DE2649902C3

DE2649902C3 - Autoradiografisches Verfahren zur Bestimmung physiologischer Veränderungen in Geweben

Info

Publication number: DE2649902C3
Application number: DE2649902A
Authority: DE
Inventors: Brian G.M. Durie; Sydney E. Salmon
Original assignee: University Patents Inc Stamford Conn (vsta)
Current assignee: University Patents Inc Stamford Conn (vsta)
Priority date: 1975-10-30
Filing date: 1976-10-29
Publication date: 1979-08-23
Also published as: FR2347687A1; FR2347687B3; US4035155A; DE2649902B2; GB1519268A; DE2649902A1

Description

Die Erfindung betrifft ein autoradiografisches Verfahren zur Bestimmung physiologischer Veränderungen in Geweben durch Herstellen einer Suspension lebender Zellen des Gewebes, Inkubation der Zellen mit einem 4> ein Radioisotop als Strukturatom enthaltenden Zellenbestandteil aus der Gruppe der Nukleinsäuren, Enzyme, Proteine und Hormone, Aufbringen der markierten Zellen auf die Oberfläche eines Objektträgers und Beschichten des Objektträgers mit einer Silberhaloge- « nid-Emulsion, so daß das Silberhalogenid den Emissionen aus dem Radioisotop exponiert wird, Entwicklung des Objektträgers zur Bildung von Silberkristallen und Bestimmen der relativen Anzahl von Silberkristallen als Maß der Radioaktivität der Zellen. v>

Die Autoradiografie ist eine Arbeitsweise, um in lebenden Zellen die Bewegung oder den Ort eines mit einem radioaktiven Isotop markierten Bestandteiles oder Baublockes einer Verbindung, welcher für das Leben und die Funktion der Zelle wesentlich ist, wie w) DNA, RNA oder eines Enzyms, zu verfolgen. Der mit dem radioaktiven Isotop markierte Bestandteil oder Baublock wird während der üblichen Funktion der Zeile in einen wesentlichen Zellenbestandteil wie RNA, DNA oder ein Enzym eingebaut. Die Einbaugeschwindigkeit b^r> des markierten Baublockes oder Bestandteiles in c.ie Zelle ist ein Maß der Aktivität dieser Zelle, welches eine w'cFiVöiic, piiySiOiOgiSCiic, ιϋΓ vjiC ιί

l»l t πιρλ^π

chung und die Medizin wertvolle Information liefert

Zu den wichtigen Zellbestandteilen, die in dieser Weise verfolgt werden können, gehören DNA und RNA. Die Geschwindigkeit der Bildung von DNA oder RNA in einer lebenden Zelle ist ein Maß der physiologischen Aktivität dieser Zelle und liefert Daten, die anzeigen können, ob diese Zelle normal oder abnormal ist Beispielsweise besitzen Zellen von malignen Geweben abnormale Wachstumskinetik und können einen gestörten DNA- und/oder RNA-Umsatz haben. Durch Messung der Bildung von DNA oder RNA über einen mit einem radioaktiven Isotop markierten Bestandteil von DNA oder RNA wie tritiiertes Thymidin oder tritiiertes Uridin ist es möglich, die Aktivität der Zelle zu bestimmen und auf diese Weise brauchbare Informationen zu erhalten, welche die Feststellung ermöglichen, ob die Zelle maligne oder normal ist und, falls es eine maligne Zelle ist, ob sie auf eine chemotherapeutische Behandlung anspricht

Die Autoradiografie ermöglicht einem Physiologen beispielsweise die Feststellung, welche Zellen eines Gewebes DNA oder RNA mit normaler oder großer Geschwindigkeit synthetisieren, und wieviel von diesen Materialien pro Zelle produziert wird. Aus solchen Daten ist die Bestimmung möglich, ob das die Zelle enthaltende, untersuchte Gewebe auf eine Chemotherapie, welche ctas Zellenwachstum stört, anspricht.

