WO2020045591A1 - Ｐｃｒ反応容器 - Google Patents

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WO2020045591A1
WO2020045591A1 PCT/JP2019/034008 JP2019034008W WO2020045591A1 WO 2020045591 A1 WO2020045591 A1 WO 2020045591A1 JP 2019034008 W JP2019034008 W JP 2019034008W WO 2020045591 A1 WO2020045591 A1 WO 2020045591A1
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flow path
pcr
substrate
sealing film
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秀典 永井
俊介 古谷
秀泰 久保
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
杏林製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a PCR reaction vessel used for a polymerase chain reaction (PCR: Polymerase Chain Reaction), a PCR apparatus using the PCR reaction vessel, and a PCR method.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • a general-purpose PCR or a thermal cycler for real-time PCR takes a long time to change the temperature due to a huge heat capacity, and it takes 1 to 2 hours for a PCR reaction.
  • a technique for speeding up the thermal cycle by repeatedly feeding a liquid onto a belt has been developed (Patent Document 1). Furthermore, the present inventors have proposed a mechanism that does not require measurement and prevents liquid leakage by using a structure in which a branch channel along a plane constituting a PCR reaction vessel is combined as a sample introduction part (Patent Document 2). .
  • Patent Document 3 discloses that a sample is moved to a thermal cycle area after the temperature of the dispensing area is raised from room temperature by a heater, and then the temperature of the dispensing area is lowered to cool and shrink air, and the residual liquid in the dispensing area Disclosed is a method of pulling a droplet back from a main channel.
  • Patent No. 6226284 WO2017 / 094674 JP2018-19606
  • An object of the present invention is to provide a PCR reaction container that does not cause a problem in sending liquid in a main flow path during a thermal cycle even when there is a residual droplet of a sample.
  • the present invention provides the following PCR reaction vessel.
  • the sample injection port is provided on the flow path without passing through the branch flow path as in the prior art.
  • the sample was injected through the branch channel, the sample remained in the branch channel, and the problem that the remaining sample entered the main channel during the thermal cycle was a problem, but the sample injection port was provided on the channel.
  • the sample remaining in the space of the sample inlet above the flow channel is held in the space even during the thermal cycle, so that it is not necessary to use a heater as described in Document 3.
  • FIGS. 1A and 1B are views for explaining a PCR reaction container according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a sectional view of the PCR reaction container taken along line AA shown in FIG. It is sectional drawing which shows a sample injection port. The results of high-speed PCR using uidA of E. coli are shown.
  • PCR reaction container and the PCR device according to the embodiment of the present invention will be described.
  • the same or equivalent components, members, and processes shown in each drawing are denoted by the same reference numerals, and the repeated description will be omitted as appropriate.
  • the embodiments do not limit the invention, but are exemplifications, and all features and combinations thereof described in the embodiments are not necessarily essential to the invention.
  • the PCR reaction container of the present invention can be used as a chip for nucleic acid amplification.
  • FIGS. 1 (a) and 1 (b) are views for explaining a PCR reaction vessel 10 according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 1A is a plan view of the PCR reaction container 10
  • FIG. 1B is a front view of the PCR reaction container 10.
  • FIG. 2 is a sectional view taken along line AA of the PCR reaction vessel shown in FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing a state where a disposable tip of a pipette is inserted into a sample inlet.
  • the PCR reaction container 10 includes a resin substrate 14 having a groove-shaped flow path 12 formed on a lower surface 14a, and a flow path seal for sealing the flow path 12 attached to the lower surface 14a of the substrate 14. It comprises a film 16 and three sealing films (a first sealing film 18, a second sealing film 20, and a third sealing film 22) stuck on the upper surface 14b of the substrate 14.
  • the substrate 14 is preferably made of a material that has good thermal conductivity, is stable against temperature changes, and is not easily attacked by the sample solution used. Further, the substrate 14 is preferably formed of a material having good moldability, good transparency and barrier properties, and low autofluorescence. As such a material, inorganic materials such as glass and silicon, as well as resins such as acryl, polyester, and silicone, among them, cycloolefin are preferable.
  • An example of the dimensions of the substrate 14 is a long side 70 mm, a short side 42 mm, and a thickness 3 mm.
  • An example of the dimensions of the flow path 12 formed on the lower surface 14a of the substrate 14 is 0.5 mm in width and 0.5 mm in depth.
  • a groove-shaped flow path 12 is formed on the lower surface 14a of the substrate 14, and the flow path 12 is sealed by a flow path sealing film 16 (see FIG. 2).
  • a first air communication port 24 is formed at a position of one end 12 a of the flow channel 12 on the substrate 14.
  • a second air communication port 26 is formed at a position of the other end 12b of the flow path 12 in the substrate 14.
  • the pair of first air communication ports 24 and second air communication ports 26 are formed so as to be exposed on the upper surface 14 b of the substrate 14.
  • Such a substrate can be produced by injection molding or cutting by an NC processing machine.
  • the width of the flow path is preferably 300 to 1000 ⁇ m. Further, the depth of the flow channel is preferably 300 to 1000 ⁇ m.
