WO2023214516A1 - 検出キット、封止液、封止液の保存方法及び試料検出方法 - Google Patents

検出キット、封止液、封止液の保存方法及び試料検出方法 Download PDF

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WO2023214516A1
WO2023214516A1 PCT/JP2023/015962 JP2023015962W WO2023214516A1 WO 2023214516 A1 WO2023214516 A1 WO 2023214516A1 JP 2023015962 W JP2023015962 W JP 2023015962W WO 2023214516 A1 WO2023214516 A1 WO 2023214516A1
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WO
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sealing liquid
sample
less
detection
target substance
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/015962
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Inventor
雄一郎 篠原
晋一 和田
圭佑 後藤
雄太 鈴木
Original Assignee
凸版印刷株式会社
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/08—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a stream of discrete samples flowing along a tube system, e.g. flow injection analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a detection kit, a sealing liquid, a method for preserving the sealing liquid, and a method for detecting a sample.
  • biomolecules may be detected by introducing biomolecules into micropores and performing a reaction accompanied by heating.
  • Non-Patent Document 1 Digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), digital Polymerase Chain Reaction (PCR), and digital Invasive Cleavaged Assay (ICA) described in Non-Patent Document 1. .
  • ELISA electrowetting-Coupled ImmunoSorbent Assay
  • PCR digital Polymerase Chain Reaction
  • ICA digital Invasive Cleavaged Assay
  • the inventors have previously developed a digital measurement technology using a reaction container (fluidic device) having multiple wells (see Patent Document 1).
  • a reaction container fluidic device having multiple wells
  • an aqueous medium containing a target substance is delivered to a channel of a fluidic device, and a plurality of wells provided on the wall of the channel are filled with the aqueous medium.
  • an oil-based sealant is sent to the channel to seal the aqueous medium in the plurality of wells with the oil-based sealant. This makes each well a plurality of independent reaction spaces.
  • the target substance is detected by heating the fluidic device to heat the reaction solution and causing a detection reaction.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and it is an object of the present invention to provide a detection kit that can suppress the generation of bubbles and perform biomolecule measurements with high precision. Another object of the present invention is to provide a sealing liquid used in such a detection kit, a method for preserving the sealing liquid, and a method for detecting a sample using such a detection kit.
  • a detection kit used for detecting a target substance contained in a liquid sample comprising a fluidic device containing the sample, a detection reagent that reacts with the target substance, and an oil-based sealing liquid,
  • the fluidic device has an internal space that accommodates an aqueous mixed solution of the sample and the detection reagent, and a plurality of wells that accommodate the mixed aqueous solution, and the amount of dissolved oxygen in the sealing liquid is 100 mg/L or less. and the amount of dissolved nitrogen in the sealing liquid is 260 mg/mL or less.
  • the detection kit according to [1] in which bubbles cannot be visually confirmed in the sealing liquid by the following method.
  • a detection kit used for detecting a target substance contained in a liquid sample comprising a fluidic device containing the sample, a detection reagent that reacts with the target substance, and an oil-based sealing liquid,
  • the fluidic device includes an internal space that accommodates a mixed aqueous solution of the sample and the detection reagent, an inlet and an outlet that communicate with the internal space, and a plurality of wells that open into the internal space and accommodate the mixed aqueous solution.
  • a detection kit comprising the following, wherein the sealing liquid makes it impossible to visually confirm air bubbles using the method described below.
  • (Confirmation method) (1) Put 1.5 mL of the sealing liquid into a 1.5 mL microtube and seal it. (2) Heat at 66°C for 25 minutes. (3) Visually check the presence or absence of air bubbles in the sealing liquid.
  • the sealing liquid is hermetically stored in a storage container, and the internal pressure of the storage container containing the sealing liquid is 2.0 ⁇ 10 2 Pa or less [1] to [3] Detection kit according to any one of the above.
  • the plurality of wells have the same shape in a plan view and are arranged in a matrix, and an arbitrary first well and a second well closest to the first well meet the following formula (1).
  • the detection kit according to any one of [1] to [7], which satisfies the above criteria. 0.8 ⁇ Da/Dab ⁇ 1...(1) (Da is the equivalent circle diameter of the opening of the first well, and Dab is the distance between the center of gravity of the opening of the first well and the center of gravity of the opening of the second well.)
  • a method for preserving a sealing liquid comprising storing the sealing liquid according to any one of [11] to [13] at a temperature of 15°C or higher.
  • a sample detection method for detecting a target substance contained in a liquid sample comprising a step of preparing a mixed aqueous solution of a detection reagent that reacts with the target substance and the sample, and an interior containing the mixed aqueous solution.
  • a fluid device having a space, an inlet and an outlet communicating with the internal space, and a plurality of wells opening into the internal space and accommodating the mixed aqueous solution is used, and the sample and the detection reagent are introduced into the internal space. and filling the well with the mixed aqueous solution, and introducing an oil-based sealing liquid into the fluid device and sealing the mixed aqueous solution in the well with the sealing liquid.
  • a sample detection method wherein the amount of dissolved nitrogen in the sealing liquid is 260 mg/mL or less.
  • the present invention it is possible to provide a detection kit that suppresses the generation of bubbles and can perform biomolecule measurements with high precision. Furthermore, it is possible to provide a sealing liquid used in such a detection kit, a method for preserving the sealing liquid, and a method for detecting a sample using such a detection kit.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view showing a detection kit according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the fluidic device included in the detection kit.
  • FIG. 3 is a plan view showing a portion of the plurality of microwells 110.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of the sample detection method of this embodiment.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of the sample detection method of this embodiment.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram of the sample detection method of this embodiment.
  • FIG. 7 is a schematic diagram illustrating an example of an ICA reaction.
  • FIG. 8 is a photograph showing the evaluation results.
  • FIG. 9 is a photograph showing the evaluation results.
  • FIGS. 1 to 6 a detection kit, a sealing liquid, a sealing liquid storage method, and a sample detection method according to the present embodiment will be described with reference to FIGS. 1 to 6. Note that in all the drawings below, the dimensions and ratios of each component are changed as appropriate to make the drawings easier to read.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view showing the detection kit of this embodiment.
  • FIG. 2 is a sectional view of the fluidic device included in the detection kit, and is a sectional view taken along line II-II in FIG.
  • the detection kit 1 includes a fluidic device 10, a detection reagent L1, and an oil-based sealing liquid L2.
  • the detection reagent L1 and the sealing liquid L2 are stored, for example, in storage containers 91 and 92, respectively.
  • Detection kit 1 is used to detect a target substance contained in a liquid sample.
  • the sample is an aqueous solution containing a target substance, and includes, for example, a biological sample and an environmental sample.
  • Biological samples are not particularly limited, and include serum, plasma, urine, cell culture fluid, and the like. Alternatively, it may be a PCR reaction solution or the like that uses a biological sample as a template and contains a staining reagent as a detection reagent.
  • examples of environmental samples include river water and industrial wastewater.
  • target substances include DNA, RNA, proteins, viruses, cells, and exosomes.
  • examples of RNA include miRNA and mRNA.
  • examples of cells include bacteria, yeast, animal cells, plant cells, and insect cells.
  • the detection kit 1 detects the target substance by reacting the target substance contained in the sample as described above with the detection reagent L1 in the fluidic device 10. At this time, in the detection kit 1, a reaction field suitable for the reaction between the target substance and the detection reagent L1 is formed using the sealing liquid L2, thereby facilitating detection of the target substance. Below, they will be explained in order.
  • the fluidic device 10 includes a well plate 11, a lid member 12, and a wall member 13.
  • the fluidic device 10 is used as a reaction container that accommodates a sample in an internal space S and performs a detection reaction of a target substance contained in the sample.
  • the well plate 11 is a plate-like member that is rectangular or strip-shaped in plan view. "Plane view” refers to the field of view from the vertical direction of the upper surface 11a of the well plate.
  • a plurality of wells (also referred to as microwells) 110 are provided on the upper surface 11a of the well plate 11 at the center of the well plate 11 in the longitudinal direction.
  • the microwell 110 is a recess provided in the upper surface 11a of the well plate 11, and is open to the upper surface 11a.
  • the microwell 110 refers to a space surrounded by the recess and a virtual plane parallel to and in contact with the upper surface 11a.
  • the microwell 110 accommodates the sample contained in the internal space S, and functions as a reaction field between the target substance contained in the sample and the detection reagent L1.
  • the material of the well plate 11 is preferably hydrophobic. Specifically, the material forming the upper surface 11a of the well plate 11 preferably has a contact angle with the sealing liquid L2 of 5° or more and 80° or less. When the well plate 11 is formed of such a material, the contact angle between the upper surface 11a and the sealing liquid L2 will be 5° or more and 80° or less. When the contact angle of the upper surface 11a is within the above range, the sample tends to be easily isolated in the microwell 110 when a sealing liquid is introduced into the internal space S by the method described later.
  • the material of the well plate 11 may or may not have electromagnetic wave transparency.
  • electromagnetic waves to be evaluated for transparency include X-rays, ultraviolet rays, visible light, and infrared rays.
  • electromagnetic wave permeability it becomes possible to utilize electromagnetic waves in order to analyze the results of experiments conducted with the fluidic device 10 having the well plate 11. For example, fluorescence, phosphorescence, etc. generated as a result of irradiation with electromagnetic waves can be measured from the well plate 11 side.
  • electromagnetic wave transmittance refers to the property of being able to transmit electromagnetic waves of various wavelengths, such as radio waves, light, X-rays, and gamma rays.
  • the microwell 110 when detecting a sample by generating fluorescence having a peak in the wavelength range of 400 to 700 nm, which is the visible light region, in the microwell 110, the microwell 110 is good for at least light in the visible light region.
  • a material with good transparency may be used.
  • Examples of materials having electromagnetic wave permeability include glass and resin.
  • the resin include ABS resin, polycarbonate, COC (cycloolefin copolymer), COP (cycloolefin polymer), acrylic resin, polyvinyl chloride, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl acetate, PET (polyethylene terephthalate), and PEN ( polyethylene naphthalate), etc.
  • These resins may contain various additives, or may be a polymer alloy in which a plurality of resins are mixed.
  • the material having electromagnetic wave transparency has substantially no autofluorescence.
  • substantially no autofluorescence means that the material has no autofluorescence at the wavelength used for sample detection, or it is so weak that it does not affect sample detection.
  • the autofluorescence is 1/2 or less, more preferably 1/10 or less of the fluorescence of the detection target, it can be said to be so weak that it does not affect sample detection.
  • detection sensitivity can be increased in sample detection using electromagnetic waves.
  • Examples of materials that have electromagnetic wave permeability and do not emit autofluorescence include quartz glass.
  • Materials with weak autofluorescence that do not interfere with sample detection using electromagnetic waves include low fluorescence glass, acrylic resin, COC (cycloolefin copolymer), COP (cycloolefin polymer), and CPP (Cast Polypropylene, unstretched polypropylene). ) etc.
  • the thickness of the well plate 11 can be determined as appropriate. When observing fluorescence using a fluorescence microscope from the well plate 11 side, the thickness of the well plate 11 may be, for example, 5 mm or less, 2 mm or less, or 1.6 mm or less. good.
  • the material of the well plate 11 is preferably a gas-impermeable resin.
  • gas impermeability is evaluated using a gas permeability coefficient expressed by the following definition.
  • the gas permeability coefficient can be determined by the method described in JIS K 7126-1:2006 "Plastics-Film and sheeting-Gas permeability test method-Part 1: Differential pressure method” or by the method described in ISO 15105-1:2002, Plastics-Film and sheeting- It can be determined based on the Determination of gas-transmission rate-Part 1: Differential-pressure method.
  • Oxygen permeability coefficient ⁇ 0.1 ( cm3 (stp) ⁇ 100 ⁇ m/ m2 ⁇ 24hr ⁇ MPa)
  • the well plate 11 is made of such a resin, it is possible to suppress dissolution of air (more specifically, oxygen) into the sealing liquid L2 during work and measurement using the fluidic device 10, and improve measurement accuracy. This is preferred because it is easy to maintain.
  • the well plate 11 may have a single layer structure using only the above-mentioned materials, or may be a laminate of a plurality of materials.
  • the layer having the microwells 110 and the layer supporting the layer may be made of different materials.
  • the material of the layer having the microwells 110 is preferably hydrophilic (having a contact angle with water of 70° or more and 180° or less) that is easily wetted by water.
  • microwell 110 Various shapes can be adopted as the shape of the microwell 110.
  • the shape of the microwell 110 include a cylindrical shape such as a cylinder, an elliptical cylinder, and a polygonal cylinder, a conical shape such as a cone and a pyramid, and a truncated cone shape such as a truncated cone and a truncated pyramid.
  • the opening diameter gradually decreases in the depth direction of the well.
  • the bottom of the microwell 110 may be flat or curved (specifically, convex or concave).
  • the maximum diameter of the microwell 110 in plan view is preferably, for example, 10 nm to 100 ⁇ m, more preferably 100 nm to 50 ⁇ m, and even more preferably 1 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the depth of the microwell 110 is preferably, for example, 10 nm to 100 ⁇ m, more preferably 100 nm to 50 ⁇ m, and even more preferably 1 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the capacity of the microwell 110 is preferably, for example, 1 fL or more and 6 nL or less, more preferably 1 fL or more and 5 pL or less, even more preferably 1 fL or more and 2 pL or less, and particularly preferably 1 fL or more and 300 fL or less.