Bei der praktischen Durchführung der Autoradiografie werden die untersuchten Gewebe bis zu einer Suspension von lebenden Zellen aufgebrochen bzw. zerkleinert. Die untersuchte Suspension der Zellen wird mit dem tritüerten Isotop wie tritiiertem Thymidin oder tritiiertem Uridin inkubiert. Die Synthese von DNA oder RNA durch solche Zellen kann in Werten der Geschwindigkeit und der Menge des eingebauten Isotops bestimmt werden. Die DNA oder RNA, welche das radioaktive Thymidin oder Uridin enthalten, werden auf diese Weise mit einem radioaktiven Isotop (Tritium) markiert und können über normale, physiologische Prozesse mittels Arbeitsweisen des radioaktiven Nachweises verfolgt oder nachgewiesen werden. Durch solche Arbeitsweisen ist es möglich, genaue Daten hinsichtlich der Produktion von DNA oder RNA durch die untersuchten Zellen zu erhalten. Dieselben Arbeitsweisen können bei der Untersuchung der Kinetik von anderen Zellbestandteilen angewandt werden. So ist aus Cancer Research, Vol. 34, Juni 1974, S. 1376-1380 die In-Vitro-Bestimmung des Thymidin-^3H-Markierungsindex in festen Tumoren bei Menschen beschrieben, wobei jedoch nur eine spezifische Aktivität von 6,0 Ci/mMol eingesetzt wurde, so daß die Autoradiografien erst 24 Stunden nach Entnehmen der Probe entwickelt und ausgewertet werden konnten. Weiterhin ist es aus der Monografie »Autoradiographie« von H. A. Fischer und G. Werner, Berlin (1971), S. 26-28 bekannt, die Exposition des Silberhalogenids mit dem Radioisotop in Gegenwart eines flüssigen Szintillator vorzunehmen. Diese Anwendung von flüssigen Szintillatoren bezieht sich jedoch auf die Autoradiografie von Papieren, z. B. zum Nachweis markierter Substanzen in trockenem Chromatogramm- und Elektrophoresepapier.

Aufgabe der Erfindung ist dagegen ein hochempfindliches Autoradiografieverfahren, welches es dem Physiologen erlaubt, Daten über das Wachstum oder die Produktion von DNA oder anderen, lebenswichtigen, physiologischen Bestandteilen von lebenden Zellen wie

Untersu RNA und Hormonen odsr Enzymen in einer sehr vie!

kürzeren Zeitspanne zu erhalten, als dies bislang möglich war.

Zur Lösung dieser Aufgabe dient das erfindungsgemäße Verfahren der zuvor beschriebenen Art, welches sich dadurch auszeichnet, daß der radioaktive Zellenbestandteil eine spezifische Aktivität von wenigstens 40 Ci/mMol besitzt,

die Silberhalogenid-Emulsion mit einem flüssigen Szintillator imprägniert wird, und
das Silberhalogenid dem radioaktiven Zellenbestandteil bei einer Temperatur von nicht über -20" C exponiert wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Autoradiografieverfahren werden z. B. tritiiertes Thymidin mit hoher spezifischer Aktivität (40 bis 60 Ci/mMol) und eine Kernspuremulsion, imprägniert mit einem flüssigen Szintillator, verwendet, um eine sehr rasche Methode zur Bestimmung des Markierungsindex und der Wachstumsfraktion von Zellsuspensionen zu erhalten. Die Exposition der Emulsion bei niedrigen Temperaturen (-20°C bis -85°C) für 20—60 Minuten ist für ein ausgezeichnetes Markieren ausreichend, so daß die Durchführung einer raschen, klinischen Entscheidung möglich wird. Expositionszeiten für Forschungsarbeiten, welche ein Markieren mit sehr niedriger Energie erfordern, können beträchtlich abgekürzt werden, z. B. von sechs Monaten auf zwei Wochen oder weniger. Diese Arbeitsweise besitzt daher eine große Anwendbarkeit in der Biologie und der Medizin.

Durch diese rasche Technik ist es möglich, einen Patienten zu untersuchen, die Rate der Zellfunktion in einem spezifischen Gewebe zu bestimmen und eine chemotherapeutische Behandlung zu empfehlen, wobei dies alles am gleichen Tag geschehen kann. Dies ist besonders wichtig bei Patienten, die an malignen Tumoren leiden.

Erfindungsgemäß ist z. B. eine ausgezeichnete Markierung mit Tritiumverbindungen in einer Stunde oder weniger zu erhalten, so daß eine rasche klinische Bestimmung und Entscheidung über die Therapie möglich wird. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt damit eine breite Anwendbarkeit in der Biologie und Medizin.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand der Zeichnung näher erläutert Die F i g. 1 und 2 sind Diagramme, welche die Aktivität von mittels Hochempfindlichkeitsautoradiografie (HSARG)gemäß der Erfindung untersuchten Zellen im Vergleich zu der Aktivität von Zellen bei der konventionellen Autoradiografie (ARG) erläutern. Die Prozentsätze der markierten Zellen, welche die Ablagerung von Silberkörnern hervorrufen, sind gegen die Expositionszeiten in jedem Diagramm aufgetragen. Hieraus ist ersichtlich, daß bei der erfindungsgemäßen HSARG brauchbare Daten sehr viel rascher als bei der ARG gemäß Stand der Technik erhalten werden.