  • first filter 28 is provided between the first air communication port 24 and the one end 12a of the flow channel 12 in the substrate 14 (see FIG. 2).
  • a second filter 30 is provided in the substrate 14 between the second air communication port 26 and the other end 12 b of the flow channel 12.
  • the pair of first and second filters 28 and 30 provided at both ends of the flow path 12 have good low-impurity characteristics, and allow only air to pass therethrough so that the quality of DNA amplified by PCR does not deteriorate. Prevent nation.
  • the filter material polyethylene, PTFE, or the like is suitable, and may be porous or hydrophobic.
  • the dimensions of the first filter 28 and the second filter 30 are formed so as to fit in the filter installation space formed on the substrate 14 without any gap.
  • the substrate 14 is provided with a sample injection port 133 between the first filter 28 and the thermal cycle area 12e or between the second filter 30 and the thermal cycle area 12e.
  • the sample inlet 133 is formed so as to be exposed on the upper surface 14 b of the substrate 14.
  • the portion of the flow path 12 between the first filter 28 and the second filter 30 forms a thermal cycle area 12e in which a high-temperature area and a medium-temperature area are planned in order to apply a thermal cycle to the sample.
  • the thermal cycle region 12e of the flow path 12 includes a meandering flow path. This is because the amount of heat given from the PCR device in the PCR step is efficiently applied to the sample, and the volume of the sample that can be subjected to PCR is set to a certain amount or more (for example, 25 ⁇ L or more).
  • the PCR reaction vessel 10 is set in a PCR apparatus, and is intended to apply a thermal cycle to the sample and measure optical properties such as fluorescence emitted from the sample.
  • the arrangement of each element including the flow path and the branch point may be arbitrarily selected in consideration of the arrangement of the probe and the like.
  • most of the flow channel 12 is formed in a groove shape exposed on the lower surface 14 a of the substrate 14. This is to enable easy molding by injection molding using a mold or the like.
  • a flow path sealing film 16 is attached on the lower surface 14a of the substrate 14.
  • the flow path sealing film 16 may have one main surface having adhesiveness, or a functional layer exhibiting adhesiveness or adhesiveness by pressing may be formed on one main surface, so that it can be easily formed. It has a function of being able to be tightly integrated with the lower surface 14 a of the substrate 14.
  • the channel sealing film 16 is desirably formed from a material having low autofluorescence including an adhesive.
  • a transparent film made of a resin such as a cycloolefin polymer, polyester, polypropylene, polyethylene or acrylic is suitable, but not limited thereto.
  • the flow path sealing film 16 may be formed from plate-like glass or resin. In this case, since rigidity can be expected, it is useful for preventing the PCR reaction vessel 10 from warping or deforming.
  • the first air communication port 24, the second air communication port 26, the first filter 28, the second filter 30, and the sample injection port 133 are provided on the upper surface 14b of the substrate 14. It is exposed to. Therefore, the first sealing film 18 is attached to the upper surface 14b of the substrate 14 to seal the first air communication port 24 and the first filter 28. Further, a second sealing film 20 is attached to the upper surface 14b of the substrate 14 to seal the second air communication port 26 and the second filter 30. Further, a third sealing film 22 is attached to the upper surface 14b of the substrate 14 to seal the sample inlet 133.
  • the first sealing film 18 has a size capable of simultaneously sealing the first air communication port 24 and the first filter 28, and the second sealing film 20 has a size capable of simultaneously sealing the second air communication port 26 and the second filter 30.
  • the connection of the pressurized pump (to be described later) to the first air communication port 24 and the second air communication port 26 is performed by using a hollow needle (pointed injection needle) provided at the tip of the pump. This is performed by piercing the second air communication port 26. Therefore, the first sealing film 18 and the second sealing film 20 are preferably films made of a material and a thickness that can be easily perforated by a needle.
  • the sealing film having a size that simultaneously seals the corresponding air communication port and the filter has been described. However, the sealing film may be sealed separately. Alternatively, a sealing film that can seal the first air communication port 24, the first filter 28, the second air communication port 26, and the second filter 30 in a lump (one sheet) may be used.
  • the third sealing film 22 is of a size that can seal the sample inlet 133.
  • the sample is injected into the flow channel 12 through the sample inlet 133 by peeling off the third sealing film 22 from the substrate 14 once, and after injecting a predetermined amount of the sample, the third sealing film 22 is again mounted on the substrate. 14 and attached back to the upper surface 14b. Therefore, as the third sealing film 22, a film having adhesiveness that is durable for several cycles of attaching / detaching is desirable.
  • the third sealing film 22 may be a mode in which a new film is pasted after the sample is injected. In this case, the importance of the properties relating to pasting / peeling can be eased.
  • the first sealing film 18 and the second sealing film 20 are desirably films having an adhesive property that can withstand several cycles of sticking / peeling.
  • a new film may be attached after the sample is injected.
  • the first sealing film 18, the second sealing film 20, and the third sealing film 22 each have a pressure-sensitive adhesive layer formed on one main surface, similarly to the flow path sealing film 16, or have an adhesive or A functional layer exhibiting adhesiveness may be formed.
