2つの環を有するアラルコキシ基(例えばフェノキシ);分岐状または直鎖のC1〜C7ヒドロキシアルキル基(例えばヒドロキシメチルまたはヒドロキシエチル);1もしくは2つの環を有するヒドロキシアリール基(例えばヒドロキシフェニル);分岐状または直鎖のC1〜C7アルキルエステル基(例えばアセテート);1もしくは2つの環を有するアリールエステル基(例えばベンゾアート);または1もしくは2つの環を有するヘテロアリール基(例えばベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾールまたはベンゾトリアゾール)により置換されたその誘導体が包含される。
であり得、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル(分岐状または直鎖)であっても3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであってもよい。これらの実施形態の一部では、R2は、
であり得る。
(式中、M+は、カチオン(アルカリ金属(例えばナトリウムまたはカリウム)、アンモニウム、またはC1-7アルキル、アラルキルもしくは芳香族第四級アンモニウムカチオン、N(DR3)4+(式中、各D3はアルキル、例えばメチルまたはエチル、アラルキル、例えばベンジルであり得るか、または複素環系(例えばピリジニウム)、および特にジナトリウム塩の一部を形成し得る)等)を示す)によって示されるリン酸エステル基であり得る。かかる第四級アンモニウムカチオンは、ポリマー性骨格にそれらの四級化基の1つを通して連結され得、すなわち
(式中、nは1より大きい)、またはポリ第四級アンモニウム塩(すなわちイオネンポリマー)の一部であり得る。
Eは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり得;
Lは、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され得、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換することができ得る;
Nucは酸素原子もしくは硫黄原子であり得;かつ
Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル、または
であり得、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Zは、
であり得る。
を有する化合物を提供する工程;該化合物を切断可能な酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程;該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程;ならびに、該反応混合物に光を生成させる工程を含む光の生成方法を提供するが、ただし、酵素複合体が固相を含み、抗原が固相に固定化され、抗原がタンパク質である場合、固相は膜またはマイクロアッセイではないものとする。
化学発光を測定するために、96/384-ウェルHydroSpeedplate洗浄器(TecanGroup Ltd.、スイス国)、Orion−II 96/384-ウェルマイクロプレート照度計(Titertek Instrument Berthold Technologies、ハンツビル、アラバマ)を使用した。
Dynabeads(登録商標)(Life Tech Dynal AS、ノルウェー国)、Corning 96-ウェルポリスチレンマイクロプレート、平底、高結合、白色(Corning,3922)、およびCorning 96-ウェルマイクロプレート、丸底、白色(Corning,3355)を入手した。
CSPD(登録商標)およびCDP-Star(登録商標)をLife Technologies、サンディエゴ、カリフォルニアから入手した。
AP-5化学発光基質(アルカリホスファターゼ用)をLumigen,Inc.(サウスフィールド、ミシガン)から入手した。これは本明細書において競合者の基質Dまたは競合者のAP基質D、競合者のフラッシュ基質D、またはVendor Xの基質Dと称す。
LumiGLO Reserve(商標)化学発光基質(HRP用)をKPL,Inc.(ゲイザースバーグ、メリーランド)から入手した。これは本明細書において競合者のHRP基質または競合者のグロー基質Eと称す。
Sapphire-II(商標)発光増強剤(Sapphire-II)、Sapphire-III(商標)発光増強剤(Sapphire-III)、Emerald(商標)-II発光増強剤(Emerald-II)、およびEmerald(商標)-III発光増強剤(Emerald-III)をApplied Biosystems Inc.、フォスターシティー、カリフォルニアから入手した。
100μLの基質製剤を、アルカリホスファターゼ(BBI BioZyme,ALPI12G)の連続希釈液10μLに添加し、基質添加後、白色マイクロタイタープレートを速度論的に2分読み込んだ。
10μLの洗浄したビーズを、ビオチニル化アルカリホスファターゼ(BioLabs,N7022S)の10倍連続希釈液40μLと25℃で40分間インキュベートした。ドーナツ状の磁石(Life Tech Ambionの磁石カタログ番号:AM10050)でビーズを2〜3分間分離し、1%BSAを含む1倍PBSで3回洗浄した。
100μL基質製剤を添加し、基質添加後、プレートを速度論的に2分読み込んだ。
ヒトIL-6に対するモノクローナル抗体(R&D Systems,MAB206)を96-ウェルマイクロプレートに固定化して標準的なヒト組換えIL-6(R&D Systems,206-IL)に結合させる。ビオチニル化抗ヒトIL-6(R&D Systems,BAF206)を添加し、これはプレート上で結合したヒト組換えIL-6に結合し、次いで、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ(Jackson ImmunoResearch,16-050-084)を添加した。化学検出とは独立して、免疫アッセイ手順は同一であった。基質製剤を洗浄したウェルに添加して、プレートを基質添加後37秒速度論的に読み込んだ。
ヒト血清(Sigma,S7023)中のヒト心臓トロポニンI(HyTest Ltd.,8T53)50μLを、LYNX Rapid Alkaline Phosphatase Antibody Conjugationキット(AbDSerotec,LNK012AP)を使用してアルカリホスファターゼにコンジュゲートした50μLのマウスα-ヒト心臓トロポニンI(α-cTnI)、SDIX(クローンTPC6)抗体と共に25℃で10分間インキュベートした。
α-ヒト心臓トロポニンI(α-cTnI)モノクローナル抗体(HyTest Ltd.,4T21,Mab560)とカップリングさせた100μLのDynabeads(登録商標)を上記試料と撹拌しながら37℃で30分間インキュベートした。ビーズをドーナツ状の磁石(Life Tech Ambionの磁石カタログ番号:AM10050)で2〜3分間分離し、TBS-Tween洗浄緩衝液で3回洗浄した。
100μLの基質製剤を添加し、プレートを基質添加後2分速度論的に読み込んだ。
図1〜図4に概説する反応スキームによって基質Aを作製した。
