DE2649902B2 - Autoradiografisches Verfahren zur Bestimmung physiologischer Veränderungen in Geweben - Google Patents
Autoradiografisches Verfahren zur Bestimmung physiologischer Veränderungen in GewebenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein autoradiografisches Verfahren zur Bestimmung physiologischer Veränderungen in
Geweben durch Herstellen einer Suspension lebender Zellen des Gewebes, Inkubation der Zellen mit einem
ein Radioisotop als Strukturatom enthaltenden Zellenbestandteil aus der Gruppe der Nukleinsäuren, Enzyme,
Proteine und Hormone, Aufbringen der markierten Zellen auf die Oberfläche eines Objektträgers und
Beschichten des Objektträgers mit einer Silberhalogenid-Emulsion,
so daß das Silberhalogenid den Emissionen aus dem Radioisotop exponiert wird, Entwicklung
des Objektträgers zur Bildung von Silberkristallen und Bestimmen der relativen Anzahl von Silberkristallen als
Maß der Radioaktivität der Zellen.
Die Autoradiografie ist eine Arbeitsweise, um in lebenden Zellen die Bewegung oder den Ort eines mit
einem radioaktiven Isotop markierten Bestandteiles oder Baublockes einer Verbindung, welcher für das
Leben und die Funktion der Zelle wesentlich ist, wie DNA, RNA oder eines Enzyms, zu verfolgen. Der mit
dem radioaktiven Isotop markierte Bestandteil oder Baublock wird während der üblichen Funktion der Zelle
in einen wesentlichen Zellenbestandteil wie RNA, DNA oder ein Enzym eingebaut. Die Einbaugeschwindigkeit
des markierten Baublockes oder Bestandteiles in die Zelle ist ein Maß der Aktivität dieser Zelle, welches eine
wertvolle, physiologische, für die klinische Untersu
chung und die Medizin wertvolle Information liefert
Zu den wichtigen Zellbestandteilen, die in dieser Weise verfolgt werden können, gehören DNA und
RNA. Die Geschwindigkeit der Bildung von IDNA oder RNA in einer lebenden Zelle ist ein Maß der
physiologischen Aktivität dieser Zelle und liefert Daten, die anzeigen können, ob diese Zelle normal oder
abnormal ist Beispielsweise besitzen Zellen von malignen Geweben abnormale Wachstumskinetik und
ίο können einen gestörten DNA- und/oder RNA-Umsatz
haben. Durch Messung der Bildung von DNA oder RNA
über einen mit einem radioaktiven Isotop markierten Bestandteil von DNA oder RNA wie tritiiertes
Thymidin oder tritiiertes Uridin ist es möglich, die Aktivität der Zelle zu bestimmen und auf diese Weise
brauchbare Informationen zu erhalten, welche die Feststellung ermöglichen, ob die Zelle maligne oder
normal ist und, falls es eine maligne Zelle ist, ob sie auf
eine chemotherapeutische Behandlung anspricht
Die Autoradiografie ermöglicht einem Physiologen beispielsweise die Feststellung, welche Zellen eines
Gewebes DNA oder RNA mit normaler oder großer Geschwindigkeit synthetisieren, und wieviel von diesen
Materialien pro Zelle produziert wird. Aus solchen Daten ist die Bestimmung möglich, ob das die Zelle
enthaltende, untersuchte Gewebe auf eine Chemotherapie, welche das Zellenwachstum stört, anspricht
Bei der praktischen Durchführung der Autoradiografie werden die untersuchten Gewebe bis zu einer
jo Suspension von lebenden Zellen aufgebrochen bzw. zerkleinert Die untersuchte Suspension der Zellen wird
mit dem tritiierfvjn Isotop wie tritiiertem Thymidin oder
tritiiertem Uridin inkubiert Die Synthese von DNA oder RNA durch solche Zellen kann in Werten der
J5 Geschwindigkeit und der Menge des eingebauten
Isotops bestimmt werden. Die DNA oder RNA, weiche das radioaktive Thymidin oder Uridin enthalten, werden
auf diese Weise mit einem radioaktiven Isotop (Tritium) markiert und können über normale, physiologische
Prozesse mittels Arbeitsweisen des radioaktiven Nachweises verfolgt oder nacngewiesen werden. Durch
solche Arbeitsweisen ist es möglich, genaue Daten hinsichtlich der Produktion von DNA oder RNA durch
die untersuchten Zellen zu erhalten. Dieselben Arbeitsweisen können bei der Untersuchung der Kinetik von
anderen Zellbestandteilen angewandt werden. So ist aus Cancer Research, Vol. 34, Juni 1974, S. 1376-1380 die
fn-Vitro-Bestimmung des Thymidin-^-Markierungsindex
in festen Tumoren bei Menschen beschrieben,
so wobei jedoch nur eine spezifische Aktivität von 6,0 Ci/mMol eingesetzt wurde, so daß die Autoradiografien
erst 24 Stunden nach Entnehmen der Probe entwickelt und ausgewertet werden konnten. Weiterhin
ist es aus der Monografie »Autoradiographie« von H. A.