  • the first sealing film 18, the second sealing film 20, and the third sealing film 22 are desirably formed of a material having low autofluorescence including an adhesive.
  • a transparent film made of a resin such as cycloolefin, polyester, polypropylene, polyethylene or acrylic is suitable, but not limited thereto.
  • it is desirable that the properties such as the adhesiveness do not deteriorate to the extent that the use is affected even by a plurality of times of sticking / peeling. However, after peeling and injecting a sample, a new film is stuck. In the case of the attachment mode, the importance of the characteristics relating to the attachment / peeling can be reduced.
  • a sample to be amplified by a thermal cycle is prepared.
  • the sample include a mixture containing two or more types of DNAs and a plurality of types of primers, a thermostable enzyme, and four types of deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) added as PCR reagents.
  • dATP, dCTP, dGTP, dTTP deoxyribonucleoside triphosphates
  • the first sealing film 18 When the first sealing film 18 is of a size that can simultaneously seal the first air communication port 24 and the first filter 28, the first sealing film 18 is completely peeled off from the substrate 14 and the first air communication Although the port 24 and the first filter 28 may be opened to the atmosphere, the first filter can be opened by opening only the first air communication port 24 without completely peeling the first sealing film 18 from the substrate 14. 28 is not exposed to the atmosphere, which is effective in preventing contamination. Also, when a sealing film capable of separately sealing the first air communication port 24 and the first filter 28 is used, similarly, the first filter 28 is not exposed to the atmosphere, which is effective in preventing contamination. is there.
  • sample injection port 133 is injected into the sample injection port 133 from an elongated conical disposable tip (sample injection member) attached to the tip of the micropipette.
  • sample injection member sample injection member
  • a fixed amount of sample can be injected into the flow channel 12 from the disposable tip using a micropipette.
  • the micropipette can push a push button down to a first stop to dispense a certain amount of sample. All the sample remaining on the disposable tip may be discharged by depressing the push button once stopped at the first stop further to the second stop. Since the disposable tip is elongated, it is inserted directly below the sample inlet 133 toward the flow channel 12, but is fixed by contacting the uppermost part of the sample inlet at any position on the pipette mounting side of the tip.
  • the sample is injected from. If the diameter of the uppermost portion of the sample inlet is too large, the tip of the disposable pipette will reach the flow channel, and when the liquid sample is injected in this state, the sample overflows without entering the flow channel, which is preferable. Absent. If the diameter of the uppermost portion of the sample inlet is too small, the tip of the disposable tip is only slightly inserted into the sample inlet, and in this state, the sample overflows from the inlet. Therefore, there is an optimum range for the size of the sample inlet.
  • the preferred size of the sample inlet is about 1 to 1.5 mm in diameter when the inlet is cylindrical.
  • the liquid sample may remain in the space of the sample inlet 133 on the flow channel 12. It is conceivable that the liquid sample in the space of the sample inlet 133 flows into the flow channel 12 according to gravity in the course of the thermal cycle, but actually, the liquid sample in the space of the sample inlet 133 before and after the thermal cycle. Are the same, and the liquid sample in this space does not adversely affect the PCR.
  • the area of the sample inlet 133 (the area of the opening on the substrate surface) is preferably 0.7 to 1.8 mm 2 , and more preferably. Is from 0.9 to 1.7 mm 2 , particularly preferably from 1.3 to 1.6 mm 2 .
  • the upper limit of the area of the sample inlet 133 is preferably 1.8 mm 2 or less, more preferably 1.7 mm 2 or less, more preferably 1.6 mm 2 or less, more preferably 1.5 mm 2 or less, 1.4 mm More preferably, it is 2 or less.
  • the lower limit of the area of the sample inlet 133 is preferably 0.7 mm 2 or more, more preferably 0.9 mm 2 or more, more preferably 1.0 mm 2 or more, and still more preferably 1.3 mm 2 or more.
  • the volume of the sample inlet (the space between the substrate surface and the flow path) is preferably 7.5 ⁇ L or less, more preferably 3 to 7.5 ⁇ L.
  • the shape of the sample inlet is not particularly limited, but is preferably a tubular shape such as a circle, an ellipse, and a polygon, and particularly preferably a circle.
  • the first sealing film 18 and the third sealing film 22 are attached back to the substrate 14 again, and the first air communication port 24 and the sample injection port 133 are sealed. As described above, a new first sealing film 18 and a new third sealing film 22 may be attached.
  • the injection of the sample 70 into the PCR reaction container 10 is completed.
  • the PCR thermal cycle is performed a predetermined number of times according to a conventional method, and the amplified DNA can be detected by fluorescence or the like.
  • Example 1 The PCR apparatus used is a reciprocating liquid transfer type PCR reaction vessel (thickness) with one flow path for alternately transporting PCR reagents over two temperature zones so that high-speed thermal cycling is possible. 4 mm). 2. A through hole was formed using a drill with a diameter of 0.9 to 1.6 mm from the upper surface of the substrate so as to be perpendicular to the center axis of the flow path formed on the resin substrate of the PCR reaction vessel, and a reagent inlet was prepared. . After removing excess burrs and dirt, all the sealing films including the channel sealing film were joined, and the subsequent PCR was verified. 3. A PCR reagent was prepared as follows.