図1に示すように、4-Me-3-OBN-ベンズアルデヒドを作製した。17.56gの出発材料によって13.6gの最終生成物を得た。4-Me-3-OBN-ベンズアルデヒドから開始して図2に示すように4-Me-Pheホスフェートを作製した。13.6gの出発材料によって17.7gの最終生成物を得た。図3に示す反応スキームによって4-Me-Pheホスフェートから開始して基質Aのエノールエーテル前駆体を作製した。5.6gの出発材料によって2.1gの最終生成物を得た。基質Aのエノールエーテル前駆体から開始して図4に示すように基質Aを作製した。1.5gの出発材料によって1.37gの最終生成物を得た。
本発明の化合物は、当業者にとって公知の変更を加えた上記反応スキームによって作製することができる。
25℃で実行する「精製アルカリホスファターゼアッセイ」プロトコルを使用してCSDP、CDP-Star、基質Aおよび基質Bによる光の放射の速度論を検討した。
「抗体捕獲のための固体支持体としてマイクロプレートを使用するサンドイッチELISA」プロトコルにおいて25℃で、基質A、CSDP、およびCDP-Starによる光の放射の速度論を検討した。
「抗体捕獲のための固体支持体としてマイクロプレートを使用するサンドイッチELISA」プロトコルにおいて37℃で、基質A、B、CおよびCDP-Starによる光放射の速度論を検討した。
「抗体捕獲のための固体支持体としてマイクロプレートを使用するサンドイッチELISA」プロトコルにおいて37℃で、Emerald-II、競合者のAP基質D、および競合者のHRP基質と共に基質A、基質B、基質C、CDP-Starを使用した場合の感度を検討した。
「精製アルカリホスファターゼアッセイ」プロトコルを使用して-20℃、4℃、および37℃で保存した基質A試料による光の最大放射を検討した。これらの温度で保存した試料を、80日間の経過を通して同じ日にアッセイした。
ビオチン標識アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジン標識トシル基活性化Dynabeads M-280ビーズを使用して、基質A、基質B、基質C、Emerald-IIを併用したCDP-Star、競合者のフラッシュ基質D、および競合者のフロー(Flow)基質Eの光放射速度論および信号対雑音を検討した。20μgのストレプトアビジン標識Dynabeadsを0.04ngのビオチン標識アルカリホスファターゼと結合させた。評価は室温で行った。
ビオチン標識アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジン標識トシル基活性化Dynabeads M-280ビーズを使用する「ストレプトアビジン被覆M-280トシル基活性化Dynabeads(登録商標)でカップリングしたビオチニル化アルカリホスファターゼ」プロトコルを使用して、基質A、基質B、基質C、Emerald-IIを併用したCDP-Star、競合者のフラッシュ基質D、および競合者のグロー基質Eの感度を検討した。20μgのストレプトアビジン標識Dynabeadsを可変量のビオチン標識アルカリホスファターゼと結合させた。各基質の至適読み込み時点および室温で評価を行った。
Dynabeads MyOneカルボン酸ビーズを使用する「抗体捕獲のための固体支持体としてDynabeads(登録商標)を使用するトロポニンサンドイッチELISA」プロトコルを使用して、Emerald-IIIを併用した基質A、基質B、およびEmerald-IIを併用したCDP-Starの光の放射の速度論および信号対雑音を検討した。プロトコルを16pg/mL cTnlを使用して37℃で実行した。
「抗体捕獲のための固体支持体としてDynabeads(登録商標)を使用するトロポニンサンドイッチELISA」プロトコルを37℃で使用して、Emerald-IIIを併用した基質A、基質B、およびEmerald-IIを併用したCDP-Starの性能を検討した。
トシル基活性化Dynabeads M-280、Dynabeads MyOneカルボン酸、およびDynabeads M-270エポキシをα-ヒト心臓トロポニンI(α-cTnI)モノクローナル抗体(HyTest Ltd.,4T21、Mab560)とカップリングさせた。
Dynabeads M-270エポキシをα-ヒト心臓トロポニンI(α-cTnI)モノクローナル抗体(HyTest Ltd.,4T21,Mab560)とカップリングさせた。「抗体捕獲のための固体支持体としてDynabeads(登録商標)を使用するトロポニンサンドイッチELISA」プロトコルを37℃で使用して、基質A、基質B、基質C、Emerald-IIを併用したCDP-StarおよびVendor Xの基質Dの免疫アッセイにおける性能を検討した。
Claims (93)
- 以下の構造を有する化合物:
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、かつ
AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルを形成する場合には、形成された基は、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、あるいはAおよびBは一緒になって、ハロゲンにより置換されたポリシクロアルキルを形成し;
であり;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、T上に酸素アニオンを生じさせる酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;かつ
R3は、水素または電子供与基であり;ただしR1が非置換の場合、R3は電子供与基であり;
ここで、
である場合は
である。 - R1が、1つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルキルである、請求項1に記載の化合物。
- R1が、1〜2個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜2個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルである、請求項1に記載の化合物。
- R1が、メチルまたは1,1,1-トリフルオロエチルである、請求項5に記載の化合物。
- R2がE-L-Nuc-Zであり、式中、Eは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Z基の酵素的切断に際してNuc基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し;Lは連結基であり;Nucは求核原子であり;かつ、Zは酵素により切断可能な基であり、ここで
Eが、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;
Lが、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく;
Nucは酸素原子または硫黄原子であり;かつ
Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである、請求項1に記載の化合物。 - 前記電子供与基が、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルコキシ、または3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルコキシである、請求項1に記載の化合物。
- 前記電子供与基が、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、請求項1に記載の化合物。