Fischer und G. Werner, Berlin (1971), S. 26-28
bekannt, die Exposition des Silberhalogenids mit dem Radioisotop in Gegenwart eines flüssigen Szintillator
vorzunehmen. Diese Anwendung von flüssigen Szintillatoren bezieht sich jedoch auf die Autoradiografie von
bo Papieren, z. B. zum Nachweis markierter Subsitanzen in
trockenem Chromatogramm- und Elektrophoresepapier.
Aufgabe der Erfindung ist dagegen ein hochempfindliches Autoradiografieverfahren, welches es dem Phy-
f>5 siologen erlaubt, Daten über das Wachstum oder die
Produktion von DNA oder anderen, lebenswichtigen, physiologischen; Bestandteilen von lebenden Zdlen wie
RNA und Hormonen oder Enzymen in einer sehr viel
kürzeren Zeitspanne zu erhalten, als dies bislang möglich war.
Zur Lösung dieser Aufgabe dient das erfindungsgemäße
Verfahren der zuvor beschriebenen Art, welches sich dadurch auszeichnet, daß der radioaktive Zellenbestandteil
eine spezifische Aktivität von wenigstens 40 Ci/mMoI besitzt,
die Silberhalogenid-Emulsion mit einem flüssigen Szintillator imprägniert wird, und
das Silberhalogenid dem radioaktiven Zellenbestandteil bei einer Temperatur von nicht über —20° C exponiert
wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Autoradiografieverfahren werden z. B. tritiiertes Thymidin mit hoher
spezifischer Aktivität (40 bis 60CiAnMoI) und eine
Kernspuremulsion, imprägniert mit einem flüssigen Szintillator, verwendet, um eine sehr rasche Methode
zur Bestimmung des Markierungsindex und der Wachstumsfraktion von Zellsuspensionen zu erhalten.
Die Exposition der Emulsion bei niedrigen Temperaturen (-200C bis -850C) für 20—60 Minuten ist für ein
ausgezeichnetes Markieren ausreichend, so daß die Durchführung einer raschen, klinischen Entscheidung
möglich wird. Expositionszeiten für Forschungsarbeiten, welche ein Markieren mit sehr niedriger Energie
erfordern, können beträchtlich abgekürzt werden, z. B. von sechs Monaten auf zwei Wochen oder weniger.
Diese Arbeitsweise besitzt daher eine große Anwendbarkeit in der Biologie und der Medizin.
Durch diese rasche Technik ist es möglich, einen j<
> Patienten zu untersuchen, die Rate der Zellfunktion in einem spezifischen Gewebe zu bestimmen und eine
chemotherapeutische Behandlung zu empfehlen, wobei dies alles am gleichen Tag geschehen kann. Dies ist
besonders wichtig bei Patienten, die an malignen Tumoren leiden.
Erfindungsgemäß ist z. B. eine ausgezeichnete Markierung mit Tritiumverbindungen in einer Stunde oder
weniger zu erhalten, so daß eine rasche klinische Bestimmung und Entscheidung über die Therapie -10
möglich V'rd. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt damit eine breite Anwendbarkeit in der Biologie und
Medizin.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand der Zeichnung näher erläutert. Die Fig. 1 und 2 sind j5
Diagramme, welche die Aktivität von mittels Hochempfindlichkeitsautoradiografie
(HSARG)gemäß der Erfindung untersuchten Zellen im Vergleich zu der Aktivität
von Zellen bei der konventionellen Autorariiograne (ARG) erläutern. Die Prozentsätze der markierten
Zellen, welche die Ablagerung von Silberkörnern hervorrufen, sind gegen die Expositionszeiten in jedem
Diagramm aufgetragen. Hieraus ist ersichtlich, daß bei der erfindungsgemäßen HSARG brauchbare Daten
sehr viel rascher als bei der ARG gemäß Stand der Technik erhalten werden.
