JP2018126132A - 封止可能な熱サイクル用微少流体チップ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】室温より高い融点を有するパラフィンろう封止剤。
【選択図】なし
Description
すなわち、複数の反応区画を有する内部流路を備える微少流体チップが、提供される。水性試料が、入口ポートを介して流路内へ、最終的には反応区画内へ導入され、そのステップの後、置換流体が、過剰な水性試料を流路から除去するために添加され、それにより、反応区画内部に新たに作成された試料画分を互いに流体的に分離する。
このように準備された微少流体チップは、次に、温熱培養ステーションに移送され、一連の加熱ステップ下に置かれ、このとき封止剤は、再び溶融し、それにより微少流体チップの内側とその外側とのガス交換と圧力平衡を可能にする。
本明細書に開示される別の態様は、複数の反応区画を有する内部流路を備える微少流体チップである。チップは、流路に接続された入口ポートをさらに有し、このとき、入口ポートは、室温より高い融点を有し固体状で内壁に付着される封止剤を備える。封止剤は、溶融され、その後入口ポートを被覆するために再凝固されない限り、入口ポートを通る液流を妨害しないように配置される。
a.上部プレートと下部プレートとの間の流路を備える微少流体チップを提供するステップであって、ここで流路は、上部プレートおよび/または下部プレートの内壁上の複数の反応区画と流体接続される;
b.水性試料を、入口ポートを介して微少流体チップの流路内に注入するステップであって、それにより水性試料を、複数の反応区画内に分配するステップ;
c.置換流体を、入口ポートを介して微少流体チップの流路内に注入するステップであって、それにより水性試料を流路から押し出し、個々の反応区画内部で水性試料画分を互いに流体的に分離するステップ;
d.室温より高い融点を有する封止剤を微少流体チップの入口ポートに適用するステップであって、次にそれが、入口ポートを封止するように、その融点より低い温度で凝固することを可能にするステップ;
e.反応区画内部に水性試料画分を収容する封止された微少流体チップを温熱培養ステーションへ移送するステップ;および、
f.微少流体チップを一連の加熱ステップ下に置くステップであって、ここで1つまたは複数のステップで、封止剤の溶融温度が超過されてその結果封止剤が溶融し、それにより入口ポートを介したガス交換および圧力平衡を可能にするステップ;を備え、
このとき、水性試料、置換流体、および封止剤は、互いに不混和性であり、封止剤は、水性試料よりも低い密度を有する。
たとえば、微少流体チップなどのデバイスは、多くの場合、分析システムの個々のユニット間で移送される必要があるので、封止剤は、入口ポートに関して漏洩防止の手段を提供する。置換流体は、それ自体では通常、チップが移動され、傾けられ、落とされる場合に、水性試料を含む流体の損失を回避するためには不十分である。同様に、置換流体は、液体なので、入口ポートを介した最終的に反応区画の試料画分内への汚染物質の侵入は通常、置換流体のみの能力では、実質的に防止できない。
隔離されることになる試料および置換流体は両方、毛細管力の影響下で吸引されることによって、流路内へ導入され得る。加圧式装填技法もまた使用され得るが、置換流体が、圧力下で微少流体チップ内に入れられる場合、圧力は、試料を反応区画から移動させるほど高くてはならない。水性試料かつ/または置換流体を装填する他の手段は、動電学的または静電気装填技法、温度差動、遠心力、真空もしくは吸引装填、磁性流体の磁気引力装填、または電気泳動装填などに使用され、それらを含み得る。
したがって、本明細書で説明する方法のいくつかの実施形態では、一連の加熱ステップが、加圧室内で実行される。