Bei der konventionellen Autoradiografie zur Bestimmung des Markierungsindex und der Wachstumsfraktion sind wenigstens sechs Tage bis zum Abschluß erforderlich. Durch Verwendung von tritiiertem Thymidin von hoher spezifischer Aktivität (40—60 Ci/mMol), eines flüssigen Szintillators und einer Emulsionsexposition bei niedriger Temperatur (-20⁰C bis -85°C) wurde ein Verfahren zur Szintiallationsautoradiografie höchster Empfindlichkeit entwickelt. Unter Anwendung dieser Techniken können Proben von frischem Blut, Knochenmark und Tumorzellen verarbeitet werden, um Hie Ergebnisse einer Thvmidinmarkierune innerhalb von fünf Stunden zu liefern.

Die Aktivierung von Silberkristallen in der fotografischen Emulsion, welche bei der Autoradiografie verwendet wird, hängt von der Anzahl und der Energie der die Emulsion durchdringenden ^-Strahlen ab. Bei der üblichen ARG ist das Ausmaß der ^-Emission relativ niedrig. Mit einem Isotop von sehr hoher spezifischer Aktivität wie dem bei der Erfindung verwendeten, tritiierten Thymidin, gibt es jedoch sehr viel mehr

ίο ß-Emissionen pro Molekül des eingebauten Isotops. Wenn die Emulsion zusätzlich mit einem Szintillator imprägniert wird, werden Photonen freigesetzt, wenn die Elektronen (^-Teilchen) durch den Szintillator durchtreten, und hierdurch werden noch mehr Silberkristalle in der Emulsion aktiviert Eine erhöhte Empfindlichkeit ist von einer geringen Zunahme der Streuung der Emissionen begleitet In der Praxis ist diese Streuung jedoch minimal und beeinträchtigt die Interpretation der Daten nicht negativ.

Mit Heparin versetzte Zellsuspensionen werden für eine Stunde mit tritiiertem Thymidin hoher spezifischer Aktivität inkubiert Vorzugsweise werden 5,0 μΟί/εαη zu Zellsuspensionen mit 0,5—1,0 χ 10⁶ Zellen/ccm zugesetzt. Dann wurden Cytozentrifugenschmierpräpa-

2> rate auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern hergestellt und mit Methanol fixiert. In der Dunkelkammer werden die Objektträger bzw. Präparate zuerst für zehn Sekunden in einer Kernspuremulsion (NTB 3, Eastman Kodak Co.) bei 42° C eingetaucht Nach dem

«ι Trocknen für annähernd 1 Stunde werden die Objektträger als nächstes für zehn Sekunden in die Szintillatorlösung eingetaucht Die bevorzugte Szintillatorlösung umfaßt eine Kombination von 2,5-Diphenyloxazol 0,5 μα/ccm (PPO) und l,4-Bis-(4-methyl-5-phe-

r> nyloxyzol-2-yl)-benzol (Dimethyl-POPOP), aufgelöst in Dioxan. Die mit dem Szintillator imprägnierte Emulsion wird in der Dunkelheit für 20 bis 60 Minuten belichtet. Die Objektträger werden dann bei 17° C in üblicher Weise entwickelt. Die Schmierfilme der zentrifugierten Zellen werden direkt durch die Emulsion mit gepufferten Giemsa-Farblösungen angefärbt

Die verschiedenen Stufen bei der eventuell erfolgreichen Arbeitsweise wurden getrennt untersucht und analysiert. Lymphocyten, die in vitro mit Phytohae-

j> magglutinin stimuliert waren, wurden als zuverlässige Quelle für hochmarkierte Zellen verwendet.

