CN112601807A - Pcr反应容器 - Google Patents

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Abstract

一种PCR反应容器，具有：基板；形成在所述基板中的流动通道；设置在流动通道的两端的一对过滤器；通过过滤器与流动通道连通的一对空气连通端口；形成在流动通道中在一对过滤器之间的热循环区域；以及样品注入端口，样品可以通过样品注入端口从上方注入到流动通道中；其中样品注入端口在基板的表面中具有0.7mm2至1.8mm2的面积。

Description

PCR反应容器
技术领域
本发明涉及一种用于聚合酶链式反应(PCR)的PCR反应容器，以及使用该PCR反应容器的PCR装置和PCR方法。
背景技术
通用PCR和实时PCR的热循环仪由于热容量大，需要很长时间才能改变温度，PCR需要1-2小时。本发明人已经开发了一种通过使用微通道芯片在多个温度区重复液体输送来加速热循环的方法(专利文献1)。此外，本发明人提出了一种机构，该机构不需要称重，并且使用组合了沿着构成PCR反应容器的平面的分支流动通道的结构作为样品引入部分来防止液体泄漏(专利文献2)。
在专利文献2提出的技术中，在样品引入时，一些残留的样品液滴残留在分支流动通道部分中，这可能导致残留的液滴意外进入主流动通道的现象，干扰通过往复液体输送进行的后续热循环中的液体输送。
专利文献3公开了一种技术，其中在通过加热器将分配区域的温度升高到高于室温的温度之后，将样品移动到热循环区域，然后降低分配区域的温度以冷却和收缩空气，从而从主流动通道收回残留在分配区域中的液滴。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：JP6226284B
专利文献2：WO2017/094674
专利文献3：JP2018-19606A
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种PCR反应容器，其中即使残留有样品液滴，在热循环过程中在主流动通道中的液体输送方面也不会出现问题。
问题的解决方案
本发明提供了以下PCR反应容器。
[1]
一种PCR反应容器，包括：
基板，
流动通道，其形成在所述基板中，
一对过滤器，其设置在所述流动通道的两端，
一对空气连通端口，其通过所述过滤器与所述流动通道连通，
热循环区域，其形成在所述流动通道中在所述一对过滤器之间，以及
样品注入端口，样品可以通过所述样品注入端口从上方注入到所述流动通道中；
其中，所述样品注入端口在所述基板的表面中具有0.7mm2至1.8mm2的面积。
[2]
根据[1]所述的反应容器，其中，所述样品注入端口是圆形、椭圆形或多边形的。
[3]
根据[1]或[2]所述的反应容器，其中，所述流动通道的宽度为300μm至1000μm。
[4]
根据[1]至[3]中任一项所述的反应容器，其中，单独地用于样品注入的具有圆形或多边形的管状形状的样品注入构件的端部到达所述流动通道的内部。
[5]
根据[1]至[4]中任一项所述的反应容器，其中，所述样品注入端口具有7.5μL以下的容积，所述容积是所述基板的表面和所述流动通道之间的空间。
[6]
根据[1]至[5]中任一项所述的反应容器，其中，在样品注入之后，所述样品注入端口的上部开口用密封件或所述样品注入构件等密封。
[7]
根据[1]至[6]中任一项所述的反应容器，其厚度为3mm至5mm。
本发明的有益效果
在本发明中，样品注入端口设置在流动通道上，而不像现有技术中那样调节分支流动通道。通过分支流动通道注入样品已经引起了问题，即样品残留在分支流动通道中，并且残留的样品在热循环期间进入主流动通道。然而，当样品注入端口设置在流动通道上时，即使在热循环期间，残留在流动通道上的样品注入端口的空间中的样品也保留在该空间中。因此，没有必要使用专利文献3中描述的加热器。
