JPWO2018168819A1 - 解析デバイス、解析キット、及び解析システム - Google Patents

Abstract

検出機を用いて生化学反応を検出するための解析デバイスであって、複数のウェルが形成されたウェルアレイを備え、前記ウェルは、下記式（１）により計算されるアスペクト比が１以上である、解析デバイス。アスペクト比＝前記ウェルの深さ／平面視において前記ウェルの開口縁に囲まれる領域に内包される円のうち最も大きい円の直径 …（１）

Description

本発明は、解析デバイス、解析キット、及び解析システムに関する。本願は、２０１７年３月１４日に、日本に出願された特願２０１７−０４８６０１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

近年、患者の血液等の体液に含まれるバイオマーカー（例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸やタンパク質等）を検出することで、がんやアルツハイマー、その他の遺伝子疾患等の病気や細菌等による感染症等を診断する方法が注目されている。

バイオマーカーを測定する方法としては、デジタルＥＬＩＳＡや、デジタルＰＣＲ、デジタルインベーダー等のように、デジタルカウント法を用いたバイオマーカーの定量方法が知られている。デジタルカウント法とは、バイオマーカーを多数の微細なウェル（例えば数μｍの寸法のウェル）にひとつずつ分けて、バイオマーカーが収容されているウェルを数えることで、バイオマーカーの濃度を調べる手法である。

デジタルカウント法には、バイオマーカーであるターゲット物質（検出対象）を粒子に結合させ、多数の粒子を多数のウェルに封入した上で、ターゲット物質の数（ターゲット物質が収容されているウェルの数）を検出する方法がある。

例えば、特許文献１には、ターゲット物質を磁性ビーズ（粒子）に結合させた上で、多数の磁性ビーズを含むサンプル流体を、多数の微細なウェルが開口するチャンネル（流路）に流すことにより、多数のウェルに磁性ビーズを収容することが記載されている。また、特許文献１には、磁性ビーズをウェルに収容した後に、蛍光発生基質（ＲＧＰ）等の試薬流体（検出用試薬）をチャンネルに供給することが記載されている。試薬流体は、ターゲット物質と反応することで蛍光現象を発生する酵素等であり、ターゲット物質が入っているウェルを数えるために用いられる。

特表２０１４−５０３８３１号公報

患者の血液等の体液を使用するリキッドバイオプシーを用いたデジタルカウント法において、ターゲット物質の濃度が低くなればなるほど、ターゲット物質を検出しにくくなる。そのため、このような低濃度のターゲット物質を検出する手段が望まれていた。

本発明は、上述した事情に鑑みたものであって、低濃度のターゲット物質を検出することが可能な解析デバイス、解析キット、及び解析システムを提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］検出機を用いて生化学反応を検出するための解析デバイスであって、複数のウェルが形成されたウェルアレイを備え、前記ウェルは、下記式（１）により計算されるアスペクト比が１以上である、解析デバイス。
アスペクト比＝前記ウェルの深さ／平面視において前記ウェルの開口縁に囲まれる領域に内包される円のうち最も大きい円の直径 …（１）
［２］前記ウェルの体積は、１００〜５０００ｆＬである、［１］に記載の解析デバイス。
［３］前記生化学反応は等温反応である、［１］又は［２］に記載の解析デバイス。
［４］前記ウェルの深さは、前記検出機の焦点深度よりも大きくかつ前記焦点深度の１００倍以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載の解析デバイス。
［５］前記ウェルの深さは、前記焦点深度の３倍以上でありかつ前記焦点深度の１０倍以下である、［４］に記載の解析デバイス。
［６］［１］〜［５］のいずれか一項に記載の解析デバイスと、検出用試薬と、封止液と、を備える、解析キット。
［７］［５］に記載の解析キットと、前記検出機と、前記検出機によって測定された測定値を解析する解析手段と、を備える解析システム。

本発明は、以下の態様を含むものであるということもできる。
１態様において、本発明は、検出機を用いて生化学反応を検出するための解析デバイスであって、複数のウェルが形成されたウェルアレイ（マイクロウェルアレイ）を備え、前記ウェルの体積は、１００ｆＬ以上であり、前記ウェルのウェル深さは、前記検出機の焦点深度よりも大きくかつ前記焦点深度の１００倍以下である解析デバイスである。