Bei der konventionellen Autoradiografie zur Bestimmung des Markierungsindex und der Wachstumsfraktion
sind wenigstens sechs Tage bis zum Abschluß erforderlich. Durch Verwendung von tritiiertem Thymi- eo
din von hoher spezifischer Aktivität (40—60CiAnMoI),
eines flüssigen Szintillators und einer Emulsionsexposition bei niedriger Temperatur (-200C bis -85°C)
wurde ein Verfahren zur Szintiallationsautoradiografie höchster Empfindlichkeit entwickelt. Unter Anwendung
dieser Techniken können Proben von frischem Blut, Knochenmark und Tumorzellen verarbeitet werden, um
die Ergebnisse einer Thymidinmarkierung innerhalb von fünf Stunden zu liefern.
Die Aktivierung von Silberkristallen in der fotografischen Emulsion, welche bei der Autoradiografie
verwendet wird, hängt von der Anzahl und der Energie
der die Emulsion durchdringenden jJ-Slrahlen ab. Bei
der üblichen ARG ist das Ausmaß der ^-Emission relativ
niedrig. Mit einem Isotop von sehr hoher spezifischer Aktivität wie dem bei der Erfindung verwendeten,
tritiierten Thymidin, gibt es jedoch sehr viel mehr ^-Emissionen pro Molekül des eingebauten Isotops.
Wenn die Emulsion zusätzlich mit einein Szintillator imprägniert wird, werden Photonen freigesetzt, wenn
die Elektronen (^-Teilchen) durch den Szintillator durchtreten, und hierdurch werden noch mehr Silberkristalle
in der Emulsion aktiviert Eine erhöhte Empfindlichkeit ist von einer geringen Zunahme der Streuung
der Emissionen begleitet In der Pnuis ist diese Streuung jedoch minimal und beeinträchtigt die
Interpretation der Daten nicht negativ.
Mit Heparin versetzte Zellsuspensionen werden für eine Stunde mit tritiiertem Thym'/'n hoher spezifischer
A.ktivität inkübiert VOrZ1J0SWeISC f.vcrd£f! 5,0 ^iCi/ccm
zu Zellsuspensionen mit 0,5 — 1,0 χ 106 Zellen/ccm
zugesetzt Dann wurden Cytozentrifugenschmierpräpa· rate auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern
hergestellt und mit Methanol fixiert. In der Dunkelkammer werden die Objektträger bzw. Präparate zuerst für
zehn Sekunden in einer KernspuremuJsion (NTB 3, Eastman Kodak Co.) bei 420C eingetaucht Nach dem
Trocknen für annähernd t Stande werden die Objektträger als nächstes für zehn Sekunden in die
Szintillatorlösung eingetaucht. Die bevorzugte Szintillatorlösung umfaßt eine Kombination von 2,5-Diphenyloxazol
O^Ci/ccm (PPO) und l,4-Bis-(4-methyl-5-phenyloxyzol-2-yl)-benzol
(Dimethyl-POPOP), aufgelöst in Dioxan. Die mit dem Szintillator imprägnierte Emulsion
wird in der Dunkelheit für 20 bis 60 Minuten belichtet. Die Objektträger werden dann bei 17°C in üblicher
Weise entwickelt. Die Schmierfilme der re:ntr:fugierten
Zellen werden direkt durch die Emulsion mit gepufferten Giemsa-Farblösungen angefärbt.
Die verschiedenen Stufen bei der eventuell erfolgreichen Arbeitsweise wurden getrennt unversucht und
analysiert. Lymphocyten, die in v'tro mit Phytohaemagglutinin
stimuliert waren, wurden als zuverlässige Quelle für hochmarkierte Zellen verwendet.
Unter Verwendung von tritiiertem Thymidin hohe" spezifischer Aktivität wurden mehrfach Experimente
unter Exposition der Objektträger für 1 bis 24 Stunden mit und ohne Überziehen mit der Szinlillatorlösung
durchgeführt. Die Fig. 1 zeigt den Einfluß des Szintillators. Beinahe eine maximale Markierung wurde
in 5 Stunden erreicht, und in nur einer Stunde wurden nahezu 75% der Endmarkierung erreicht. Doppelte und
dreifache Proben zeigten übereinstimmend ein rascheres Markieren mit der Szintillatorlösun/ (P<ü,05 für
Zeitpunkte bei 1 und 5 Stunden). Bei zusätzlichen Untersuchungen wurden die Emulsionse>;position auf
sechs Tage verlängert, und die Endmarkierung wurde mit der Markie.ung bei Anwendung von tritiiertem
Thymidin geringerer spezifischer Aktivität (2 Ci/mMol) verglichen. Die Endmarkierung wurde gegebenenfalls
bei der gleichen Anzahl von Zellen nachgewiesen, welche beträchtlich früher unter Verv/endung der
schnellen Arbeitsweise identifiziert wurden. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach der Inkubation mit
dem Isotop untersucht, wobei gefunden wurde, daß sie wesentlich größer ais 95% war
Die Anzahl der Körner/Zelle wurde durch die Verwendung des Szintillator stark erhöht. Hei der
Mochempfindlichkeitsautoradiografie hatten 50% der Zellen mehr als 15 Körner pro Keim in fünf Stunden.