  • the tip position of the pipette tip does not completely reach the inside of the flow channel and stops inside the reagent inlet, depending on the relationship with the diameter of the reagent inlet.
  • the rear end of the PCR reagent that has been injected into the flow path and formed into a plug remains in the reagent injection port, and a part of the PCR reagent remains in the reagent injection port during the subsequent liquid transfer in PCR. Becomes 6.
  • PCR reaction container in which PCR reagents are injected and sealed with a sealing film, a device with built-in temperature zones of 98 ° C and 61 ° C, a pump for reciprocal liquid transfer, and a fluorescence detector for quantifying amplified DNA in the flow path And real-time PCR was performed.
  • the PCR conditions were as follows.
  • Table 2 summarizes the arrival position of the tip of the pipette tip when the pipette tip is inserted into the sample inlet.
  • Table 3 summarizes the liquid height at the rear end of the PCR reagent plug at the reagent inlet before PCR in a pattern in which the reagent is not pushed in.
  • the sample is injected into the reagent inlet located at the upper part of the channel. If some of the solution remained, it was expected that the solution would leak due to gravity in the middle of the solution transfer, blocking the flow path and preventing normal reciprocating solution transfer, but without any leakage from the sample inlet. It was confirmed that it was possible to transfer the PCR solution.
  • the PCR device achieved by the present invention realizes a rapid test, and is useful as a device for initial response to pandemic such as highly pathogenic influenza.
  • it can be applied not only to genetic testing technology for tailor-made medical care based on genetic information, but also to the ability to quickly determine the therapeutic effect by quantitative PCR in clinical settings, and therefore has a particularly high market advantage in medical settings.

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Abstract

基板と、　前記基板に形成された流路と、　前記流路の両端に設けられた一対のフィルタと、　前記フィルタを通じて前記流路と連通する一対の空気連通口と、　前記流路における前記一対のフィルタの間に形成されたサーマルサイクル領域と、　前記流路に上から試料を注入することができる試料注入口を備え、　前記試料注入口の前記基板の表面部面積は０．７～１．８ｍｍ2　であることを特徴とする　ＰＣＲ反応容器。

Description

ＰＣＲ反応容器
　本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）に使用されるＰＣＲ反応容器、該ＰＣＲ反応容器を用いたＰＣＲ装置およびＰＣＲ方法に関する。
　汎用のＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ用サーマルサイクラーは、巨大な熱容量のため温度変化に時間がかかり、ＰＣＲ反応に１～２時間を要するが、本発明者らは既にマイクロ流路チップを用いて複数の温度帯上へ繰り返し送液することでサーマルサイクルを高速化する手法を開発した（特許文献１）。さらに、本発明者らは、試料導入部分として、ＰＣＲ反応容器を構成する平面に沿った分岐流路を組み合わせた構造により、計量が不要でかつ液漏れを防ぐ機構を提案した（特許文献２）。
　特許文献２で提案された手法では、試料導入時に一部の残留試料液滴が分岐流路部分に残留し、それ以降の往復送液によるサーマルサイクルにおいて、偶発的に当該残留液滴が、主流路へ入り込み送液を妨害する現象が生じる可能性があった。