Unter Verwendung von tritiiertem Thymidin hoher spezifischer Aktivität wurden mehrfach Experimente unter Exposition der Objektträger für 1 bis 24 Stunden

->o mit und ohne Überziehen mit der Szintillatorlösung durchgeführt Die F i g. 1 zeigt den Einfluß des Szintillators. Beinahe eine maximale Markierung wurde in 5 Stunden erreicht, und in nur einer Stunde wurden nahezu 75% der Endmarkierung erreicht Doppelte und

T> dreifache Proben zeigten übereinstimmend ein rascheres Markieren mit der Szintillatorlösung (P<0,05 für Zeitpunkte bei 1 und 5 Stunden). Bei zusatzlichen Untersuchungen wurden die Emulsionsexposition auf sechs Tage verlängert, und die Endmarkierung wurde

to mit der Markierung bei Anwendung von tritiiertem Thymidin geringerer spezifischer Aktivität (2 Ci/mMol) verglichen. Die Endmarkierung wurde gegebenenfalls bei der gleichen Anzahl von Zellen nachgewiesen, welche beträchtlich früher unter Verwendung der

μ schnellen Arbeitsweise identifiziert wurden. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach der Inkubation mit dem Isotop untersucht, wobei gefunden wurde, daß sie wesentlich erößer als 95% war.

Die Anzahl der Körner/Zelle wurde durch die Verwendung des Szintillator stark erhöht. Bei der Hochempfindlichkeitsautoradiografie hatten 50% der Zeilen mehr als 15 K.cnier pro Keim in fünf Stunden. Die I in'ergrundmarkieriing war bemerkenswert niedrig, ^c,eibst bei LxpoMuonszeiten von sechs Tagen. Kür Zeitpunkte bis zu 24 Stunden betrug die mittlere Anzahl der Untergrundkörner 38 Körner pro 100 Zellen mit einem Maximum von 65 Körnern pro Hundert Zellen. Aus dem Wahrscheinlichkeitsgesetz von Poisson ergibt sich nur eine 0,05°/uige Wahrscheinlichkeit, daß der Untergrund für mehr als 4 Körner pro Zelle verantwortlich sein könnte. Daher wurden fünf oder mehr Körner pro Zelle als definitive Markierung bei dieser Arbeitsweise angesehen.

Es ist bekannt, daß die Temperatur die Fluorogralie bei der Dünnschichtchromatografie mit Tritiumverbindungen beträchtlich beeinflußt. Es wurde hierfür angenommen, daß die Möglichkeit der Schwingung von Molekülen bei niedrigen Temperaturen »eingefroren wird« und daher Energie in die Photonenemission geht, die sonst durch die statistische Bewegung verloren ginge. Es wurde der Einfluß der Temperatur auf die Hochempfindlichkeitsautoradiografie untersucht. Temperaturen zwischen 17° C und —196° C wurden angewandt. Ein frühes Markieren wurde deutlich gefördert, wenn die Exposition der Emulsion bei niedrigen Temperaturen zwischen —20° C bis —85° C ermöglicht wurde. Ein weiteres Abkühlen ergab eine unter dem Optimalwert liegende Markierung und führte zusätzlich zu einer Neigung zur Rißbildung der Emulsion. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IA angegeben. Bei 0,5 nCi/ccm waren -85°C die optimale Temperatur für das Markieren.

Der Einfluß von Szintillator und Temperatur sind bei geringen Werten des Isotopeneinbaues und der ^-Emission am stärksten ausgeprägt. Durch Erhöhung der Dosis von mit der Zellsuspension in vitro inkubiertem, tritiiertem Thymidin auf 5— ΙΟμΟ/ccm konnte ein rasches, maximales Markieren in einfacher Weise erreicht werden. Die Ergebnisse der Dosisversuche sind in den Tabellen IB und II zusammengestellt. Mit 5— 10μΟ/α:ηίΐ konnte ein maximales Markieren in 20 bis 60 Minuten durchgeführt werden. Der Wert von gezählten Körnern/Zelle stieg auch noch nach dieser Zeit an, jedoch ergab sich nur eine vernachlässigbare Zunahme der Anzahl von Zellen, welche signifikant markiert wurden (mehr als 5 Körner/Zelle), selbst wenn die Exposition der Emulsion auf sechs Tage ausgedehnt wurde. Die Untergrundmarkierung blieb niedrig.