Die Untergrundmarkierung war bemerkenswert niedrig, selbst bei Expositions/eiten von sechs Tagen. Für
Zeitpunkte bis zu 24 Stunden betrug die mittlere Anzahl der Untergrundkörner 38 Körner pro 100 Zellen mit
einem Maximum von 65 Körnern pro Hundert Zellen. Aus dem Wahrscheinlichkeitsgesetz von Poisson ergibt
sich nur eine 0,05%ige Wahrscheinlichkeit, daß der Untergrund für mehr als 4 Körner pro Zelle
verantwortlich sein könnte. Daher wurden fünf oder mehr Körner pro Zelle als definitive Markierung bei
dieser Arbeitsweise angesehen.
Es ist bekannt, daß die Temperatur die Fluorografie bei der Dünnschichtchromatografie mit Tritiumverbindungen
beträchtlich beeinflußt. Es wurde hierfür angenommen, daß die Möglichkeit der Schwingung von
Molekülen bei niedrigen Temperaturen »eingefroren wird« und daher Knergie in die Photonenemission geht,
die sonst durch die statistische Bewegung verloren ginge. Es wurde der Einfluß der Temperatur auf die
Hochempfindlichkeitsautoradiografie untersucht. Temperaturen zwischen l7rC und -1960C wurden angewandt.
Ein frühes Markieren wurde deutlich gefördert, wenn die Exposition der Emulsion bei niedrigen
Temperaturen/.wischen -20°Cbis -85°C ermöglicht
wurde. Ein weiteres Abkühlen ergab eine unter dem Optimalwert liegende Markierung und führte zusätzlich
zu einer Neigung zur Rißbildung der Emulsion. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IA angegeben.
Bei 0,5 nCi/ccm waren -85°C die optimale Temperatur
für das Markieren.
Der Einfluß von Szintillator und Temperatur sind bei geringen Werten des Isotopeneinbaues und der
ß- Emission am stärksten ausgeprägt. Durch Erhöhung der Dosis von mit der Zellsuspension in vitro
inkubiertem, tritiiertem Thymidin auf δ-ΙΟμΟΛχιπ
konnte ein rasches, maximales Markieren in einfacher Weise erreicht werden. Die Ergebnisse der Dosisversuche
sind in den Tabellen IB und II zusammengestellt. Mit 5—ΙΟμΟΛχπι konnte ein maximales Markieren in 20
bis €0 Minuten durchgeführt werden. Der Wert von gezählten Körnern/Zelle stieg auch noch nach dieser
Zeit an, jedoch ergab sich nur eine vernachlässigbare Zunahme der Anzahl von Zellen, welche signifikant
markiert wurden (mehr als 5 Körner/Zelle), selbst wenn die Exposition der Emulsion auf sechs Tage ausgedehnt
wurde. Die Untergrundmarkierung blieb niedrig.
Da einer der Hauptgründe zur Entwicklung dieser Technik darin lag, sie bei der klinischen Untersuchung
von Patienten anzuwenden, wurden Proben einer Reihe von Patienten mit Leukämien, Myelomen und malignen
Effusionen genommen. Die Hochempfindlichkeitsautoradiografie mit 0\5-10μ(3/αη wurde mit der Autoradiograf
ie Coons et al. Cancer 19 [1966J S. 1200-1204) verglichen. Die Ergebnisse waren hinsichtlich
des Prozentsatzes an markierten Zellen vollständig vergleichbar. Für eine Analyse von Doppelproben für
jede Methode ergab sich eine zweifache Differenz im Markierungsindex als statistisch signifikant (P<0,05).