　特許文献３は、分注領域の温度をヒータにより室温より高めた後に試料をサーマルサイクル領域に移動させ、その後、分注領域の温度を低下させて空気を冷却収縮させ、分注領域の残留液滴を主流路から引き戻す手法を開示している。
特許第6226284号 WO2017/094674 特開2018-19606
　本発明は、試料の残留液滴がある場合であっても、サーマルサイクル中の主流路での送液に問題が生じることのないＰＣＲ反応容器を提供することを目的とする。
　本発明は、以下のPCR反応容器を提供するものである。
〔１〕
　基板と、
　前記基板に形成された流路と、
　前記流路の両端に設けられた一対のフィルタと、
　前記フィルタを通じて前記流路と連通する一対の空気連通口と、
　前記流路における前記一対のフィルタの間に形成されたサーマルサイクル領域と、
　前記流路に上から試料を注入することができる試料注入口を備え、
　前記試料注入口の前記基板の表面部面積は０．７～１．８ｍｍ2であることを特徴とする
　ＰＣＲ反応容器。
〔２〕
　前記試料注入口が円形又は楕円形又は多角形である〔１〕記載の反応容器。
〔３〕
　前記流路の幅が３００～１０００μｍである〔１〕又は〔２〕に記載の反応容器。
〔４〕
　別途試料注入に使用する円形もしくは多角形の管状の形状を有する試料注入部材の先端が流路の内部まで到達することを特徴とする〔１〕～〔３〕のいずれ１項に記載の反応容器。
〔５〕
　さらに前記試料注入口の容積（前記基板表面から前記流路間の空間）が７．５μＬ以下である〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の反応容器。
〔６〕
　試料注入後において前記試料注入口の上部開口部がシールまたは前記試料注入部材等により密閉されることを特徴とする〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の反応容器。
［７］
　厚みが３～５ｍｍである〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の反応容器。
　本発明では先行技術にあるような分岐流路を介さず試料注入口を流路上に設けている。分岐流路を介して試料を注入した場合、分岐流路内に試料が残存し、残存試料がサーマルサイクル中に主流路に入り込むことが問題であったが、試料注入口を流路上に設けた場合、流路の上の試料注入口の空間に残存する試料は、サーマルサイクル中にも前記空間内に保持されるので、文献３に記載されるようなヒータを使用する必要はない。
図１（ａ）および（ｂ）は、本発明の第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器を説明するための図である。 図１（ａ）に示すＰＣＲ反応容器のＡ－Ａ断面図である。 試料注入口を示す断面図である。 E. coliのuidAを用いた高速ＰＣＲの結果を示す。
　以下、本発明の実施形態に係るＰＣＲ反応容器およびＰＣＲ装置について説明する。各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。本発明のＰＣＲ反応容器は、核酸増幅用チップとして用いることができる。
　図１（ａ）および図1（ｂ）は、本発明の第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器１０を説明するための図である。図１（ａ）は、ＰＣＲ反応容器１０の平面図であり、図1（ｂ）は、ＰＣＲ反応容器１０の正面図である。図２は図１（ａ）に示すＰＣＲ反応容器のＡ－Ａ断面図である。図３は、試料注入口にピペットの使い捨てチップを挿入した状態を示す図である。
　ＰＣＲ反応容器１０は、下面１４ａに溝状の流路１２が形成された樹脂製の基板１４と、基板１４の下面１４ａ上に貼られた、流路１２を封止するための流路封止フィルム１６と、基板１４の上面１４ｂ上に貼られた３枚の封止フィルム（第１封止フィルム１８、第２封止フィルム２０および第３封止フィルム２２）とから成る。
　基板１４は、熱伝導性がよく、温度変化に対しても安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１４は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス、シリコン等の無機材料をはじめ、アクリル、ポリエステル、シリコーンなどの樹脂、中でもシクロオレフィンが好適である。基板１４の寸法の一例は、長辺７０ｍｍ、短辺４２ｍｍ、厚み３ｍｍである。基板１４の下面１４ａに形成される流路１２の寸法の一例は、幅０．５ｍｍ、深さ０．５ｍｍである。
　基板１４の下面１４ａには溝状の流路１２が形成されており、この流路１２は、流路封止フィルム１６により封止されている（図２参照）。基板１４における流路１２の一端１２ａの位置には、第１空気連通口２４が形成されている。基板１４における流路１２の他端１２ｂの位置には、第２空気連通口２６が形成されている。一対の第１空気連通口２４および第２空気連通口２６は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。このような基板は射出成形やＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。前記流路の幅は、好ましくは３００～１０００μｍである。また、前記流路の深さは、好ましくは３００～１０００μｍである。
　基板１４中における第１空気連通口２４と流路１２の一端１２ａとの間には、第１フィルタ２８が設けられている（図２参照）。基板１４中における第２空気連通口２６と流路１２の他端１２ｂとの間には、第２フィルタ３０が設けられている。流路１２の両端に設けられた一対の第１フィルタ２８および第２フィルタ３０は、低不純物特性が良好であるほか、空気のみを通し、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの品質が劣化しないようにコンタミネーションを防止する。フィルタ材料としては、ポリエチレンやＰＴＦＥなどが好適であり、多孔質または疎水性を備えていてもよい。第１フィルタ２８および第２フィルタ３０の寸法は、基板１４に形成されたフィルタ設置スペースに隙間なく収まるような寸法に形成される。
