DE69133325T2

DE69133325T2 - Verwendung von 5,10,15,20-tetrakis(r-carboxyphenyl)porphin zum nachweis und zur behandlung von lungenkrebs

Info

Publication number: DE69133325T2
Application number: DE69133325T
Authority: DE
Inventors: A. Dean COLE; C. David MOODY; Edward L. ELLINWOOD; Gerard M. KLEIN
Original assignee: SISTERS OF CHARITY OF LEAVENWO; Sisters Of Charity Of Leavenworth Health Services Corp Stmary's Hospital And Medical Center Inc Grand Junction; University of California
Current assignee: SISTERS OF CHARITY OF LEAVENWO; Sisters Of Charity Of Leavenworth Health Services Corp Stmary's Hospital And Medical Center Inc Grand Junction; University of California
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1991-06-17
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2011-06-18
Also published as: HU9203923D0; AU670743B2; DE69133325D1; EP0533845A1; FI925673A; AU8061491A; FI925673A0; WO1991019977A1; US5162231A; US5391547A; DK0533845T3; NO924820L; RU2114430C1; CA2085464A1; KR0171393B1; CA2085464C; WO1991019978A1; EP0533845A4; JPH06500164A; JP3047468B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von Porphyrinen, um Lungenkrebs nachzuweisen, und insbesondere die Verwendung von 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphin, um Lungenkrebs nachzuweisen.
Lungenkrebs ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem in der Welt und bleibt unbehandelbar. 1986 wurde nachgewiesen, daß maligne Läsionen der Lunge mehr als dreimal so viele Männer tötete wie Darmkrebs und Brustkrebs als häufigste letale Krebserkrankung bei Frauen überholte. Trotz einer enormen Bereitstellung von Resourcen während der letzten 10 Jahre war der Erfolg beim Management von Lungenkrebs bestenfalls minimal. 1988 wurde die jährliche Todesrate bei Lungenkrebs in den Vereinigten Staaten sogar auf annähernd 110.000 Todesfälle geschätzt. Zusätzlich wurden 1988 150.000 neue Fälle von Lungenkrebs diagnostiziert, was Lungenkrebs zum Krebskiller Nummer eins macht. Versuche zur Massendurchmusterung von Hochrisikopopulationen sind ebenfalls erfolglos gewesen.
Die Behandlung von Lungenkrebs ist großenteils erfolglos und manchmal kontrovers gewesen. Die gesamte Fünfjahres-Überlebensrate eines Patienten mit Lungenkrebs blieb noch immer unterhalb 10%. Die Praxis des chirurgischen Entfernens des Tumors ist die erfolgreichste Art aller Behandlungen; in vielen Fällen treten die malignen Läsionen jedoch wieder auf oder metastasieren. Die Verwendung von Radiotherapie und Chemotherapie hat ebenfalls beschränkten Erfolg beim Verlängern der Lebenszeit von Lungenkrebspatienten. In der Tat ist die mittlere Überlebensrate bei einem Patienten mit kleinzelligem Lungenkarzinom, der mit einer Chemotherapie und mit oder ohne Bestrahlungstherapie behandelt wird, 10 bis 15 Monate bei Patienten mit "eingeschränkter" Erkrankung und 7 bis 11 Monate bei Patienten mit "ausgedehnter" Erkrankung.
Der Zusammenhang zwischen Lungenkrebs und Zigarettenrauch ist gut etabliert; andere Umweltfaktoren spielen jedoch auch eine Rolle bei der Ätiologie von Lungenkrebs. Eines dieser Umweltagenzien ist Radon-222, ein Edelgas, das in der natürlichen Umgebung ubiquitär ist, welches durch den Zer fall von Radium erzeugt wird; welches wieder vom Zerfall von Uran stammt. Uran ist in der Erdkruste auf der ganzen Welt vorhanden. Radongas bildet sich in der Erdoberfläche während des Uranzerfalls und diffundiert in die Atmosphäre, wo es eine Gesundheitsgefahr wird. Wenn Radon in der Atmosphäre zerfällt, heften sich seine kurzlebigen radioaktiven Töchter (Isotope von Polonium, Wismut und Blei) an Staubpartikel in der Luft. Diese radioaktiven Partikel, wie auch die nicht gebundenen Radontöchter, werden dann in die Lungen inhaliert. Radon und die Radontöchter geben alpha-, beta- und gamma-Strahlung ab. Es wird geschätzt, daß die Radontöchter über 95% der alpha-Strahlungsdosis auf die Basalzellen in dem tracheobronchialen Epithel der Lunge liefern.