上記の解析デバイスにおいて、前記ウェル深さは、前記焦点深度の３倍以上でありかつ前記焦点深度の１０倍以下であってもよい。

上記の解析デバイスにおいて、前記ウェルにおいて、前記ウェル深さ／開口径の比は１以上であってもよい。

上記の解析デバイスにおいて、前記生化学反応は、加熱反応であってもよい。

１態様において、本発明は、上記の解析デバイスと、検出用試薬及び封止液と、を備える解析キットである。

１態様において、本発明は、上記の解析キットと、前記検出機と、前記検出機によって測定された測定値を解析する解析手段と、を備える解析システムである。

上記の解析デバイス、解析キット、及び解析システムによれば、低濃度のターゲット物質を検出することができる。

本実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。 図１のＩＩ−ＩＩ線における断面図である。 前記マイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイの要部を示す図である。 前記マイクロ流体デバイスの使用例を説明するための図である。 前記マイクロ流体デバイスの使用例を説明するための図である。 前記マイクロ流体デバイスの使用例を説明するための図である。 前記マイクロウェルアレイのウェルと検出機の焦点深度とを模式的に示す図である。 実施例１に関する蛍光視野の撮影画像である。 比較例１に関する蛍光視野の撮影画像である。 実施例３の解析デバイスのウェルアレイの走査型電子顕微鏡写真である。 実施例４の解析デバイスのウェルアレイの走査型電子顕微鏡写真である。 実施例５の解析デバイスのウェルアレイの走査型電子顕微鏡写真である。 比較例３の解析デバイスのウェルアレイの走査型電子顕微鏡写真である。 比較例４の解析デバイスのウェルアレイの走査型電子顕微鏡写真である。 （ａ）は、実施例３の解析デバイスを用いて蛍光シグナルを検出した代表的な写真である。（ｂ）は、実施例４の解析デバイスを用いて蛍光シグナルを検出した代表的な写真である。（ｃ）は、実施例５の解析デバイスを用いて蛍光シグナルを検出した代表的な写真である。（ｄ）は、比較例３の解析デバイスを用いて蛍光シグナルを検出した代表的な写真である。（ｅ）は、比較例４の解析デバイスを用いて蛍光シグナルを検出した代表的な写真である。

以下、本発明の一実施形態に係る解析デバイス、解析キット、及び解析システムついて、図１から図１５を参照して説明する。

まず、本実施形態に係る解析デバイスとして、リキッドバイオプシーを用いたデジタルカウント法に用いられるマイクロ流体デバイス１について説明する。図１は、マイクロ流体デバイス１を示す斜視図である。図２は、図１のＩＩ−ＩＩ線における断面図である。図３は、マイクロ流体デバイス１のマイクロウェルアレイ４の要部を示す図である。また、図３（ａ）はその平面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＩＩＩｂ−ＩＩＩｂ線における断面図である。なお、マイクロ流体デバイス１は、リキッドバイオプシーに限らず、タンパク質や、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス粒子、細菌などの測定にも使用可能である。

図１から図３に示すように、マイクロ流体デバイス１は、複数のウェル３が形成されたマイクロウェルアレイ４を備えている。マイクロウェルアレイ４の複数のウェル３は、図３（ａ）に例示するように、アレイ状に配列されている。図３（ａ）では、ウェル３は、横方向（図３（ａ）において左右方向）に間隔をあけて複数並んでいる。また、横方向に並んだ複数のウェル３からなる横配列ウェル群３０は、縦方向（図３（ａ）において上下方向）に複数並んでいる。縦方向に隣り合う横配列ウェル群３０は、互いに縦方向にウェル３が重ならないように横方向にずれて配置されている。マイクロウェルアレイ４において、複数のウェル３の形状は全て同一であることが好ましい。

複数のウェル３が開口するマイクロウェルアレイ４の面（開口面６）は平坦となっている。複数のウェル３は、例えばマイクロウェルアレイ４の開口面６の全体に形成されてもよいが、本実施形態では、マイクロウェルアレイ４の開口面６のうち周縁領域７を除く領域（ウェル形成領域８）に形成されている。ウェル形成領域８の周縁形状は任意であってよいが、本実施形態では長方形となっている。

図２及び図３に示すように、ウェル３は、底を有する穴である。本実施形態では、ウェル３は円筒状に形成され、底面９を有している。なお、ウェル３の形状は、円筒形に限られず、任意であってよく、例えば円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であってもよい。ここで、逆円錐形及び逆角錐形とは、それぞれ円錐及び角錐の底面がウェル３の開口部となるようなウェル３の形状を意味する。ウェル３の形状が逆円錐形や逆角錐形である場合には、例えば円錐や角錐の頂部を切り取り、ウェル３の底面９を平坦にしてもよい。他の例として、ウェル３の底面９を、ウェル３の開口部に向けて凸又は凹となる曲面状に形成してもよい。また、ウェル３の形状は、例えば上述の形状を二つ以上組み合わせたような形状であってもよい。例えば、ウェル３の形状は、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であってもよい。

したがって、ウェル３において、ウェルの深さ方向に垂直な面における断面積は一定であってもよいし、異なっていてもよい。また、ウェル３において、ウェルの深さ方向に垂直な面における断面の形状は円であってもよいし、円以外の任意の形状であってもよい。また、ウェル３において、ウェルの深さ方向に垂直な面における断面の形状は、ウェルの深さ方向全体にわたって一定であってもよいし、ウェルの深さに応じて異なっていてもよい。

図３（ｂ）に示すように、本実施形態では、ウェル３の深さ（ウェル深さ）Ｗｈは、ウェル３の開口径Ｗｄよりも大きくなっている。すなわち、ウェル深さＷｈ／開口径Ｗｄの比は、１よりも大きくなっている。

いいかえると、ウェル３は、下記式（１）により計算されるアスペクト比が１以上である。
アスペクト比＝ウェルの深さ／平面視において前記ウェルの開口縁に囲まれる領域に内包される円のうち最も大きい円の直径 …（１）

上述したように、ウェルの深さ方向に垂直な面における断面の形状は、ウェルの深さ方向全体にわたって一定の場合もあるし、ウェルの深さに応じて異なっている場合もある。本明細書では、いずれの場合においても、ウェルの開口部を平面視し、開口縁に囲まれる領域に内包される円のうち最も大きい円の直径をアスペクト比の計算に用いるものとする。ここで、開口縁とは、ウェルの開口部における縁を意味する。

例えば、ウェルの形状が円筒形である場合、「平面視において前記ウェルの開口縁に囲まれる領域に内包される円のうち最も大きい円の直径」は、ウェルの開口部における直径とすることができる。

