WO2017199933A1 - 反応処理装置および反応処理装置の制御方法 - Google Patents

反応処理装置および反応処理装置の制御方法 Download PDF

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福澤　隆
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日本板硝子株式会社
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a reaction processing apparatus used for polymerase chain reaction (PCR) and a control method thereof.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Genetic testing is widely used for testing in various medical fields, identification of crops and pathogenic microorganisms, food safety assessment, and testing for pathogenic viruses and various infectious diseases.
  • a method of analyzing a DNA obtained by amplifying a part of the DNA is known.
  • PCR is a technique of attention that selectively amplifies a portion of a very small amount of DNA collected from a living body or the like.
  • PCR a predetermined thermal cycle is applied to a sample obtained by mixing a biological sample containing DNA and a PCR reagent composed of primers, enzymes, etc., and a denaturation, annealing, and extension reaction is repeatedly caused to cause a specific portion of DNA to be generated. It selectively amplifies.
  • PCR it is common to perform a predetermined amount of a target sample in a reaction processing container such as a PCR tube or a microplate (microwell) in which a plurality of holes are formed, but in recent years, it has been formed on a substrate.
  • a reaction processing container also called a chip
  • Patent Document 1 Performing using a reaction processing container (also called a chip) having a fine flow path has been put into practical use (for example, Patent Document 1).
  • PCR using a reciprocating flow path type reaction vessel multiple temperature regions maintained at different temperatures are set on the flow path in order to give the sample a thermal cycle by moving the sample back and forth in the flow path. Is done.
  • the sample In order to properly apply a thermal cycle to the sample, the sample needs to stop accurately in each temperature region. If the stop position varies, the reaction may not occur, the progress of the reaction may vary at the location of the sample, the reaction such as DNA amplification may become inaccurate, and this may lead to misjudgment of workers and workers. is there.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide a reaction that can give a thermal cycle to a sample by moving the sample in a reciprocating manner in a flow path in which different temperature regions are set.
  • An object of the present invention is to provide a technique capable of accurately stopping a sample at a predetermined position in a temperature region in a processing apparatus.
  • a reaction processing apparatus includes a reaction processing container in which a flow path for moving a sample is formed, a liquid feeding means for moving and stopping the sample in the flow path, Temperature control means for providing a path with a first temperature region maintained at a first temperature, a second temperature region maintained at a second temperature lower than the first temperature, a first temperature region of the channel, And a detection unit that detects a sample passing through a detection region set between two temperature regions, and a control unit that controls the liquid feeding unit based on a signal detected by the detection unit.
  • the control unit supplies the liquid when the predetermined first waiting time has elapsed from the time when the detection unit detects the passage of the sample through the detection region.
  • the control means detects a predetermined time set independently of the first waiting time from the time when the detection means detects the passage of the sample through the detection area.
  • the liquid feeding means is instructed to stop the sample.
  • reaction processing apparatus includes a reaction processing container in which a flow path for moving a sample is formed, a liquid feeding means for moving and stopping the sample in the flow path, and a first temperature maintained at a first temperature in the flow path. And a temperature control means for providing a second temperature region maintained at a second temperature lower than the first temperature, and a detection region set between the first temperature region and the second temperature region of the flow path Detection means for detecting a sample to be detected, and control means for controlling the liquid feeding means based on a signal detected by the detection means.
  • reaction processing apparatus includes a reaction processing container in which a flow path for moving a sample is formed, a liquid feeding means for moving and stopping the sample in the flow path, and a first temperature maintained at a first temperature in the flow path. And a temperature control means for providing a second temperature region maintained at a second temperature lower than the first temperature, and a detection region set between the first temperature region and the second temperature region of the flow path Detection means for detecting a sample to be detected, and control means for controlling the liquid feeding means based on a signal detected by the detection means.
  • the control means When the sample is moved from the second temperature region in a first temperature region, the moving speed in the detection area of the sample to the first moving speed v 1, closest to the detection region end of the specimen to stop at a predetermined position in the flow path part and the distance between the center of the detection area and X 01, when the sample is moved from the first temperature region to the second temperature region, the moving speed in the detection area of the sample and the second moving speed v 2, in the flow path the distance between the center of the endmost portion close to the detection area and the detection area of the sample to be stopped at a predetermined position and X 02, a certain amount of time specific to the reaction device and t C, the correction coefficient ⁇ and ⁇
  • t C may be a time corresponding to a difference between the time when the sample actually passes through the detection region and the time when the detection unit detects that the sample passes through the detection region.
  • the sample may include DNA, a PCR reagent, and a fluorescent reagent.
  • the detection means may include a fluorescence detector that detects fluorescence emitted from the sample.