Epidemiologische Beweisführung hat festgelegt, daß die Exposition gegenüber Radon und seinen Töchtern zu einen erhöhten Risiko für Bronchialkarzinome führt, In den frühen 60er Jahren wurden zytologische Techniken entwickelt, um Lungenkrebs in Uranminenarbeitern festzustellen, welche bei mehreren Verfahren einer signifikanten Radon- und Radontochterinhalierung ausgesetzt sind, die über eine Dauer von vielen Jahren auf das Bronchialepithel einwirkt. Es ist weiter erwiesen worden, daß die Inzidenz von Lungenkrebs in Minenarbeitern, die Zigaretten rauchen, zehnmal größer ist als in Minenarbeitern, die nicht rauchen. Die pulmonären Zytopathologietechniken haben sich als sehr empfindliches Verfahren zum Detektieren abnormer/kanzerogener Zellen in Hochrisikopopulationen, wie beispielsweise Uranminenarbeitern, herausgestellt, jedoch kann, sobald die neoplastischen Zellen identifiziert worden sind, die Aufgabe des Lokalisierens des okkulten Karzinoms in der Lunge schwierig und in vielen Fällen ein nicht zu bewältigendes Problem sein. Da die meisten Läsionen in situ mit dem Auge ohne Hilfsmittel nicht gesehen werden können, müssen solche Läsionen durch selektive Bronchialabstriche und blind durchgeführte ("blind spur") Biopsien lokalisiert werden. Diese diagnostischen Verfahren benötigen eine Vollnarkose und mindestens 2 bis 3 Stunden zur Durchführung. Die Lokalisierung solcher frühen neoplastischen Läsionen ist von signifikanter Bedeutung zur Behandlung von Lungenkrebs. Es wird von vielen vermutet, daß damit die Behandlung von Lungenkrebs erfolgreich wird, da das Behandlungsverfahren in einem frühen Stadium der Krebsentwicklung (in situ) gestartet werden muß. Um diese frühen malignen Lungenläsionen erfolgreich nachzuweisen, müsse neue Verbindungen entwickelt werden, die in klinischen Routineverfahren zum Nachweisen von kleinen Lungenläsionen verwendet werden können.
Porphyrine und insbesondere Hämatoporphyrinderivate sind seit vielen Jahren dafür bekannt, daß sie eine signifikante Affinität für maligne Krebszellen haben, und sie haben sich als nützlich als diagnostische Marker erwiesen. Tumorzellen, die Hämatoporphyrin aufgenommen haben, fluoreszieren, wenn sie mit UV-Licht bestrahlt werden. Die Spezifität der Aufnahme der Porphyrine, die in der Vergangenheit verwendet wurden, war jedoch nicht so vollständig wie gewünscht; das bedeutet, daß es einen wesentlichen Hintergrund der Fluoreszenz von nicht kanzerogenen Zellen gibt, die die Fluoreszenz der Zellen von Interesse begleiten. Kürzlich wurde ein Hämatoporphyrinderivat zur Bildgebung von neoplastischen Invasionen der Blase bei Menschen verwendet. Das Verfahren betrifft die endoskopische Erkundung der vermuteten Tumorstelle mit einer Instrumentierung, die Fluoreszenzemission, die von einer Anregung von Porphyrinen mit 400 nm Licht stammt, detektiert.
Porphyrine sind auch bei der Diagnose und Lokalisierung von kleinen radiologisch okkulten Lungentumoren verwendet worden (D. A. Cortese et al., "Hematoporphyrin Derivative In The Detection and Localization of Radiographhically Occult Lung Cancer", Am. Rev. Respir. Dis. 126, 1087 (1982); H. Kato et al., "Early Detection of Lung Cancer by Means of Hematoporphyrin Derivative Fluorescence and Laser Photoradiation", Clin. Chest Med. 6, 237 (1985)). In diesen Studien wurde ein fotoelektrisches Fluoreszenznachweissystem in Kombination mit einem konventionellen Bronchoskop verwendet, um frühe squamöse Zellkarzinome in Patienten mit normalen Brustradiographien zu identifizieren und lokalisieren. K. B. Patel et al., "Fluorescing Cells in Sputum After Parenteral HPD", in Progress in Clinical and Biological Research, Bd. 170, D. Doiron und C. Gorner, Hrsg.; "Porphyrin Localization And Treatment of Tumors", S. 521–530 (1984) haben ebenfalls bewiesen, daß maligne Zellen in Sputumproben von Lungenkrebspatienten nachgewiesen werden können, denen Hämatoporphyrinderivat injiziert wurde. In dieser Studie fluoreszierten maligne Zellen wie auch einige nicht maligne Zellen bis zu 9 Tage nach der intravenösen Injektion von Porphyrin. Die Aufnahme von Porphyrin in normale Zellen ist nicht ungewöhnlich, da andere Gewebe, wie beispielsweise embryonale und verletzte Gewebe, ebenfalls als Hämatoporphyrinderivat lokalisierend, beschrieben wurden.