  • enzyme reactions such as digital PCR and invader reactions can be suitably performed in a microscopic space.
  • gene mutation detection can be performed by digital PCR.
  • the volume of the microwell 110 can be calculated by measuring the dimensions of the microwell 110 using a scanning electron microscope or a phase contrast microscope.
  • the well plate 11 has a plurality of microwells 110 of the same shape and size.
  • the same shape and same size may be defined as having the same shape and the same capacity to the extent required for digital measurement, and variations to the extent of manufacturing errors are acceptable.
  • the density of the microwells 110 is, for example, 100,000 to 10 million cells/cm 2 , preferably 100,000 to 5 million cells/cm 2 , and more preferably 100,000 to 1 million cells/cm 2 .
  • the density of the microwells 110 is within this range, it is easy to encapsulate a sample in a predetermined number of microwells 110. Furthermore, observation of wells for analyzing experimental results is easy.
  • the abundance ratio of the mutation to be detected relative to the wild type is about 0.01%, for example, 1 to 2 million microwells 110 is preferably used.
  • FIG. 3 is a plan view showing a portion of the plurality of microwells 110.
  • the plurality of microwells 110 in the well plate 11 have the same shape in plan view. Note that a small number (for example, 1 to 4) of the plurality of microwells may have different shapes in order to be used as an alignment mark in imaging or device manufacturing.
  • the plurality of microwells 110 are regularly arranged in a matrix.
  • the expression that the microwells 110 are "regularly arranged” means that the centers of gravity of the openings of the plurality of microwells 110 are arranged in a fixed pattern.
  • the centers of gravity of the openings of the microwells 110 may be arranged in a square grid.
  • a line connecting the centers of gravity of the openings of four adjacent microwells 110 forms a rectangle, preferably a square.
  • the centers of gravity of the openings of the microwells 110 may be arranged in a triangular lattice shape (also referred to as a hexagonal lattice shape). In this case, a line connecting the centers of gravity of the openings of three adjacent microwells 110 forms an equilateral triangle.
  • an arbitrary well (also referred to as a first well) A and a well B closest to the well A (also referred to as a second well) preferably satisfy the following formula (1).
  • 0.8 ⁇ Da/Dab ⁇ 1 (1) (Da is the equivalent circle diameter of the opening of well A, and Dab is the distance between the center of gravity of the opening of well A and the center of gravity of the opening of well B.)
  • the lower limit of the value of Da/Dab is 0.8, and may be 0.83.
  • the upper limit of the value of Da/Dab is less than 1, may be 0.92, or may be about 0.9.
  • These lower limit values and upper limit values can be arbitrarily combined.
  • Da/Dab may be 0.8 or more and less than 1, 0.83 or more and 0.92 or less, or 0.83 or more and 0.9 or less.
  • the microwells 110 shown in FIG. 3 are arranged in a triangular lattice. As shown in FIG. 3, the centers of gravity Ca, Cb, and Cc of the respective openings of any well A, well B closest to well A, and well C closest to both well A and well B form an equilateral triangle with each as a vertex.
  • the equivalent circle diameter of the opening of the microwell 110 is preferably 1 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less. That is, the lower limit of the equivalent circle diameter of the opening of the microwell 110 is preferably 1 ⁇ m.
  • the upper limit of the equivalent circle diameter of the opening of the microwell 110 may be less than 20 ⁇ m, may be less than 19 ⁇ m, may be less than 18 ⁇ m, may be less than 17 ⁇ m, and may be less than 16 ⁇ m. It may be 15 ⁇ m or less, 14 ⁇ m or less, 13 ⁇ m or less, 12 ⁇ m or less, 11 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or less. You can.
  • the upper limit and lower limit of the equivalent circle diameter of the opening of the microwell 110 can be arbitrarily combined.
  • the lid member 12 has the same contour shape as the well plate 11 (that is, a rectangular shape) in plan view.
  • the lid member 12 is arranged to face the upper surface 11a of the well plate 11 with a gap therebetween.
  • the lid member 12 has two through holes that penetrate in the thickness direction.
  • the two through holes are provided at one end and the other end of the lid member 12 in the longitudinal direction, respectively.
  • One of the through holes is an inlet 121 used when injecting a liquid into the internal space S of the fluid device 10, and the other through hole is an outlet 122 used when discharging a liquid from the internal space S. be.
  • liquid material includes not only liquid samples but also detection reagents and sealing liquids.
  • the inlet 121, the internal space S, and the outlet 122 communicate in this order, forming a flow path FC as a whole.
  • a detection reaction of a target substance is performed by appropriately flowing a liquid material through the channel FC.
  • a plurality of microwells 110 are arranged between an inlet 121 and an outlet 122.
  • a cylindrical injection port 125 surrounding the injection port 121 is provided on the upper surface 12a of the lid member 12. Injection port 125 communicates with injection port 121 .
  • the injection port 125 is used, for example, to connect a syringe when filling the internal space with a liquid substance using a syringe filled with a liquid substance.
  • a cylindrical discharge port 126 surrounding the discharge port 122 is provided on the upper surface 12a of the lid member 12. Exhaust port 126 communicates with exhaust port 122 .
  • the discharge port 126 is used, for example, to connect a tube through which the liquid flows when extracting the liquid from the internal space S.
  • the materials exemplified as the material of the well plate 11 mentioned above can be adopted.
  • the material of the lid member 12 may be the same as the material of the well plate 11, or may be different.
  • the material of the lid member 12 may or may not have electromagnetic wave permeability.
  • At least one of the well plate 11 and the lid member 12 has optical transparency.
  • the material of the lid member 12 is preferably hydrophobic. Specifically, it is preferable that the material constituting the surface (that is, the lower surface 12b) of the lid member 12 facing the internal space S has a contact angle with the sealing liquid L2 of 5 degrees or more and 80 degrees or less.
  • the contact angle between the lower surface 12b and the sealing liquid L2 will be 5° or more and 80° or less.
  • the contact angle of the lower surface 12b is within the above range, the sample tends to be easily isolated in the microwell 110 when a sealing liquid is introduced into the internal space S by the method described later.
  • the wall member 13 is formed into a closed ring shape when viewed from above, and is arranged along the outer edge of the upper surface 11a of the well plate 11.
  • the wall surface of the wall member 13 facing the internal space S is approximately rectangular in plan view, and the width gradually decreases on the injection port 121 side.
  • the wall member 13 is sandwiched between the well plate 11 and the lid member 12, and together form the fluid device 10.
  • a space surrounded by the well plate 11, the lid member 12, and the wall member 13 is an internal space S in which a liquid sample is accommodated.
  • the internal space S extends in the longitudinal direction of the well plate 11 along the rectangular well plate 11.
  • the wall member 13 functions not only as a wall surface of the internal space S but also as a spacer between the well plate 11 and the lid member 12.
  • the height of the wall member 13, that is, the height of the internal space S, may be, for example, 100 ⁇ m or less.
  • the material of the wall member 13 is not particularly limited, but for example, a double-sided adhesive tape in which an acrylic adhesive is laminated on both sides of a core film can be suitably used.
  • Examples of the material of the core film include silicone rubber and acrylic foam.
  • the same material as the well plate 11 described above can be used for the material of the wall member 13.
  • the wall member 13 formed of such a material can be integrated with the well plate 11 and the lid member 12 by adhesion using an adhesive, or by welding using heat welding, ultrasonic welding, laser welding, or the like.
  • the wall member 13 may be formed integrally with the well plate 11 and constitute a part of the well plate 11. Similarly, the wall member 13 may be formed integrally with the lid member 12 and constitute a part of the lid member 12.
  • the well plate 11 described above can be manufactured using known injection molding, microimprinting technology, or nanoimprinting technology. Further, the well plate 11 can also be manufactured by forming the microwells 110 by etching using a known photolithography technique.
  • the above-mentioned lid member 12 can be manufactured by known injection molding.
  • the wall member 13 When the wall member 13 is formed integrally with the lid member 12, the wall member 13 can be manufactured simultaneously with the lid member 12 by known injection molding. When the wall member 13 is separate from the lid member 12, the wall member 13 can be manufactured by cutting out a double-sided adhesive tape in which an acrylic adhesive is laminated on both sides of the core film described above.
  • the detection reagent L1 reacts with the target substance and is used to detect the target substance.
  • Examples of the detection reagent L1 include buffer substances, enzymes, substrates, antibodies, antibody fragments, and the like.
  • the enzyme is selected in accordance with the content of the biochemical reaction in order to perform a biochemical reaction such as an enzymatic reaction on a template nucleic acid related to the target substance.
  • a biochemical reaction to a template nucleic acid is, for example, a reaction in which signal amplification occurs under conditions in which the template nucleic acid is present.
  • the detection reagent L1 is selected depending on the detection reaction employed. Specific detection reactions include the ICA method, the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method (registered trademark), the 5' ⁇ 3' nuclease method (TaqMan (registered trademark) method), the fluorescent probe method, and the like.
  • sealing liquid L2 is oil-based and is immiscible or difficult to mix with the aqueous sample.
  • the sealing liquid L2 covers the opening of the microwell 110 containing the mixed aqueous solution of the sample and the detection reagent L1, and is individually sealed to prevent the mixed aqueous solutions contained in the microwell 110 from mixing with each other. It has a function to stop.
  • the sealing liquid L2 is oil.
  • oil fluorine oil, silicone oil, hydrocarbon oil, or a mixture thereof can be used.
  • Specific examples of the sealing liquid include fluorine-based liquids such as FC-40, FC-43, FC-770, FC-72, and FC-3283 (all manufactured by 3M), and KF96 (manufactured by Shin-Etsu Chemical). It will be done.
  • sealing liquid L2 mineral oil used in PCR reactions, etc. can also be used.
  • a seal containing a certain amount or more of microbubbles also referred to as bubble precursors
  • bubble precursors also referred to as bubble precursors
  • the cause is thought to be that when the sealing liquid is heated, the gas dissolved in the sealing liquid volatilizes toward the bubble precursor, and the bubbles expand and grow into bubbles of a visible size.
  • the sealing liquid L2 has a dissolved oxygen amount of 100 mg/L or less and a dissolved nitrogen amount of 260 mg/mL or less.
  • the amount of dissolved oxygen is more preferably 80 mg/L or less, and even more preferably 60 mg/L or less.
  • the amount of dissolved oxygen is preferably as small as possible, and theoretically it may be as small as it is below the detection limit, but since it is easy to adjust, it may be 20 mg/L or more.
  • the upper limit and lower limit of the amount of dissolved oxygen can be arbitrarily combined. That is, the amount of dissolved oxygen may be 20 mg/L or more and 80 mg/L or less, or 20 mg/L or more and 60 mg/L or less.
  • the amount of dissolved nitrogen is more preferably 200 mg/L or less, and even more preferably 150 mg/L or less.
  • the amount of dissolved nitrogen is preferably as small as possible, and theoretically it may be as small as it is below the detection limit, but since it is easy to adjust, it may be 50 mg/L or more.
  • the upper limit and lower limit of the amount of dissolved nitrogen can be arbitrarily combined. That is, the amount of dissolved nitrogen may be 50 mg/L or more and 200 mg/L or less, or 50 mg/L or more and 150 mg/L or less.
  • the amount of dissolved oxygen and dissolved nitrogen in the sealing liquid L2 can be measured using gas chromatography (eg, GC-2014AT, manufactured by Shimadzu Corporation) under the conditions described in Examples.
  • gas chromatography eg, GC-2014AT, manufactured by Shimadzu Corporation
  • the sealing liquid L2 included in the detection kit 1 is adjusted so that bubbles cannot be visually confirmed when heated under the following conditions.
  • Conditions (1) Put 1.5 mL of the sealing liquid into a 1.5 mL microtube and seal it. (2) Heat at 66°C for 25 minutes. (3) Visually check the presence or absence of air bubbles in the sealing liquid.
  • the sealing liquid L2 thus adjusted is stored in the storage container 92 in a sealed manner.
  • the internal pressure of the storage container 92 containing the sealing liquid L2 is 2.0 ⁇ 10 2 Pa or less. That is, the sealing liquid is hermetically stored in a storage container with an internal pressure of 2.0 ⁇ 10 2 Pa or less.
  • the internal pressure can be measured using a known internal pressure measuring device (for example, KDM30 (manufactured by Krone Co., Ltd.)).
  • KDM30 manufactured by Krone Co., Ltd.
  • Various values can be adopted as the lower limit of the internal pressure depending on the pressure resistance of the storage container 92.
  • the lower limit of the internal pressure may be, for example, 1 ⁇ 10 4 Pa or more, or 1 ⁇ 10 3 Pa or more.
  • the upper and lower limits of the internal pressure can be arbitrarily combined, and may be, for example, 1 x 10 4 Pa or more and 2.0 x 10 2 Pa or less, or 1 x 10 3 Pa or more and 2.0 x 10 2 Pa. It may be less than Pa.
  • the storage temperature of the sealing liquid L2 may be 20°C or higher, or may be 30°C or higher. Further, the storage temperature of the sealing liquid L2 may be 70°C or lower, or may be 40°C or lower.
  • the upper and lower limits of storage temperature can be arbitrarily combined.
  • the storage temperature of the sealing liquid L2 may be greater than or equal to 20°C and less than or equal to 70°C, or may be greater than or equal to 30°C and less than or equal to 40°C.
  • the sealing liquid volume is larger than the air volume in the container in order to prevent the air in the container from dissolving into the sealing liquid.