  • the time when the sample moves from the second temperature region to the first temperature region is the first passage time tp1
  • the sample moves when the sample moves from the first temperature region to the second temperature region.
  • the control means is based on a signal from the fluorescence detector or a value obtained by performing a predetermined calculation process on the signal and a predetermined threshold value.
  • the second moving speed v 2 L / t p2 may be calculated from the time t p2 and the sample length L.
  • the control means may change the threshold according to the progress of the sample reaction.
  • the control means may control the liquid feeding means so that the first passage time tp1 and the second passage time tp2 become a predetermined target passage time.
  • a reaction processing container in which a flow path for moving a sample is formed, a liquid feeding means for moving and stopping the sample in the flow path, and the flow path are maintained at the first temperature.
  • a temperature control means for providing a first temperature region, a second temperature region maintained at a second temperature lower than the first temperature, and a detection set between the first temperature region and the second temperature region of the flow path; And a detection means for detecting a sample passing through the region.
  • the reaction processing container in which the flow path for moving the sample is formed, the liquid feeding means for moving and stopping the sample in the flow path, and the flow path are maintained at the first temperature.
  • This control method when the sample is moved from the second temperature region in a first temperature region, the moving speed in the detection area of the sample to the first moving speed v 1, most of the sample to stop at a predetermined position in the flow path the distance between the center of the detection region and an end portion close to the detection region as X 01, when the sample is moved from the first temperature region to the second temperature region, the moving speed in the detection area of the sample and the second moving speed v 2 , the distance between the center of the endmost portion close to the detection area and the detection area of the sample to be stopped at a predetermined position in the flow path and X 02, a certain amount of time specific to the reaction device is taken as t C
  • the reaction processing container in which the flow path for moving the sample is formed, the liquid feeding means for moving and stopping the sample in the flow path, and the flow path are maintained at the first temperature.
  • This control method when the sample is moved from the second temperature region in a first temperature region, the moving speed in the detection area of the sample to the first moving speed v 1, most of the sample to stop at a predetermined position in the flow path the distance between the center of the detection region and an end portion close to the detection region as X 01, when the sample is moved from the first temperature region to the second temperature region, the moving speed in the detection area of the sample and the second moving speed v 2 ,
  • the distance between the end closest to the detection region of the sample that stops at a predetermined position in the flow path and the center of the detection region is X 02
  • a certain time unique to the reaction processing apparatus is t C
  • ⁇ is a correction coefficient
  • the sample is moved from the first temperature region to the second temperature.
  • t d2 / 2 ⁇ ⁇ ( X 02 / v 2)
  • -t second waiting time defined by C comprises instructing to stop the sample liquid feeding means .
  • sample passes through the detection region Since the sample to be subjected to PCR has a certain volume, it has a predetermined length partitioned by an interface with air in the flow path. When a sample to be subjected to PCR moves in a certain direction, it has a front end portion including a leading interface and a rear end portion including a rearmost interface. “The sample has passed the detection region” means that when the sample is moving in a certain direction, the front end of the sample has entered the detection region and the rear end has left the detection region.
  • the time when the sample passes through the detection region means the time when the rear end of the sample leaves the detection region.
  • the passage time of the sample (in the detection region) is the time when the rear end of the sample leaves the detection region from the time when the tip of the sample enters the detection region (the time when the sample passes through the detection region) This is the time required for a sample having a predetermined length to pass through the detection region.
  • sample position when the sample in the flow path moves in the direction away from the detection region or stops in the direction away from the detection region, the end of the sample closest to the detection region
  • sample position is represented by the distance X between the interface belonging to the region and the center of the detection region.
  • the sample in a reaction processing apparatus capable of applying a thermal cycle to a sample by reciprocatingly moving the sample in flow paths in which different temperature regions are set, the sample is placed at a predetermined position in the temperature region. It is possible to provide technology that can be stopped accurately.
  • FIG. 1A and FIG. 1B are diagrams for explaining a reaction processing container that can be used in a reaction processing apparatus according to an embodiment of the present invention. It is a schematic diagram for demonstrating the reaction processing apparatus which concerns on embodiment of this invention.
  • FIG. 3A and FIG. 3B are diagrams for explaining the stop position of the sample.
  • 4 (a) to 4 (c) are a fluorescence signal chart, a sample position chart, and a sample speed chart until the sample passes through the fluorescence detection region and stops after the standby time is set. It is a figure which shows the change of a fluorescence signal. It is a figure which shows the change of the fluorescence signal at the time of reaction progressing to some extent.
  • FIG. 7A to 7C are a fluorescence signal chart diagram, a sample position chart diagram, and a sample velocity chart diagram until the sample passes through the fluorescence detection region and stops with the standby time set to zero. It is a figure which shows the experimental result which controlled the passage time of the sample according to the table of Table 4.