附图说明
图1(a)和图1(b)是用于解释根据本发明第一实施例的PCR反应容器的图。
图2是图1(a)所示PCR反应容器的A-A截面图。
图3是显示样品注入端口的截面图。
图4显示了使用大肠杆菌uidA的高速PCR的结果。
具体实施方式
下面描述根据本发明实施例的PCR反应容器和PCR装置。附图中所示的相同或等同的部件、构件和处理由相同的附图标记表示，并且适当地省略重复的描述。这些实施例不限制本发明，而仅仅是示例。并不是实施例中描述的所有特征及其组合都是本发明所必需的。本发明的PCR反应容器可用作核酸扩增的芯片。
图1(a)和图1(b)是用于解释根据本发明第一实施例的PCR反应容器10的图。图1(a)是PCR反应容器10的平面图。图1(b)是PCR反应容器10的前视图。图2是图1(a)所示PCR反应容器的A-A截面图。图3示出了吸液管的一次性吸头插入样品注入端口中的状态。
PCR反应容器10包括具有下表面14a的树脂基板14(该下表面14a具有槽状流动通道12)、用于密封贴附到基板14的下表面14a的流动通道12的流动通道密封膜16、以及贴附到基板14的上表面14b的三个密封膜(第一密封膜18、第二密封膜20和第三密封膜22)。
基板14优选由具有良好导热性、对温度变化稳定、并且不容易受到使用的样品溶液影响的材料制成。此外，基板14优选由具有良好的成型性、优异的透明性和阻隔性以及低自发荧光的材料制成。这种材料优选为无机材料，例如玻璃和硅、以及树脂，例如丙烯酸树脂、聚酯树脂和硅树脂；特别优选环烯烃。基板14的尺寸例如长边为70mm，短边为42mm，厚度为3mm。形成在基板14的下表面14a中的流动通道12的尺寸例如为0.5mm宽和0.5mm深。
槽状流动通道12形成在基板14的下表面14a中，并且流动通道12用流动通道密封膜16密封(见图2)。第一空气连通端口24形成在基板14中的流动通道12的一端12a。第二空气连通端口26形成在基板14中的流动通道12的另一端12b。这对第一空气连通端口24和第二空气连通端口26形成为暴露在基板14的上表面14b上。这种基板可以通过注射成型或通过用数控加工机切割等来生产。流动通道的宽度优选为300μm至1000μm。流动通道的深度优选为300μm至1000μm。
第一过滤器28设置在第一空气连通端口24和基板14中的流动通道12的一端12a之间(见图2)。第二过滤器30设置在第二空气连通端口26和基板14中的流动通道12的另一端12b之间。设置在流动通道12两端的这对第一过滤器28和第二过滤器30具有足够的低杂质特性，仅允许空气通过，并防止污染，使得通过PCR扩增的DNA的质量不会恶化。过滤材料优选为聚乙烯、PTFE等，并且可以是多孔的或疏水的。第一过滤器28和第二过滤器30各自的尺寸形成为使其紧密配合在形成于基板14中的过滤器安装空间中。
基板14在第一过滤器28和热循环区域12e之间、或者在第二过滤器30和热循环区域12e之间设置有样品注入端口133。样品注入端口133形成为暴露在基板14的上表面14b上。
在流动通道12中在第一过滤器28和第二过滤器30之间形成热循环区域12e，在该区域中设置了高温区域和中温区域，以对样品施加热循环。流动通道12的热循环区域12e包括蛇形流动通道。这是为了有效地将PCR装置在PCR步骤中产生的热量施加到样品上，并允许预定体积或更多(例如，25μL或更多)的样品进行PCR。由于PCR反应容器10设置安装在PCR装置中，以对样品进行热循环，并测量光学特性值(例如从样品发出的荧光)，所以考虑到温度控制单元和稍后描述的荧光检测探针的布置，可以自由选择元件(例如流动通道和分支点)的布置。