Die US-Patentserie Nr. 4,783,529 offenbart die Herstellung von ⁶⁴Cu-markiertem 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin und dessen Verwendung bei der Tumorbildgebung nach der Konjugierung an proteinspezifische Antikörper.
Moan et al. beschreiben in ihrem Artikel in Photochem. Photobiol. 46, 713–722 (1987), daß Tetra-arylporphyrin, wie beispielsweise Tetra-(3-hydroxyphenyl)porphyrin, als selektiver Tumorlokalisierer im Hinblick auf die photosensibilisierenden Wirkungen und Tumor- versus Zellaufnahme verwendet werden kann.
Die Lokalisierung maligner Läsionen unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren hängt von der visuellen Detektion der roten Fluoreszenzemission des Porphyrins ab. In den meisten Verfahren wird dies durch das Scannen der Lunge mit einem Bronchoskop ausgeführt, das so adaptiert wurde, daß es Licht bei einer Wellenlänge (400 nm) emittiert, welche die Porphyrinmoleküle anregt. Der begrenzende Faktor mit diesem Verfahren ist, daß es zeitraubend ist und gut ausgebildetes Personal benötigt, um alle Bereiche der Lunge auf maligne Läsionen zu untersuchen. Da die Fluoreszenzemission aus diesen kleinen Läsionen so schwach und schwierig zu beobachten ist, können kleine Läsionen leicht übersehen werden. Zusätzlich muß das Porphyrin auf der Oberfläche des Tumors sein und der Tumor muß auf der Oberfläche der Lunge liegen, um die Porphyrinfluoreszenz visuell nachzuweisen. Jedes Material, wie beispielsweise die muköse Schicht, oder eine Situation, wo ein Tumor tief sitzt, interferiert mit der aufliegenden Detektion der Porphyrinfluoreszenz. Das führte dazu, daß Porphyrine nicht mit Erfolg als diagnostisches Werkzeug für okkulte Lungenläsionen verwendet worden sind.
Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, um kleine okkulte maligne Tumormassen in den Lungen von Patienten zu lokalisieren.
Ein weiteres Ziel unserer Erfindung liegt darin, ein Verfahren für die selektive Bestrahlung okkulter maligner Tumormassen in den Lungen von Patienten zur Verfügung zu stellen.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein schnelles Hochkontrastverfahren zum Detektieren des Vorhandenseins maligner Zellen in vitro zur Verfügung zu stellen.
Zusätzliche Ziele, Vorteile und neue Eigenschaften der Erfindung werden teilweise in der folgenden Beschreibung ausgeführt und teilweise werden sie den Fachleuten im Gebiet nach der Prüfung des Folgenden offensichtlich, oder sie können durch die Ausübung der Erfindung erlernt werden. Die Ziele und Vorteile der Erfindung können mit Hilfe der Instrumente und Kombinationen, auf die insbesondere in den angehängten Ansprüchen hingewiesen wird, umgesetzt und erreicht werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Um das zuvor Gesagte und weitere Ziele zu erreichen und in Übereinstimmung mit den Zwecken der vorliegenden Erfindung, die hier ausgeführt und umfassend beschrieben ist, schließt das Verfahren zum Nachweisen von Lungenkrebs in vitro das Herstellen einer Einzelzellsuspension von Lungenzellen ein, das Behandeln der Einzelzellsuspension von Lungenzellen mit 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphin über einen ausreichenden Zeitraum, um eine signifikante Aufnahme davon durch neoplastische Lungenzellen zu sichern, die in der Einzelzellsuspension der Lungenzellen enthalten sind, das Aussetzen der behandelten Zellsuspension gegenüber ultravioletter Bestrahlung, um die Fluoreszenz von 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphin auszulösen, das von den neoplastischen Zellen aufgenommen wurde, und das Untersuchen der Suspension auf fluoreszierende Zellen. Weitere besonders vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 7 beschrieben.
Bevorzugt wird die Einzelzellsuspension entweder mit Carbowax und Alkohol oder mit Paraformaldehyd fixiert.