実施例において後述するように、解析デバイスのウェルアレイを構成するウェルのアスペクト比が１以上であると、低濃度のターゲット物質を良好に検出することができる。ここで、良好に検出することができるとは、例えば、シグナル／ノイズ比が高いことを意味する。シグナルとは、目的の生化学反応により生成されるシグナルであり、ノイズとは、シグナルが生成されない陰性対照の生化学反応により生成されるシグナルである。ノイズは、例えば、検出対象を含まない検出用試薬を反応させた場合のシグナルであってもよく、バックグラウンドといいかえることもできる。

解析デバイスのウェルアレイを構成するウェルにおいて、上記式（１）により計算されるアスペクト比は、例えば１以上であってもよく、例えば１．３以上であってもよく、例えば１．７以上であってもよく、例えば２以上であってもよく、例えば３以上であってもよく、例えば３．５以上であってもよく、例えば４以上であってもよい。しかしながら、アスペクト比が高くなると、ウェルアレイの製造が困難になる場合がある。このため、アスペクト比の上限は、例えば１０であってもよく、例えば５であってもよく、例えば４であってもよい。

以下、上記式（１）における「平面視において前記ウェルの開口縁に囲まれる領域に内包される円のうち最も大きい円の直径」のことを、「ウェルの開口径」という場合がある。

ウェル３の開口径Ｗｄは、例えば１００μｍ以下である。ここで、ウェル深さＷｈは、開口面６に対して垂直な方向における、ウェル３の開口縁３ａと底面９との間の距離のうち最も大きい距離である。また、開口径Ｗｄは、平面視において開口縁３ａに囲まれる領域に内包される円のうち最も大きい円の直径である。本実施形態では、ウェル３の形状は円筒形であるため、ウェル深さＷｈは円筒の軸方向の長さであり、開口径Ｗｄは円筒の円の直径である。例えば、ウェル３の形状が逆三角錐の場合には、ウェル深さＷｈは逆三角錐の高さ、すなわち底面に垂直な方向における三角形の底面とこの底面に含まれない頂点との間の距離であり、開口径Ｗｄは、底面の三角形に内接する円の直径である。

また、ウェル深さＷｈは、マイクロ流体デバイス１に用いられる後述する検出機の焦点深度よりも大きくかつ焦点深度の１００倍以下であってもよい。好ましくは、ウェル深さＷｈは、検出機の焦点深度の３倍以上１０倍以下であってもよい。

また、ウェル３の体積は、１００ｆＬ（フェムトリットル）以上であることが好ましい。また、ウェル３の体積の上限は、例えば５０００ｆＬであってよい。ウェル３の体積は、４０００ｆＬ以下であることが好ましく、３０００ｆＬ以下であることがより好ましく、２５００ｆＬ以下であることが更に好ましく、２０００ｆＬであることが特に好ましい。

マイクロウェルアレイ４は、光を通すように構成されてもよいが、これに限ることはない。マイクロウェルアレイ４を構成する材料は、ウェル３（特にウェル３の内面）に求める特性を考慮し、親水性材料又は疎水性材料の何れかを選択すればよい。マイクロウェルアレイ４を構成する材料としては、例えばガラス、樹脂、金属の少なくとも１つ、又は、複数を混合した材料が挙げられる。

さらに本実施形態のマイクロウェルアレイ４の具体的な構成について説明する。図２及び図３に示すように、マイクロウェルアレイ４は、板状の底部層１１と、底部層１１の上に重ねて形成された板状の壁部層１２と、を備えている。

底部層１１のうち壁部層１２が配置される面は、ウェル３の底面９を構成する。より詳細には、壁部層１２が配置される底部層１１の面のうち、壁部層１２が配置されない領域は、ウェル３の底面９を構成する。底部層１１には、例えばガラスや樹脂を用いることができる。壁部層１２は、その厚さ方向に貫通し、厚さ方向から見てアレイ状に配列された複数の孔部を有する。各孔部の内面は、ウェル３の内周面１０を構成する。壁部層１２には、例えば樹脂を用いることができる。

底部層１１及び壁部層１２は、図２及び図３に例示するように別個に形成されてもよいし、例えば樹脂の射出成形等によって一体に形成されてもよい。マイクロウェルアレイ４のウェル３は、例えばフォトリソグラフィを使って形成されてもよいし、上記した射出成形等の際に同時に形成されてもよい。

図１及び図２に示すように、マイクロウェルアレイ４には、マイクロウェルアレイ４とともにマイクロ流体デバイス１の流路２を構成する蓋部材５が設けられている。蓋部材５は、板状又はシート状に形成された部材であり、マイクロウェルアレイ４の開口面６に対向して配置されている。マイクロウェルアレイ４と蓋部材５との間には、流路２として機能する隙間が存在している。

蓋部材５は、その厚さ方向に貫通する複数の貫通孔１５を有する。各貫通孔１５は、マイクロ流体デバイス１の流路２に連通し、流路２内に流体を供給する入口や、流体を排出する出口として機能する。本実施形態において、蓋部材５は二つの貫通孔１５Ａ、１５Ｂ（第一貫通孔１５Ａ及び第二貫通孔１５Ｂ）を有する。二つの貫通孔１５Ａ、１５Ｂは、長方形とされたウェル形成領域８のうち互いに向かい合う二つの角部に対応する位置に配されている。