  • the sealed liquid volume may be 1.01 times or more and 10 times or less, preferably 1.01 times or more and 5 times or less, more preferably 1.01 times or more and 2 times or less, and more preferably 1.01 times or more and 2 times or less than the air volume in the container. is less than twice as large.
  • the surface area within the storage container may be one or more times the area where the sealing liquid contacts the air within the container.
  • the material of the storage container 92 is selected from resin such as PE (polyethylene), PVC (polyvinyl chloride), PP or PET, metal, and glass.
  • resin such as PE (polyethylene), PVC (polyvinyl chloride), PP or PET, metal, and glass.
  • the storage container 92 is made of resin, it is more preferably a gas-impermeable resin.
  • the sample detection method of this embodiment is a sample detection method for detecting a target substance contained in a liquid sample, and includes the following steps. (1) Step of preparing a mixed aqueous solution of the detection reagent L1 that reacts with the target substance and the sample (2) An internal space S that accommodates the mixed aqueous solution, an inlet 121 and an outlet that communicate with the internal space S, and an internal Step (3) of introducing the mixed aqueous solution into the internal space S and filling the mixed aqueous solution into the microwells 110 using the fluidic device 10 having a plurality of microwells 110 that are open to the space S and accommodate the mixed aqueous solution (3) Fluid Step (4) of introducing the sealing liquid L2 into the device 10 and sealing the mixed aqueous solution in the microwell 110 with the sealing liquid L2; (4) heating the fluidic device 10 to cause a reaction between the target substance and the detection reagent L1;
  • the sample detection method is performed using the detection kit 1 described above.
  • Step of adjusting mixed aqueous solution a liquid sample and detection reagent L1 are mixed to prepare a mixed aqueous solution.
  • concentration of the detection reagent L1 in the mixed aqueous solution is adjusted as appropriate depending on the type of detection reagent L1 used and the type of detection reaction.
  • the detection reagent L1 used may contain an adsorption inhibitor.
  • the adsorption inhibitor has a function of suppressing adsorption of target substances, enzymes, etc. contained in the mixed aqueous solution to the member.
  • Adsorption inhibitors include surfactants and proteins.
  • the sample may be pretreated prior to preparing the mixed aqueous solution.
  • pretreatment include concentration adjustment (dilution or concentration), loading on a carrier, binding reaction of two or more types of target substances, filtration sterilization by filtering, pH adjustment, and denaturation (annealing) of the target substance by heat treatment.
  • the mixed aqueous solution L that has passed through the flow path FC is discharged from the discharge port 122.
  • the concentration of the mixed aqueous solution L in advance so that one target substance is filled inside one microwell 110.
  • concentration of the mixed aqueous solution L in advance so that one target substance is filled inside one microwell 110.
  • one microwell 110 is filled with one or less target substances, that is, zero or one target substance.
  • the number of microwells 110 in which a detection reaction, which will be described later, has been confirmed corresponds to the number of target substances, and the target substances can be detected one by one, that is, digital measurement becomes possible. Note that the target substance does not need to be introduced into all microwells 110.
  • the means for introducing the target substance into the microwell 110 is not particularly limited, and an appropriate means can be selected depending on the target substance to be detected. For example, there is a method in which the target substance is sedimented by its own weight within the fluidic device 10 (specifically, within the channel FC) and distributed to the microwells.
  • a substance that captures the target substance may be used to bind the capture substance to the target substance, which does not easily settle under its own weight, and then send the liquid.
  • the efficiency of introduction of the target substance into the microwell 110 can be improved by immobilizing the capture substance in the microwell in advance and allowing the capture substance to capture the target substance sent together with the mixed aqueous solution L. .
  • the reaction that binds the captured material and the target substance can be performed at any time.
  • the target substance and the captured substance may be brought into contact in a sample tube.
  • the target substance may be introduced into the microwell 110, and the captured substance and the target substance may be brought into contact with each other in the microwell 110.
  • a capture substance is a substance that can capture a target substance.
  • the capture material may be, for example, a combination of a solid phase and a substance that specifically binds to the target substance.
  • Examples of the solid phase constituting the supplement include particles, membranes, and substrates. Furthermore, the number of substances that specifically bind to the target substance may be one type, or two or more types may be used. For example, there may be three types, four types, or five or more types.
  • the particles are not particularly limited, and include polymer particles, magnetic particles, glass particles, and the like.
  • the particles are surface-treated to avoid non-specific adsorption.
  • particles having a functional group such as a carboxyl group on the surface are preferable. More specifically, a product such as "Magnosphere LC300" manufactured by JSR Corporation can be used.
  • cells to which the virus can attach ie, cells that have virus receptors
  • the capture material may be used as the capture material.
  • the sealing liquid L2 is sent from the injection port 121 to the channel FC.
  • the sealing liquid L2 sent to the channel FC flows in the surface direction of the upper surface 11a in the internal space S, and out of the mixed aqueous solution L sent to the channel FC, the mixed solution L2 that is not accommodated in the microwell 110 is mixed.
  • Aqueous solution L is flushed away and replaced.
  • FIG. 6 shows a state in which all of the plurality of microwells 110 are sealed with the sealing liquid L2, and all the channels FC are replaced with the sealing liquid L2.
  • the sealing liquid L2 When injecting the sealing liquid L2, it is preferable to inject the sealing liquid L2 slowly so that the sealing liquid L2 does not contain air bubbles in the internal space S. After the sealing liquid L2 is injected, it is visually confirmed that the sealing liquid L2 does not contain air bubbles during the injection operation.
  • the sealing liquid L2 used is preferably the sealing liquid L2 attached to the detection kit 1 described above, particularly fluorine oil. It is preferable that the sealing liquid L2 is adjusted so that bubbles cannot be visually confirmed when heated under the following conditions. (conditions) (1) Put 1.5 mL of the sealing liquid into a 1.5 mL microtube and seal it. (2) Heat at 66°C for 25 minutes. (3) Visually check the presence or absence of air bubbles in the sealing liquid.
  • the sealing liquid L2 has a dissolved oxygen amount of 100 mg/L or less and a dissolved nitrogen amount of 260 mg/mL or less, as described above.
  • Step of detecting the target substance the fluidic device 10 is heated to cause a reaction between the target substance and the detection reagent L1. At this time, the sealing liquid L2 that seals the microwell 110 is suppressed from generating bubbles due to heating, as described above. Therefore, in the step of detecting the target substance, generation of bubbles in the sealing liquid L2 is suppressed, and the target substance can be detected with high accuracy.
  • Any known detection method can be used to detect the target substance, depending on the characteristics of the target substance to be detected. For example, it can be carried out by first performing a reaction (also referred to as signal amplification reaction) that amplifies the signal derived from the target substance to a detectable level as necessary, and then detecting the amplified signal using an appropriate means. I can do it.
  • a reaction also referred to as signal amplification reaction
  • Examples of signals that can be used in the detection method according to the present embodiment include fluorescence, chemiluminescence, color development, potential change, and pH change.
  • the signal amplification reaction may be, for example, a biochemical reaction, more specifically an enzymatic reaction.
  • a fluidic device is heated under a constant temperature condition that allows the desired enzyme activity to be obtained, for example, at 60° C. or higher. It is preferably an isothermal reaction maintained at about 66° C. for a predetermined period of time, such as at least 10 minutes, preferably about 15 minutes.
  • Examples of signal amplification reactions include, specifically, when using reactions to detect nucleic acids, ICA reactions such as the Invader (registered trademark) method, LAMP method (registered trademark), TaqMan (registered trademark) method, and the like. Examples include fluorescent probe method.
  • the signal amplification reaction it is particularly preferable to use an ICA reaction.
  • ICA reaction signal amplification progresses through a cycle of two reactions: (1) complementary binding between nucleic acids, and (2) recognition and cleavage of a triplex structure by an enzyme.
  • the influence of reaction cycle inhibition by impurities other than the target substance is small. Therefore, even if various components other than the target substance (ie, impurities) are present in the microwell 110, the target substance can be detected with high accuracy by using the ICA reaction.
  • the mixed aqueous solution L contains the reaction reagent and template nucleic acid necessary for the ICA reaction.
  • the biochemical reaction in the reaction process is an ICA reaction
  • the fluorescent substance is released from the quencher, and a predetermined reaction occurs in response to the excitation light. emits a fluorescent signal.
  • the reaction temperature between the target substance and the detection reagent is preferably 50°C or higher and 99°C or lower.
  • FIG. 7 is a schematic diagram illustrating an example of the ICA method.
  • FIG. 7 shows how DNA, which is a target substance, is detected by the ICA method.
  • Reaction reagents necessary for the ICA reaction include ICA reaction reagents such as flap probe 810, flap endonuclease FEN, fluorescent substrate 820, and invasion probe (invader oligo) 830.
  • the flap probe 810 and the invasion probe 830 are nucleic acid fragments (oligonucleotides) designed to hybridize to DNA as a target substance (target DNA) and form a flap structure with the double-stranded nucleic acid 140.
  • the fluorescent substrate 820 has a hairpin structure and is a nucleic acid fragment in which a fluorescent substance F and a quencher Q are bound.
  • a fluorescent substance F is bound to the 5' end of the nucleic acid fragment, and a quencher Q is bound to a few bases 3' from the 5' end.
  • the quencher Q suppresses the luminescence of the fluorescent material F.
  • the flap probe 810 and the invasion probe 830 are hybridized to the target DNA.
  • the flap probe 810 and the invasion probe 830 each overlap by one base at the SNP site of the target DNA, forming an unstable three-base-like structure.
  • a first flap portion 811 is formed.
  • the first flap region 811 is a portion of the flap probe 810 that did not hybridize with the target DNA.
  • FEN recognizes the three base-like structure and reacts.
  • the first flap portion 811 is cleaved to generate a nucleic acid fragment 811, which is released into the mixed aqueous solution L.
  • the generated nucleic acid fragment 811 hybridizes to the fluorescent substrate 820.
  • Nucleic acid fragment 811 invades the hairpin structure of fluorescent substrate 820, overlaps by one base at the SNP site, and forms an unstable three-base-like structure.
  • a second flap portion 821 is formed.
  • the second flap region 821 is a portion of the fluorescent substrate 820 that is no longer hybridized due to the invasion of the nucleic acid fragment 811.
  • FEN recognizes the three base-like structure and reacts.
  • the second flap region 821 is cleaved, and a nucleic acid fragment 821 is generated.
  • the remainder of the cleaved nucleic acid fragment 821 from the fluorescent substrate 820 is indicated by reference numeral 820'.
  • the fluorescent substance F separates from the quencher Q and generates fluorescence FL.
  • Target DNA can be detected by detecting this fluorescence FL.
  • Detection of the target substance can also be performed by binding a substance that specifically binds to the target substance (also referred to as a specific binding substance) to the target substance, and detecting the bound specific binding substance.
  • a substance that specifically binds to the target substance also referred to as a specific binding substance
  • the target substance is a protein
  • it can be detected using ELISA. More specifically, the detection may be performed, for example, by a sandwich ELISA using the FRET principle.
  • a first specific binding substance for example, an antibody
  • a first fluorescent substance also called a donor
  • a fluorescence wavelength of the first fluorescent substance are combined.
  • a second specific binding substance labeled with a second fluorescent substance also referred to as an acceptor having an overlapping absorption wavelength is prepared.
  • the target substance eg, antigen
  • the target substance eg, antigen
  • the target substance is brought into contact with both the first specific binding substance and the second specific binding substance to form a complex.
  • the distance between the donor and acceptor becomes close, and the fluorescence wavelength of the acceptor can be detected by irradiation with the excitation wavelength of the donor.
  • the specific binding substance may be labeled with a nucleic acid fragment, and the nucleic acid fragment may be detected by an ICA reaction.
  • the specific binding substance substances similar to specific binding molecules for the structure described below, such as antibodies, antibody fragments, aptamers, etc., can be used.
  • the specific binding substance may be labeled directly or indirectly, for example with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP).
  • HRP horseradish peroxidase
  • a known appropriate method can be selected depending on the type of signal to be observed. For example, when performing bright field observation, white light is irradiated perpendicularly to the base material provided with the well array. When observing a fluorescent signal, excitation light corresponding to the fluorescent substance is irradiated into the well from the bottom side of the well, and the fluorescence emitted by the fluorescent substance is observed. An image of the whole or part of the observed well array is taken and saved, and the image is processed by a computer system.
  • sealing liquid L2 is not suppressed in advance from generating bubbles due to heating as described above, there may be a step of deaerating the sealing liquid L2 prior to the sealing process using the sealing liquid L2. good.
  • the sealing liquid L2 can be degassed using reduced pressure, heating, ultrasonic irradiation, or a combination thereof.
  • the detection kit 1 configured as described above, it is possible to suppress the generation of air bubbles and perform biomolecule measurements with high precision.
  • the sealing liquid configured as described above suppresses the generation of bubbles due to heating, it is possible to perform biomolecule measurement with high accuracy when used in the detection kit 1.
  • the sealing liquid storage method configured as described above, it is possible to suitably store the sealing liquid in which the generation of bubbles is suppressed.
  • biomolecule measurement can be performed with high precision.
  • a well plate made of a cyclic polyolefin (product number "ZEONOR1020R”, manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.) and a lid member made of a cyclic polyolefin (product number "ZEONOR1020R”, manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.) were each produced by injection molding.
  • the thickness of the well plate was 0.6 mm.
  • microwells were formed on one side of the well plate by injection molding.