　基板１４には、第１フィルタ２８とサーマルサイクル領域１２ｅの間、或いは、第２フィルタ３０とサーマルサイクル領域１２ｅの間に試料注入口１３３が設けられている。試料注入口１３３は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。
　流路１２における第１フィルタ２８と第２フィルタ３０との間の部分は、試料にサーマルサイクルを与えるために、高温領域と中温領域が予定されているサーマルサイクル領域１２ｅを形成する。流路１２のサーマルサイクル領域１２ｅは、蛇行流路を含んでいる。これは、ＰＣＲ工程でＰＣＲ装置から与えられる熱量を効率的に試料に与えるためと、ＰＣＲに供することのできる試料の体積を一定量以上（例えば、２５μＬ以上）にするためである。ＰＣＲ反応容器１０はＰＣＲ装置に設置し、試料にサーマルサイクルを与え、かつ、試料から発せられる蛍光等の光学物性値を計測することを予定しているので、後述の温度調節部や蛍光検出用プローブの配置なども考慮に入れて、流路や分岐点をはじめとした各要素の配置を任意に選択すればよい。
　本第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器１０において、流路１２の大部分は基板１４の下面１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により容易に成形できるようにするためである。この溝を流路として活用するために、基板１４の下面１４ａ上に流路封止フィルム１６が貼られる。流路封止フィルム１６は、一方の主面が粘着性を備えていてもよいし、押圧により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１４の下面１４ａと密着して一体化できる機能を備える。流路封止フィルム１６は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィンポリマー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、流路封止フィルム１６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、ＰＣＲ反応容器１０の反りや変形防止に役立つ。
　また、本第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器１０において、第１空気連通口２４、第２空気連通口２６、第１フィルタ２８、第２フィルタ３０および試料注入口１３３は、基板１４の上面１４ｂに露出している。そこで、第１空気連通口２４および第１フィルタ２８を封止するために第１封止フィルム１８を基板１４の上面１４ｂに貼り付ける。また、第２空気連通口２６および第２フィルタ３０を封止するために第２封止フィルム２０を基板１４の上面１４ｂに貼り付ける。また、試料注入口１３３を封止するために第３封止フィルム２２を基板１４の上面１４ｂに貼り付ける。
　第１封止フィルム１８は第１空気連通口２４と第１フィルタ２８とを、第２封止フィルム２０は第２空気連通口２６と第２フィルタ３０とを同時に封止可能なサイズのものが用いられる。第１空気連通口２４、第２空気連通口２６への加圧式ポンプ（後述する）の接続は、ポンプ先端に備わった中空のニードル（先端がとがった注射針）で第１空気連通口２４、第２空気連通口２６に穿孔することにより行う。そのため、第１封止フィルム１８、第２封止フィルム２０は、ニードルによる穿孔が容易な材質や厚みから成るフィルムが好ましい。本第１実施形態では該当する空気連通口とフィルタとを同時に封止するサイズの封止フィルムについて記載したが、これらを別個に封止する態様でもよい。また、第１空気連通口２４、第１フィルタ２８、第２空気連通口２６及び第２フィルタ３０を一括（一枚）で封止することのできる封止フィルムであってもよい。
　第３封止フィルム２２は、試料注入口１３３を封止可能なサイズのものが用いられる。試料注入口１３３を通じての試料の流路１２内への注入は、第３封止フィルム２２を一旦、基板１４から剥がして行い、所定量の試料の注入後には第３封止フィルム２２を再び基板１４の上面１４ｂに戻し貼り付ける。そのため、第３封止フィルム２２としては、数サイクルの貼り付け／剥がしに耐久するような粘着性を備えるフィルムが望ましい。また第３封止フィルム２２は、試料注入後には新しいフィルムを貼り付ける態様であってもよく、この場合は貼り付け／剥がしに関する特性の重要性は緩和されうる。
　また試料注入時には、第１封止フィルム１８又は第２封止フィルム２０のいずれかを第３封止フィルム２２と同様に一旦剥がす必要がある。空気の出口を作ってやらないと試料が流路内に入って行かないからである。そのため第１封止フィルム１８と第２封止フィルム２０は、同じく数サイクルの貼り付け／剥がしに耐久するような粘着性を備えるフィルムが望ましい。また、試料注入後には新しいフィルムを貼りつける態様であってもよい。
なお、空気連通口２４、２６とは別に空気の出口を設け、第４封止フィルムの貼り付け／剥がしにより流路内への試料注入を行なうことも可能である。
　第１封止フィルム１８、第２封止フィルム２０及び第３封止フィルム２２は、流路封止フィルム１６と同様に、一方の主面に粘着剤層が形成され、または押圧により粘着性や接着性を発揮する機能層が形成されていてもよい。第１封止フィルム１８、第２封止フィルム２０及び第３封止フィルム２２は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン又はアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また上述したように複数回の貼り付け／剥離によっても、その粘着性等の特性が使用に影響をきたす程度に劣化しないことが望ましいが、剥離して試料等の注入後に、新たなフィルムを貼り付ける態様である場合は、この貼り付け／剥がしに関する特性の重要性は緩和されうる。