Da einer der Hauptgründe zur Entwicklung dieser Technik darin lag, sie bei der klinischen Untersuchung von Patienten anzuwenden, wurden Proben einer Reihe von Patienten mit Leukämien, Myelomen und malignen Effusionen genommen. Die Hochempfindlichkeitsauto- radiografie mit 0,5—10 μ(3/αη wurde mit der Autoradiografie Co ons et aL, Cancer 19 [1966], S. 1200—1204) verglichen. Die Ergebnisse waren hinsichtlich des Prozentsatzes an markierten Zellen vollständig vergleichbar. Für eine Analyse von Doppelproben für jede Methode ergab sich eine zweifache Differenz im Markierungsindex als statistisch signifikant (P<O,0S). Von 52 Beobachtungen bei 40 Patienten hatten die Ergebnisse der Hochempfmdlichkeitsautoradiografie unter Standardautoradiografie ein mittleres Verhältnis von 1,4 und waren daher statistisch nicht verschieden. Bei der Anwendung der Hochempfmdlichkeitsautoradiografie lag der mittlere Markierungsindex für elf nicht behandelte Patienten mit Myelom bei 4% und für acht Pauente^ mit Remission bei 16%. Diese Daten warei vollständig mit früheren Daten vergleichbar, welche mittels Standardautoradiografie bei Patienten mit -, multiplen-, Myelom erhalten worden waren.

Die zur Durchführung der Standardnutoradiografie erforderliche Zeit schränkte zahlreiche klinische Anwendungen und Forschungsanwendungen ein. Gemäß der Erfindung sind sehr kurze Expositionszeiten

Ij möglich, so daß die Anwendung der Autoradiografie erleichtert wird. Dies ist ein wesentlicher Fortschritt gegenüber neueren Modifikationen der Standardautoradiografie einschließlich der Verwendung von tritiiertem Thymidin (spezifische Aktivität von 6 Ci/mMol. die

υ Ergebnisse in 24 bis 48 Stunden ergibt) und der Verwendung eines Szintillator zusammen mit tritiiertem Thymidin von niedriger, spezifischer Aktivität.

Für geringe Werte der ^-Emission von eingebautem, tritiiertem Thymidin verstärkt das Beschichten der fotografischen Emulsion mit einem Szintillator eine früher Markierung sehr stark. Dieser Effekt kann noch weiter verbessert werden, indem die Emulsion bei niedrigen Temperaturen belichtet wird, wobei —85° C bei dem erfindungsgemäßen Verfahren optimal ist

2) (Tabelle IA). Die Methode sollte am brauchbarsten in den Fällen erweisen, in denen geringe Werte der Isotopenaufnahme bislang verlängerte Expositionszeiten (z. B. 6 bis 8 Monate) erforderten. Es wurde nun gefunden, daß das erfindungsgemäße Verfahren bei

«ι solchen Untersuchungsmethoden Ergebnisse in zwei bis drei Wochen möglich macht Weiterhin gibt es potentielle Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Elektronenmikroskopie, der Dünnschichtchromatografie und der Papierchromatografie.

π Eine sehr wichtige Abänderung der Erfindung liegt in der Erhöhung der spezifischen Aktivität von tritiiertem Thymidin auf etwa 40—60 Ci/mMol/ccm an inkubierten Zellen, so daß eine maximale Zellmarkierung sehr rasch erreicht werden kann.

4(1 Mit Emulsionsbelichtungszeiten von nur 20—60 Minuten bei 5 — 10μο/α:ι·η werden Markierungsprozentsätze nahe bei den Maximalwerten erreicht. Auf diese Weise ist es möglich, den Markierungsindex (LI %) oder die Wachstumsfraktion innerhalb von 4—5

4i Stunden nach Erhalt einer klinischen Probe zu berechnen. Die relative Markierungsintensität oder die Kornzahl als Funktion der Zeit kann ebenso signifikant wie die prozentuale Markierung sein. Weiterhin ist es möglich, die Markierungsgeschwindigkeit gemäß der

so Erfindung rasch zu bestimmen. In den Fällen, in denen eine in-vitro-Inkubation mit hohen Dosen an tritiiertem Thymidin hoher spezifischer Aktivität kombiniert mit der Anwendung des Szintillators und der Belichtung bei niedriger Temperatur (—85° C) möglich ist, können daher Daten für das Fällen einer raschen klinischen Entscheidung verfügbar gemacht werden. Die Kenntnis des Markierungsindex ist von beträchtlichem, klinischen Interesse, z. B. im Hinblick auf die Wahrscheinlichkeit des Ansprechens gegenüber einer Chemotherapie bei der akuten Leukämie wie auch als Kennzeichen für das Ansprechen bei Patienten mit festen Tumoren. Ein Hauptvorteil dieser Autoradiografiemethode gegenüber anderen Mitteln zur raschen Zellzyklusanalyse ist die Fähigkeit, gemischte Zellpopulationen sorgfältig zu analysieren. Durch das Anfärben nach G i e m s a und gegebenenfalls nach anderen speziellen Anfärbemethoden kann die Zellmarkierung mit der konventionellen Morphologie in Beziehung gesetzt werden, unc

Mehrfachzellpopulationen können in einer vorgegebenen Probe uniersucht wc.·den Der bei dem ufindungsgemäßen Verfahren beobachtete, extrem geringe Untergrund scheint mit der erforderlichen, extrem kurzen Belichtungszeit oder Eypositionszeit in Bezie- > hung zu stehen, da dies die Exposition gegenüber der äußeren Bestrahlung durch die Umwelt, welche für den Untergrund verantwortlich ist, wesentlich herabsetzt.