- 前記電子供与基が、1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、請求項1に記載の化合物。
- 前記電子供与基が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシおよびブチルオキシからなる群より選択される、請求項1に記載の化合物。
- 前記酵素部分によって切断可能な結合の切断により、25℃で光が生成され、これが約15分未満で最大に達する、請求項1に記載の化合物。
- 前記光の生成が約10分未満で最大に達する、請求項17に記載の化合物。
- 前記光の生成が約5分未満で最大に達する、請求項17に記載の化合物。
- 前記酵素部分によって切断可能な結合の切断により、37℃で光が生成され、これが約15分未満で最大に達する、請求項1に記載の化合物。
- 前記光の生成が約10分未満で最大に達する、請求項20に記載の化合物。
- 前記光の生成が約5分未満で最大に達する、請求項20に記載の化合物。
- (a)請求項1に記載の化合物を提供する工程;
(b)該化合物を切断可能な酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程;
(c)該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程;ならびに、
(d)該反応混合物に光を生成させる工程
を含む、光の生成方法。 - 25℃での光の生成が約15分未満で最大に達する、請求項24に記載の方法。
- 前記光の生成が約10分未満で最大に達する、請求項25に記載の方法。
- 前記光の生成が約5分未満で最大に達する、請求項25に記載の方法。
- 37℃での光の生成が約15分未満で最大に達する、請求項24に記載の方法。
- 前記光の生成が約10分未満で最大に達する、請求項28に記載の方法。
- 前記光の生成が約5分未満で最大に達する、請求項28に記載の方法。
- 前記酵素部分が加水分解酵素を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、またはノイラミニダーゼである、請求項31に記載の方法。
- 前記酵素部分が酵素である、請求項32に記載の方法。
- 前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程をさらに含み、該光の生成が前記酵素の存在を示し、該生成された光の量が試料中に存在する該酵素の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、請求項33に記載の方法。
- 前記光の生成が約10分未満で最大に達する、請求項34に記載の方法。
- 前記光の生成が約5分未満で最大に達する、請求項34に記載の方法。
- 前記酵素部分が、抗原に結合可能な第1の抗体と、基質が分解されて光を生成するように前記化合物を切断可能な酵素とを含む酵素結合抗体である、請求項32に記載の方法。
- 前記第1の抗体が、前記酵素に共有結合または非共有結合で結合されている、請求項37に記載の方法。
- 前記第1の抗体が、標識に共有結合で結合されており、前記酵素が、該標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合されている、請求項38に記載の方法。
- 前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項39に記載の方法。
- 前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、請求項39に記載の方法。
- (a)抗原を含む疑いのある試料を提供する工程;
(b)該抗原に結合可能な第2の抗体を含む固相を提供する工程;
(c)該試料および酵素結合抗体を該固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程;ならびに
(d)前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該抗原の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、工程
をさらに含む、請求項37に記載の方法。 - 前記光の生成が約10分未満で最大に達する、請求項42に記載の方法。
- 前記光の生成が約5分未満で最大に達する、請求項42に記載の方法。
- 未結合の酵素結合抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 前記酵素部分が、抗原と、前記化合物が分解されて光を生成するように前記化合物を切断可能な酵素とを含む、酵素結合抗原である、請求項32に記載の方法。
- 前記抗原が前記酵素に共有結合または非共有結合で結合されている、請求項46に記載の方法。
- 抗原が標識に共有結合で結合されており、前記酵素が、該標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合されている、請求項47に記載の方法。
- 前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項48に記載の方法。
- 前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、請求項48に記載の方法。
- (a)抗原を含む疑いのある試料を提供する工程;
(b)該抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程;
(c)該試料および酵素結合抗原を該固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程;ならびに
(d)前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、該生成された光の量が、該試料中に存在する該抗原の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、工程
をさらに含む、請求項46に記載の方法。 - 前記光の生成が約10分未満で最大に達する、請求項51に記載の方法。
- 前記光の生成が約5分未満で最大に達する、請求項51に記載の方法。
- 未結合の酵素結合抗原を酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項51に記載の方法。
- 前記酵素部分が、核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断可能な酵素とを含む酵素結合オリゴヌクレオチドである、請求項32に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが前記酵素に共有結合または非共有結合で結合されている、請求項55に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが標識に共有結合で結合されており、前記酵素が、該標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合されている、請求項56に記載の方法。
- 前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項57に記載の方法。
- 前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、請求項57に記載の方法。