本実施形態において、各貫通孔１５は、小孔部１６と、貫通方向から見た大きさが小孔部１６よりも大きな大孔部１７と、を有している。小孔部１６と大孔部１７とは、貫通孔１５の貫通方向に並んでいる。小孔部１６は、マイクロ流体デバイス１の流路２側に開口する貫通孔１５の開口端を構成している。大孔部１７は、マイクロ流体デバイス１の流路２と反対側に開口する貫通孔１５の開口端を構成している。大孔部１７は、例えばマイクロ流体デバイス１の流路２から溢れた流体を貯留する流体貯留部として機能する。複数の貫通孔１５は、例えば同じ形状、大きさに形成されてもよいし、互いに異なる形状、大きさに形成されてもよい。

蓋部材５は、例えば光を通すように構成されてもよいが、これに限ることはない。例えば、ウェル３に収容される粒子やバイオマーカー等の検出対象が存在することによる蛍光等のシグナルを光学的手法で検出する場合には、蓋部材５及びマイクロウェルアレイ４の少なくとも一方が、光を通すように構成されているとよい。また、ウェル３に収容される粒子やバイオマーカー等の検出対象が存在することによる蛍光などのシグナルを光学的手法以外の手法で検出する場合には、蓋部材５及びマイクロウェルアレイ４は、例えば光を通すように構成されなくてもよい。

蓋部材５を構成する材料としては、例えばガラス、樹脂、金属のうち少なくとも１つ、又は、複数を混合した材料が挙げられる。蓋部材５は、流体等が流路２において流れる際に変形しない程度の剛性を有してもよい。

マイクロウェルアレイ４と蓋部材５との間には、マイクロウェルアレイ４のウェル形成領域８を囲むスペーサ１８が設けられている。スペーサ１８は、マイクロウェルアレイ４と蓋部材５との隙間を確保し、マイクロウェルアレイ４及び蓋部材５と共にマイクロ流体デバイス１の流路２を構成する。

スペーサ１８は、例えばマイクロウェルアレイ４や蓋部材５と一体に形成されてもよいが、本実施形態では別個に形成されている。スペーサ１８の材質等に特に制限はないが、例えばシリコーンゴムやアクリル発泡体からなる芯材フィルムの両面に粘着剤（例えばアクリル系粘着剤）が積層された両面粘着テープや、接着剤を両面に塗布した紙等が挙げられる。

次に、上述したマイクロ流体デバイス１の使用例について説明する。図４から図６は、マイクロ流体デバイス１の使用例を説明するための図である。

はじめに、ターゲット物質となる粒子２１を含有する粒子含有流体２０と、封止液２４と、を準備する。粒子含有流体２０は、粒子２１及び溶媒流体２２から構成されており、さらに検出用試薬２３が混合されている。検出用試薬２３は、ターゲット物質に生化学反応を起こさせるための試薬であり、ターゲット物質に応じて適宜選択される。封止液２４は、例えばオイルである。本実施形態に係る解析キットは、上述したマイクロ流体デバイス１、検出用試薬２３、及び封止液２４から構成されている。

ターゲット物質となる粒子２１は、例えばＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質、ウイルス粒子、細菌、細胞、エクソソームなどの分析対象物である。また、粒子２１は、上記のＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質、ウイルス粒子、細菌、細胞、エクソソームなどの分析対象物を捕捉したビーズなどの捕捉物であってもよい。ウェル３で反応する試薬は、ウイルス粒子、細菌、細胞、及びエクソソームに対しては、外殻のタンパク質や糖鎖だけでなく、内部に格納されているＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質を検出することも可能である。また、分析対象物を捕捉するビーズは、ウイルス粒子、細菌、細胞、エクソソームなどの外殻のタンパク質や糖鎖を識別するような物質をビーズ表面に持つことも可能である。

次に、マイクロ流体デバイス１を、流路２における粒子含有流体２０及び封止液２４の流れが水平方向になるように、かつ、ウェル３の開口が鉛直方向において上側を向くように配置する。続いて、ピペットを用いて、粒子含有流体２０をマイクロ流体デバイス１の第一貫通孔１５Ａから流路２に注入する。図４は、粒子含有流体２０を注入し終わったところを示している。

その後、図５及び図６に示すように、封止液２４をマイクロ流体デバイス１の第一貫通孔１５Ａから流路２に注入し、流路２を封止液２４で満たす。すなわち、流路２内の粒子含有流体２０を封止液２４に置換する。これにより、各ウェル３内の粒子含有流体２０が封止液２４によって封止される。封止を行った後に、例えば、マイクロ流体デバイス１を加熱することによって内部で生化学反応が起こる。

生化学反応としては、酵素反応が挙げられる。酵素反応は等温反応であってもよく、例えばＰＣＲ等の温度サイクルを要する反応（変温反応）であってもよい。しかしながら、機器構成、解析手順を単純化できる観点から、酵素反応は等温反応であることが好ましい。また、等温反応は、変温反応と比べて、安定した酵素反応を得ることができ、再現性が高い傾向にある。

具体的な等温反応としては、例えば、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法等が挙げられるがこれらに限定されない。

反応後にマイクロウェルアレイ４のウェル３内において測定対象となるシグナルとしては、蛍光や、発光、燐光等が挙げられる。これらの波長域は、可視光や、紫外線、赤外線等の電磁波として観測可能なものを対象とできる。このため、このような波長域を測定できる測定機器を有している検出機器を、本実施形態に係る検出機として利用可能である。具体的に、本実施形態では、反応を検出するための検出機として蛍光顕微鏡４０を使用している。