Die beschriebenen Methoden stellen einen wesentlichen Fortschritt hinsichtlich der Empfindlichkeit oder m Geschwindigkeit, mit der die Ergebnisse bei der Autoradiografie verfügbar sind, dar. Sowohl für Forschungsanwendungen, welche häufig durch die extrem niedrigen Aufnahmeraten des Isotops beschränkt sind, wie auch für die Gewinnung von in-vitro-Indices für die Fällung von klinischen Entscheidungen liefert das erfindungsgemäße Verfahren daher eine zuverlässige Arbeitsweise, welche in der Biologie und der Medizin breite Anwendung finden kann.

Tabelle I

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Einfluß der Temperatur auf die Markierungsgeschwindigkeit bei zwei verschiedenen Konzentrationen von tritiiertem Thymidin. Die Versuche A wurden bei einer Dosis von 0,5 μΟί/οείη und einer spezifischen Aktivität von 40—60 Ci/mMol durchgeführt. Die Versuche B wurden bei einer Dosis von 10 μο/οαη und der gleichen spezifischen Aktivität durchgeführt. Die Ergebnisse sind ais Prozentsatz an markierten Zeiien (Markierungsindex) angegeben. jo

	17 C	B	-SS'-C	B
	A	29	A	22
20 Minuten	3	31	10	37
1 Stunde	4,2	30	11	35
5 Stunden	11	35	19	37
24 Stunden	25	Tabeliell	27

Einfluß der Dosis von tritiiertem Thymidin auf die Markierungsgeschwindigkeit, spezifische Aktivität = 40—60 Ci/mMol. Ergebnisse angegeben als Markierungsindex (°/o).

	\|xCi/ccm Zellen	2,0	5.0	10,0	50.0	100,0
	0,5	21	26	29	22	25
20 Minuten	6	28	30	31	20	23
1 Stunde	21	44	37	30	34	30
5 Stunden	31	39	36	30	36	29
24 Stunden	35	-	36	35	34	32
6 Tage	33

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Im folgenden werden noch Einzelheiten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angegeben.

!.Materialien

1. Fotografische Emulsion: Kernspuremulsion NTB3 (Kodak)

2. Szintillationsflüssigkeit: 5 g PPO + 100 mg Dimethyl-POPOP, aufgelöst in 500 ml Dioxan.

3. Polyoxyäthyiensorbitanmonooleat (Tween 80, P1754) wurde als Emulgator für die fotografische Emulsion verwendet

4. Tntiiertes Thymidin mit hoher spezifischer Aktivität, 40—60 Ci/mMol (New England Nuclear NET-O27Z).

5. Fotografische Fixierlösung (Eastman Kodak, Catalog Nr. 1971746).

6. Entwickler (Eastman Kodak D19).

7. Giemsa-Blutfärbelösung mit Zitronensäurepuffer (Fisher Scientific Company, G-146,734319).

8. Die übrige erforderliche Ausrüstung umfaßt einen Ofen und ein Wasserbad, das auF 42°C eingestellt werden kann, eine Dunkelkammer, eine Zellenzentrifuge (Shandon), standardmäßige Objektträger, ein Wasserbad von 17° C, Objektträgerbehälter und die üblichen Laborlösungen.

II. Methoden

1. Für Knochenmarkproben

Es wurden 2 ecm Knochenmark in eine 0,2 ml 1/1000 Heparinlösung (ohne Konservierungsstoff) enthaltende Spritze aufgesaugt. Die Markprobe wurde mit dem Heparin gut vermischt. Die Markprobe wurde in ein Kulturröhrchen überführt und, es wurden etwa 3 ecm Hanks-Lösung + 2 ecm 3%ige Dextranlösung zugesetzt. Mit einer 10-ml-Pipette wurde das Mark durchgearbeitet. Bei 37° C wurde bei 1 g während 2 Stunden absetzen gelassen. Die roten Zellen und Granulocyten sedimentierten sich auf dem Boden. Die restlichen weißen Zeilen und das überstehende Piasma wurden abgenommen.