- (a)核酸を含む疑いのある試料を提供する工程;
(b)該核酸を固相に固定化する工程、
(c)固定化された該核酸と酵素結合オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程;ならびに
(d)前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該核酸の存在を示し、該生成された光の量が試料中に存在する核酸の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する工程
をさらに含む、請求項55に記載の方法。 - 前記光の生成が約10分未満で最大に達する、請求項60に記載の方法。
- 前記光の生成が約5分未満で最大に達する、請求項60に記載の方法。
- 未結合の酵素結合オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項60に記載の方法。
- 前記反応混合物が増強剤をさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 前記増強剤が、ポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含む、請求項64に記載の方法。
- 前記増強剤がアクセプター色素をさらに含む、請求項65に記載の方法。
- 前記アクセプター色素が、フルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 405、ALEXA FLUOR 430、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、またはALEXA FLUOR 555である、請求項66に記載の方法。
- 前記ポリマー性第四級アンモニウム塩が、ポリ(塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム)、ポリ[ビニルベンジル(塩化ベンジルジメチルアンモニウム)]、ポリ[ビニル(塩化ベンジルトリブチルアンモニウム)]、ポリ[ビニル(塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム)]またはそれらの組み合わせである、請求項65に記載の方法。
- 前記ポリマー性第四級ホスホニウム塩が、ポリ(塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム)、ポリ(塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム)、ポリ(塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム)、ポリ(塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム)とポリ(塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム)とを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせである、請求項65に記載の方法。
- R1が、1つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルキルである、請求項24に記載の方法。
- R1が、1〜2個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜2個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルである、請求項24に記載の方法。
- R1が、メチルまたは1,1,1-トリフルオロエチルである、請求項73に記載の方法。
- R2がE-L-Nuc-Zであり、式中、Eは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Z基の酵素的切断に際してNuc基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し;Lは連結基であり;Nucは求核原子であり;かつ、Zは酵素により切断可能な基であり;式中、
Eが、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;
Lが、1〜4個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-(CH2)m-O-(CH2)n、-(CH2)m-S-(CH2)n-、または-(CH2)m-NR6-(CH2)n-からなる群より選択され、式中、mおよびnは0〜3であり、m+nは2または3であり、式中、R6は、1〜10個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、1〜24個の炭素原子を含むアルキル、2〜24個の炭素原子を含むアルケニル、1〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2〜24個の炭素原子を含み、かつ1〜24個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6〜10個の炭素を含むアリール、1〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2〜24個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1〜4個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく;
Nucは酸素原子もしくは硫黄原子であり;かつ
Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシル、または
であり、式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立して、H、1〜4個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または3〜6個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである、請求項24に記載の方法。 - 前記電子供与基が、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルコキシ、または3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルコキシである、請求項24に記載の方法。
- 前記電子供与基が、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、請求項24に記載の方法。
- 前記電子供与基が、1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは1〜5個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、請求項24に記載の方法。
- 前記電子供与基が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシまたはブチルオキシからなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
- (a)請求項1に記載の化合物を提供する工程;