在根据第一实施例的PCR反应容器10中，大部分流动通道12形成为暴露在基板14的下表面14a上的凹槽形状。这是为了便于使用模具等通过注射成型进行成型。为了利用该凹槽作为流动通道，将流动通道密封膜16贴附到基板14的下表面14a。流动通道密封膜16的一个主表面可以具有粘性，或者可以在一个主表面上形成在按压时发挥粘性或粘附性的功能层。该膜具有能够容易地与基板14的下表面14a结合的功能。流动通道密封膜16理想地由包含粘合剂的具有低自发荧光性的材料制成。在这方面，由诸如环烯烃聚合物、聚酯、聚丙烯、聚乙烯或丙烯酸树脂的树脂制成的透明膜是合适的，但不限于此。此外，流动通道密封膜16可以由板状玻璃或树脂制成。在这种情况下，可以期望刚性特性，这有助于防止PCR反应容器10的翘曲和变形。
此外，在根据第一实施例的PCR反应容器10中，第一空气连通端口24、第二空气连通端口26、第一过滤器28、第二过滤器30和样品注入端口133暴露在基板14的上表面14b上。为了密封第一空气连通端口24和第一过滤器28，将第一密封膜18贴附到基板14的上表面14b。为了密封第二空气连通端口26和第二过滤器30，将第二密封膜20贴附到基板14的上表面14b。为了密封样品注入端口133，将第三密封膜22贴附到基板14的上表面14b。
所使用的第一密封膜18具有能够同时密封第一空气连通端口24和第一过滤器28的尺寸，所使用的第二密封膜20具有能够同时密封第二空气连通端口26和第二过滤器30的尺寸。加压泵(稍后描述)通过用设置在泵的端部的中空针(具有尖头的注入针)在第一空气连通端口24和第二空气连通端口26中进行穿孔而连接到第一空气连通端口24和第二空气连通端口26。因此，第一密封膜18和第二密封膜20优选地是由具有易于用针穿孔的厚度的材料制成的膜。第一实施例描述了具有能够同时密封相应的空气连通端口和过滤器的尺寸的密封膜；然而，可以单独对它们进行密封。可选地，也可以使用能够同时密封第一空气连通端口24、第一过滤器28、第二空气连通端口26和第二过滤器30的密封膜(单个膜)。
所使用的第三密封膜22具有能够密封样品注入端口133的尺寸。通过样品注入端口133将样品注入到流动通道12中以这样的方式进行，即从基板14上一次移除第三密封膜22，并且在注入预定量的样品后，将第三密封膜22取回并再次贴附到基板14的上表面14b。因此，第三密封膜22理想地是具有粘性的膜，该膜能够经受贴附和移除的数次循环。此外，第三密封膜22可以以这样的方式使用，即在注入样品后贴附新的膜。在这种情况下，可以减轻贴附和移除特性的重要性。
在样品注入时，需要以与第三密封膜22相同的方式一次移除第一密封膜18或第二密封膜20。这是因为除非形成空气出口，否则样品不能进入流动通道。因此，第一密封膜18和第二密封膜20也理想地是具有粘性的膜，其能够经受贴附和移除的数次循环。可选地，可以在样品注入后贴上新的薄膜。
还可以提供空气连通端口24和26之外的空气出口，并且通过贴附和移除第四密封膜将样品注入流动通道。
在第一密封膜18、第二密封膜20和第三密封膜22中，如流动通道密封膜16一样，可以在其一个主表面上形成粘合剂层，或者可以形成在按压时发挥粘性或粘附性的功能层。第一密封膜18、第二密封膜20和第三密封膜22各自理想地由包含粘合剂的具有低自发荧光性的材料制成。在这方面，由诸如环烯烃、聚酯、聚丙烯、聚乙烯或丙烯酸树脂的树脂制成的透明膜是合适的，但不限于此。如上所述，希望即使在多次贴附和去除之后，粘性和其他特性不会恶化到影响使用的程度。如果在移除膜并注入样品等之后贴附新膜，则可以减轻贴附和移除性质的重要性。
接下来，解释使用如上所述配置的PCR反应容器10的方法。首先，准备要通过热循环扩增的样品。样品的示例包括通过向含有两种或更多种类型的DNA的混合物中加入几种类型的引物、热稳定酶和四种类型的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)作为PCR试剂而获得的样品。然后，从基板14移除第一密封膜18和第三密封膜22，以开放第一空气连通端口24和样品注入端口133。当第一密封膜18的尺寸被设定为同时密封第一空气连通端口24和第一过滤器28时，第一密封膜18可以从基板14完全移除，以将第一空气连通端口24和第一过滤器28向大气开放；然而，通过仅打开第一空气连通端口24而不从基板14完全移除第一密封膜18，第一过滤器28不暴露于大气，这在防止污染方面是有效的。此外，当使用能够分别密封第一空气连通端口24和第一过滤器28的密封膜时，也不将第一过滤器28暴露于大气，这在防止污染方面是有效的。