マイクロウェルアレイ４が光を通すように構成されている場合、マイクロ流体デバイス１は、蛍光顕微鏡４０でマイクロウェルアレイ４側から観察できるように配置される。蛍光顕微鏡４０で観察した画像は、例えば図８のように示される。図８の例では、蛍光顕微鏡４０により蛍光を観察している。

ここで、ウェル３のウェル深さＷｈと蛍光顕微鏡４０の焦点深度ＤＯＦとの関係についてより詳細に説明する。焦点深度とは、顕微鏡でサンプル面を観察又は撮影する時に、ピントが合っている位置から対物レンズとサンプル面との距離を変えてもピントがシャープに合っている範囲を指す。本明細書では、この範囲の大きさを焦点深度の値とする。図７は、ウェル３と蛍光顕微鏡４０の焦点深度ＤＯＦとを模式的に示す図である。図７（ａ）は、従来のウェル３Ｐの場合を示し、図７（ｂ）は、本実施形態に係るウェル３の場合を示している。

図７（ａ）に示すように、従来のウェル３Ｐでは、ウェル深さＷｈｐは、蛍光顕微鏡４０の焦点深度ＤＯＦよりも小さく設定されている。一方で、蛍光顕微鏡４０によって観察できる範囲は、概ね焦点深度ＤＯＦの範囲である。このため、ウェル３Ｐ内の液体が生化学反応により全体的に蛍光しており、蛍光顕微鏡４０の焦点ＦＰがウェル３Ｐの底面９Ｐに合わせられている場合に、蛍光顕微鏡４０は、焦点深度ＤＯＦよりも小さいウェル深さＷｈｐの範囲でウェル３Ｐ内の液体の蛍光を観察する。すなわち、蛍光顕微鏡４０は、ウェル深さＷｈｐの範囲で蛍光が積算された状態を観察する。

これに対して、図７（ｂ）に示すように、本実施形態に係るウェル３では、ウェル深さＷｈは、検出機である蛍光顕微鏡４０の焦点深度ＤＯＦよりも大きく設定されている。このため、ウェル３内の液体が生化学反応により全体的に蛍光しており、蛍光顕微鏡４０の焦点ＦＰがウェル深さＷｈの半分の位置に合わせられている場合に、蛍光顕微鏡４０は、焦点深度ＤＯＦの全体の範囲でウェル３Ｐ内の液体の蛍光を観察する。このため、蛍光顕微鏡４０は、焦点深度ＤＯＦの全体の範囲で蛍光が積算された状態を観察する。このように、本実施形態に係るウェル３では、従来のウェル３Ｐに比べて、蛍光顕微鏡４０によって蛍光をより多く積算した状態で観察することができる。これにより、従来の装置では検出できなかった低濃度のターゲット物質の場合であっても、蛍光をより多く積算することによって、検出することができる。

なお、上述した例では、ターゲット物質を粒子２１として粒子２１を含む粒子含有流体２０を用いているが、これに限らない。流体がターゲット物質を含んでいれば、粒子２１を含んでいなくてもよい。

また、検出機には、測定した蛍光値等（測定値）を解析する解析手段４１を有していてもよい。解析手段４１として、例えばプレートリーダーや分光光度計等を用いることができる。本実施形態に係る解析システムは、上述したマイクロ流体デバイス１、蛍光顕微鏡（検出機）４０、及び解析手段４１から構成されている。

本実施形態によれば、マイクロ流体デバイス１は、蛍光顕微鏡４０を用いて生化学反応を検出するための解析デバイスであって、複数のウェル３が形成されたマイクロウェルアレイ４を備えている。ウェル３の体積は、１００ｆＬ以上であってもよい。ウェル３のウェル深さＷｈは、蛍光顕微鏡４０の焦点深度ＤＯＦよりも大きくかつ焦点深度ＤＯＦの１００倍以下であってもよい。

上述したマイクロ流体デバイス１において、ウェル３のウェル深さＷｈが蛍光顕微鏡４０の焦点深度ＤＯＦよりも大きい場合、従来の構成に比べて、ターゲット物質が存在する場合に生化学反応によって発生する蛍光等のシグナルをウェル深さＷｈに沿ってより多く積算することができる。これにより、ターゲット物質の濃度が低い場合であっても、より確実にターゲット物質を検出することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

〔実施例１〕
本実施例では、ウェルの深さを変えて、蛍光を積算させる効果について検討した。

（条件）
マイクロ流体デバイスの各ウェルは、円筒形に形成した。各ウェルの直径（開口径）は５μｍ、ウェルの深さは２０μｍとした（設計値）。上記構成のウェルを有するマイクロ流体デバイスを、熱可塑性樹脂を用いて射出成形で作製した。

試薬１として、フルオレセイン、ＭＯＰＳ（３−モルフォリノプロパンスルフォン酸）、ＭｇＣｌ_２、Ｔｗｅｅｎ、ＤＤＷ（精製水）を混合した混合液を調製した。より詳細には、試薬１として、２０μＭ フルオレセイン、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ＤＤＷを混合した混合液を調製した。また、封止液２４として、オイル（ＦＣ４０、ＳＩＧＭＡ社製）を使用した。

（手順）
まず、上記で調製した試薬１（２０μＬ）をピペットを用いてマイクロ流体デバイスの第一貫通孔に送液した。その後、オイル（１５０μＬ）をマイクロ流体デバイスの第一貫通孔に送液して封止を行った。そして、蛍光顕微鏡（キーエンス社製）で観察を行った。蛍光顕微鏡の焦点深度は、３μｍ（±１．５μｍ）であった。