  • the opening shape of the microwell was circular.
  • the size of the microwell was 10 ⁇ m in diameter and 15 ⁇ m in depth.
  • a plurality of microwells were formed in a triangular lattice in an area of 6.0mm x 30.0mm on the substrate so that the distance between the center of the microwell and the center of the microwell closest to the microwell was 12 ⁇ m.
  • Wells were arranged to form a well array.
  • the lid member was formed integrally with the wall member. By adjusting the height of the wall member to 30 ⁇ m, the height of the channel was set to 30 ⁇ m.
  • aqueous medium that is, buffer
  • the aqueous medium to be sent to the fluidic device was prepared with the composition shown in Table 1.
  • the dissolved oxygen concentration and dissolved nitrogen concentration of the sealing liquid after degassing were determined by measuring the sealing liquid using gas chromatography and using a calibration curve method. During measurements, the GC inlet was replaced with He to prevent atmospheric contamination.
  • the measurement sample was collected using a syringe.
  • the sampling position was approximately 10 mm deep from the liquid level, and the sampling positions were adjusted visually and manually so that they were approximately the same.
  • the injection amount of each standard gas was as follows. Mother gas: 20, 100, 200 ⁇ L Dilution gas: 20, 100, 200 ⁇ L
  • Component mass (g) Component molecular weight (g/mol) x standard gas concentration (%) / 100 x injection amount (L) / 24.47 (L)
  • the dissolved gas concentrations of the untreated sealing liquid stored at room temperature were 120 mg/L for oxygen and 260 mg/L for nitrogen.
  • Fluorinated oil (Fluorinert FC-40, manufactured by SIGMA-ALDRICH) was used as the sealant.
  • the sealing liquid was degassed using the method described below. (Deaeration method) 50 ml of the sealing liquid was placed in a screw bottle (SV-50A, manufactured by Niommen Rika Glass Co., Ltd.) and heated at 70° C. for 2 hours using a hot plate.
  • the sealing liquid after heating was cooled to room temperature, and the dissolved gas concentration was measured using the method described above.
  • Oxygen 100.0 mg/L, nitrogen: 260.0 mg/L.
  • the fluidic device injected with the sealing liquid was placed on a transparent heat plate (model number: MP-10DMFH-PG, manufactured by Kitasato Corporation) heated to 66° C., and left standing for 25 minutes.
  • a transparent heat plate model number: MP-10DMFH-PG, manufactured by Kitasato Corporation
  • USB camera CMOS camera (model version: DFK22AUC03, manufactured by Imaging Source)
  • Lens Ai Nikkor 105mm f2.5mm (manufactured by Nikon)
  • Lighting Metal halide lamp (model number: LSM210, manufactured by Sumita Optical Co., Ltd.)
  • Example 1 The presence or absence of bubble generation was confirmed in the same manner as in Example 1, except that an untreated sealing liquid that had been stored at room temperature was used.
  • FIG. 8 is a photograph showing the evaluation results.
  • Example 2 The sealing liquid was degassed using the method described below. (Deaeration method) A 50 ml screw tube bottle containing the sealing liquid was placed in a vacuum desiccator in an open state. The pressure inside the desiccator was reduced using a rotary pump (model number: DW-120, manufactured by Sato Vacuum Co., Ltd.), and the sample was stored at an initial pressure of 1.6 ⁇ 10 2 Pa for 6 days.
  • a rotary pump model number: DW-120, manufactured by Sato Vacuum Co., Ltd.
  • FIG. 9 is a photograph showing the evaluation results. As a result of the evaluation, no bubbles were generated in the fluid device using the sealing liquid of Example 2.
  • the present invention it is possible to provide a detection kit that suppresses the generation of bubbles and can perform biomolecule measurements with high precision. Furthermore, it is possible to provide a sealing liquid used in such a detection kit, a method for preserving the sealing liquid, and a method for detecting a sample using such a detection kit.
  • 1... Detection kit 10... Fluid device, 91, 92... Storage container, 110... Well (microwell), 120... Well array, 121... Inlet, 122... Outlet, A... Well (first well), B ...Well (second well), Ca...Center of gravity, L...Mixed aqueous solution, L1...Detection reagent, L2...Sealing liquid, S...Internal space

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Abstract

この検出キットは、液状の試料に含まれる標的物質の検出に用いる検出キットであって、試料を収容する流体デバイスと、標的物質と反応する検出試薬と、油性の封止液と、を備え、流体デバイスは、試料と検出試薬との混合水溶液を収容する内部空間と、内部空間と連通する注入口及び排出口と、内部空間に開口し混合水溶液を収容する複数のウェルと、を有し、封止液の溶存酸素量は１００ｍｇ／Ｌ以下であり、且つ封止液の溶存窒素量は２６０ｍｇ／ｍＬ以下である。

Description

検出キット、封止液、封止液の保存方法及び試料検出方法
　本発明は、検出キット、封止液、封止液の保存方法及び試料検出方法に関する。
　本願は、２０２２年５月２日に日本に出願された特願２０２２－０７６０５７号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　生体分子を流体デバイス内で検出する技術が知られている。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ技術では、微小孔に生体分子を導入し、加熱を伴う反応を行うことにより、生体分子を検出する場合がある。
　また、生体分子を単分子検出できる技術が知られている。このような技術としては、例えば、非特許文献１に記載されたデジタルEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay（ＥＬＩＳＡ）、デジタルPolymerase Chain Reaction（ＰＣＲ）、デジタルInvasive Cleavaged Assay（ＩＣＡ）等のデジタル計測技術が挙げられる。
　発明者らは、以前に、複数のウェルを有する反応容器（流体デバイス）を用いたデジタル計測技術を開発している（特許文献１参照）。以前開発した方法では、まず、流体デバイスの流路に標的物質を含む水性媒体を送液し、流路壁面に設けられた複数のウェルに水性媒体を充填する。次いで、流路に油性封止液を送液して複数のウェル内の水性媒体を油性封止液で封止する。これにより、各ウェルを複数の独立した反応空間とする。さらに、流体デバイスを加熱することで反応溶液を加熱し、検出反応させることにより、標的物質の検出を行う。
国際公開第２０１５／１１５６３５号
Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules Soo Hyeon Kim,  Lab Chip, 2012,12, 4986-4991
　しかしながら、特許文献１に記載の方法では、流体デバイスを加熱した際に、流体デバイス内に気泡が発生することがある。生じる気泡は、検出反応及び観察の妨げとなることから、改善が求められている。
　本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであって、気泡の発生を抑制し生体分子計測を高精度で実施可能な検出キットを提供することを目的とする。また、このような検出キットに用いられる封止液、封止液の保存方法、及びこのような検出キットを用いた試料検出方法を提供することを併せて目的とする。
［１］液状の試料に含まれる標的物質の検出に用いる検出キットであって、前記試料を収容する流体デバイスと、前記標的物質と反応する検出試薬と、油性の封止液と、を備え、前記流体デバイスは、前記試料と前記検出試薬との混合水溶液を収容する内部空間と、前記混合水溶液を収容する複数のウェルと、を有し、前記封止液の溶存酸素量は１００ｍｇ／Ｌ以下であり、且つ前記封止液の溶存窒素量は２６０ｍｇ／ｍＬ以下である検出キット。
［２］前記封止液は、下記方法により気泡を目視確認できない［１］に記載の検出キット。
（確認方法）
（１）１．５ｍＬマイクロチューブに前記封止液１．５ｍＬを入れて密閉する。
（２）６６℃で２５分間加温する。
（３）前記封止液中の気泡の有無を目視確認する。
［３］液状の試料に含まれる標的物質の検出に用いる検出キットであって、前記試料を収容する流体デバイスと、前記標的物質と反応する検出試薬と、油性の封止液と、を備え、前記流体デバイスは、前記試料と前記検出試薬との混合水溶液を収容する内部空間と、前記内部空間と連通する注入口及び排出口と、前記内部空間に開口し前記混合水溶液を収容する複数のウェルと、を有し、前記封止液は、下記方法により気泡を目視確認できない検出キット。
（確認方法）
（１）１．５ｍＬマイクロチューブに前記封止液１．５ｍＬを入れて密閉する。
（２）６６℃で２５分間加温する。
（３）前記封止液中の気泡の有無を目視確認する。
［４］前記封止液は保存容器に密閉して収容され、前記封止液が収容された前記保存容器の内部圧力は、２．０×１０２Ｐａ以下である［１］から［３］のいずれか１項に記載の検出キット。
［５］前記封止液はフッ素系オイルである［１］から［４］のいずれか１項に記載の検出キット。