Es ist zu beachten, daß gemäß der gewöhnlichen chemischen Terminologie freie Basephorphyrine als "Porphine" bezeichnet werden, während komplexierte Porphyrine die Bezeichnung "Porphinato" tragen.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung und in Übereinstimmung mit ihren Zielen und Zwecken wird die Verwendung von dem ⁶⁷Cu- oder dem ⁶⁴Cu-Komplex von 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphinato bei der Herstellung einer Substanz, die bei der in vivo Diagnose von Lungenkrebs verwendet werden soll, offenbart, wie in den Ansprüchen 8 bis 11 ausgeführt. Die in den Patienten einzuschleusende Substanz und ein Bild der emittierten gamma-Strahlung bzw. Positronenemissions-Tomographie der emittierten Positronen wird dann gebildet.
Die Erfindung schlägt auch die Verwendungen des ⁶⁷Cu- oder des ⁶⁴Cu-Komplexes von 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphinato zur Herstellung von Substanzen zur Verfügung, die für die Behandlung von Lungenkrebs geeignet sind, wie in den Ansprüchen 12 bis 13 ausgeführt wird.
Der Nutzen und die Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen eine wirksame, schnellere und ökonomische Identifizierung von Lungenkrebszellen in Sputumproben und in Biopsaten durch bronchoskopische Untersuchung der Lungen und durch gamma-Strahlenbildgebung oder Positronenemissions-Tomographie ein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die begleitende Figur, die in die Beschreibung eingeschlossen ist und einen Teil davon bildet, stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar und dient zusammen mit der Beschreibung dem Erklären der Prinzipien der Erfindung.
Die Figur stellt die Strukturformel von 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphin (A) und die für den Komplex dieses Porphyrins und ⁶⁷Cu (B) dar.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
Kurz gefaßt schließt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Tetra-arylphorphyrinen und insbesondere 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphin (TCPP) als Fluoreszenzindikator für Lungenkrebszellen ein, und als Radioindikator dafür als Komplexmittel ⁶⁷Cu. Der letztgenannte Komplex stellt auch eine Quelle von beta-Strahlung für die selektive Zerstörung von bösartigen Lungentumoren wie auch für die gamma-Strahlung, die für die Bildgebungsanalyse von deren Lokalisation beispielsweise durch Einzelphotonemissions-Computertomographie nützlich ist, dar. ⁶⁴Cu kann das ⁶⁷Cu substituieren, falls nur die Radioindikatoreigenschaften von Interesse sind. Das Kupfer-64-Isotop des Kupfers ist ein Positronenemittent, und gute Positronenemissions-Tomographietechniken können verwendet werden, um die bösartigen Tumorgewebemassen zu lokalisieren. Diese Anwendungen stammen aus der Affinität, die TCPP und solche der gleichen Familie von Porphyrinen für bösartige Lungentumoren haben, wenn sie in die Nähe solcher Zellen eingeschleust werden.
Nun wird eingehender auf die vorliegenden Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen und auf ein Beispiel davon, das durch die begleitende Figur darstellt wird.
Die Figur stellt die Strukturformel eines Beispiels der Klasse der Tetra-arylporphyrine, die verwendet werden können, um die vorliegende Erfindung durchzuführen: 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphin, TCPF, (A), und die vom Komplex dieses Porphyrins und ⁶⁷Cu (B), dar. Eine erste Untersuchung wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob TOPP sich in den neoplastischen Sputumzellen, die von Uranminenarbeitern erhalten wurden, lokalisieren würde und unter welchen Bedingungen dieser Prozeß maximiert werden könnte. Eine zweite Studie untersuchte die Lokalisierung von TCPP in verschiedenen Arten von Lungenkrebszellen (squamöse Zellen, kleine Zellen, metastatische Lungenlymphome und Adenokarzinom) und die Fähigkeit, Lungenkrebs in solchen Patienten unter Verwendung von TCPP zu diagnostizieren.
A. Lokalisierung von TOPP in neoplastischen Sputumzellen
Für diese Studie wurden fünf Parameter untersucht: (1) Die Wirkung verschiedener Sputumverarbeitungsverfahren auf die Aufnahme von Porphyrin in Sputumzellen, (2) den Vergleich von TOPP mit drei weiteren Porphyrinen, die für ihre Aufnahme durch Tumoren bekannt sind, (3) die Zeit, die für eine optimale Aufnahme des Porphyrins in die Sputumzellen benötigt wird, (4) die Aufnahme von Porphyrin in Test- und Kontroll-Sputumproben und (5) die Überprüfung, daß TOPP in bösartigen Sputumzellen lokalisiert war. Bei jeder dieser Untersuchungen wurde die Aufnahme von Porphyrin in Sputumzellen mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Nichtmetalliertes Porphyrin fluoresziert bei ungefähr 650 nm. Die Sputumproben wurden auf (1) die Anzahl an Zellen in den Sputumproben, die fluoreszierten und (2) die Intensität der Porphyrinfluoreszenz untersucht.