2. Die abpipettierten Zellen und daS Plasma oder zuvor hergestellte Zellsuspension wurden entnommen und bei 1200 Upm zentrifugiert Das Zellkügelchen wurde erneut suspendiert und auf 10 ecm mit Hanks-Lösung aufgefüllt

3. Es wurde die Anzahl der Zellen in der Lösung mit einem standardmäßigen Coulter-Zähler ausgezählt ES wurde bei einer Konzentration von 0,5—1,0 χ 10*Zellen/ccm resuspendiert

4. Es wurden 2 ecm der Suspension in ein getrenntes Röhrchen pipettiert Es wurden 5,0 μΟΛχίη an tritiiertem Thymidin zugesetzt Die Inkubation wurde für 1 Stunde bei 37° C durchgeführt Es wurde zweimal zentrifugiert und gewaschen und erneut zu 0,5—1 Million pro ecm resuspendiert

5. Es wurden Cytozentrifugenpräparate hergestellt. Für jedes Präparat wurden 3 Tropfen der präparierten Zellsuspension + 1 Tropfen der Hanks-Lösung zugesetzt. Es wurde die erforderliche Anzahl von Präparaten in der Cytozentrifuge hergestellt Die Präparate bzw. Objektträger wurden getrocknet (an Luft).

Autoradiografie

I. Herstellung der Reagenzien
und der Ausrüstung (in der Dunkelkammer)

1. Der Ofen und das Wasserbad wurden auf 42° C eingestellt

2. Es wurde die Kernspurenemulsion NTB 3 mit dem gleichen Volumen an destilliertem Wasser vermischt Es wurden 1,0 ml der Emulgatorlösung (Tween 80) hinzugegeben. Die Mischung wurde für wenigstens 1 Stunde in dem Ofen von 42° C inkubiert 30 ml der Mischung wurden in einen Kunststoffbehälter gegossen. Der Behälter wurde in dem Wasserbad von 42° C verwendungsbereit gehalten.

3. Die Objektträger bzw. Präparate wurden auf dem Wasserbad erwärmt.

4. Szintillationsflüssigkeit: 5 g PPO + 100 mg Dimethyl-POPOP wurden in 500 ml Dioxan vermischt. Sie wurden in einer dunklen Flasche gelagert.

Arbeitsweise

1. Die Lichter in der Dunkelkammer wurden ausgeschaltet.

2. Nachdem die Kemspuremulsionslösung (NTB 3-Lösung) fertig war, wurde jeder Objektträger, jeweils einer zu einem Zeitpunkt, in diese Lösung für 10 Sekunden eingetaucht. Jeder Objektträger wurde zum Abtropfen aufgestellt und in eine Trockenkammer überführt.

3. Die Kernspuremulsionslösung (NTB 3-Lösung) wurde zurück in die Lagerflasche gegossen und in der Kälte aufbewahrt.

4. Die Objektträger bzw. Präparate wurden für wenigstens 1 Stunde trocknen gelassen.

5. Dann wurden die Objektträger nacheinander in die Szintillationsflüssigkeit für 10 Sekunden eingetaucht Die Objektträger wurden in einem Objektträgerbehälter aufbewahrt und trocknen gelassen. Die Objektträger wurden bei Zimmertemperatur in der Dunkelheit bei 20—60 Minuten oder länger, je nach Erfordernissen, aufbewahrt.

6. Nach der Expositionszeit wurden die Objektträger bzw. Präparate entwickelt und fixiert.

Entwicklung und Fixierung
Lösungen

1. Es wurden 450 ml destilliertes Wasser in einem 500-ml-Becherglas auf eine Heizplatte auf 45 bis 50⁰C erwärmt Das destillierte Wasser wurde in die dunkelgefärbte Flasche eingeschüttet und das Volumen auf 500 ml mit kaltem destilliertem Wasser gebracht, bis die Temperatur 37° C betrug (soll nicht variieren). Dann wurden 78,5 g Entwickler (Kodak D19) hinzugegeben und gut gerührt Diese' Lösung wurde für 0,5 Stunden in einen Kühlschrank eingesetzt Dann wurde sie in einem Wasserbad von 17° C in der Dunkelkammer angeordnet

2. Es wurden 92 g Fixiersalz (Kodak) in 350 ml destilliertem Wasser aufgelöst und dann auf 494 ml aufgefüllt Es wurde für etwa 03 Stunden gerührt und dann in der Dunkelkammer aufbewahrt. Für 0,5

Stunde wurde gekühlt, um die Temperatur auf 17°C zu erniedrigen, dann wurde die Lösung in einem Wasserbad in der Dunkelkammer angeordnet.