（結果）
図８に、実施例１の蛍光顕微鏡での蛍光視野の写真を示す。実施例１では、蛍光値（相対値）は３５００程度であった。

〔比較例１〕
実施例１の条件と比較して、ウェルのウェル深さのみ３μｍに変更したマイクロ流体デバイスを用いた。また、手順は実施例１と同様である。

図９に、比較例１の蛍光顕微鏡での蛍光視野の写真を示す。比較例１では、蛍光値（相対値）は１１００程度であった。

以上の結果より、実施例１のマイクロ流体デバイスでは、比較例１と比較して、蛍光値を３倍以上積算できたと言える。

〔実施例２〕
本実施例では、ウェルの深さを変えて、検出可能なターゲット物質の低濃度について検討した。

（条件）
マイクロ流体デバイスの各ウェルは、円筒形に形成した。各ウェルの直径（開口径）は５μｍ、ウェルの深さは２０μｍとした（設計値）。上記構成のウェルを有するマイクロ流体デバイスを、熱可塑性樹脂を用いて射出成形で作製した。

試薬２として、アレルプローブ２種、インベーダーオリゴ１種、ＦＲＥＴ２種、ＭＯＰＳ、ＭｇＣｌ_２、フラップエンドヌクレアーゼ、Ｔｗｅｅｎ、ＤＤＷ、ターゲット２種を混合した混合液を調製した。より詳細には、試薬２として、下記表１に示す１μＭ アレルプローブ１、１μＭ アレルプローブ２、１μＭ インベーダーオリゴ、ターゲット核酸１、ターゲット核酸２、及び、検出用のＦＲＥＴカセット２種（終濃度２μＭ）、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０００Ｕ／μＬ フラップエンドヌクレアーゼ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ＤＤＷを混合した混合液を調製した。このとき、試薬２内のターゲット核酸１及びターゲット核酸２の濃度が、それぞれ、０ｆＭ、０．２ｆＭ（２００ａＭ）、２ｆＭ、２０ｆＭ、２００ｆＭになるように５種類を調製した。また、封止液２４として、オイル（ＦＣ４０、ＳＩＧＭＡ社製）を使用した。

表１中のターゲット核酸１（配列番号１）とターゲット核酸２（配列番号２）は検出対象となる核酸であり、それぞれ小文字で示したｇ（グアニン）とａ（アデニン）の塩基配列のみが異なっている。

アレルプローブ１（配列番号３）はターゲット核酸１に相補的な配列を有しており二本鎖を形成するが、小文字部分「５’−ｃｇｃｇｃｃｇａｇｇ−３’」（配列番号６）は塩基対形成せず、フラップ部位を形成し、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて核酸断片として切り出される。

アレルプローブ２（配列番号４）はターゲット核酸２に相補的な配列を有しており二本鎖を形成するが、小文字部分「５’−ａｃｇｇａｃｇｃｇｇａｇ−３’」（配列番号７）は塩基対形成せず、フラップ部位を形成し、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて核酸断片として切り出される。

続いて、切り出された各核酸断片がＦＲＥＴカセットにハイブリダイズしてフラップ部位が形成され、フラップエンドヌクレアーゼの基質となり切断される。その結果、蛍光シグナルが検出される。

（手順）
まず、上記で調製した試薬２（２０μＬ）をピペットを用いてマイクロ流体デバイスの第一貫通孔に送液した。その後、オイル（１５０μＬ）をマイクロ流体デバイスの第一貫通孔に送液して封止を行った。続いて、マイクロ流体デバイスを加熱して等温反応を行い蛍光シグナルを発生させた。さらに、蛍光顕微鏡（キーエンス社製）で観察を行った。蛍光顕微鏡の焦点深度は、３μｍ（±１．５μｍ）であった。

実施例２では、蛍光顕微鏡で、マイクロ流体デバイスに形成されたウェルを任意に視野に入れ、各ターゲット濃度についてそれぞれ５枚撮影を行った。最後に撮影した５枚の写真において蛍光シグナルを発生したウェル（以下、「蛍光ウェル」と適宜称する。）をカウントして平均値を算出した。

（結果）
結果を下記表２に示す。表２に示すように、試薬２内のターゲット濃度が０ｆＭ、０．２ｆＭ、２ｆＭ、２０ｆＭ、２００ｆＭでのインベーダー反応がそれぞれ確認できた。また、ターゲット濃度が２００ｆＭから０．２ｆＭにかけて１０分の１ずつ減少するのにつれて、蛍光ウェルのカウント数の平均値も約１０分の１ずつ減少していることが分かる。ただし、蛍光ウェルのカウント数の平均値が１以下となる場合には、蛍光ウェルを確認できないことになる。したがって、２ｆＭの低濃度まで検出可能なことが確認できた。

〔比較例２〕
実施例２の条件と比較して、ウェルのウェル深さのみ３μｍに変更したマイクロ流体デバイスを用いた。また、試薬２内のターゲット核酸１及びターゲット核酸２の濃度が、それぞれ、０ｆＭ、２０ｆＭ、２００ｆＭ、２０００ｆＭ（２ｐＭ）、２００００ｆＭ（２０ｐＭ）、２０００００ｆＭ（２００ｐＭ）になるように６種類を調製した。

（手順）
まず、上記で調製した試薬２（２０μＬ）をピペットを用いてマイクロ流体デバイスの第一貫通孔に送液した。次に、オイル（１５０μＬ)をマイクロ流体デバイスの第一貫通孔に送液して封止を行った。続いて、マイクロ流体デバイスを加熱して蛍光反応を行った。さらに、蛍光顕微鏡（キーエンス社製）で観察を行った。蛍光顕微鏡の焦点深度は、３μｍ（±１．５μｍ）であった。