(b)該化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断可能な酵素を含む疑いのある試料を提供する工程;
(c)該試料を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程;ならびに、
(d)該化合物の添加後に該反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該酵素の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該酵素の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、工程
を含む、試料中の酵素の存在および/または量を決定するアッセイ方法。 - (a)請求項1に記載の化合物を提供する工程;
(b)抗原を含む疑いのある試料を提供する工程;
(c)該抗原と、該化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断することができる酵素とを含む、酵素結合抗原を提供する工程;
(d)該抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程;
(e)該試料および酵素結合抗原を該固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程;
(f)該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程;ならびに、
(g)該化合物の添加後に該反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該抗原の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、工程
を含む、試料中の抗原の存在および/または量を決定するアッセイ方法。 - (a)請求項1に記載の化合物を提供する工程;
(b)核酸を含む疑いのある試料を提供する工程;
(c)該核酸を固相に固定化する工程;
(d)該核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、該化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断可能な酵素とを含む、酵素結合オリゴヌクレオチドを提供する工程;
(e)固定化された該核酸と該酵素結合オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程;
(f)該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程;ならびに、
(g)該化合物の添加後に該反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該核酸の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該核酸の量に相関し得、25℃〜37℃での該光の生成が約15分未満で最大に達する、工程
を含む、試料中の核酸の存在および/または量を決定するアッセイ方法。 - (a)請求項1に記載の化合物、および
(b)緩衝液
を含む、試料中の分析物の存在および/または量を検出するためのキット。 - 以下の構造を有する化合物:
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;かつ
R3は、水素または電子供与基である。 - 以下の構造を有する化合物:
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;
R3は、水素または電子供与基であり;
R4およびR5は独立して、H、F、Cl、Br、I、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、1〜20個の炭素原子を含むアルコキシ、6〜14個の炭素原子を含むアリール、6〜14個の炭素原子を含むアリールオキシ、2〜21個の炭素原子を含むエステル、3〜30個の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、3〜30個の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、2〜21個の炭素原子を含むアルキルアミド、7〜15個の炭素原子を含むアリールアミド、2〜21個の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、7〜15個の炭素原子を含むアリールカルバモイル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、6〜14個の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、3〜60個の炭素原子を含むトリアルキルシリル、18〜42個の炭素原子を含むトリアリールシリル、7〜32個の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、6〜14個の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、1〜20個の炭素原子を含むアルキルスルホニル、6〜14個の炭素原子を含むアリールスルホニル、2〜20個の炭素原子を含むアルキルチオおよび6〜14個の炭素原子を含むアリールチオからなる群より選択され;かつ
Xは、硫黄原子、酸素原子、または窒素原子である。 - 以下の構造を有する化合物:
式中、
AおよびBは独立して、1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、2〜20個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルキル、3〜20個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロアルケニル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3〜20個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4〜60個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の1つは、置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、AおよびBが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または1つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく;
R1は、1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜20個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい3〜20個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり;
R2は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり;かつ
R3は、水素または電子供与基である。
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