1. Arbeitsverfahren
Sputumproben benötigen eine Verarbeitung, um eine Einzelzellsuspension aus Lungenzellen herzustellen. Sputumproben aus Test- und Kontrollpatienten wurden eingesammelt und mit Alkohol und Carbowax, Alkohol allein, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verarbeitet oder blieben unverarbeitet. Alle Proben wurden mit einem Mischer über 1 Minute nach der Zugabe des Verarbeitungsgemisches gemischt und dann in Petrischalen gegeben, die verschiedene Porphyrine enthielten. Sputumproben, die mit Alkohol und Carbowax oder Alkohol (kein Carbowax) bearbeitet wurden, hatten eine größere Anzahl an Zellen, die frei von Schleim waren als Proben, die mit PBS bearbeitet wurden oder nicht bearbeitete Proben. Zellen in den nicht bearbeiteten Sputumproben blieben auf dem Boden der Petrischale angeheftet, wobei nur wenige Zellen frei von dem Schleim waren. Die Sputumproben, die mit PBS bearbeitet wurden, hatten die größte Anzahl lebender Zellen, wenn sie mit Sputumproben verglichen wurden, die mit Alkohol oder Alkohol/Carbowax bearbeitet wurden; Sputumzellen jedoch, die mit Alkohol oder Alkohol/Carbowax bearbeitet wurden, hatten die größte TCPP-Aufnahme, was vermuten ließ, daß TCPP eine Affinität für nicht lebende verarbeitete Zellen haben könnte.
2. Untersuchung der verschiedenen Porphyrine
Vier Porphyrine, die aufgrund ihrer bekannten Affinität für neoplastische Zellen ausgewählt wurden, wurden auf ihre Fähigkeit, maligne Sputumzellen nachzuweisen, getestet. Sputumzellen, die aus jeder der vier Verarbeitungsverfahren, die oben ausgeführt wurden, erhalten wurden, wurden mit einem der Hämatoporphyrinderivate, HPD, 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphin, TCPP, 5,10,15,20-Tetrakis(4-sulfonatophenyl)porphin, TTPS oder Uroporphyrin, URO behandelt. Bei allen Untersuchungen wurden die Porphyrine in Gewebekulturmedium bei einer Konzentration von 200 μg/ml gelöst. Auf die Zugabe von Porphyrin folgend wurde jede Probe für eine spezifische Zeitspanne inkubiert.
Nach der Inkubationsperiode wurde jede Sputumprobe mit einem Fluoreszenzmikroskop auf die Porphyrinaufnahme untersucht. Die Hintergrund-Fluoreszenz durch die Porphyrinaufnahme nicht bösartiger Zellen war in einigen Messungen niedriger. Sputumproben, die mit TCPP inkubiert worden sind, hatten die größte Anzahl von fluoreszierenden Zellen und den größten Kontrast (Helligkeit) zwischen fluoreszierenden bösartigen Zellen und der Hintergrund-Fluoreszenz, was auf eine signifikante Porphyrinaufnahme der bösartigen Körper hinwies. Sputumproben, die mit HPD und TPPS verarbeitet wurden, hatten eine moderate Porphyrinaufnahme, und Proben, die mit URO bearbeitet wurden, hatten die geringste Porphyrinaufnahme.
3. Inkubationszeit
Jede Sputumprobe wurde bei 37°C mit jedem der Porphyrine für entweder 6 oder 24 Stunden inkubiert und dann hinsichtlich der Porphyrinaufnahme mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Nach der 6-stündigen Inkubationszeit hatten die Zellen damit begonnen, Porphyrin zu lokalisieren; wenn die Sputumzellen jedoch mit PBS gewaschen wurden, verringerte sich die Fluoreszenz beträchtlich. Dies legt nahe, daß das Porphyrin nicht fest an die Zellen gebunden war. Nach 24 Stunden hingegen stieg die Aufnahme von Porphyrin durch Sputumzellen beträchtlich. Dies wurde durch die Anzahl an Zellen, die Porphyrin aufgenommen hatten, und die Intensität der Porphyrinfluoreszenz bewiesen. Wenn Sputumzellen, die für 24 Stunden inkubiert worden sind, mit PBS gewaschen wurden, blieb das Porphyrin an diese Zellen angeheftet. Längere Inkubationszeiten wurden nicht untersucht.