　次に、以上のように構成されたＰＣＲ反応容器１０の使用方法について説明する。まず、サーマルサイクルにより増幅すべき試料を準備する。試料としては、二以上の種類のＤＮＡを含む混合物に、ＰＣＲ試薬として複数種類のプライマー、耐熱性酵素及び４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものがあげられる。次に、第１封止フィルム１８と第３封止フィルム２２を基板１４から剥がし、第１空気連通口２４と試料注入口１３３を開放する。第１封止フィルム１８が第１空気連通口２４と第１フィルタ２８を同時に封止できるサイズのものであった場合、第１封止フィルム１８を完全に基板１４から剥がして、第１空気連通口２４と第１フィルタ２８を大気中に開放してもよいが、第１封止フィルム１８を完全に基板１４から剥がさずに、第１空気連通口２４のみを開放することによって、第１フィルタ２８が大気中に晒されることがなく、コンタミネーション防止には効果がある。また第１空気連通口２４と第１フィルタ２８を別個に封止できる封止フィルムを用いた場合にも同様に第１フィルタ２８が大気中に晒されることがなく、コンタミネーション防止には効果がある。
　次に、試料注入口１３３に試料をマイクロピペットの先端に取り付けた細長い円錐形状の使い捨てチップ（試料注入部材）から注入する。マイクロピペットにより使い捨てのチップから一定量の試料を流路１２内に注入することができる。マイクロピペットは、プッシュボタンを第１ストップまで押し下げて一定量の試料を排出することができる。第１ストップで一度止めたプッシュボタンを第２ストップまでさらに強く押し下げることにより使い捨てチップに残った全ての試料を排出してもよい。使い捨てチップは細長いので試料注入口１３３の上部から流路１２に向けて真下に差し込まれるが、チップのピペット取り付け側のいずれかの位置で試料注入口の最上部に当接することで固定され、そこから試料が注入される。試料注入口の最上部の径が大きすぎると使い捨てピペットの先端が流路に到達することになり、この状態で液体の試料を注入すると試料が流路に入ることなく試料が外に溢れるので好ましくない。また、試料注入口の最上部の径が小さすぎると、使い捨てチップの先端部がわずかに試料注入口内に差し込まれるだけであり、この状態では試料が注入口から溢れ出ることになる。したがって、試料注入口の大きさには最適な範囲が存在する。好ましい試料注入口の大きさには、注入口が円筒状の場合直径1～1.5mm程度である。
　適切な径の試料注入口からマイクロピペットの先端に取り付けた使い捨てピペットから試料を注入した場合、プッシュボタンの第２ストップまで強く押し下げると、使い捨てチップの試料を全て排出し流路に押し入れることができる。
　一方、マイクロピペットのプッシュボタンを第１ストップまでしか押し下げなかった場合は、流路１２上の試料注入口１３３の空間内に液体試料が残存するおそれがある。試料注入口１３３の空間内の液体試料は、サーマルサイクルの過程で重力に従い流路１２内に流れ込むことが考えられるが、実際には、サーマルサイクルの前後で試料注入口１３３の空間内の液体試料の液量は同じであり、この空間内の液体試料はＰＣＲに悪影響を及ぼすことはない。
　したがって、本発明の反応容器であれば使用者の注入方法に関係なく、ＰＣＲを実行することが可能となる。このように悪影響を及ぼすことなくＰＣＲを実行するためには、試料注入口１３３の面積（前記基板表面部における開口部面積）は、０．７～１．８ｍｍ2であることが好ましく、さらに好ましくは０．９～１．７ｍｍ2であり、特に好ましくは１．３～１．６ｍｍ2である。また、試料注入口１３３の面積の上限は、１．８ｍｍ2以下が好ましく、１．７ｍｍ2以下がより好ましく、１．６ｍｍ2以下がより好ましく、１．５ｍｍ2以下がより好ましく、１．４ｍｍ2以下がさらに好ましい。また、試料注入口１３３の面積の下限は、０．７ｍｍ2以上が好ましく、０．９ｍｍ2以上がより好ましく、１．０ｍｍ2以上がより好ましく、１．３ｍｍ2以上がさらに好ましい。
　また、試料注入口の容積（前記基板表面から前記流路間の空間）が７．５μＬ以下であることが好ましく、さらに好ましくは３～７．５μＬである。
　試料注入口の形状は、特に限定されるものではないが、円形、楕円形、多角形などの管状の形状が好ましく、特に好ましくは円形である。
　次に、第１封止フィルム１８と第３封止フィルム２２を再び基板１４に貼り戻し、第１空気連通口２４と試料注入口１３３を封止する。上述したように、新たな第１封止フィルム１８と第３封止フィルム２２を貼ってもよい。以上でＰＣＲ反応容器１０への試料７０の注入は完了である。試料を注入後は、常法に従いＰＣＲのサーマルサイクルを所定の回数行い、増幅したＤＮＡを蛍光などにより検出することができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。
実施例１
１．使用するPCR装置には高速なサーマルサイクルが可能な様に、２カ所の温度帯の上へPCR試薬を交互に搬送するための１本の流路を有する往復送液型のＰＣＲ反応容器（厚み４ｍｍ）を利用した。
２．PCR反応容器の樹脂製の基板に形成された流路の中心軸と直行する様に、当該基板の上面から直径0.9 ～ 1.6 mmのドリルを用いて貫通孔を形成し、試薬注入口を作製した。余分なバリや汚れを除去した後、流路封止フィルムを含む全ての封止フィルムを接合し、以後のＰＣＲの検証を行った。
３．以下のようにＰＣＲ試薬を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
４．使い捨てピペットチップ（Molecular BioProductsのART 100E (100 μL)を使用）を装着したマイクロピペットを用いて、調製済みのPCR試薬の20 μlを吸引し、ピペットチップの先端を試薬注入口へ差し込んだ状態で、PCR試薬の吸引した全量をPCR反応容器の流路内へ注入した。