接下来，将样品从连接到微量吸液管末端的细长锥形一次性吸头(样品注入构件)注入到样品注入端口133中。微量吸液管允许固定量的样品从一次性吸头注入流动通道12。通过按下微量吸液管的按钮至第一个止档，可以从微量吸液管中排出固定量的样品。可通过更用力地按下按钮(该按钮已一次停止在第一个止档处)至第二个止档将残留在一次性吸头中的全部样品排出。细长的一次性吸头从样品注入端口133的上部直接向下朝向朝流动通道12插入，并且通过在吸头的吸液管附接侧的任意位置处抵靠样品注入端口的最上部来固定，样品从该位置注入。如果样品注入端口最上部分的直径太大，一次性吸液管的末端到达流动通道；在这种状态下注入液体样品是不优选的，因为样品溢出到外部而没有进入流动通道。如果样品注入端口最上部分的直径太小，一次性吸头的末端只稍微插入样品注入端口，在这种状态下，样品从注入端口溢出。因此，样品注入端口的尺寸有一个最佳范围。当注入端口为圆筒形时，样品注入端口的尺寸优选为直径约1mm至1.5mm。
当通过具有适当直径的样品注入端口从附接到微量吸液管末端的一次性吸液管注入样品时，可以通过用力按压按钮至第二止档而将一次性吸头中的全部样品排出并推入流动通道。
另一方面，如果微量吸液管的按钮只向下推到第一个止档，液体样品可能会残留在流动通道12上的样品注入端口133的空间中。可以想象，在热循环过程中，样品注入端口133的空间中的液体样品因为重力流入流动通道12。然而，实际上，样品注入端口133的空间中的液体样品的量在热循环之前和之后是相同的，并且该空间中的液体样品不会对PCR产生不利影响。
因此，本发明的反应容器允许PCR，而不管使用者的注入方法如何。为了这样进行PCR而没有不利影响，样品注入端口133的面积(基板表面中的开口面积)优选为0.7mm2至1.8mm2，更优选为0.9mm2至1.7mm2，特别优选为1.3mm2至1.6mm2。样品注入端口133的面积上限优选为1.8mm2以下，更优选为1.7mm2以下，甚至更优选为1.6mm2以下，甚至更优选为1.5mm2以下，并且进一步更优选为1.4mm2以下。样品注入端口133的面积的下限优选为0.7mm2以上，更优选为0.9mm2以上，甚至更优选为1.0mm2以上，并且进一步更优选为1.3mm2以上。
此外，样品注入端口的容积(基板表面和流动通道之间的空间)优选为7.5μL以下，更优选为3μL至7.5μL。
样品注入端口的形状没有特别限制，但是优选为圆形、椭圆形或多边形管状，特别优选为圆形管状。
接下来，将第一密封膜18和第三密封膜22再次贴回到基板14，以分别密封第一空气连通端口24和样品注入端口133。如上所述，可以贴附新的第一密封膜18和新的第三密封膜22。以这种方式，完成了将样品70注入到PCR反应容器10中。在注入样品后，可以根据常规方法进行预定次数的PCR热循环，并且可以通过荧光等检测扩增的DNA。
实施例
下面基于实施例对本发明进行说明；然而，本发明不限于这些实施例。
实施例1
1.对于所使用的PCR装置，使用了往复式液体输送PCR反应容器(厚度：4mm)，其具有一个流动通道，用于在两个温度区上交替输送PCR试剂，使得可以进行高速热循环。
2.使用直径为0.9mm至1.6mm的钻头，垂直于在基板中形成的流动通道的中心轴，从PCR反应容器的树脂基板的上表面形成通孔，从而产生试剂注入端口。去除多余的毛刺和污垢后，将所有密封膜(包括一个流动通道密封膜)接合起来，并进行后续的PCR验证。