［６］前記流体デバイスの材料は、気体不透過性の樹脂である［１］から［５］のいずれか１項に記載の検出キット。
［７］前記内部空間に面する面に対する前記封止液の接触角が５°以上８０°以下である［１］から［６］のいずれか一項に記載の検出キット。
［８］前記複数のウェルは、平面視で同一形状であり、且つマトリクス状に配置され、任意の第１ウェルと、前記第１ウェルに最も近接する第２ウェルとが、下記式（１）を満たす［１］から［７］のいずれか１項に記載の検出キット。
　０．８≦Ｄａ／Ｄａｂ＜１…（１）
　（Ｄａは、前記第１ウェルの開口部の円相当径であり、Ｄａｂは、前記第１ウェルの開口部の重心と、前記第２ウェルの開口部の重心と、の距離である。）
［９］前記Ｄａが１μｍ以上５０μｍ以下である［８］に記載の検出キット。
［１０］前記ウェル１つあたりの容積が１ｆＬ以上６ｐＬ以下である［１］から［９］のいずれか１項に記載の検出キット。
［１１］［１］から［１０］のいずれか１項に記載の検出キットで用いられる油性の封止液であって、溶存酸素量が１００ｍｇ／Ｌ以下であり、且つ溶存窒素量が２６０ｍｇ／ｍＬ以下である封止液。
［１２］下記方法により気泡を目視確認できない［１１］に記載の封止液。
（確認方法）
（１）１．５ｍＬマイクロチューブに前記封止液１．５ｍＬを入れて密閉する。
（２）６６℃で２５分間加温する。
（３）前記封止液中の気泡の有無を目視確認する。
［１３］内部圧力が２．０×１０２Ｐａ以下である保存容器に密閉して収容されている［１１］又は［１２］に記載の封止液。
［１４］［１１］から［１３］のいずれか１項に記載の封止液を１５℃以上の温度で保存する封止液の保存方法。
［１５］液状の試料に含まれる標的物質を検出する試料検出方法であって、前記標的物質と反応する検出試薬と、前記試料との混合水溶液を調整する工程と、前記混合水溶液を収容する内部空間と、前記内部空間と連通する注入口及び排出口と、前記内部空間に開口し前記混合水溶液を収容する複数のウェルと、を有する流体デバイスを用い、前記内部空間に前記試料と前記検出試薬との混合水溶液を導入して、前記混合水溶液を前記ウェルに充填する工程と、前記流体デバイスに、油性の封止液を導入し、前記封止液によって前記混合水溶液を前記ウェルに封止する工程と、前記流体デバイスを加熱して前記標的物質と前記検出試薬との反応を生じさせ、前記標的物質を検出する工程と、を有し、前記封止液の溶存酸素量は１００ｍｇ／Ｌ以下であり、且つ前記封止液の溶存窒素量は２６０ｍｇ／ｍＬ以下である試料検出方法。
［１６］前記封止液は、下記方法により気泡を目視確認できない［１５］に記載の試料検出方法。
（確認方法）
（１）１．５ｍＬマイクロチューブに前記封止液１．５ｍＬを入れて密閉する。
（２）６６℃で２５分間加温する。
（３）前記封止液中の気泡の有無を目視確認する。
［１７］前記封止液がフッ素系オイルである、［１５］又は［１６］に記載の試料検出方法。
［１８］前記封止する工程に先立って、前記封止液を脱気する工程を含む、［１５］から［１７］のいずれか１項に記載の試料検出方法。
［１９］前記検出する工程において、前記標的物質と前記検出試薬との反応温度が５０℃以上９９℃以下である［１５］から［１８］のいずれか１項に記載の試料検出方法。
　本発明によれば、気泡の発生を抑制し生体分子計測を高精度で実施可能な検出キットを提供することができる。また、このような検出キットに用いられる封止液、封止液の保存方法、及びこのような検出キットを用いた試料検出方法を提供することができる。
図１は、実施形態の検出キットを示す概略斜視図である。 図２は、検出キットに含まれる流体デバイスの断面図である。 図３は、複数のマイクロウェル１１０の一部を示す平面図である。 図４は、本実施形態の試料検出方法の説明図である。 図５は、本実施形態の試料検出方法の説明図である。 図６は、本実施形態の試料検出方法の説明図である。 図７は、ＩＣＡ反応の一例を説明する模式図である。 図８は、評価結果を示す写真である。 図９は、評価結果を示す写真である。
　本明細書において、数値範囲を「１～１０μｍ」と記載した場合、１μｍから１０μｍまでの範囲を意味し、下限値である１μｍと上限値である１０μｍを含む数値範囲を意味する。
　以下、図１～図６を参照しながら、本実施形態に係る検出キット、封止液、封止液の保存方法及び試料検出方法について説明する。なお、以下の全ての図面においては、図面を見やすくするため、各構成要素の寸法や比率などは適宜異ならせてある。
＜検出キット、封止液、封止液の保存方法＞
　図１は、本実施形態の検出キットを示す概略斜視図である。図２は、検出キットに含まれる流体デバイスの断面図であり、図１の線分ＩＩ－ＩＩにおける矢視断面図である。
　検出キット１は、流体デバイス１０と、検出試薬Ｌ１と、油性の封止液Ｌ２とを備える。検出試薬Ｌ１及び封止液Ｌ２は、例えば保存容器９１，９２にそれぞれ保存されている。検出キット１は、液状の試料に含まれる標的物質の検出に用いられる。
　試料は、標的物質を含む水溶液であり、例えば、生体試料、環境試料を含む。生体試料としては、特に制限されず、血清、血漿、尿及び細胞培養液等が挙げられる。また、生体試料を鋳型とし、検出試薬として染色用試薬を含むＰＣＲ反応溶液等であってもよい。さらに、環境試料としては、例えば、河川の水及び工場排水等が挙げられる。
　標的物質としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細胞及びエキソソーム等が挙げられる。ここで、ＲＮＡとしては、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ等が挙げられる。また、細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞等が挙げられる。
　検出キット１は、流体デバイス１０において、上述のような試料に含まれる標的物質と、検出試薬Ｌ１とを反応させ、標的物質を検出する。その際、検出キット１においては、封止液Ｌ２を用いて上記標的物質と検出試薬Ｌ１との反応に適した反応場を形成し、標的物質の検出を容易にする。
　以下、順に説明する。
［流体デバイス］
　図１及び図２に示すように、流体デバイス１０は、ウェルプレート１１、蓋部材１２及び壁部材１３を有する。流体デバイス１０は、内部空間Ｓに試料を収容し、試料に含まれる標的物質の検出反応を行う反応容器として用いられる。
（ウェルプレート）
　ウェルプレート１１は、平面視矩形又は短冊状を呈する板状部材である。「平面視」とは、ウェルプレートの上面１１ａの鉛直方向からの視野を指す。ウェルプレート１１の上面１１ａには、ウェルプレート１１の長手方向の中央に、複数のウェル（マイクロウェルともいう）１１０が設けられている。
　マイクロウェル１１０は、ウェルプレート１１の上面１１ａに設けられた凹部であり、上面１１ａに開口している。マイクロウェル１１０とは、上記凹部と、上面１１ａと平行であって上面１１ａに接する仮想平面とに囲まれた空間を指す。
　マイクロウェル１１０は、内部空間Ｓに収容した試料を内部に収容し、試料に含まれる標的物質と、検出試薬Ｌ１との反応場として機能する。
　ウェルプレート１１の材料は、疎水性であることが好ましい。詳しくは、ウェルプレート１１の上面１１ａを構成する材料は、封止液Ｌ２との接触角が５°以上８０°以下であることが好ましい。このような材料でウェルプレート１１を形成すると、上面１１ａと封止液Ｌ２との接触角が５°以上８０°以下となる。上面１１ａの接触角が上記の範囲であると、後述する方法で内部空間Ｓに封止液を導入した場合に、マイクロウェル１１０に試料を隔離しやすい傾向にある。
　なお、上記接触角は、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて、水の代わりに封止液Ｌ２を用いて測定して求める。
　具体的には、以下の操作を行う。水平に置かれたウェルプレート１１と同じ材料で作成された平板の試験片に、４μL以下の封止液Ｌ２を滴下し、液滴を作成する。本液滴に対し、以下の２つの値を測定する。
　ｒ＝液滴の試験片に接している面の半径（ｍｍ）
　ｈ＝試験片表面から液滴の頂点までの高さ（ｍｍ）
　得られたｒ及びｈを用い、下記式（１）より接触角θを算出する。　θ＝２ｔａｎ－１（ｈ／ｒ）
　ウェルプレート１１の材料は、電磁波透過性を有するものであってもよく、有しないものであってもよい。ここで、透過性判断の対象である電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線及び赤外線等が挙げられる。ウェルプレート１１が電磁波透過性を有する場合、ウェルプレート１１を有する流体デバイス１０で行った実験結果を解析するために、電磁波を利用することが可能になる。例えば、電磁波を照射した結果生じる蛍光、燐光等をウェルプレート１１側から計測することができる。なお、「電磁波透過性」とは、電波、光、Ｘ線及びガンマ線など、種々の波長の電磁波を透過可能である性質を意味する。
　詳しくは後述するが、例えば、マイクロウェル１１０において、可視光領域である４００～７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を生じさせ試料検出を行う場合には、少なくとも可視光領域の光に対して良好な透過性を有する材料を用いればよい。
　電磁波透過性を有する材料としては、例えば、ガラス及び樹脂等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）及びＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等が挙げられる。これらの樹脂は各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合されたポリマーアロイであってもよい。
　電磁波透過性を有する材料は、自家蛍光を実質的に有しないことが好ましい。自家蛍光を実質的に有しないとは、材料が、試料検出に使用する波長の自家蛍光を全く有しないか、有していても試料検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下、より好ましくは１／１０以下程度の自家蛍光であれば、試料検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。このような材料を用いてウェルプレート１１を形成すると、電磁波を利用した試料検出において、検出の感度を高めることができる。
　電磁波透過性を有し、かつ自家蛍光を発しない材料としては、例えば、石英ガラスが挙げられる。自家蛍光が微弱であり、電磁波を用いた試料検出に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）及びＣＰＰ（Cast Polypropylene、無延伸ポリプロピレン）等が挙げられる。
　ウェルプレート１１の厚みは、適宜決定することが出来る。ウェルプレート１１側から蛍光顕微鏡を用いて蛍光を観察する場合には、ウェルプレート１１の厚みは、例えば５ｍｍ以下であってもよく、２ｍｍ以下であってもよく、１．６ｍｍ以下であってもよい。
　さらに、ウェルプレート１１の材料は、気体不透過性の樹脂であると好ましい。本実施形態において「気体不透過性」は、下記の定義で表される気体透過係数を用いて評価する。気体透過係数は、ＪＩＳ　Ｋ　７１２６－１：２００６「プラスチック－フィルム及びシート－ガス透過度試験方法－第１部：差圧法」に記載の方法又はＩＳＯ　１５１０５－１：２００２，Ｐｌａｓｔｉｃｓ－Ｆｉｌｍ　ａｎｄ　ｓｈｅｅｔｉｎｇ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇａｓ－ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｒａｔｅ－Ｐａｒｔ　１：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ－ｐｒｅｓｓｉｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄに基づいて、求めることができる。
　酸素透過係数について、以下の基準以下の材料であれば、「気体不透過性の樹脂」として好適に用いることができる。
　酸素透過係数≦０．１（ｃｍ３（ｓｔｐ）・１００μｍ／ｍ２・２４ｈｒ・ＭＰａ）
　ウェルプレート１１がこのような樹脂で形成されていると、流体デバイス１０を用いた作業及び測定中に、封止液Ｌ２に対する空気（より具体的には酸素）の溶解を抑制でき、測定精度を維持しやすいため好ましい。
　ウェルプレート１１は、上記材料のみを用いた単層の構成であってもよく、複数の材料の積層体であってもよい。積層体を加工してウェルプレート１１を形成する場合、マイクロウェル１１０を有する層と、当該層を支持する層とは別の材料であってもよい。この場合、マイクロウェル１１０を有する層の材料は、水に濡れやすい親水性（水との接触角が７０°以上１８０°以下）であることが好ましい。
（マイクロウェル）
　マイクロウェル１１０の形状は、種々の形状を採用することができる。マイクロウェル１１０の形状として、例えば円筒形、楕円筒形、多角筒形等の筒形、円錐形、角錐形等の錘形、円錐台及び角錐台等の錘台形を例示できる。マイクロウェル１１０が錐形又は錘台形の場合、開口径がウェルの深さ方向に漸減する形状であるとよい。
　マイクロウェル１１０の底部は、平坦であってもよく、曲面（具体的には、凸面や凹面）であってもよい。
　マイクロウェル１１０が円筒形の場合、平面視におけるマイクロウェル１１０の最大径は、例えば１０ｎｍ～１００μｍであれば好ましく、１００ｎｍ～５０μｍがより好ましく、１μｍ～２０μｍがさらに好ましい。また、マイクロウェル１１０の深さは、例えば１０ｎｍ～１００μｍであれば好ましく、１００ｎｍ～５０μｍがより好ましく、１μｍ～２０μｍがさらに好ましい。
　マイクロウェル１１０の容量は、例えば１ｆＬ以上６ｎＬ以下であれば好ましく、１ｆＬ以上５ｐＬ以下がより好ましく、１ｆＬ以上２ｐＬ以下がさらに好ましく、１ｆＬ以上３００ｆＬ以下が特に好ましい。１つあたりのマイクロウェル１１０の容量がこのような範囲であると、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内で行う酵素反応を好適に行うことができる。デジタルＰＣＲにより、例えば遺伝子の変異検出等を行うことができる。
　マイクロウェル１１０の容積は、走査型電子顕微鏡や位相差顕微鏡を用いてマイクロウェル１１０の寸法を測定することにより算出することができる。
　ウェルプレート１１は、同形同大の複数のマイクロウェル１１０を有している。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