  • reaction processing apparatus is an apparatus for performing PCR. It should be noted that the same or equivalent components, members, and processes shown in the drawings are denoted by the same reference numerals, and repeated descriptions are omitted as appropriate.
  • the embodiments do not limit the invention but are exemplifications, and all features and combinations thereof described in the embodiments are not necessarily essential to the invention.
  • FIG. 1 (a) and 1 (b) are views for explaining a reaction processing vessel 10 that can be used in a reaction processing apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 (a) is a plan view of the reaction processing vessel 10
  • FIG. 1 (b) is a cross-sectional view taken along the line AA of the reaction processing vessel 10 shown in FIG. 1 (a).
  • the reaction processing container 10 includes a substrate 14 and a flow path sealing film 16.
  • the substrate 14 is preferably formed of a material that is stable against temperature changes and hardly corroded by the sample solution used. Furthermore, the substrate 14 is preferably formed of a material having good moldability, good transparency and barrier properties, and low autofluorescence. As such a material, not only inorganic materials such as glass and silicon (Si) but also resins such as acrylic, polyester, and silicone, among which cycloolefin is preferable.
  • An example of the dimensions of the substrate 14 is a long side of 75 mm, a short side of 25 mm, and a thickness of 4 mm.
  • a groove-like flow path 12 is formed on the lower surface 14 a of the substrate 14, and the flow path 12 is sealed with a flow path sealing film 16.
  • An example of the dimensions of the flow path 12 formed on the lower surface 14a of the substrate 14 is a width of 0.7 mm and a depth of 0.7 mm.
  • a first communication port 17 communicating with the outside is formed at one end of the flow path 12 in the substrate 14.
  • a second communication port 18 is formed at the other end of the flow path 12 in the substrate 14.
  • a pair of first communication port 17 and second communication port 18 formed at both ends of the flow path 12 are formed so as to be exposed on the upper surface 14 b of the substrate 14.
  • Such a substrate can be manufactured by injection molding or cutting by an NC processing machine.
  • a flow path sealing film 16 is stuck on the lower surface 14a of the substrate 14.
  • most of the flow path 12 is formed in a groove shape exposed on the lower surface 14 a of the substrate 14. This is to facilitate molding by injection molding using a mold or the like.
  • a flow path sealing film 16 is pasted on the lower surface 14a of the substrate 14.
  • one main surface may be provided with adhesiveness, and a functional layer that exhibits adhesiveness and adhesiveness by pressing, energy irradiation such as ultraviolet rays, heating, or the like is provided on one main surface. It may be formed and has a function that can be easily brought into close contact with the lower surface 14a of the substrate 14 and integrated.
  • the channel sealing film 16 is preferably formed of a material having low autofluorescence including an adhesive.
  • a transparent film made of a resin such as cycloolefin, polyester, polypropylene, polyethylene, or acrylic is suitable, but not limited thereto.
  • the flow path sealing film 16 may be formed from plate-shaped glass or resin. In this case, since a rigid property can be expected, it is useful for preventing warping and deformation of the reaction processing vessel 10.
  • the flow path 12 includes a reaction region in which a plurality of levels of temperature can be controlled by a reaction processing apparatus described later.
  • a thermal cycle can be given to the sample by moving the sample so as to reciprocate continuously in a reaction region in which a plurality of levels of temperatures are maintained.
  • the flow path 12 shown in FIGS. 1A and 1B is formed in a straight line.
  • the reaction processing container 10 is mounted on a reaction processing apparatus described later, the right side of the flow path 12 in the drawing is a relatively high temperature (about 95 ° C.) reaction region (hereinafter referred to as “high temperature region”). It is planned that the left side of will be in a region of lower temperature (about 55 ° C.) (hereinafter referred to as “low temperature region”).
  • the reaction region of the flow path 12 is formed in a straight line, but the form of the reaction region is not limited to this, and for example, a so-called combination of a curved part and a straight part. It may be formed in a meandering shape that is continuously folded. In this case, the effective area of a heater or the like that constitutes the temperature control means described later can be used effectively, and it is easy to reduce the temperature variation within the reaction region, and the substantial size of the reaction processing vessel. There is an advantage that the reaction processing apparatus can be reduced in size.
  • FIG. 1A and FIG. 1B show a state in which the sample 20 is introduced into the flow path of the reaction processing vessel 10.
  • the sample 20 is introduced into the flow path 12 from either the first communication port 17 or the second communication port 18.