本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」(PCR)は、当技術分野で知られている、試料中の標的のポリヌクレオチドのセグメント濃度を増大させる増幅方法を示し、ここで試料は、単一のポリヌクレオチド種または複数のポリヌクレオチドであり得る。通常、PCRプロセスは、所望の標的配列を含む反応混合に先立って、モル過剰の2つ以上の拡張可能なオリゴヌクレオチドを導入するステップからなり、ここで、プライマーは、二本鎖の標的配列の対向する鎖を相補する。反応混合は、DNAポリメラーゼの存在下での温熱サイクルプログラムに従い、DNAプライマーに両側を挟まれた所望の標的配列の増幅をもたらす。逆転写酵素PCR(RT−PCR)は、DNA依存性のDNAポリメラーゼプライマー伸長の多数サイクルの前に、まず一本鎖DNA分子を発生させるために、RNA鋳型および逆転写酵素、または逆転写酵素活性を有する酵素を利用するPCR反応である。多重PCRは、単一の反応で2つ以上の増幅産物を生成するPCR反応を示し、一般に、単一の反応に3つの以上のプライマーを含有することによる。一般に、PCRサイクルは、通常90℃より高い温度での変性ステップを含み、そのステップで二本鎖鋳型核酸の個々の鎖が、互いから分離される。ほとんどの場合、耐熱性の核酸ポリメラーゼが最大酵素活性を呈する70℃から80℃まで、再び昇温される前に、プライマーは、著しく低い温度、多くの場合50℃から65℃で、各鋳型鎖上のそれらの相補する標的位置へアニーリングされる。非常に多様なPCR適用の方法が、当技術分野で広く知られており、多くの出典たとえば、「Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学カレント・プロトコル)」、Ausubelら編、第15節、John Wiley & Sons, Inc.、 New York (1994)で説明されている。
本明細書で説明する別の態様は、標的核酸を含むと思われる水性試料を温熱培養する微少流体チップであり、微少流体チップは、
− 上部プレートと下部プレートとの間の流路であって、上部プレートおよび/または下部プレートの内壁上の複数の反応区画と流体接続する、流路と、
− 流路と流体連絡する入口ポートと、
− 水性試料の通過を妨害しないように、固体状態で入口ポートの内壁に付着された室温より高い融点を有する封止剤であって、水性試料と混和せず、それよりも低い密度を有する、封止剤と、を備える。
本明細書で説明する微少流体チップのいくつかの実施形態では、封止剤は、入口ポートの内壁の溝または凸部として形成される注入路によって保持され、このとき、注入路および入口ポートは、本明細書で説明する方法の状況で提示されたように、流体的に接続される。
分析または診断用の統合された解決方法を取得し、利用することが、多くの場合有利であるので、本明細書で説明する別の態様は、標的核酸を含むと思われる水性試料を温熱培養するキットであり、キットは、
− 本明細書で説明する微少流体チップと、
− 水性試料および封止剤の両方と混和しない置換流体と、を備える。
置換流体および封止剤の明細は、本明細書で説明する方法の文脈にあるようなものである。
本明細書で説明するキット自体で、標的核酸を含むと思われる水性試料を温熱培養する分析システムの一部を形成し得て、分析システムは、
− 本明細書で説明するキットと、
− 水性試料、置換流体、および液体状態の封止剤を、微少流体チップの流路内に充填するように構成された充填ステーションと、
− 微少流体チップを一連の加熱ステップ下に置くように構成された温熱培養ステーションであって、このとき、1つまたは複数のステップで、封止剤の溶融温度が超過され、それにより入口ポートを介したガス交換および圧力平衡を可能にする、温熱培養ステーションとを備える。
図面の詳細な説明
図1の概略図は、本明細書で説明する微少流体チップ(1)の実施形態を上からの斜視図で示す。本実施形態の上部プレート(3)は、流路(2)が見えるように、透明な材料からなる。透明な上部プレート(3)は、多様な利点を有し、たとえば、上からの反応区画(5)内部の検体の光学的検出を可能にし得る。下部プレート(4)もまた透明である実施形態では、光透過性に基づいた光学的検出がさらに可能である。本実施形態での反応区画(5)は、下部プレート(4)の上面の空洞として形成された六角形の凹部が、流路(2)に流体連絡する入口ポート(6)を介して水性試料(10)で充填され得る。出口ポート(7)は、排出される空気ためのガス排出口を、または過剰な水性試料(10)または置換流体(20)用の排出開口までも提供する。本実施形態の両ポートは、円筒形状を示し、上部プレート(3)の上方への凸部として形成される。他の適切なポート形状も可能である。