実施例２と同様に、蛍光顕微鏡で、マイクロ流体デバイスに形成されたウェルを任意に視野に入れ、各ターゲット濃度についてそれぞれ５枚撮影を行った。最後に撮影した５枚の写真の蛍光ウェルをカウントして平均値を算出した。

（結果）
結果を下記表３に示す。表３に示すように、試薬２内のターゲット核酸１及びターゲット核酸２の濃度が、それぞれ、濃度が０ｆＭ、２０ｆＭ、２００ｆＭ、２０００ｆＭ、２００００ｆＭ、２０００００ｆＭでのインベーダー反応がそれぞれ確認できた。また、表３から、ターゲット濃度が２０００ｆＭから２０ｆＭにかけて１０分の１ずつ減少するにつれて、蛍光ウェルのカウント数の平均値も約１０分の１ずつ減少していることが分かる。しかし、２０ｆＭにおける蛍光ウェルのカウント数の平均値が７．４であるため、ターゲット濃度が１０分の１に減少した２ｆＭの場合には蛍光ウェルのカウント数の平均値が１以下になると想定され、蛍光ウェルを確認できないことになる。したがって、比較例２では、２ｆＭ以下の低濃度では、ターゲット物質を適切に検出できないと考えられる。

以上の結果から、実施例２のマイクロ流体デバイスでは、比較例２のマイクロ流体デバイスの約１０倍の検出感度を実現することができた。

また、上述した実施例に加えて、発明者らの検討によって、さらに下記の知見が得られた。

ウェルの体積を大きくする事によって一定の範囲の蛍光をカウントすれば低濃度のターゲット物質を検出する事が可能となる場合がある。この場合に、例えば１０ｆＭの濃度を検出する際には１視野（例えば、ウェルが正方格子状に配列されている場合に１００×１００個のウェルを含む領域）あたりのカウントが６個程度であるため、ウェルの体積は１００ｆＬ以上が好ましい。また、ウェルのアスペクト比（ウェルの開口径に対するウェル深さの比）は、大きい方が好ましい。

また、ウェルのウェル深さを大きくすることによって光を集光することができる。ウェル深さは、顕微鏡等の検出機の焦点深度よりも大きくすることが好ましい。このように、ウェル深さを大きくすることによって、焦点深度外に存在する蛍光物質からの光を積算することができる。

１分子のＤＮＡを検出対象として、酵素反応による単位時間あたりに発生される蛍光分子の数Ｆが一定の場合、ウェルの体積Ｖ（ここでは、ウェルを直径ａ及び深さｈの円筒状に形成した場合の体積）中での蛍光分子の濃度Ｄａは、次に示す式（２）で表される。
Ｄａ＝Ｆ／（π×ａ^２×ｈ／４） …（２）
蛍光顕微鏡で積算できる蛍光は、焦点深度の１００倍より狭い範囲においては観察方向（ウェルの深さ方向）に存在する蛍光分子であり、検出される蛍光輝度（蛍光強度）は観察方向に直交する平面における単位体積あたりの蛍光分子となるため、この場合の蛍光輝度Ｑは、次に示す式（３）で表される。
Ｑ＝Ｆ／（π×ａ^２／４） …（３）
よって、ウェルの体積Ｖが同じ場合には、直径ａを小さくし、深さｈを大きくするほうが、蛍光を積算させる（測定する蛍光量を増やす）ためには好ましい。また、直径ａと深さｈとの比は、ｈ／ａ≧１が好ましく、ｈ／ａ≧１．５がさらに好ましい。

また、顕微鏡で１回に撮影可能な単位体積あたりのウェルの体積を増やすことで、ターゲット分子がウェルに入る確率が増えるため、低濃度サンプルの検出が可能となる。体積を増やすためには、ウェルを近接して配置させるだけでなく、ウェルの体積を増やす必要がある。ウェルの近接配置のためにはウェルの直径は小さい方がよく、深さ方向に体積を増やす方が好ましい。

ウェルにおいて表面積あたりの体積を大きくすることによって、酵素反応の反応性が向上する場合がある。例えば、ウェルの直径を変化させることによって反応性が向上する場合があり、またウェルのアスペクト比を変化させることによって反応性が向上する場合がある。ウェル内等のような微小空間内での酵素反応において、固層表面から受ける影響は無視できない。このため、ウェルの体積あたりのウェル内壁の表面積を小さくすることによって、ウェル内壁への酵素やターゲットの吸着などによる表面からの影響を小さくすることができる。反応体積（ウェルの体積）の表面積比を小さくするためには、体積を大きくすることが必要となり、ウェルの直径を大きくすることになる。このため、上述したウェルの深さを大きくすることによる光の積算との調整を行う必要がある。よって、反応体積が５０００ｆＬ以上の場合には、ウェルの表面積比（ウェルの表面積／ウェルの体積）が０．４以下であることが好ましい。また、反応体積が５０００ｆＬ以下の場合には、ウェルの表面積比が１以下であることが好ましい。

また、封止液として用いるオイルは酵素反応に対して反応を阻害する影響を大きく与える可能性がある。よって、オイルと接している面積を小さくするために、ウェルが同じ体積であればウェルの直径を小さくすることが好ましい。また、ウェルの深さを大きくしてウェルの底面からオイルまでの距離を長くすることで反応阻害を防ぐことができる。ウェルの底面からオイルまでの距離は２０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましい。また、ウェルの底面からオイルまでの距離は３μｍ以下であると反応阻害の影響が強く現れる。