Von 52 Beobachtungen bei 40 Patienten hatten die Ergebnisse der Hochempfindlichkeitsautoradiografie
unter Standardautoradiografie ein mittleres Verhältnis von 1,4 und waren daher statistisch nicht verschiedea
Bei der Anwendung der Hochempfindlichkeitsautoradiografie
lag der mittlere Markieningsindex für elf nicht
behandelte Patienten mit Myelom bei 4% und für ach Patienten mit Remission bei 16%. Diese Daten warei
vollständig mit früheren Daten vergleichbar, welchi mittels Slandardautoradiografie bei Patienten mi
multiplem Myelom erhalten worden waren.
Die zur Durchführung der Standardautoradiografii erforderliche Zeit schränkte zahlreiche klinische An
Wendungen und Forschungsanwendungen ein. Gemät der Erfindung sind sehr kurze Expositionszeitet
möglich, so daß die Anwendung der Autoradiografi« erleichtert wird. Dies ist ein wesentlicher Fortschrit
gegenüber neueren Modifikationen der Siandardauto radiografie einschließlich der Verwendung von tritiier
tem Thymidin (spezifische Aktivität von b Ci/mMol, di<
Ergebnisse in 24 bis 48 Stunden ergibt) und dei Verwendung eines Szintillator zusammen mit tritiier
tem Thymidin von niedriger, spezifischer Aktivität.
Für geringe Werte der j?-Emission von eingebautem
tritiiertem Thymidin verstärkt das Beschichten dei fotografischen Emulsion mit einem Szintillator ein«
früher Markierung sehr stark. Dieser Effekt kann nocr weiter verbessert werden, indem die Emulsion be
niedrigen Temperaturen belichtet wird, wobei -85°C bei dem erfindungsgemäßen Verfahren optimal isi
(Tabelle IA). Die Methode sollte am brauchbarsten ir den Fällen erweisen, in denen geringe Werte dei
Isotopenaufnahme bislang verlängerte Expositionszeiten (z. B. 6 bis 8 Monate) erforderten. Es wurde nur
gefunden, daß das erfindungsgemäße Verfahren bei solchen dntersuchungsmethoden Ergebnisse in zwei bis
drei Wochen möglich macht. Weiterhin gibt es potentielle Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
bei der Llektronenmikroskopie, der Dünnschichtchromatografie
und der Papierchromatografie.
Eine sehr wichtige Abänderung der Erfindung liegt in
der Erhöhung der spezifischen Aktivität von tritiiertem Thymidin auf etwa 40—60 Ci/mMol/ccm an inkubierten
Zellen, so daß eine maximale Zellmarkierung sehr rasch erreicht werden kann.
Mit Emulsionsbelichtungszeiten von nur 20—60 Minuten bei δ-ΙΟμΟ/αΜη werden Markierungsprozentsätze
nahe bei den Maximalwerten erreicht Auf diese Weise ist es möglich, den Markierungsindex (LI
%) oder die Wachstumsfraktion innerhalb vop 4—5 Stunden nach Erhalt einer klinischen Probe zu
berechnen. Die relative Markierungsintensität oder die Kornzahl als Funktion der Zeit kann ebenso signifikant
wie die prozentuale Markierung sein. Weiterhin ist es möglich, die Markierungsgeschwindigkeit gemäß der
Erfindung rasch zu bestimmen. In den Fällen, in denen eine in-vitro-Inkubation mit hohen Dosen an tritiiertem
Thymidin hoher spezifischer Aktivität kombinier* mit der Anwendung des Szintillators und der Belichtung bei
niedriger Temperatur (-850C) möglich ist, können
daher Daten für das Fällen einer raschen klinischen Entscheidung verfügbar gemacht werden. Die Kenntnis
des Markierungsindex ist von beträchtlichem, klinischen Interesse, z. B. im Hinblick auf die Wahrscheinlichkeit
des Ansprechens gegenüber einer Chemotherapie bei der akuten Leukämie wie auch als Kennzeichen für das
Ansprechen bei Patienten mit festen Tumoren. Ein Hauptvorteil dieser Autoradiografiemethode gegenüber anderen Mitteln zur raschen ZellzyklusanaJyse ist
die Fähigkeit, gemischte Zellpopulationen sorgfältig zu analysieren. Durch das Anfärben nach G i e m s a und
gegebenenfalls nach anderen speziellen Anfärbemethoden kann die Zellmarkiemng mit der konventionellen
Morphologie in Beziehung gesetzt werden, und
Mehrfachzellpopulationen können in einer vorgegebenen Probe untersucht werden. Der bei dem erfindungsgemäQen
Verfahren beobachtete, extrem geringe Untergrund scheint mit der erforderlichen, extrem
kurzen Belichtungszeit oder Expositionszeit in Bezie· hung zu stehen, da dies die Exposition gegenüber der
äußeren Bestrahlung durch die Umwelt, welche für den Untergrund verantwortlich ist, wesentlich herabsetzt.