変形形態a)は、その内壁の左右に付着された固体状態の封止剤(30)の2つの部分を有し、水性試料(10)または置換流体(20)の流体通過を妨害しないように中間に空隙を残す、入口ポート(6)を表す。この図面は、断面図を示すので、封止剤(30)もまた、入口ポート(6)内壁に沿った連続した環を形成し得る。
実施例1:漏洩防止用ポート封止剤としてのパラフィンろうの適合性
目的:
チップが誤って反転されたまたは床に落下した場合に、封止剤を使用した入口ポートの封止が漏洩防止として機能し得るのか。
材料:
1.容積45μlの隔離流体および45μlの封止剤を受けることに適した入口ポートおよび出口ポートを有する微少流体チップ。微少流体チップは、総容量10μlを有する流路、および総容積10μlを備える流動室内部の複数の区画を特徴として有する。
3.封止剤:パラフィンろう。Fisher Chemical、CAS:8002−74−2、EC:232−315−6、透明化温度:約55〜71℃。
5.20gのパラフィンろうを溶かすための加熱プレートおよび容器。
実施された試験:
1.容量10μl(チップ内部の区画の総容積に等しい)のPCR反応混合液(5xマスターミックス1に水4の割合)で微少流体チップを充填した。
5.凝固プロセスが完了するまでの時間を測定した。
観察:
試験は、封止剤としてパラフィンろう、および置換流体としてシリコーン流体PMX200を使用して実施した。24個のチップが処理された。ろうの固化には、室温で1分間の待機時間で十分であった。調査されたチップ全てが落下試験で合格となり、すなわち、液体の漏洩または流出は観察されなかった。
実施例2:ポート封止剤としてのパラフィンろうの低自己蛍光特性
目的:
自己蛍光は、蛍光の読出しに基づく生体分子分析を含めた微少流体の装置内部では、望ましくない材料特性である。全体での蛍光信号への寄与が、画像面内の全ての材料について評価されなければならない。入口ポートおよび出口ポートは、微少流体チップの画像化の主眼にはないが、散乱光は、封止剤と相互作用し、望ましくない信号をもたらし得るのか。
材料:
1.実施例1で説明した微少流体チップおよびパラフィンろう。
3.適切なフィルタセットを有する落射蛍光顕微鏡などの、蛍光緩衝溶液を収容する微少流体チップの蛍光撮像に適した撮像装置。
実施された試験
1.実施例1で説明したように、蛍光色素を含むPCR反応溶液で微少流体チップを充填した。
3.反応区画内部の蛍光溶液とチップ上部の一部を被覆するろうの層を収容する微少流体チップにおいて蛍光を撮像した。
観察:
区画内部で測定された蛍光(バックグラウンド除去後)は、31250±3562のRFU(相対蛍光単位)を示した。画像範囲内のパラフィンろうの点からの蛍光は、10875±740のRFUを示した。パラフィンろうの点によって発光された蛍光信号は、調査したい信号のみの35%に相当した。本試験は、測定点の厚さが非常に大きく選定されたので、極端な場合を示しており、標的への適用においては、パラフィンろうは画像範囲の外側であるため、検出される自己蛍光レベルは、標的への適用では無視できる。
実施例3:パラフィンろうで封止された出入り口を有する微少流体チップにおけるデジタルPCR性能
目的:
入口ポートおよび出口ポート封止を有する微少流体チップと、有さない微少流体チップでのデジタルPCR試験の性能比較:デジタルPCRなどの生化学の定量化分析は、封止剤としてパラフィンろうを使用することによって、マイナスの影響を受け得ないのか。
材料:
1.試験1で説明した、微少流体チップ、置換流体および封止流体、ならびに汎用PCRマスターミックス。
3.微少流体チップを使用してPCRを実施するための、かつ微少流体チップの区画内部での温熱サイクル後の蛍光信号を測定するための、温熱サイクル用および撮像計器。温熱サイクル用計器は、室温と98℃との間で微少流体チップを温熱サイクルすることが可能である。さらに、計器は、プラス1.5barの圧力設定でサイクルを実施することが可能である。
実施されるべき試験
1.マスターミックス、プライマー/プローブのセット、およびマスターミックスのキットの手順書で説明されるような標的からPCR反応混合液を準備した。3つの試験の全てを、封止剤としてろうを使用して実施すると共に、3つの試験の全てを、入口ポートおよび出口ポートの封止なしの対照として実施した。