生化学反応が加熱反応である場合には、ウェル内に保持された微量な反応液の蒸発を考慮する必要がある。１００ｆＬ以下の反応体積では、ウェル内の反応液の蒸発により生化学反応が停止していると考えられる。

〔実施例３〜５、比較例３、４〕
ウェルの深さ及び開口径が異なるウェルを有する、実施例３〜５、比較例３、４のウェルアレイを備えた解析デバイス（マイクロ流体デバイス）を製造した。解析デバイスの形状は図１、２に示すものと同様であった。各ウェルは円筒形に形成した。

続いて、上記表１に示した核酸断片を用いて、以下の条件でＩｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙによる核酸検出を行った。

具体的には、試薬３として、上記表１に示す、０．１μＭ アレルプローブ１、０．１μＭ アレルプローブ２、１μＭ インベーダーオリゴ、１０ｆＭ ターゲット核酸１、及び、検出用のＦＲＥＴカセット２種（終濃度２μＭ）、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０３ｍｇ／ｍＬ フラップエンドヌクレアーゼ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ＤＤＷを混合した混合液を調製した。また、封止液２４として、オイル（ＦＣ４０、ＳＩＧＭＡ社製）を使用した。

なお、試薬３では、ターゲット核酸２を使用していないが、実際に塩基変異を検出する場合の実験条件に近づけるため、アレルプローブ２や、アレルプローブ２に対応したＦＲＥＴカセットも混合した。

続いて、ピペットを用いて、上記で調製した試薬３（２０μＬ）をマイクロ流体デバイスの第一貫通孔に送液した。続いて、オイル（ＦＣ４０、ＳＩＧＭＡ社製）１５０μＬをマイクロ流体デバイスの第一貫通孔に送液して封止を行った。続いて、マイクロ流体デバイスを加熱して、等温反応による蛍光シグナルの生成を行った。さらに、蛍光顕微鏡（キーエンス社製）でマイクロ流体デバイスのウェルアレイを観察し、シグナルの蛍光強度（相対値）を測定した。

より具体的には、蛍光顕微鏡でマイクロ流体デバイスに形成されたウェルを任意に視野に入れ撮影を行い、撮影した写真の中で、有意にシグナルを発したウェルの蛍光強度（相対値）を測定してその平均値をシグナル値として算出すると共に、有意なシグナルを発しなかったウェルの蛍光強度（相対値）を測定してその平均値をノイズ値として算出した。蛍光顕微鏡の焦点深度は、３μｍ（±１．５μｍ）であった。

上記の一連の実験について、実施例３〜５、比較例３、４のウェルアレイを備えた各解析デバイスにおけるシグナルとノイズの蛍光強度（相対値）をそれぞれ測定した。

また、実施例３〜５、比較例３、４の解析デバイスのウェルアレイを、ウェルの中心を含み、ウェルの深さ方向に沿った面でそれぞれ切断し、走査型電子顕微鏡で観察して、ウェルの開口径及び深さを実測した。また、ウェルの開口径は、ウェルの開口部における直径とした。

図１０〜１４は、それぞれ、実施例３〜５、比較例３、４の解析デバイスのウェルアレイの走査型電子顕微鏡写真である。また、図１５（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ、実施例３〜５、比較例３、４の解析デバイスを用いて蛍光シグナルを検出した代表的な写真である。

下記表４に、実施例３〜５、比較例３、４の解析デバイスのウェルアレイの開口径、ウェルの深さ、アスペクト比、ウェルの体積、シグナル（相対値）の平均値、ノイズ（相対値）の平均値、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を示す。

その結果、アスペクト比が１以上である、実施例３〜５の解析デバイスは、高いシグナル／ノイズ比を示し、低濃度のターゲット物質を良好に検出することができることが明らかとなった。

以上、本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。

１…マイクロ流体デバイス（解析デバイス）、３…ウェル、４…マイクロウェルアレイ、２３…検出用試薬、２４…封止液、４０…蛍光顕微鏡（検出機）、４１…解析手段、ＤＯＦ…焦点深度、ＦＰ…焦点、Ｗｄ…開口径、Ｗｈ…ウェル深さ。

Claims (7)

1. 検出機を用いて生化学反応を検出するための解析デバイスであって、
   複数のウェルが形成されたウェルアレイを備え、
   前記ウェルは、下記式（１）により計算されるアスペクト比が１以上である、解析デバイス。
   アスペクト比＝前記ウェルの深さ／平面視において前記ウェルの開口縁に囲まれる領域に内包される円のうち最も大きい円の直径 …（１）
2. 前記ウェルの体積は、１００〜５０００ｆＬである、請求項１に記載の解析デバイス。
3. 前記生化学反応は等温反応である、請求項１又は２に記載の解析デバイス。
4. 前記ウェルの深さは、前記検出機の焦点深度よりも大きくかつ前記焦点深度の１００倍以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の解析デバイス。
5. 前記ウェルの深さは、前記焦点深度の３倍以上でありかつ前記焦点深度の１０倍以下である、請求項４に記載の解析デバイス。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の解析デバイスと、検出用試薬と、封止液と、を備える、解析キット。
7. 請求項５に記載の解析キットと、前記検出機と、前記検出機によって測定された測定値を解析する解析手段と、を備える解析システム。