Die beschriebenen Methoden stellen einen wesentlichen Fortschritt hinsichtlich der Empfindlichkeit oder
Geschwindigkeit, mit der die Ergebnisse bei der Autoradiografie verfügbar sind, dar. Sowohl für
Forschungsanwendungen, welche häufig durch die extrem niedrigen Aufnahmeraten des Isotops beschränkt
sind, wie auch für die Gewinnung von in vitro-lndices für die Fällung von klinischen Entscheidungen
liefert das erfindungsgemäße Verfahren daher eine zuverlässige Arbeitsweise, welche in der Biologie
und der Medizin breite Anwendung finden kann.
Einfluß der Temperatur auf die Markierungsgeschwindigkeit bei zwei verschiedenen Konzentrationen
von tritiiertem Thymidin. Die Versuche A wurden bei einer Dosis von 0,5 μϋί/«:ηι und einer spezifischen r>
Aktivität von 40—60 Ci/mMol durchgeführt. Die Versuche B wurden bei einer Dosis von ΙΟμΟΛχηι und der
gleichen spezifischen Aktivität durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz an markierten Zellen
(Markierungsindex) angegeben. m
17 C | B | -85 C | B | |
A | 29 | Λ | 22 | |
20 Minuten | 3 | 31 | 10 | 37 |
1 Stunde | 4.2 | 30 | Il | 35 |
5 Stunden | 11 | 35 | 19 | 37 |
24 Stunden | 25 | Il | 27 | |
Tabelle | ||||
Einfluß der Dosis von tritiiertem Thymidin auf die Markierungsgeschwindigkeit, spezifische Aktivität
= 40—60 Ci/mMol. Ergebnisse angegeben als Mar- ·»>
kierungsindex (%).
■iCi/ | ecm Zellen | 5.0 | 10.0 | 50.0 | 100.0 | |
0.5 | 2.0 | 26 | 29 | 22 | 25 | |
20 Minuten | 6 | 21 | 30 | 31 | 20 | 23 |
1 Stunde | 21 | 28 | 37 | 30 | 34 | 30 |
5 Stunden | 31 | 44 | 36 | 30 | 36 | 29 |
24 Stunden | 35 | 39 | 36 | 35 | 34 | 32 |
6 Tage | 33 | - |
Im folgenden werden noch Einzelheiten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angegeben.
1. Fotografische Emulsion: Kernspuremulsion NTB3 (Kodak)
2. Szintillationsflüssigkeit: 5 g PPO + 100 mg Dimethyl-POPOP, aufgelöst in 500 ml Dioxan.
3. Polyoxyäthylensorbitanmonooleat (Tween 80,
P1754) wurde als Emulgator für die fotografische Emulsion verwendet
4. Tritiiertes Thymidin mit hoher spezifischer Aktivität,
40—60 Ci/mMol (New England Nuclear NET-O27Z).
5. Fotografische Fixierlösung (Eastman Kodak, Catalog Nr. 1971746).
6. Entwickler (Eastman Kodak D19).
7. Giemsa-Blutfärbelösung mit Zitronensäurepuffer (Fisher Scientific Company, G-146,734319).
8. Die übrige erforderliche Ausrüstung umfaßt einen Ofen und ein Wasserbad, das auf 420C eingestellt
werden kann, eine Dunkelkammer, eine Zellenzentrifuge (Shandon), standardmäßige Objektträger,
ein Wasserbad von 17°C, Objektträgerbehälter und
die üblichen Laborlösungcn.
II. Methoden
1. Für Knochenmarkproben
Es wurden 2 ecm Knochenmark in eine 0,2 ml
1/1000 Heparinlösung (ohne Konservierungsstoff) enthaltende Spritze aufgesaugt. Die Markprobe
wurde mit dem Heparin gut vermischt. Die Markprobe wurde in ein Kulturröhrchcn überführt
und, es wurden etwa 3 ecm Hanks-Lösung + 2 ecm 3%ige Dextranlösung zugesetzt. Mit einer 10-mI-Pipette
wurde das Mark durchgearbeitet. Bei 37"C wurde bei 1 g während 2 Stunden absetzen
gelassen. Die roten Zellen und Granulocyten sedimentierten sich auf dem Boden. Die restlichen
weißen Zellen und das überstehende Plasma wurden abgenommen.