Arbeitsweise

Nach der Abdunklurg wurden die erforderlichen Volumina an Entwicklerlösung und Fixierbad in getrennte Schalen gegossen. Jedes Präparat bzw. jeder Objektträger wurde in dem Entwickler für 3 Minuten eingesetzt, dann in destilliertem Wasser für 10 Sekunden abgewaschen. Es wurde in die Fixierbadschale für J Minuten überführt, dann wurde jeder Objektträger in das Wasserbad von 17⁰C überführt, wo sie für 15 Minuten aufbewahrt werden sollen. Die Objektträger wurden aus diesem Wasserbad entfernt und an der Luft trocknen gelassen. Während dieser Zeit kann bei Licht gearbeitet werden.

Färben
1. Herstellung der Färbelösung

Es wurden 0,5 g Giemsa-Blutfarbstoff in 42 ml Glyzerin bei 55—60°C aufgelöst, 42 ml Methanol wurden zugesetzt und 48 Stunden für ein vollständiges Auflösen stehengelassen. Es wurde filtriert und auf diese Weise die Ausgangslösung erhalten. Die Färbelösung wurde in folgender Weise hergestellt: 75 ml Zitronensäure (0,1 M), Puffer pH = 5,75; 5,4 ml Methanol; 4,5 ml filtrierte Ausgangslösung.

Die Färbelösung wurde in der ersten Anfärbschale (Fassungsvermögen 100 ml) angeordnet.

2. Herstellung der Zitronensäure (0,1 M)-puffer

a) Für die zweite Färbelösungsschale, pH = 5,75; 119,2 ml 0,2 M Na₂HPO₄, 80,8 ml 0,1 M Zitronensäure, der pH-Wert muß überprüft werden.

b) Für die dritte Färbebadschale, pH = 5,40; 111,5 ml 0,2 M Na₂HPO₄; 88,5 ml 0,1 M Zitronensäure; der pH-Wert muß überprüft werden.

3. Anfärben

Jeder Objektträger bzw. jedes Präparat wurde in die Giemsa-Blutfärbelösung für 12 Minuten eingebracht, dann in Puffer Nr. 1, der auf pH = 5,75 eingestellt ist, für 30 Sekunden überführt, dann in Puffer Nr. 2, der auf pH = 5,4 eingestellt ist, für 30 Sekunden überführt, und dann wird der Objektträger bzw. das Präparat an der Luft trocknen gelassen.

Die Präparate bzw. Objektträger sind dann fertig, um in einem Deckglas versehen und ausgezählt zu werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Autoradiografisches Verfahren zur Bestimmung physiologischer Veränderungen in Geweben durch Herstellen einer Suspension lebender Zellen des Gewebes, Inkubation der Zeilen mit einem ein Radioisotop als Strukturatom enthaltenden Zellenbestandteil aus der Gruppe der Nukleinsäuren, Enzyme, Proteine und Hormone, Aufbringen der ι ο markierten Zellen auf die Oberfläche eines Objektträgers und Beschichten des Objektträgers mit einer Silberhalogenid-Emulsion, so daß das Silberhalogenid den Emissionen aus dem Radioisotop exponiert wird. Entwicklung des Objektträgers zur Bildung von Silberkristallen und Bestimmen der relativen Anzahl von Silberkristallen als Muß der Radioaktivität der Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß der radioaktive Zellenbestandteil eine spezifische Aktivität von wenigstens 40 Ci/mMol besitzt, die Silberhalogenid-Emulsion mit einem flüssigen Szintillator imprägniert wird, und

das Silberhalogenid dem radioaktiven Zellenbestandteil bei einer Temperatur von nicht über - 20° C exponiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Radioisotop Tritium ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure Ribonukleinsäure (RNA) oder Deoxyribonukleinsäure (DNA) ist. jo

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Szintillator eine Kombination von 2,5-DiphenyIoxazol (PPO) und l,4-Bis-(4-methyl-5-phenyloxazol-2-yl)-benzol (Dimethyl-POPOP) ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn- r> zeichnet, daß die radioaktive Nukleinsäurekomponente tritiiertesThymidin oder tritiiertes Uridin ist.