3.置換流体(110μl)をピペットで微圧によって流路内に移した。
5.微少流体チップを温熱サイクル装置にかけた。微少流体チップは、プラス1.5barの圧力に設定し、その後、95℃で2分の前培養、ならびに95℃で10秒および58℃で20秒の40サイクルの温熱サイクルの下においた。40℃への最終冷却は30秒間であった。昇温および降温の速度は、毎秒1.2℃であった。温熱サイクル機の蓋は、58℃の低温に保持した。
観察:
対照試験用に、μl毎の複製数を、FAMチャネルで示された1239±30に、およびHEXチャネルで6246±299に決定した。封止剤としてパラフィンろうを使用した試験の場合、決定したμl毎の複製数が、FAMチャネルで11188±72、HEXチャネルで6213±210と示された。パラフィンろうで封止された微少流体チップと、対照試験との間の複製係数の差異は、統計的に著しい差異ではない(片側t検定で、FAMがP=0.3207、HEXがP=0.8833)。3つの封止ありおよび封止なし試験の平均蛍光強度[RFU]もまた、正負の両信号で統計的に著しく異ならない。FAM[正信号]のWelchのt検定:ろうなし:4885±12、対して、ろうあり:4883±29:P=0.9215。FAM[負信号]:ろうなし:760±2、対して、ろうあり:749±4:P=0.0554。HEX[正信号]:ろうなし:11411±30、対して、ろうあり:11333±42:P=0.2140。HEX[負信号]:ろうなし:2465±11、対して、2448±39:P=0.5414。
2 流路
3 上部プレート
4 下部プレート
5 反応区画
6 入口ポート
7 出口ポート
8 流体境界部
10 水性試料
20 置換流体
30 封止剤
31 注入路、溝
32 ピペット針
40 分析システム
42 充填ステーション
43 温熱培養ステーション
44 自動ディスペンサ
45 自動ディスペンサ
46 加熱要素
Claims (15)
- 標的核酸を含むと思われる水性試料(10)を温熱培養するための方法であって、
a.上部プレート(3)と下部プレート(4)との間の流路(2)を備える微少流体チップ(1)を提供するステップであって、ここで前記流路(2)は、前記上部プレート(3)および/または前記下部プレート(4)の内壁上の複数の反応区画(5)と流体接続されるものである;
b.前記水性試料(10)を、入口ポート(6)を介して前記微少流体チップ(1)の前記流路(2)内に注入するステップであって、それにより前記水性試料(10)を、前記複数の反応区画(5)に分配するステップ;
c.置換流体(20)を、前記入口ポート(6)を介して前記微少流体チップ(1)の前記流路(2)内に注入するステップであって、それにより前記水性試料(10)を前記流路(2)から押し出し、前記個々の反応区画(5)内部で前記水性試料(10)画分を互いに流体的に分離するステップ;
d.室温より高い融点を有する封止剤(30)を前記微少流体チップ(1)の前記入口ポート(6)に液体状態で適用し、次にそれが、前記入口ポート(6)を封止するように、その融点より低い温度で凝固することを可能にするステップ;
e.前記反応区画(5)内部に前記水性試料(10)画分を収容する前記封止された微少流体チップ(1)を温熱培養ステーション(43)へ移送するステップ;および、
f.前記微少流体チップ(1)を一連の加熱ステップ下に置くステップであって、ここで1つまたは複数のステップで、前記封止剤(30)の前記溶融温度が超過され、その結果前記封止剤(30)が溶融し、それにより前記入口ポート(6)を介したガス交換および圧力平衡を可能にする、ステップ;
を備え、
前記水性試料(10)、前記置換流体(20)、および前記封止剤(30)は、互いに不混和性であり、前記封止剤(30)は、前記水性試料(10)よりも低い密度を有する、前記方法。 - 高密度から低密度への順番が、水性試料(10)>置換流体(20)>封止剤(30)である、請求項1に記載の方法。
- 前記一連の加熱ステップが、加圧室内で実行される、請求項1または2に記載の方法。