3.如下所示制备PCR试剂。
表1
Figure BDA0002947561710000081
4.用配有一次性吸液管吸头的微量吸液管吸取20μL制备的PCR试剂(使用Molecular BioProducts ART 100E(100μL))。将吸液管吸头末端插入试剂注入端口，将吸出的全部PCR试剂注入到PCR反应容器的流动通道中。
5.当PCR试剂从微量吸液管中排出时，排出的溶液通常在一次性吸液管吸头的末端位置被切断。因此，可以想象，由于与试剂注入端口的直径的关系，吸液管吸头的末端位置没有完全到达流动通道的内部，而是停留在试剂注入端口中。在这种情况下，注入到流动通道中的塞状PCR试剂的后端停留在试剂注入端口中，并且在随后的PCR中的液体输送期间，一部分PCR试剂残留在试剂注入端口中。
6.另一方面，当注入PCR试剂时，通过推动过量的微量吸液管排出吸取的全部PCR试剂，然后将空气连续地推出到流动通道中，由此PCR试剂，包括塞状后端，可以被完全注入到流动通道中。因此，使用微量吸液管将全部PCR试剂完全推入流动通道的条件表示为“推入试剂”。另一方面，PCR试剂不通过普通微量吸液管操作推入流动通道的情况在下文中称为“不推入试剂”。
7.将其中注入PCR试剂并用密封膜密封的PCR反应容器安装在结合了98℃和61℃的温度区、用于往复液体输送的泵和用于对流动通道中扩增的DNA定量的荧光检测器的装置中，并进行实时PCR。PCR条件如下。
Figure BDA0002947561710000091
结果和讨论
1.表2总结了当吸液管吸头插入样品注入端口时，吸液管吸头末端到达的位置。
表2
钻头直径(mm) 吸液管吸头末端的位置
0.9 没有进入样品注入端口
1.0 在样品注入端口的上边缘
1.1 在样品注入端口中
1.2 在样品注入端口中
1.3 在样品注入端口中
1.4 在流动通道的高度附近
1.5 到达流动通道的内部
1.6 到达流动通道密封膜
2.表3总结了在不推入试剂的模式下，进行PCR之前，在试剂注入端口中的塞状PCR试剂后端的液体高度。
表3
钻头直径(mm) 注入端口中试剂的液体高度
0.9 PCR试剂无法注入
1.0 靠近试剂注入端口的入口
1.1 靠近试剂注入端口的入口
1.2 试剂注入端口内大约60％的高度
1.3 试剂注入端口内大约50％的高度
1.4 试剂注入端口内大约30％的高度
1.5 试剂注入端口内大约10％的高度
1.6 PCR试剂溢出，没有进入流动通道
3.吸液管吸头无法插入直径为0.9mm的样品注入端口，因此无法注入PCR试剂。另一方面，直径为1.6mm的样品注入端口的直径大于吸液管吸头末端的直径；因此，PCR试剂从样品注入端口的上部溢出，无法注入。
4.因此，发现当吸液管吸头不能插入试剂注入端口时，或者当注入端口的直径大于吸液管吸头的直径时，PCR试剂不能被注入并且溢出。
5.当试剂注入端口的直径为1.5mm时，吸液管吸头的末端到达流动通道的内部；然而，当不推入试剂时，塞状PCR试剂的后端进入试剂注入端口。认为其原因是在试剂注入后吸液管吸头被收回时被拉回。
6.接下来，图4显示了实时PCR结果的扩增曲线。
7.约2个循环的Ct值差异在从测量装置得出的不确定度范围内，且证实没有显著差异。
8.基于上述结果，表4总结了对于用于形成试剂注入端口的每个钻头尺寸，试剂注入和PCR是否可能的评估。
表4
Figure BDA0002947561710000111
9.当用吸液管将PCR试剂推入直径为1.5mm的试剂注入端口时，由于微量吸液管的压力，从样品注入端口的入口发生泄漏，样品无法正常注入。
10.然而，在任何可以正常注入PCR试剂的条件下，如图4所示正常地进行实时PCR是可能的，而不影响PCR液体输送。
11.表5总结了PCR后样品注入端口中残留的液体量。试剂注入端口中残留的试剂量在PCR前后几乎没有变化。