2. Die abpipettierten Zellen und das Plasma oder zuvor hergestellte Zellsuspension wurden entnommen
und bei 1200 Upm zentrifugiert. Das Zellkügelchen wurde erneut suspendiert und auf 10 ecm
mit Hanks-Lösung aufgefüllt.
3. Es wurde die Anzahl der Zellen in der Lösung mit einem standardmäßigen Coulter-Zähler ausgezählt.
ES wurde bei einer Konzentration von 0,5—1,0 χ lO'Zellen/ccmresuspendiert.
4. Es wurden 2 ecm der Suspension in ein getrenntes Röhrchen pipettiert. Es wurden 5,0 μΟΛχίη an
tritiiertem Thymidin zugesetzt. Die Inkubation wurde für 1 Stunde bei 37°C durchgeführt. Es
wurde zweimal zentrifugiert und gewaschen und erneut zu 0,5— 1 Million pro ecm resuspendiert.
5. Es wurden Cytozentrifugenpräparate hergestellt. Für jedes Präparat wurden 3 Tropfen der
präparierten Zellsuspension + 1 Tropfen der Hanks-Lösung zugesetzt. Es wurde die erforderliche
Anzahl von Präparaten in der Cytozentrifuge hergestellt. Die Präparate bzw. Objektträger
wurden getrocknet (an Luft).
Autoradiografie
I. Herstellung der Reagenzien
und der Ausrüstung (in der Dunkelkammer)
1. Der Ofen und das Wasserbad wurden auf 42° C eingestellt
2. Es wurde die Kernspurenemulsion NTB 3 mit dem gleichen Volumen an destilliertem Wasser vermischt Es wurden 1,0 ml der Emulgatorlösung
(Tween 80) hinzugegeben. Die Mischung wurde für wenigstens 1 Stunde in dem Ofen von 42° C
inkubiert 30 ml der Mischung wurden in einen Kunststoffbehälter gegossen. Der Behälter wurde
in dem Wasserbad von 42° C verwendungsbereit gehalten.
3. Die Objektträger bzw. Präparate wurden auf dem Wasserbad erwärmt.
4. Szintillationsflüssigkeit: 5 g PPO + 100 mg Dimethyl-POPOP
wurden in 500 ml Dioxan vermischt. Sie wurden in einer dunklen Flasche gelagert.
Arbeitsweise
1. Die Lichter in der Dunkelkammer wurden ausgeschaltet.
2. Nachdem die Kernspuremulsionslösung (NTB 3-Lösung) fertig war, wurde jeder Objektträger,
jeweils einer zu einem Zeitpunkt, in diese Lösung für 10 Sekunden eingetaucht. Jeder Objektträger
wurde zum Abtropfen aufgestellt und in eine Trockenkammer überführt.
Die Kernspuremulsionslösung (NTB 3-Lösung) wurde zurück in die Lagerflasche gegossen und in
der Kälte aufbewahrt.
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wenigstens 1 Stunde trocknen gelassen.
5. Dann wurden die Objektträger nacheinander in die Szintillationsflüssigkeit für 10 Sekunden eingetaucht.
Die Objektträger wurden in einem Objektträgerbehälter aufbewahrt und trocknen gelassen.
Die Objektträger wurden bei Zimmertemperatur in der Dunkelheit bei 20—60 Minuten oder länger, je
nach Erfordernissen, aufbewahrt.
6. Nach der Expositionszeit wurden die Objektträger bzw. Präparate entwickelt und fixiert.
Entwicklung und Fixierung
Lösungen
Lösungen
1. Es wurden 450 ml destilliertes Wasser in einem 500-ml-Becherglas auf eine Heizplatte auf 45 bis
500C erwärmt. Das destillierte Wasser wurde in die dunkelgefärbte Flasche eingeschüttet und das
Volumen auf 500 ml mit kaltem destilliertem Wasser gebracht, bis die Temperatur 37°C betrug
(soll nicht variieren). Dann wurden 78,5 g Entwickler (Kodak D19) hinzugegeben und gut gerührt.
Diese Lösung wu.'de für 0,5 Stunden in einen Kühlschrank eingesetzt. Dann wurde sie in einem
Wasserbad von 17°C in der Dunkelkammer angeordnet.