　マイクロウェル１１０の密度は、例えば１０万～１０００万個／ｃｍ２であり、好ましくは１０万～５００万個／ｃｍ２であり、更に好ましくは１０万～１００万個／ｃｍ２である。マイクロウェル１１０の密度がこのような範囲であると、所定数のマイクロウェル１１０に試料を封入させる操作が容易である。また、実験結果を解析するためのウェルの観察も容易である。
　例えば、検出キット１を用いてセルフリーＤＮＡの変異を測定する際に、検出対象の変異の野生型に対する存在割合が０．０１％程度である場合、例えば、１００万～２００万個のマイクロウェル１１０を使用することが好適である。
　図３は、複数のマイクロウェル１１０の一部を示す平面図である。図３に示すように、ウェルプレート１１において複数のマイクロウェル１１０は、平面視で同一形状である。なお、撮像やデバイス製造におけるアライメントマークとして使用するため、複数のマイクロウェルのうち、少数（例えば、１～４個）は異なる形状であってもよい。
　また、複数のマイクロウェル１１０は、マトリクス状に規則的に配置されている。ここで、マイクロウェル１１０が「規則的に配置されている」とは、複数のマイクロウェル１１０の開口部の重心同士が、一定のパターンで配置されていることを意味する。
　例えば、マイクロウェル１１０の開口部の重心同士が四角格子状に配置されていてもよい。この場合、互いに隣り合う４つのマイクロウェル１１０の開口部の重心同士を結ぶ線は、矩形、好ましくは正方形を形成する。
　または、マイクロウェル１１０の開口部の重心同士が三角格子状（六角格子状ともいう）に配置されていてもよい。この場合、互いに隣り合う３つのマイクロウェル１１０の開口部の重心同士を結ぶ線は正三角形を形成する。
　複数のマイクロウェル１１０のうち、任意のウェル（第１ウェルともいう）Ａと、ウェルＡに最も近接するウェル（第２ウェルともいう）Ｂとは、下記式（１）を満たすことが好ましい。
　０．８≦Ｄａ／Ｄａｂ＜１　…（１）
（Ｄａは、ウェルＡの開口部の円相当径であり、Ｄａｂは、ウェルＡの開口部の重心と、ウェルＢの開口部の重心と、との距離である。）
　ウェルプレート１１において、Ｄａ／Ｄａｂの値の下限は、０．８であり、０．８３であってもよい。また、Ｄａ／Ｄａｂの値の上限は、１未満であり、０．９２であってもよく、約０．９であってもよい。これらの下限値及び上限値は任意に組み合わせることができる。例えば、Ｄａ／Ｄａｂは、０．８以上１未満であってもよく、０．８３以上０．９２以下であっても良く、０．８３以上０．９以下であってもよい。
　上記式（１）を満たす場合、複数のマイクロウェル１１０が三角格子状に配置されていると、任意のマイクロウェル１１０の開口部の重心と、当該マイクロウェル１１０に最も近接するマイクロウェル１１０の開口部の重心との間の距離が一定になる。
　図３に示すマイクロウェル１１０は、三角格子状に配置されている。図３に示すように、任意のウェルＡと、ウェルＡに最も近接するウェルＢと、ウェルＡ及びウェルＢの双方に最も近接しているウェルＣのそれぞれの開口部の重心Ｃａ、Ｃｂ、Ｃｃは、それぞれを頂点とする正三角形を形成している。
　図３において、ウェルＡ、ウェルＢ及びウェルＣのそれぞれの開口部の重心Ｃａ、Ｃｂ、Ｃｃを結ぶ線は、正三角形である。
　ウェルプレート１１において、マイクロウェル１１０の開口部の円相当径は、１μｍ以上５０μｍ以下であることが好ましい。すなわち、マイクロウェル１１０の開口部の円相当径の下限は１μｍであることが好ましい。
　また、マイクロウェル１１０の開口部の円相当径の上限は、２０μｍ未満であってもよく、１９μｍ以下であってもよく、１８μｍ以下であってもよく、１７μｍ以下であってもよく、１６μｍ以下であってもよく、１５μｍ以下であってもよく、１４μｍ以下であってもよく、１３μｍ以下であってもよく、１２μｍ以下であってもよく、１１μｍ以下であってもよく、１０μｍ以下であってもよい。
　マイクロウェル１１０の開口部の円相当径について、上限値と下限値とは任意に組み合わせることができる。
（蓋部材）
　蓋部材１２は、平面視でウェルプレート１１と同じ輪郭形状（つまり短冊状）を呈している。蓋部材１２は、ウェルプレート１１の上面１１ａに対し隙間を開けて対向して配置されている。
　蓋部材１２には、厚さ方向に貫通する２つの貫通孔を有する。２つの貫通孔は、蓋部材１２の長手方向の一端側と他端側とにそれぞれ設けられている。一方の貫通孔は、流体デバイス１０の内部空間Ｓに液状物を注入する際に用いる注入口１２１であり、他方の貫通孔は、内部空間Ｓから液状物を排出させる際に用いる排出口１２２である。
　ここで、「液状物」には、液状の試料の他、検出試薬や封止液も該当する。
　注入口１２１、内部空間Ｓ及び排出口１２２はこの順に連通し、全体として流路ＦＣを形成している。流体デバイス１０では、流路ＦＣに液状物を適宜流動させて、標的物質の検出反応を行う。平面視において、注入口１２１と排出口１２２との間に、複数のマイクロウェル１１０が配置されている。
　蓋部材１２の上面１２ａには、注入口１２１の周囲を囲む筒状の注入ポート１２５が設けられている。注入ポート１２５は、注入口１２１と連通している。注入ポート１２５は、例えば、液状物を充填したシリンジを用いて内部空間に液状物を充填する際、シリンジの接続に用いる。
　同様に、蓋部材１２の上面１２ａには、排出口１２２の周囲を囲む筒状の排出ポート１２６が設けられている。排出ポート１２６は排出口１２２と連通している。排出ポート１２６は、例えば、内部空間Ｓから液状物を抜き出す際に、液状物が流動するチューブの接続に用いる。
　蓋部材１２の材料は、上述したウェルプレート１１の材料として例示した材料を採用することができる。蓋部材１２の材料は、ウェルプレート１１の材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。
　また、蓋部材１２の材料は、電磁波透過性を有していてもよく、電磁波透過性を有していなくてもよい。
　マイクロウェル１１０を明視野で観察する場合、ウェルプレート１１と蓋部材１２との少なくとも一方は光透過性を有する。
　蓋部材１２の材料は、疎水であることが好ましい。詳しくは、蓋部材１２の内部空間Ｓに面する面（つまり下面１２ｂ）を構成する材料は、封止液Ｌ２との接触角が５°以上８０°以下であることが好ましい。このような材料で蓋部材１２を形成すると、下面１２ｂと封止液Ｌ２との接触角が５°以上８０°以下となる。下面１２ｂの接触角が上記の範囲であると、後述する方法で内部空間Ｓに封止液を導入した場合に、マイクロウェル１１０に試料を隔離しやすい傾向にある。
（壁部材）
　壁部材１３は、平面視で閉環状に形成され、ウェルプレート１１の上面１１ａの外縁に沿って配置されている。図１では、壁部材１３の内部空間Ｓに面する壁面は、平面視で略矩形であり、注入口１２１側において幅が漸減している。
　壁部材１３は、ウェルプレート１１と蓋部材１２とに挟持され、一体となることで流体デバイス１０を形成する。ウェルプレート１１と蓋部材１２と壁部材１３とで囲まれた空間は、液状の試料が収容される内部空間Ｓである。内部空間Ｓは、短冊状のウェルプレート１１に沿って、ウェルプレート１１の長手方向に伸びている。
　壁部材１３は、内部空間Ｓの壁面として機能する上、ウェルプレート１１と蓋部材１２との間のスペーサとして機能する。壁部材１３の高さ、すなわち内部空間Ｓの高さは、例えば１００μｍ以下であってもよい。
　壁部材１３の材料は、特に制限されないが、例えば芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層された両面粘着テープを好適に用いることができる。芯材フィルムの材料は、シリコーンゴム、アクリル発泡体を例示することができる。このような材料を用いて壁部材１３を形成することで、内部空間Ｓを液密に形成することができる。
　また、壁部材１３の材料は、上述したウェルプレート１１と同じ材料を採用することができる。このような材料で形成された壁部材１３は、接着剤による接着、又は熱溶着、超音波溶着、レーザー溶着等による溶着により、ウェルプレート１１及び蓋部材１２と一体化することができる。
　なお、壁部材１３は、ウェルプレート１１と一体的に形成され、ウェルプレート１１の一部を構成していてもよい。同様に、壁部材１３は蓋部材１２と一体的に形成され、蓋部材１２の一部を構成していてもよい。
　上述のウェルプレート１１は、公知の射出成形、マイクロインプリンティング技術やナノインプリンティング技術を用いて製造することができる。また、ウェルプレート１１は、公知のフォトリソグラフィ技術を用い、エッチングでマイクロウェル１１０を形成することで製造することもできる。
　上述の蓋部材１２は、公知の射出成形にて製造することができる。
　壁部材１３が蓋部材１２と一体的に形成されている場合、壁部材１３は、公知の射出成形にて蓋部材１２と同時に製造することができる。壁部材１３が蓋部材１２と別体である場合、壁部材１３は、上述した芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層された両面粘着テープを切り抜くことで製造することができる。
［検出試薬］
　検出試薬Ｌ１は、標的物質と反応して、標的物質の検出に用いられる。検出試薬Ｌ１としては、緩衝物質、酵素、基質、抗体、抗体断片等が挙げられる。
　酵素は、例えば標的物質が核酸である場合には、標的物質に関連する鋳型核酸に対する酵素反応等の生化学的反応を行うために、生化学的反応の内容に対応して選択される。鋳型核酸に対する生化学的反応は、例えば、鋳型核酸が存在する条件下でシグナル増幅が起こるような反応である。
　検出試薬Ｌ１は、採用する検出反応に応じて選択される。具体的な検出反応としては、ＩＣＡ法、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）法（商標登録）、５’→３’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎ（登録商標）法）、蛍光プローブ法等が挙げられる。
［封止液、封止液の保存方法］
　封止液Ｌ２は、油性であり、水性である試料と互いに混和しないか、混和しにくいものであることが好ましい。封止液Ｌ２は、内部に試料と検出試薬Ｌ１との混合水溶液を収容したマイクロウェル１１０の開口部を覆い、マイクロウェル１１０の内部に収容した混合水溶液同士が互いに混合しないように、個別に封止する機能を有する。
　封止液Ｌ２は、オイルであることが好ましい。オイルとしては、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイル又はこれらの混合物等を使用することができる。具体的な封止液としては、ＦＣ－４０、ＦＣ－４３、ＦＣ－７７０、ＦＣ－７２及びＦＣ－３２８３（いずれも３Ｍ社製）等のフッ素系液体並びにＫＦ９６（信越化学社製）が挙げられる。
　また、封止液Ｌ２は、ＰＣＲ反応等に用いられるミネラルオイル等も用いることができる。
　発明者らの検討により、標的物質の検出のために加熱をする場合、加熱をする前の流体デバイス内に、気泡になりうる微小な気泡（気泡前駆体ともいう）を一定量以上含む封止液が注入されていると、検出反応及び観察の妨げとなる気泡を生じやすいことが分かった。詳しくは、封止液を加熱した際に、封止液に溶存する気体が気泡前駆体に向かって揮発し、気泡が膨張することで視認できるサイズの気泡に成長することが原因と考えられる。
　封止液Ｌ２は、溶存酸素量が１００ｍｇ／Ｌ以下であり、且つ溶存窒素量が２６０ｍｇ／ｍＬ以下である。
　溶存酸素量は、８０ｍｇ／Ｌ以下であるとより好ましく、６０ｍｇ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。溶存酸素量は、少ないほど好ましく、理論的には検出限界以下となるまで少なくてもよいが、調整が容易であることから２０ｍｇ／Ｌ以上であればよい。　溶存酸素量の上限値と下限値とは任意に組み合わせることができる。つまり、溶存酸素量は、２０ｍｇ／Ｌ以上８０ｍｇ／Ｌ以下であってもよく、２０ｍｇ／Ｌ以上６０ｍｇ／Ｌ以下であってもよい。
　溶存窒素量は、２００ｍｇ／Ｌ以下であるとより好ましく、１５０ｍｇ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。溶存窒素量は、少ないほど好ましく、理論的には検出限界以下となるまで少なくてもよいが、調整が容易であることから５０ｍｇ／Ｌ以上であればよい。
　溶存窒素量の上限値と下限値とは任意に組み合わせることができる。つまり、溶存窒素量は、５０ｍｇ／Ｌ以上２００ｍｇ／Ｌ以下であってもよく、５０ｍｇ／Ｌ以上１５０ｍｇ／Ｌ以下であってもよい。
　封止液Ｌ２の溶存酸素量及び溶存窒素量は、ガスクロマトグラフィー（例えばＧＣ－２０１４ＡＴ、島津製作所製）を用いて、実施例に記載の条件で測定することができる。
　検出キット１に付属する封止液Ｌ２は、下記条件で加熱したときに目視で気泡が確認できないよう調整されていることが好ましい。
（条件）
（１）１．５ｍＬマイクロチューブに前記封止液１．５ｍＬを入れて密閉する。
（２）６６℃で２５分間加温する。
（３）前記封止液中の気泡の有無を目視確認する。
　このように調整された封止液Ｌ２は、保存容器９２に密封して収容される。封止液Ｌ２が収容された保存容器９２の内部圧力は、２．０×１０２Ｐａ以下である。すなわち、封止液は、内部圧力が２．０×１０２Ｐａ以下である保存容器に密閉して収容されている。内部圧力は、公知の内圧測定器（例えば、ＫＤＭ３０（株式会社クローネ製））を用いて測定することができる。内部圧力の下限は、保存容器９２の耐圧性に依存して種々の値を採用することができる。内部圧力の下限は、例えば１×１０４Ｐａ以上であってもよく、１×１０３Ｐａ以上であってもよい。内部圧力の上限値と下限値は、任意に組み合わせることができ、例えば１×１０４Ｐａ以上２．０×１０２Ｐａ以下であってもよく、１×１０３Ｐａ以上２．０×１０２Ｐａ以下であってもよい。
　封止液Ｌ２を保存する際は、上記内部圧力の状態で保存容器９２に密封し、１５℃以上の温度で保存する。封止液Ｌ２の保存温度は、２０℃以上であってもよく、３０℃以上であってもよい。また、封止液Ｌ２の保存温度は、７０℃以下であってもよく、４０℃以下であってもよい。保存温度の上限値と下限値とは任意に組み合わせることができる。例えば、封止液Ｌ２の保存温度は、２０℃以上７０℃以下であってもよく、３０℃以上４０℃以下であってもよい。このような条件で保存することにより、封止液Ｌ２への空気中の酸素や窒素の再溶解を抑制し、標的物質の検出を好適に行うことができる。
　保存容器９２で保管する際、容器内の空気が封止液に溶け込むことを防ぐため、容器内の空気体積よりも封止液体積の方が大きい方が望ましい。封止液体積は容器内の空気体積の１．０１倍以上１０倍以下であってもよく、好ましくは１．０１倍以上５倍以下、より好ましくは１．０１倍以上２倍以下、より好ましくは２倍以下である。また、保存容器９２に保管する際、容器内の空気と封止液が接する面積に対し、保存容器内の表面積が１倍以上であってよい。