- ステップaにおける前記微少流体チップ(1)が、前記入口ポート(6)を介した前記流路(2)への前記水性試料(10)または前記置換流体(20)の通過を妨害しないように固体状態で前記入口ポート(6)の内壁に付着される前記封止剤(30)を予備装填される、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 固体状態の前記封止剤(30)は、前記入口ポート(6)の内壁の溝または凸部として形成される注入路(31)によって保持され、前記注入路(31)および前記入口ポート(6)は、流体的に接続される、請求項4に記載の方法。
- 前記封止剤(30)が、ろうである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微少流体チップ(1)が、前記入口ポート(6)と同等に取り扱われる、または前記封止剤(30)に関して予備装填される出口ポート(7)をさらに備える、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性試料(10)、前記置換流体(20)、および前記封止剤(30)が、充填ステーション(42)で前記流路(2)内に充填され、一方、前記一連の加熱ステップが、前記充填ステーションから離間された温熱培養ステーション(43)で、適用される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一連の加熱ステップが、前記水性試料(10)の前記画分を収容する前記反応区画(5)内部でのポリメラーゼ連鎖反応を促進する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 標的核酸を含むと思われる水性試料(10)を温熱培養するための微少流体チップ(1)であって、
上部プレート(3)と下部プレート(4)との間の流路(2)であって、前記流路(2)は、前記上部プレート(3)および/または前記下部プレート(4)の内壁上の複数の反応区画(5)と流体接続される;
前記流路(2)と流体連絡する入口ポート(6);および、
前記水性試料(10)の通過を妨害しないように、固体状態で前記入口ポート(6)の内壁に付着された室温より高い融点を有する固体状態の封止剤(30)であって、前記水性試料(10)と混和せず、それよりも低い密度を有する、封止剤(30);
を備える、微少流体チップ(1)。 - 前記封止剤(30)が、前記入口ポート(6)の内壁の溝または凸部として形成される注入路(31)によって保持され、前記注入路(31)および前記入口ポート(6)は、流体的に接続される、請求項10に記載の微少流体チップ(1)。
- 前記封止剤(30)は、前記入口ポート(6)内部の開口を囲むように、前記入口ポート(6)の内周に広がる、請求項10に記載の微少流体チップ(1)。
- 前記流路(2)と流体連絡する出口ポート(7)をさらに備え、前記封止剤(30)は、前記水性試料(10)の通過を妨害しないように、固体状態で前記出口ポート(7)の内壁にさらに付着される、請求項10〜12のいずれか1項に記載の微少流体チップ(1)。
- 標的核酸を含むと思われる水性試料(10)を温熱培養するためのキットであって、
請求項10〜13のいずれか1項に記載の微少流体チップ(1)と、
前記水性試料(10)および前記封止剤(30)の両方と混和しない置換流体(20)とを備える、前記キット。 - 標的核酸を含むと思われる水性試料(10)を温熱培養するための分析システムであって、
請求項14に記載の前記キットと、
前記水性試料(10)、前記置換流体(20)、および液体状態の前記封止剤(30)を、前記微少流体チップ(1)の前記流路(2)内に充填するように構成された充填ステーション(42);および、
前記微少流体チップ(1)を一連の加熱ステップ下に置くように構成された温熱培養ステーション(43)であって、1つまたは複数のステップで、前記封止剤(30)の前記溶融温度が超過され、その結果前記封止剤(30)が溶融し、それにより前記入口ポート(6)を介したガス交換および圧力平衡を可能にする、温熱培養ステーション(43);を備える、分析システム。
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