2. Es wurden 92 g Fixiersalz (Kodak) in 350 ml destilliertem Wasser aufgelöst und dann auf 494 ml
aufgefüllt. Es wurde für etwa 0,5 Stunden gerührt und dann in der Dunkelkammer aufbewahrt. Für 0,5
Stunde wurde gekühlt, um die Temperatur auf 17°C zu erniedrigen, dann wurde die Lösung in einem
Wasserbad in der Dunkelkammer angeordnet.
Arbeitsweise
Nach der Abdunklung wurden die erforderlichen Volumina an Entwicklerlösung und Fixierbad in
getrennte Schalen gegossen. Jedes Präparat bzw. jeder Objektträger wurde in dem Entwickler für 3 Minuten
eingesetzt,dann in destilliertem Wasser für 10 Sekunden abgewaschen. Es wurde in die Fixierbadschale für 3
Minuten überführt, dann wurde jeder Objektträger in das Wasserbad von 17° C überführt, wo sie für 15
Minuten aufbewahrt werden sollen. Die Objektträger wurden aus diesem Wasserbad entfernt und an der Luft
trocknen gelassen. Während dieser Zeit kann bei Licht gearbeitet werden.
Färben
1. Herstellung der Färbelösung
1. Herstellung der Färbelösung
Es wurden 0,5 g Giemsa-Blutfarbstoff in 42 ml Glyzerin bei 55—60°C aufgelöst, 42 ml Methanol
wurden zugesetzt und 48 Stunden für ein vollständiges Auflösen stehengelassen. Es wurde filtriert und auf diese
Weise die Ausgangslösung erhalten. Die Färbelösung wurde in folgender Weise hergestellt: 75 ml Zitronensäure
(0,1 M), Puffer pH = 5,75; 5,4 ml Methanol; 4,5 ml filtrierte Ausgangslösung.
Die Färbelösung wurde in der ersten Anfärbschale (Fassungsvermögen 100 ml) angeordnet.
2. Herstellung der Zitronensäure (0,1 M)-puffer
a) Für die zweite Färbelösungsschale, pH = 5,75; 119,2 ml 0,2 M Na2HPO4, 80,8 ml 0,1 M Zitronensäure,
der pH-Wert muß überprüft werden.
b) Für die dritte Färbebadschale, pH = 5,40; 111,5 ml
0,2 M Na2HPO4; 88,5 ml 0,1 M Zitronensäure; der
pH-Wert muß überprüft werden.
3. Anfärben
Jeder Objektträger bzw. jedes Präparat /urde in die Giemsa-Blutfärbelösung für 12 Minuten eingebracht,
dann in Puffer Nr. 1, der auf pH = 5,75 eingestellt ist, für 30 Sekunden überführt, dann in Puffer Nr. 2, der auf
pH = 5,4 eingestellt ist, für 30 Sekunden überführt, und dann wird der Objektträger bzw. das Präparat an der
Luft trocknen gelassen.
Die Präparate bzw. Objektträger sind dann fertig, um in einem Deckglas versehen und ausgezählt zu werden.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
- Patentansprüche:t. Autoradiografisches Verfahren zur Bestimmung physiologischer Veränderungen in Geweben durch Herstellen einer Suspension lebender Zellen des Gewebes, Inkubation der Zellen mit einem ein Radioisotop als Strukturatom enthaltenden Zellenbestandteil aus der Gruppe der Nukleinsäuren, Enzyme, Proteine und Hormone, Aufbringen der markierten Zellen auf die Oberfläche eines Objektträgers und Beschichten des Objektträgers mit einer Silberhalogenid-Emulsion, so daß das Silberhalogenid den Emissionen aus dem Radioisotop exponiert wird, Entwicklung des Objektträgers zur Bildung von Silberkristallen und Bestimmen der relativen Anzahl von Silberkristallen als Maß der Radioaktivität der Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß der radioaktive Zellenbestandteil eine spezifische Aktivität von wenigstens 40 Ci/mMol besitzt,
die Silberhalogenid-Emulsion mit einem flüssigen Szintillator imprägniert wird, und
das Silberhalogenid dem radioaktiven Zellenbestandteil bei einer Temperatur von nicht über — 20° C exponiert wird. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Radioisotop Tritium ist
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure Ribonukleinsäure (RNA) oder Deoxyribonukleinsäure (DNA) ist
- 4. Verfahren nach Ansprach 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Szintillator eine Kombination von 2,5-Diphenjloxazol (PPO) und l,4-Bis-(4-methyI-5-phenyloxazoI-2-yl)-benzoI pimethyl-POPOP) ist.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die radioaktive Nukleinsäurekomponente tritiiertes Thymidin oder tritiiertes Uridin ist
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