　保存容器９２の材料は、ＰＥ（ポリエチレン）、ＰＶＣ（ポリ塩化ビニル）、ＰＰ又はＰＥＴといった樹脂、金属、及びガラスから選択される。保存容器９２の材料が樹脂の場合は、気体不透過性の樹脂であるとより好ましい。
＜試料検出方法＞
　図４～６は、本実施形態の試料検出方法の説明図である。本実施形態の試料検出方法は、液状の試料に含まれる標的物質を検出する試料検出方法であって、以下の工程を含む。
（１）標的物質と反応する検出試薬Ｌ１と、試料との混合水溶液を調整する工程
（２）混合水溶液を収容する内部空間Ｓと、内部空間Ｓと連通する注入口１２１及び排出口と、内部空間Ｓに開口し混合水溶液を収容する複数のマイクロウェル１１０と、を有する流体デバイス１０を用い、内部空間Ｓに混合水溶液を導入して、混合水溶液をマイクロウェル１１０に充填する工程
（３）流体デバイス１０に、封止液Ｌ２を導入し、封止液Ｌ２によって混合水溶液をマイクロウェル１１０に封止する工程
（４）流体デバイス１０を加熱して標的物質と検出試薬Ｌ１との反応を生じさせ、標的物質を検出する工程
　試料検出方法は、上述の検出キット１を用いて行われる。
（１）混合水溶液を調整する工程
　まず、液状の試料と検出試薬Ｌ１とを混合し、混合水溶液を調整する。混合水溶液における検出試薬Ｌ１の濃度は、用いる検出試薬Ｌ１の種類及び検出反応の種類に応じて適宜調整する。
　用いる検出試薬Ｌ１は、吸着防止剤を含んでもよい。吸着防止剤は、混合水溶液中に含まれる標的物質や酵素などが部材に吸着することを抑制する機能を有する。吸着防止剤には、界面活性剤、タンパク質が挙げられる。
　標的物質の検出を容易にするため、混合水溶液の調整に先立って試料を前処理してもよい。前処理としては、濃度調整（希釈又は濃縮）、担持体による担持、２種以上の標的物質の結合反応、フィルタリングによる濾過滅菌、ｐＨ調整及び熱処理による標的物質の変性（アニーリング）などが挙げられる。
（２）混合水溶液をマイクロウェルに充填する工程
　次いで、図４に示すように、注入口１２１から内部空間Ｓに、検出試薬Ｌ１を含む混合水溶液Ｌを注入する。混合水溶液Ｌが内部空間Ｓ（つまり流路ＦＣ）を流動すると、内部空間Ｓに開口しているマイクロウェル１１０にも混合水溶液Ｌが充填される。
　内部空間Ｓ及び全てのマイクロウェル１１０が混合水溶液Ｌで充填された後、流路ＦＣを通過した混合水溶液Ｌは、排出口１２２から排出される。
　このとき、１つのマイクロウェル１１０の内部に１つの標的物質が充填されるように、予め混合水溶液Ｌの濃度を調整しておくことが好ましい。例えば、後述の試料検出方法を実施した後、混合水溶液Ｌが高濃度であることによって標的物質の定量が困難という結果となった場合には、当該結果を予備実験結果として用い、混合水溶液Ｌを希釈する。
　上記操作により、１つのマイクロウェル１１０に１つ以下、すなわち、０個又は１個の標的物質が充填される。これにより、後述の検出反応が確認されたマイクロウェル１１０の数と、標的物質の数とが対応して、標的物質の検出を１個単位で行うことができ、すなわちデジタル計測が可能となる。なお、全てのマイクロウェル１１０に標的物質が導入される必要はない。
　標的物質をマイクロウェル１１０に導入する手段は、特に制限されず、検出対象である標的物質に応じた適切な手段を選択することができる。例えば、標的物質を自重により流体デバイス１０内（具体的には流路ＦＣ内）で沈降させ、マイクロウェルに分配する方法が挙げられる。
　また、標的物質を捕捉する物質（捕捉物ともいう）を利用し、自重で沈降しにくい標的物質に捕捉物を結合させて送液してもよい。さらに、予めマイクロウェルに捕捉物を固定化させておき、混合水溶液Ｌと共に送液された標的物質を捕捉物に捕捉させることで、標的物質のマイクロウェル１１０への導入効率を向上させることもできる。
　捕捉物と標的物質とを結合させる反応は、任意の時点で行うことができる。例えば、混合水溶液を調整する前に、サンプルチューブ内で標的物質と捕捉物を接触させることにより行ってもよい。
　または、捕捉物をマイクロウェル１１０に導入した後に、標的物質をマイクロウェル１１０に導入し、マイクロウェル１１０で捕捉物と標的物質とを接触させてもよい。
　捕捉物は、標的物質を捕捉することができる物質である。捕捉物は、例えば、固相と標的物質に対する特異的結合物質との結合体であってもよい。
　補足物を構成する固相としては、粒子、膜及び基板等が挙げられる。また、標的物質に対する特異的結合物質は１種類でもよいし、２種類以上であってもよい。例えば３種類であってもよいし、４種類であってもよいし、５種類以上であってもよい。
　粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子及びガラス粒子等が挙げられる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理が施された粒子が好ましい。また、特異的結合物質を固定化するために、表面にカルボキシル基等の官能基を有する粒子が好ましい。より具体的には、ＪＳＲ社製の商品名「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＬＣ３００」等を用いることができる。
　また、例えば標的物質としてウイルスを用いる場合、ウイルスが付着することができる細胞（すなわち、ウイルス受容体を有する細胞）を、捕捉物として用いてもよい。
（３）混合水溶液をマイクロウェル１１０に封止する工程
　次いで、図５に示すように、注入口１２１から流路ＦＣに封止液Ｌ２を送液する。流路ＦＣに送液された封止液Ｌ２は、内部空間Ｓにおいて上面１１ａの面方向に流動し、流路ＦＣに送液された混合水溶液Ｌのうち、マイクロウェル１１０に収容されていない混合水溶液Ｌを押し流して置換する。
　これにより、封止液Ｌ２は、標的物質を含む混合水溶液Ｌを収容した複数のマイクロウェル１１０をそれぞれ個別に封止し、マイクロウェル１１０は独立した反応空間となる。流路ＦＣが封止液Ｌ２で満たされると、余分な封止液Ｌ２は排出口１２２から排出される。図６は、複数のマイクロウェル１１０の全てが封止液Ｌ２で封止され、且つ流路ＦＣが全て封止液Ｌ２で置換された状態を示す。
　封止液Ｌ２を注入する際には、内部空間Ｓにおいて封止液Ｌ２に気泡を含まないよう、封止液Ｌ２をゆっくりと注入すると良い。封止液Ｌ２の注入後には、注入作業により封止液Ｌ２に気泡を含んでいないことを目視で確認する。
　この時、用いる封止液Ｌ２は、上述した検出キット１に付属の封止液Ｌ２、特にフッ素系オイルが好ましい。封止液Ｌ２は、下記条件で加熱したときに目視で気泡が確認できないよう調整されていることが好ましい。
（条件）
（１）１．５ｍＬマイクロチューブに前記封止液１．５ｍＬを入れて密閉する。
（２）６６℃で２５分間加温する。
（３）前記封止液中の気泡の有無を目視確認する。
　封止液Ｌ２は、上述のように溶存酸素量が１００ｍｇ／Ｌ以下であり、且つ溶存窒素量が２６０ｍｇ／ｍＬ以下である。
（４）標的物質を検出する工程
　次いで、流体デバイス１０を加熱して標的物質と検出試薬Ｌ１との反応を生じさせる。このとき、マイクロウェル１１０を封止する封止液Ｌ２は、上述のように加熱による気泡発生が抑制されている。そのため、標的物質を検出する工程において、封止液Ｌ２における気泡発生が抑制され、高精度で標的物質の検出が可能となる。
　標的物質を検出する方法は、検出したい標的物質の特性に合わせて、公知の任意の検出方法を使用することができる。例えば、まず必要に応じて標的物質由来のシグナルを検出可能なレベルまで増幅させる反応（シグナル増幅反応ともいう）を行い、次いで増幅されたシグナルを適切な手段を用いて検出することにより、行うことができる。
　本実施形態に係る検出方法において使用することができるシグナルの例としては、蛍光、化学発光、発色、電位変化及びｐＨ変化等が挙げられる。
　シグナル増幅反応は、例えば生化学反応、より具体的には酵素反応であってもよい。一例として、シグナル増幅反応は、シグナル増幅のための酵素を含んだ試薬液がウェル内に収容された状態で、流体デバイスを、所望の酵素活性が得られる一定温度条件下、例えば６０℃以上、好ましくは約６６℃で、所定時間、例えば少なくとも１０分間、好ましくは約１５分間、維持する等温反応である。
　シグナル増幅反応の例としては、具体的には、核酸を検出する反応を使用する場合は、インベーダー（登録商標）法等のＩＣＡ反応や、ＬＡＭＰ法（商標登録）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法及び蛍光プローブ法等が挙げられる。
　シグナル増幅反応としては、ＩＣＡ反応を用いることが特に好ましい。ＩＣＡ反応は、（１）核酸同士の相補的結合と、（２）酵素による三重鎖構造の認識及び切断との２つの反応のサイクルによってシグナル増幅が進行する。このようなシグナル増幅反応においては、標的物質以外の夾雑物による反応サイクル阻害の影響が小さい。したがって、マイクロウェル１１０内に標的物質以外の様々な成分（つまり夾雑物）が存在する場合でも、ＩＣＡ反応を用いることにより、標的物質を精度よく検出することができる。
　例えば、シグナル増幅反応にＩＣＡ反応を用いる場合、混合水溶液Ｌは、ＩＣＡ反応に必要な反応試薬及び鋳型核酸を含む。反応工程における生化学反応がＩＣＡ反応である場合、等温反応による酵素反応によって、ウェルに標的物質が存在する場合には、蛍光物質が消光物質から遊離することによって、励起光に対応して所定の蛍光シグナルを発する。
　シグナル増幅反応にＩＣＡ反応を用いる場合、標的物質と検出試薬との反応温度は５０℃以上９９℃以下であると好ましい。
　以下、ＩＣＡ反応について、より詳細に説明する。
　図７は、ＩＣＡ法の一例を説明する模式図である。図７では、ＩＣＡ法により標的物質であるＤＮＡを検出する様子を示す。
　ＩＣＡ反応に必要な反応試薬としては、フラッププローブ８１０、フラップエンドヌクレアーゼＦＥＮ、蛍光基質８２０、侵入プローブ（インベーダーオリゴ）８３０等のＩＣＡ反応試薬が挙げられる。
　フラッププローブ８１０と侵入プローブ８３０とは、標的物質であるＤＮＡ（標的ＤＮＡ）にハイブリダイズして二本鎖核酸１４０とフラップ構造を形成するように設計された核酸断片（オリゴヌクレオチド）である。
　蛍光基質８２０は、ヘアピン構造を有し、蛍光物質Ｆと消光物質Ｑとが結合した核酸断片である。図７に示す蛍光基質８２０においては、核酸断片の５’末端に蛍光物質Ｆが結合され、５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている。消光物質Ｑは、蛍光物質Ｆの発光を抑制している。
　まず、標的ＤＮＡにフラッププローブ８１０と侵入プローブ８３０とをハイブリダイズさせる。フラッププローブ８１０と侵入プローブ８３０とは、それぞれ標的ＤＮＡのＳＮＰ部位で１塩基オーバーラップし、不安定な３塩基様構造を形成する。その結果、第１フラップ部位８１１が形成される。第１フラップ部位８１１は、フラッププローブ８１０のうち、標的ＤＮＡとハイブリダイズしなかった部分である。
　続いて、ＦＥＮは、上記３塩基様構造を認識して反応する。これにより、第１フラップ部位８１１が切断されて核酸断片８１１が生成し、混合水溶液Ｌ中に遊離する。
　生じた核酸断片８１１は、蛍光基質８２０にハイブリダイズする。核酸断片８１１は、蛍光基質８２０のヘアピン構造に侵入し、ＳＮＰ部位で１塩基オーバーラップして、不安定な３塩基様構造を形成する。その結果、第２フラップ部位８２１が形成される。第２フラップ部位８２１は、蛍光基質８２０のうち、核酸断片８１１の侵入によりハイブリダイズしなくなった部分である。
　続いて、ＦＥＮは、上記３塩基様構造を認識して反応する。これにより、第２フラップ部位８２１が切断され、核酸断片８２１が生成される。図７においては、蛍光基質８２０から核酸断片８２１が切断された残部を、符号８２０’で示している。
　その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れ、蛍光ＦＬを発生する。この蛍光ＦＬを検出することにより、標的ＤＮＡを検出することができる。
　また、標的物質の検出は、標的物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質ともいう）を標的物質に結合させ、結合した特異的結合物質を検出することによっても、行うことができる。例えば、標的物質がタンパク質である場合、ＥＬＩＳＡを用いて検出することができる。より具体的には、検出は、例えばＦＲＥＴの原理を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、行ってもよい。
　ＦＲＥＴの原理を用いたサンドイッチ法を行う場合は、まず、第１の蛍光物質（ドナーともいう）で標識した第１の特異的結合物質（例えば抗体）と、第１の蛍光物質の蛍光波長と重複する吸光波長を有する第２の蛍光物質（アクセプターともいう）で標識した第２の特異的結合物質を準備する。
　続いて、標的物質（例えば抗原）を、第１の特異的結合物質と第２の特異的結合物質の両方と接触させ、複合体を形成させる。複合体が形成されると、ドナーとアクセプターの距離が近づき、ドナーの励起波長の照射によりアクセプターの蛍光波長を検出することができるようになる。あるいは、特異的結合物質を核酸断片で標識しておき、核酸断片をＩＣＡ反応により検出してもよい。
　特異的結合物質としては、後述する構造体に対する特異的結合分子と同様のもの、例えば抗体、抗体断片、アプタマー等を使用することができる。標的物質に結合した特異的結合物質を検出するために、特異的結合物質を、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素により、直接的又は間接的に標識してもよい。２以上の特異的結合物質を使用する場合は、各々の特異的結合分子を、互いに識別可能に標識することができる。
　シグナルの観察方法は、観察するシグナルの種類に応じて公知の適切な方法を選択することができる。例えば、明視野観察を行う場合は、ウェルアレイが設けられた基材に対して垂直方向に白色光を照射する。蛍光シグナルを観察する場合は、蛍光物質に対応する励起光をウェルの底側からウェル内へ照射し、蛍光物質が発する蛍光を観察する。観察されたウェルアレイの全体又は一部の画像を撮影して保存し、コンピューターシステムによる画像処理を行う。
　なお、封止液Ｌ２が上記のように予め加熱による気泡発生が抑制されていない場合、封止液Ｌ２を用いて封止する工程に先立って、封止液Ｌ２を脱気する工程を有するとよい。封止液Ｌ２の脱気は、減圧、加熱、超音波照射、及びこれらの組み合わせを採用することができる。
　以上のような構成の検出キット１によれば、気泡の発生を抑制し生体分子計測を高精度で実施可能となる。
　また、以上のような構成の封止液は、加熱による気泡の発生が抑制されているため、検出キット１に用いて生体分子計測を高精度で実施可能となる。