表5
钻头直径(mm) PCR后残留在试剂注入端口中的液体量
0.9 -
1.0 试剂注入端口内大约60％的高度
1.1 靠近试剂注入端口的入口
1.2 试剂注入端口内大约60％的高度
1.3 试剂注入端口内大约50％的高度
1.4 试剂注入端口内大约30％的高度
1.5 试剂注入端口内大约10％的高度
1.6 -
12.如上所述，当不通过分支流动通道注入样品，而如本实施例那样不设置分支流动通道而将溶液通过样品注入端口直接注入时，预期如果一部分溶液残留在位于流动通道上方的试剂注入端口中，它将在液体输送期间由于重力而漏出，阻塞流动通道并阻碍正常的往复液体输送；然而，已证实PCR液体输送可以正常进行，没有从样品注入端口的泄漏。
参考标记列表
10.PCR反应容器
12.流动通道
14.基板
16.流动通道密封膜
18.第一密封膜
20.第二密封膜
22.第三密封膜
24.第一空气连通端口
26.第二空气连通端口
28.第一过滤器
30.第二过滤器
133.样品注入端口
工业适用性
通过本发明获得的PCR装置实现了快速检测，并且可用作对诸如高致病性流感的流行病的初始反应的设备。此外，这种PCR装置不仅可以应用于基于遗传信息的定制药物的遗传检测技术，而且可以在临床实践中通过定量PCR快速确定治疗效果。因此，其市场优势在医疗领域尤为明显。
序列表
<110> 国立研究开发法人产业技术综合研究所
杏林制药株式会社
<120> PCR反应容器
<130> P19-149WO
<150> JP 2018-161316
<151> 2018-08-30
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
gtgtgatatc tacccgcttc gc 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
agaacggttt gtggttaatc agga 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 3
tcggcatccg gtcagtggca gt 22

Claims (7)

1.一种PCR反应容器，包括：
基板，
流动通道，其形成在所述基板中，
一对过滤器，其设置在所述流动通道的两端，
一对空气连通端口，其通过所述过滤器与所述流动通道连通，
热循环区域，其形成在所述流动通道中在所述一对过滤器之间，以及
样品注入端口，样品能够通过所述样品注入端口从上方注入到所述流动通道中；
其中，所述样品注入端口在所述基板的表面中具有0.7mm2至1.8mm2的面积。
2.根据权利要求1所述的反应容器，其中，所述样品注入端口是圆形、椭圆形或多边形的。
3.根据权利要求1或2所述的反应容器，其中，所述流动通道的宽度为300μm至1000μm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的反应容器，其中，单独用于样品注入的具有圆形或多边形管状形状的样品注入构件的端部到达所述流动通道的内部。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的反应容器，其中，所述样品注入端口具有7.5μL以下的容积，所述容积是所述基板的表面和所述流动通道之间的空间。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的反应容器，其中，在样品注入之后，所述样品注入端口的上部开口用密封件或所述样品注入构件密封。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的反应容器，其中，所述反应容器的厚度为3mm至5mm。
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