５．マイクロピペットからPCR試薬を排出する際、通常は使い捨てピペットチップの先端位置において排出した溶液が切り取られる。そのため、試薬注入口の径との関係によりピペットチップの先端位置が、完全に流路内まで到達せず試薬注入口内に止まることが考えられる。この場合、流路中に注入されプラグ状になったPCR試薬の後端が試薬注入口内に留ることとなり、以後のPCRにおける送液時に、一部のPCR試薬が試薬注入口に残存することとなる。
６．一方、このPCR試薬の注入時に、マイクロピペットを過剰量押し込むことにより、吸引したPCR試薬の全量を排出した後、空気も引き続き流路内へ押し出すことで、PCR試薬のプラグの後端を含め完全に流路内部まで注入することが可能である。このように、マイクロピペットにより完全にPCR試薬全量を流路内まで押し込む条件を、試薬押し込み有りと表現し、一方、一般的なマイクロピペットの操作により流路内部までPCR試薬を押し込まない場合については、以後、試薬押し込み無しと表現する。
７．PCR試薬を注入し封止フィルムでシールしたPCR反応容器について、98℃および61℃の温度帯と、往復送液用のポンプと、流路内の増幅DNAを定量する蛍光検出器を内蔵した装置に装着し、リアルタイムPCRを行った。なお、PCRの条件は以下の通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
結果と考察：
１．表２に、試料注入口にピペットチップを挿入した際のピペットチップ先端の到達位置をまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
２．表３に、試薬を押し込まないパターンでのPCR前の試薬注入口におけるPCR試薬プラグの後端の液高さをまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
３．直径0.9 mmについては試料注入口にピペットチップが挿入できなかったため、PCR試薬を注入できなかった。一方、直径1.6 mmの場合は、ピペットチップの先端より試料注入口の径が太くなったため、試料注入口の上部からPCR試薬が溢れて注入ができなかった。
４．このように、ピペットチップが試薬注入口に入らない、もしくはピペットチップ先端に比べ大きな穴径の場合は注入ができずにPCR試薬が溢れることがわかった。
５．試薬注入口の直径が1.5 mmの場合にはピペットチップの先端が流路内部まで到達していたが、試薬の押し込み無しの場合において、PCR試薬プラグの後端が試薬注入口に入り込んでいた。これは試薬注入後にピペットチップを引き抜く際に引き戻されたためと考えられる。
６．次に、リアルタイムPCRを行った結果の増幅曲線を図４に示す。
７．Ct値で2サイクル程度の差異については測定装置由来の不確かさの範囲であり、有意な差は確認されなかった。
８．以上の結果から、試薬注入口の形成に用いたドリルのサイズ毎の試薬の注入とPCRが可能かの評価を表４にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
９．直径1.5 mmの試薬注入口において、ピペットでPCR 試薬を押し込んだ場合には、マイクロピペットの圧力により試料注入口の入口から漏洩し、正常に試料注入が行えなかった。
１０．ただし、正常にPCR試薬を注入できた何れの条件においてもPCRの送液には影響せず図４の通り正常にリアルタイムPCRが可能であった。
１１．なお、PCR後に試料注入口に残留した液量を表５にまとめた。試薬注入口に残った試薬量はPCR前後でほぼ変化が見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
１２．以上、分岐流路を通じて試料注入する場合ではなく、本実施例の様に分岐流路を設けず試料注入口を介して直接溶液を注入する場合には、流路上部に位置する試薬注入口内に一部溶液が残留した場合に送液の途中で重力により漏れ出し、流路を塞がれ正常な往復送液を阻害されることが予想されたが、一切試料注入口から漏れ出すこと無く正常にPCRの送液が可能であることが確認された。
　１０　ＰＣＲ反応容器
　１２　流路
　１４　基板
　１６　流路封止フィルム
　１８　第１封止フィルム
　２０　第２封止フィルム
　２２　第３封止フィルム
　２４　第１空気連通口
　２６　第２空気連通口
　２８　第１フィルタ
　３０　第２フィルタ
　１３３　試料注入口
　本発明により達成されるＰＣＲ装置は迅速検査を実現し、高病原性インフルエンザなどパンデミックの初動対応用機器として有用である。また遺伝情報に基づくテーラーメード医療用の遺伝子検査技術に応用できるだけでなく、臨床現場においては定量ＰＣＲによる治療効果の判定を迅速に行うことができることから、特に医療現場での市場優位性は高い。

Claims (7)

  1. 　基板と、
    　前記基板に形成された流路と、
    　前記流路の両端に設けられた一対のフィルタと、
    　前記フィルタを通じて前記流路と連通する一対の空気連通口と、
    　前記流路における前記一対のフィルタの間に形成されたサーマルサイクル領域と、
    　前記流路に上から試料を注入することができる試料注入口を備え、
    　前記試料注入口の前記基板の表面部面積は０．７～１．８ｍｍ2であることを特徴とする
    　ＰＣＲ反応容器。
  2. 　前記試料注入口が円形又は楕円形又は多角形である請求項１記載の反応容器。
  3. 　前記流路の幅が３００～１０００μｍである請求項１又は２に記載の反応容器。
  4. 　別途試料注入に使用する円形もしくは多角形の管状の形状を有する試料注入部材の先端が流路の内部まで到達することを特徴とする請求項１～３のいずれ１項に記載の反応容器。
  5. 　さらに前記試料注入口の容積（前記基板表面から前記流路間の空間）が７．５μＬ以下である請求項１～４のいずれか１項に記載の反応容器。
  6. 　試料注入後において前記試料注入口の上部開口部がシールまたは前記試料注入部材等により密閉されることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の反応容器。
  7. 　厚みが３～５ｍｍである請求項１～６のいずれか１項に記載の反応容器。
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