4. Aufnahme in Test- und Kontrollproben
Kontroll-Sputumproben enthielten keine neoplastischen Zellen. Das Vorhandensein einer großen Anzahl entzündlicher Zellen wurde jedoch gefunden. Wenn die Porphyrinaufnahme in den Test- und Kontrollproben verglichen wurde (d. h. die Anzahl an Sputumzellen, die fluoreszierten), war die Porphyrinaufnahme in den Kontrollproben beträchtlich niedriger als die Aufnahme in den Testproben. Zudem war die Fluoreszenzintensität der wenigen Kontrollzellen, die fluoreszierten, geringer als die Fluoreszenzintensität der Testzellen. Der dramatischste Unterschied zwischen der Aufnahme von Porphy rin durch Test- und Kontroll-Sputumzellen wurde in Proben gesehen, die mit TCPP inkubiert wurden.
5. Identifizierung von Sputumzellen mit Fluoreszenz
Um bei der Identifizierung der neoplastischen Zellen zu helfen, wurden Sputumproben, die die größte TCPP-Aufnahme aufwiesen, mit PAP-Farbstoff gefärbt, einem Farbstoff, der routinemäßig von Zytologen zum Identifizieren neoplastischer Zellen verwendet wird. Zellen, die unter Verwendung des PAP-Farbstoffs als neoplastisch identifiziert wurden, wurden markiert und auf die TCPP-Aufnahme mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Obwohl die Fluoreszenzintensität durch die PAP-Färbeprozedur reduziert worden ist, wurde eine TCPP-Fluoreszenz in jeder neoplastischen Zelle beobachtet.
B. Lokalisierung von TCPP in verschiedenen Arten von Lungenkrebs
Es wurden Studien durchgeführt, indem Patienten verwendet wurden, die bestätigten squamösen Zelllungenkrebs, Haferzell-Lungenkrebs, Lungenadenokarzinoma und fortgeschrittene metastasische Lymphome (Lungenmetastasen) haben, unter Verwendung von Verfahren, die mit den oben genannten identisch sind. Unter Verwendung einer Messung der Anzahl an fluoreszierenden Zellen in einer Sputumprobe mal der Fluoreszenzintensität in den Zellen wurde herausgefunden, daß diese Anzahl 3- bis 6-mal größer bei Sputumproben von Krebspatienten als bei Patienten ohne Krebs war. Diese Studien bestätigen ebenfalls, daß TCPP und Carbowax und Ethanol zur größten Aufnahme von Porphyrin in neoplastischen Sputumzellen führte.
Weitere Untersuchungen bestimmten, daß TCPP auch in Krebsen der Lunge lokalisiert, die in Gewebekulturen gezüchtet werden. Außerdem können squamöse Karzinomzellen, die in Kultur gezüchtet werden und mit TCPP behandelt werden, leicht unter Verwendung von Durchflußzytometrie nachgewiesen werden, und es wurde bewiesen, daß die Autofluoreszenz von Kontrollzellen (Zellen, die nicht TCPP ausgesetzt waren) vernachlässigbar war, wenn sie mit der Fluoreszenz von Zellen, die gegenüber TCPP ausgesetzt wurden, verglichen wurde. Beim Ausweiten der Untersuchungen auf andere Arten von Lungenzellen wurde herausgefunden, daß kleinzellige (Haferzell) Lungenkrebse des Menschen TCPP in 2- bis 3-mal niedrigeren Mengen absorbierten als die squamöse Zelllinie, aber daß dies noch immer beträchtlich höher als die Aufnahme durch normale Zellen ist. Es wurde ebenfalls herausgefunden, daß normale humane Lungenepithelzellen TCPP nur leicht über der Autofluoreszenz oder den Hintergrundkonzentrationen aufnahmen: das bedeutet in vielfach niedrigeren Konzentration als die TCPP-Konzentration in den neoplastischen Zelllinien, die untersucht wurden. Das Inkubieren der Zellen für 24 Stunden in TOPP war mehr als adequat, um die TCPP-Lokalisierung zu maximieren, und das Fixieren der Zellen vor der Exposition gegenüber TCPP erhöhte die TCPP-Aufnahme. Paraformaldehyd als Fixationsmittel stellte sich als die TCPP-Aufnahme durch die Zellen leicht erhöhend gegenüber solchen heraus, die mit Alkohol und Carbowax fixiert wurden.