　また、以上のような構成の封止液の保存方法によれば、気泡の発生が抑制された封止液を好適に保存可能である。
　また、以上のような構成の試料検出方法によれば、生体分子計測を高精度で実施可能となる。
　以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施の形態例について説明したが、本発明は係る例に限定されない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計、仕様等に基づき種々変更可能である。
　以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［流体デバイスの製造］
　環状ポリオレフィン（品番「ＺＥＯＮＯＲ１０２０Ｒ」、日本ゼオン社製）製のウェルプレートと、環状ポリオレフィン（品番「ＺＥＯＮＯＲ１０２０Ｒ」、日本ゼオン社製）製の蓋部材を、それぞれ射出成形で作製した。ウェルプレートの厚さは０．６ｍｍであった。
　射出成形にて、ウェルプレートの一方面に複数のマイクロウェルを形成した。マイクロウェルの開口形状は円とした。マイクロウェルのサイズは、直径１０μｍ、深さ１５μｍであった。基板上の６．０ｍｍ×３０．０ｍｍの領域に、マイクロウェルの中心と、当該マイクロウェルに最も近接するマイクロウェルの中心との間の距離が１２μｍとなるように、三角格子状に複数のマイクロウェルを配置し、ウェルアレイを形成した。
　蓋部材は壁部材と一体に形成した。壁部材の高さを３０μｍに調整することにより、流路の高さを３０μｍとした。
　続いて、ウェルプレートと蓋部材（壁部材）とを、レーザー溶着により接合して、実施例１及び実施例２の流体デバイスを作製した。
［バッファーの調整］
　流体デバイスに送液する水性媒体（つまりバッファー）を表１の組成で調整した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［溶存気体濃度の測定］
　脱気後の封止液の溶存酸素濃度及び溶存窒素濃度は、封止液をガスクロマトグラフィーで測定し、検量線法により求めた。測定の際、大気による汚染を防ぐため、ＧＣ注入口をＨｅで置換した。
　また、測定試料はシリンジを用いて採取した。採取位置は、液面から深さ１０ｍｍ程度の位置とし、目視且つ手動により採取位置がおよそ同じとなるよう調整した。
（測定条件）
使用装置：ＧＣ－２０１４ＡＴ（島津製作所）
プレカラム：Ｐｏｒａｐａｋ　Ｑ
カラム：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｅｖｅ　５Ａ
キャリアーガス：Ｈｅ
注入口温度：１７０℃
カラム温度：５０℃
検出器：熱伝導検出器　（１００　ｍＡ）
検出器温度：１５０℃
測定試料量：２０μＬ
　成分の標品として以下の標準ガス（母ガス）を、真空瓶を用いてＨｅガスで希釈（２／２０１）し、試料と同様に測定して検量線を作成した。
（標準ガス）
　窒素、酸素の混合ガス：　Ｏ２ ２１％、
　Ｎ２ ７９％、（関西ガスファースト社製）
　各標準ガスの注入量は以下の通りとした。
　母ガス　　：２０，１００，２００μＬ
　希釈ガス　：２０，１００，２００μＬ
　標準ガスの成分質量には以下の計算式を用いた。
　成分質量（ｇ）＝成分分子量（ｇ／ｍｏｌ）×標準ガス濃度（％）／１００×注入量（Ｌ）／２４．４７（Ｌ）
　なお、上記式における「２４．４７」は、１ｍｏｌの理想気体の２５℃における体積である（単位：Ｌ）。
　室温状態で保管していた未処理の封止液の溶存気体濃度は、酸素：１２０ｍｇ／Ｌ、窒素：２６０ｍｇ／Ｌであった。
［実施例１］
　封止液として、フッ素オイル（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ ＦＣ－４０、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を使用した。
　下記方法で封止液を脱気した。
（脱気方法）
　封止液５０ｍｌをスクリュー瓶（ＳＶ－５０Ａ、日電理化硝子株式会社製）に入れ、ホットプレートを用いて７０℃で２時間加熱した。
　加熱後の封止液を室温まで冷却し、上述の方法で溶存気体濃度を測定したところ、酸素：１００．０ｍｇ／Ｌ、窒素：２６０．０ｍｇ／Ｌであった。
（確認方法）
　流体デバイスの流路に、表１に示す組成のバッファーを２０μＬ注入した。次いで、バッファーが注入された流体デバイスに、脱気した封止液を２００μＬ注入し、流路内のバッファーを封止液で置換した。
　その後、封止液を注入した流体デバイスを、６６℃に加温した透明ヒートプレート（型番：ＭＰ－１０ＤＭＦＨ－ＰＧ、株式会社北里コーポレーション製）上に配置し、２５分間静置した。
　加熱後の流体デバイスの流路内の様子を、以下に示す観察器具を用いて加熱をしたまま観察し、目視で気泡の発生有無を確認した。
（観察器具）
ＵＳＢカメラ：ＣＭＯＳカメラ（型版：ＤＦＫ２２ＡＵＣ０３、Imaging Source社製）レンズ：Ａｉ　Ｎｉｋｋｏｒ　１０５ｍｍ　ｆ２．５ｍｍ（Ｎｉｋｏｎ社製）
照明：メタルハライドランプ（型番：ＬＳＭ２１０、住田光学社製）
［比較例１］
　室温状態で保管していた未処理の封止液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、気泡の発生有無を確認した。図８は、評価結果を示す写真である。
　評価の結果、比較例１の封止液を用いた流体デバイスでは気泡が発生し、実施例１の封止液を用いた流体デバイスでは気泡が発生しなかった。
［実施例２］
　下記方法で封止液を脱気した。
（脱気方法）
　封止液を入れたスクリュー管瓶５０ｍｌを開放状態のまま真空デシケータに入れた。ロータリーポンプ（型番：ＤＷ－１２０、佐藤真空社製）を用いてデシケータ内を減圧し、初期圧力１．６×１０２Ｐａで６日間保管した。
　デシケータ内を常圧に戻し、減圧後の封止液について上述の方法で溶存気体濃度を測定したところ、酸素：５．０ｍｇ／Ｌ、窒素：８．６ｍｇ／Ｌであった。
　脱気後の封止液を用いたこと以外は実施例１と同様にして、気泡の発生有無を確認した。図９は、評価結果を示す写真である。評価の結果、実施例２の封止液を用いた流体デバイスでは気泡が発生しなかった。
　以上の結果から、本発明が有用であることが分かった。
　本発明によれば、気泡の発生を抑制し生体分子計測を高精度で実施可能な検出キットを提供することができる。また、このような検出キットに用いられる封止液、封止液の保存方法、及びこのような検出キットを用いた試料検出方法を提供することができる。
　１…検出キット、１０…流体デバイス、９１，９２…保存容器、１１０…ウェル（マイクロウェル）、１２０…ウェルアレイ、１２１…注入口、１２２…排出口、Ａ…ウェル（第１ウェル）、Ｂ…ウェル（第２ウェル）、Ｃａ…重心、Ｌ…混合水溶液、Ｌ１…検出試薬、Ｌ２…封止液、Ｓ…内部空間

Claims (18)

  1. 　液状の試料に含まれる標的物質の検出に用いる検出キットであって、
    　前記試料を収容する流体デバイスと、
    　前記標的物質と反応する検出試薬と、
    　油性の封止液と、を備え、
    　前記流体デバイスは、前記試料と前記検出試薬との混合水溶液を収容する内部空間と、前記混合水溶液を収容する複数のウェルと、を有し、
    　前記封止液の溶存酸素量は１００ｍｇ／Ｌ以下であり、且つ前記封止液の溶存窒素量は２６０ｍｇ／ｍＬ以下である検出キット。
  2. 　前記封止液は、下記方法により気泡を目視確認できない請求項１に記載の検出キット。
    （確認方法）
    （１）１．５ｍＬマイクロチューブに前記封止液１．５ｍＬを入れて密閉する。
    （２）６６℃で２５分間加温する。
    （３）前記封止液中の気泡の有無を目視確認する。
  3. 　前記封止液は保存容器に密閉して収容され、
    　前記封止液が収容された前記保存容器の内部圧力は、２．０×１０２Ｐａ以下である請求項１又は２に記載の検出キット。
  4. 　前記封止液はフッ素系オイルである請求項１に記載の検出キット。
  5. 　前記流体デバイスの材料は、気体不透過性の樹脂である請求項１に記載の検出キット。
  6. 　前記内部空間に面する面に対する前記封止液の接触角が５°以上８０°以下である請求項１に記載の検出キット。
  7. 　前記複数のウェルは、平面視で同一形状であり、且つマトリクス状に配置され、
    　任意の第１ウェルと、前記第１ウェルに最も近接する第２ウェルとが、下記式（１）を満たす請求項１に記載の検出キット。
    　０．８≦Ｄａ／Ｄａｂ＜１　…（１）
    （Ｄａは、前記第１ウェルの開口部の円相当径であり、Ｄａｂは、前記第１ウェルの開口部の重心と、前記第２ウェルの開口部の重心と、の距離である。）
  8. 　前記Ｄａが１μｍ以上５０μｍ以下である請求項７に記載の検出キット。
  9. 　前記ウェル１つあたりの容積が１ｆＬ以上６ｐＬ以下である請求項１に記載の検出キット。
  10. 　請求項１に記載の検出キットで用いられる油性の封止液であって、
    　溶存酸素量が１００ｍｇ／Ｌ以下であり、且つ溶存窒素量が２６０ｍｇ／ｍＬ以下である封止液。
  11. 　下記方法により気泡を目視確認できない請求項１０に記載の封止液。
    （確認方法）
    （１）１．５ｍＬマイクロチューブに前記封止液１．５ｍＬを入れて密閉する。
    （２）６６℃で２５分間加温する。
    （３）前記封止液中の気泡の有無を目視確認する。
  12. 　内部圧力が２．０×１０２Ｐａ以下である保存容器に密閉して収容されている請求項１０又は１１に記載の封止液。
  13. 　請求項１０に記載の封止液を１５℃以上の温度で保存する封止液の保存方法。
  14. 　液状の試料に含まれる標的物質を検出する試料検出方法であって、
    　前記標的物質と反応する検出試薬と、前記試料との混合水溶液を調整する工程と、
    　前記混合水溶液を収容する内部空間と、前記内部空間と連通する注入口及び排出口と、前記内部空間に開口し前記混合水溶液を収容する複数のウェルと、を有する流体デバイスを用い、前記内部空間に前記試料と前記検出試薬との混合水溶液を導入して、前記混合水溶液を前記ウェルに充填する工程と、
    　前記流体デバイスに、油性の封止液を導入し、前記封止液によって前記混合水溶液を前記ウェルに封止する工程と、
    　前記流体デバイスを加熱して前記標的物質と前記検出試薬との反応を生じさせ、前記標的物質を検出する工程と、を有し、
    　前記封止液の溶存酸素量は１００ｍｇ／Ｌ以下であり、且つ前記封止液の溶存窒素量は２６０ｍｇ／ｍＬ以下である試料検出方法。
  15. 　前記封止液は、下記方法により気泡を目視確認できない請求項１４に記載の試料検出方法。
    （確認方法）
    （１）１．５ｍＬマイクロチューブに前記封止液１．５ｍＬを入れて密閉する。
    （２）６６℃で２５分間加温する。
    （３）前記封止液中の気泡の有無を目視確認する。
  16. 　前記封止液がフッ素系オイルである、請求項１４又は１５に記載の試料検出方法。
  17. 　前記封止する工程に先立って、前記封止液を脱気する工程を含む、請求項１４に記載の試料検出方法。
  18. 　前記検出する工程において、前記標的物質と前記検出試薬との反応温度が５０℃以上９９℃以下である請求項１４に記載の試料検出方法。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060239865A1 (en) * 2003-01-13 2006-10-26 Johan-Valentin Kahl Sample chamber for a liquid
WO2008090922A1 (ja) * 2007-01-24 2008-07-31 Toray Industries, Inc. 分析用チップ及び分析方法
JP2010130925A (ja) * 2008-12-03 2010-06-17 Olympus Corp 核酸増幅方法、核酸増幅装置及び微量液体の保持方法
JP2013068546A (ja) * 2011-09-22 2013-04-18 Sharp Corp 送液装置及び送液方法
WO2016072416A1 (ja) * 2014-11-04 2016-05-12 凸版印刷株式会社 核酸導入方法、核酸検出方法、生体成分解析方法、生体成分定量用アレイデバイス、及び生体成分解析キット
JP2018126132A (ja) * 2017-02-06 2018-08-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 封止可能な熱サイクル用微少流体チップ
JP2021511073A (ja) * 2018-01-24 2021-05-06 思納福（北京）医療科技有限公司Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． 微小液滴の容器、微小液滴の容器製造方法、微小液滴敷き詰め方法、微小液滴生成試薬キット、温度制御装置、微小液滴生成用の油相組成物及びその処理方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060239865A1 (en) * 2003-01-13 2006-10-26 Johan-Valentin Kahl Sample chamber for a liquid
WO2008090922A1 (ja) * 2007-01-24 2008-07-31 Toray Industries, Inc. 分析用チップ及び分析方法
JP2010130925A (ja) * 2008-12-03 2010-06-17 Olympus Corp 核酸増幅方法、核酸増幅装置及び微量液体の保持方法
JP2013068546A (ja) * 2011-09-22 2013-04-18 Sharp Corp 送液装置及び送液方法
WO2016072416A1 (ja) * 2014-11-04 2016-05-12 凸版印刷株式会社 核酸導入方法、核酸検出方法、生体成分解析方法、生体成分定量用アレイデバイス、及び生体成分解析キット
JP2018126132A (ja) * 2017-02-06 2018-08-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 封止可能な熱サイクル用微少流体チップ
JP2021511073A (ja) * 2018-01-24 2021-05-06 思納福（北京）医療科技有限公司Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． 微小液滴の容器、微小液滴の容器製造方法、微小液滴敷き詰め方法、微小液滴生成試薬キット、温度制御装置、微小液滴生成用の油相組成物及びその処理方法

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