C. Unterstützende Untersuchungen unter Verwendung von ⁶⁷Cu
1. Herstellung von Kupfer-67 und Kupfer-67/Porphyrin-Komplex
Die Herstellung von Kupfer-67 beinhaltet die Bestrahlung eines Zinkoxidziels mit 600 bis 800 MeV Protonen über mehrere Tage. Die Spaltungsreaktion in dem Ziel produziert nicht nur ⁶⁷Cu, sondern auch mehrere weitere Isotope geringerer Masse als Zink. Die Reinigungsprozedur ist kompliziert und schließt die Trennung von ⁶⁷Cu von Zink und anderen Metallen durch elektrochemisches Ausplattieren ("plating") ein (J. A. Mercer-Smith et al., "The Development Of Copper-67 Labeled Prophyrin-Antibody Conjugates", in Targeted Diagnosis and Therapy, Bd. 1, Antibody-Mediated Delivery Systems; J. T. Toddwell, Hrsg. (Marcel Dekker, New York, 1988) S. 317–352). Die Herstellung von ⁶⁷Cu TOPP wird entweder aus N-bzHTCPP oder TCPP mit Hilfe von Radiometallierung von ⁶⁷CuCl₂ erreicht.
2. Serumstabilität von ⁶⁷Cu TCPP
Von großer Bedeutung bei der Entwicklung eines Radiopharmazeutikums ist die Stabilität des Komplexes ⁶⁷Cu TCPP gegenüber des Verlustes des Radioisotops ⁶⁷Cu in vivo. Um die Stabilität von ⁶⁷Cu TCPP zu testen, wurde ein Fluoreszenzverfahren, das auf der Tagsache beruht, daß Kupferporphyrine nicht fluoreszieren, während nichtmetallierte das tun, entwickelt, wodurch der Verlust von Kupfer unter simulierten physiologischen Bedingungen (J. C. Roberts et al., "Preparation And Characterization OF Copper-67 Porphyrin-Antibody Conjugates", J. Immunol. Methods 105, 153 (1987) gemessen wurde. Es wurde gefunden, daß die Stabilität von Cu TOPP in humanem Serumalbumin und zwei Chelatbildnern, EDTA und DTPA, so war, daß weniger als 1% Umwandlung (die Nachweisgrenze) in Inkubationszeiten von bis zu 12 Tagen auftraten. Zusätzlich gab es keine nachweisbare Transkomplexierung mit anderen Metallionen, wie durch Ultraviolett-Spektroskopie angezeigt wurde.
3. Biologische Verteilung und biologische Halbwertszeit von ⁶⁷Cu TCPP
Eine sterile Dosis ⁶⁷Cu TOPP (1,0 × 10^–6 g) wurde intravenös in die Schwanzvene von Ratten injiziert. Es wurde bestimmt, daß die Leber und Niere dieser normalen Tiere (kein Krebs) die Hauptorgane der ⁶⁷Cu TCPP-Lokalisierung waren. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß ⁶⁷Cu TCPP für die Detektion und Behandlung von kanzerogenem Lungengewebe in vivo geeignet ist, da normales Lungengewebe scheinbar keine signifikanten Mengen an ⁶⁷Cu TOPP aufnimmt, was die Lungentumore gegenüber normalen Lungenzell-Aufnahmeverhältnissen substantiell macht. Eine biologische Halbwertszeitstudie bewies, daß ⁶⁷Cu TOPP biologisch aus den Tieren nach einer normalen exponentiellen Zerfallskurve mit einer Halbwertszeit von 108 Stunden eliminiert wird.
Die vorhergehende Beschreibung in ihren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist zum Zwecke der Illustrierung und Beschreibung dargelegt worden. Es wird nicht beabsichtigt, daß diese erschöpfend ist oder die Erfindung auf die exakte offenbarte Form begrenzt, und offensichtlich sind viele Veränderungen und Variationen im Hinblick auf die oben beschriebene Lehre möglich. Es wäre jemandem mit gewöhnlichen Fachkenntnissen in dem Gebiet der Krebsdetektion und -behandlung nach dem Studieren der vorliegenden Offenbarung klar, daß ein Verfahren zum Lokalisieren der Orte böswilliger Lungentumore in vivo das Injizieren einer Probe des ⁶⁴Cu-Komplexes von 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphinato in den Blutkreislauf einschließt, oder das Einführen eines Aerosols, das diesen Komplex enthält, in die Lunge eines Patienten, der diagnostiziert werden soll, und das Durchführen einer Positronenemissions-Tomographie (G. Firnau et al., "⁶⁴Cu Labelling Of Hematoporphyrin Derivative For Non-Invasive In-Vivo Measurement Of Tumour Uptake", in Progress in Clinical And Biological Research, Bd. 170, D. Doiron und C. Gorner, Hrsg.; "Porphyrin Localization And Treatment of Tumors", S. 629–636 (1984)). Für die Radioisotopenmarkierung unter Verwendung von Isotopen mit langen Halbwertszeiten wäre einer Person mit derartigem Wissen im relevanten Fachgebiet klar, daß es auch wirksam wäre, die ⁶⁴Cu-Komplexe in das Gewebe für eine darauffolgende Diffusion in den Blutkreislauf einzuschleusen. Es wäre einem Arzt mit gewöhnlichen Fachkenntnissen außerdem offensichtlich, daß Proben aus Gewebemassenbiopsaten wie auch aus Sputumproben für in vitro Diagnosen hergestellt werden könnten.
Die Ausführungsformen wurden ausgewählt und beschrieben, um die Prinzipien der Erfindung und ihre praktische Anwendung am besten zu erklären, um dadurch andere Fachleute in die Lage zu versetzen, die Erfindung in zahlreichen Ausführungsformen und mit zahlreichen Modifizierungen zu benutzen, die für die besondere Verwendung als geeignet vorausgesetzt werden. Es ist beabsichtigt, daß der Erfindungsbereich durch die hier angehängten Ansprüche definiert wird.

Claims

In vitro Verfahren zum Nachweisen von Lungenkrebsgeschwüren, umfassend die Schritte des Herstellens einer Einzelzellsuspension aus Lungenzellen, des Behandelns der Einzelzellsuspension aus Lungenzellen mit 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphin für ausreichende Zeit, um dessen signifikante Aufnahme durch neoplastische Lungenzellen, die in der Einzelzellsuspension aus Lungenzellen vorhanden sind, zu sichern, des Aussetzens der behandelten Zellsuspension gegenüber ultravioletter Strahlung, um Fluoreszenz des 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphins zu induzieren, das von den neoplastischen Zellen aufgenommen wurde, und Untersuchen der Suspension nach fluoreszierenden Zellen.
Verfahren wie in Anspruch 1 beschrieben, wobei der Schritt des Behandelns der Einzelzellsuspension mit 5,10,15,20-Tetrakis (4-carboxyphenyl)porphin eine Inkubation der Suspension bei erhöhter Temperatur einschließt.
Verfahren wie in Anspruch 2 beschrieben, wobei der Schritt des Behandelns der Einzelzellsuspension außerdem das Fixieren der Zellprobe mit Carbowax und Alkohol einschließt.
Verfahren wie in Anspruch 2 beschrieben, wobei der Schritt des Behandelns der Einzelzellsuspension außerdem das Fixieren der Zellprobe mit Paraformaldehyd einschließt.
Verfahren wie in Anspruch 1 beschrieben, wobei der Schritt des Untersuchens der Einzelzellsuspension auf fluoreszierende Zellen die Verwendung von Fluoreszenz-Bildgebungstechniken einschließt und das Supprimieren der Hintergrund-Fluoreszenz-Emission.
Verfahren wie in Anspruch 1 beschrieben, wobei der Schritt des Behandelns der Einzelzellsuspension außerdem das intensive Mischen der Einzelzellsuspension mit 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphin einschließt.
Verfahren wie in Anspruch 1 beschrieben, wobei der Schritt des Untersuchens der Zellsuspension auf fluoreszierende Zellen die Verwendung von Durchflußzytometrie-Techniken einschließt.
Verwendung des ⁶⁷Cu-Komplexes von 5,10,15,20-Tetrakis (4-carboxyphenyl)porphinato zur Herstellung einer Substanz, die einem Patienten zur Diagnose von Lungenkrebsgeschwüren verabreicht werden soll, wobei ein Bild aus den emittierten Gammastrahlen zum Lokalisieren der Stellen von Lungenmalignität gebildet wird.
Verwendung des ⁶⁴Cu-Komplexes von 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphinato zur Herstellung einer Substanz, die einem Patienten zur Diagnose von Lungenkrebs verabreicht wird, wobei eine Positronenemissions-Tomographie der emittierten Positronenstrahlung zum Lokalisieren der Stellen von Lungenmalignität durchgeführt wird.
Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die Substanz in den Blutkreislauf des Patienten zu injizieren ist.
Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die Substanz in Aerosolform in die Lungen des Patienten eingebracht wird.
Verwendung des ⁶⁷Cu-Komplexes von 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphinato, die in den Blutkreislauf eines Patienten zur Behandlung von Lungenkrebs injiziert werden soll, wobei der Komplex eine Quelle für β-Strahlung zur selektiven Zerstörung von Lungenmalignität bietet.
Verwendung des ⁶⁷Cu-Komplexes von 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphinato zur Herstellung einer Substanz, die in Aerosolform in die Lungen des Patienten eingebracht wird, zur Behandlung von Lungenkrebs, wobei der Komplex eine Quelle für β-Strahlung zur selektiven Zerstörung von Lungenmalignität bietet.