  • the introduction method is not limited to these, but an appropriate amount of sample may be directly introduced from the communication port using, for example, a pipette, a dropper, or a syringe. Alternatively, it may be an introduction method while preventing contamination through a cone-shaped needle tip in which a filter made of porous PTFE or polyethylene is incorporated. In general, many types of such needle tips are sold and easily available, and can be used by being attached to the tip of a pipette, dropper, syringe or the like. Further, the sample may be moved to a predetermined location in the flow path by discharging and introducing the sample with a pipette, a dropper, a syringe, or the like, and further pushing and pushing.
  • a fluorescent probe for example, a fluorescent probe, a thermostable enzyme, and four types of deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were added as a PCR reagent to a mixture containing one or more types of DNA. Things can be raised. Further, a primer that specifically reacts with the DNA to be treated is mixed. Commercially available reagent kits for real-time PCR can also be used.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining the reaction processing apparatus 30 according to the embodiment of the present invention.
  • the reaction processing apparatus 30 includes a reaction processing container mounting unit (not shown) on which the reaction processing container 10 is mounted, a temperature control system 32, and a CPU.
  • the temperature control system 32 has a region on the right side of the paper surface in the flow path 12 of the reaction processing container 10 of about 95 ° C. (with respect to the reaction processing container 10 placed on the reaction processing container mounting portion.
  • the high temperature region) and the region on the left side of the paper can be accurately maintained and controlled at about 55 ° C. (low temperature region).
  • the temperature control system 32 maintains the temperature of each temperature region in the thermal cycle region.
  • the temperature control system 32 has a high-temperature heater 60 for heating the high-temperature region of the flow channel 12 and a low temperature of the flow channel 12.
  • a low temperature heater 62 for heating the region, a temperature sensor (not shown) such as a thermocouple for measuring the actual temperature in each temperature region, and a high temperature heater driver 33 for controlling the temperature of the high temperature heater 60 And a low-temperature heater driver 35 that controls the temperature of the low-temperature heater 62.
  • the actual temperature information measured by the temperature sensor is sent to the CPU 36. Based on the actual temperature information of each temperature region, the CPU 36 controls each heater driver so that the temperature of each heater becomes a predetermined temperature.
  • Each heater may be, for example, a resistance heating element or a Peltier element.
  • the temperature control system 32 may further include other component parts for improving the temperature controllability of each temperature region.
  • the reaction processing apparatus 30 further includes a liquid feeding system 37 for moving the sample 20 in the flow path of the reaction processing container 10.
  • the liquid feeding system 37 includes a first pump 39, a second pump 40, a first pump driver 41 for driving the first pump 39, a second pump driver 42 for driving the second pump 40, A first tube 43 and a second tube 44 are provided.
  • One end of the first tube 43 is connected to the first communication port 17 of the reaction processing container 10. It is preferable that a packing 45 or a seal for ensuring airtightness is disposed at a connection portion between the first communication port 17 and one end of the first tube 43. The other end of the first tube 43 is connected to the output of the first pump 39. Similarly, one end of the second tube 44 is connected to the second communication port 18 of the reaction processing container 10. It is preferable that a packing 46 and a seal for ensuring airtightness are disposed at a connection portion between one end of the second communication port 18 and the second tube 44. The other end of the second tube 44 is connected to the output of the second pump 40.
  • the first pump 39 and the second pump 40 may be micro-blower pumps made of, for example, a diaphragm pump.
  • a micro blower pump model MZB1001T02 manufactured by Murata Manufacturing Co., Ltd. can be used. This micro blower pump can increase the pressure on the secondary side from the primary side during operation, but the pressure on the primary side and the secondary side are equal at the moment of stopping or at the time of stopping.
  • the CPU 36 controls the blowing and pressurization from the first pump 39 and the second pump 40 via the first pump driver 41 and the second pump driver 42.
  • the blowing and pressurization from the first pump 39 and the second pump 40 act on the sample 20 in the flow path through the first communication port 17 and the second communication port 18 to move the sample 20 as a driving force. More specifically, by alternately operating the first pump 39 and the second pump 40, the pressure applied to one of the end surfaces of the sample 20 becomes larger than the pressure applied to the other end. Power is obtained.
  • the sample 20 can be reciprocated in the flow path to pass through each temperature region of the flow path 12 of the reaction processing vessel 10, As a result, the sample 20 can be given a thermal cycle.
  • the target DNA in the sample 20 is selectively amplified by repeatedly applying each step of denaturation in the high temperature region and annealing / extension in the low temperature region.
  • the high temperature region can be regarded as a denaturing temperature region
  • the low temperature region can be regarded as an annealing / elongation temperature region.
  • the time during which the sample 20 stays in each temperature region can be appropriately set by changing the time during which the sample 20 stops at a predetermined position in each temperature region.
  • the reaction processing apparatus 30 further includes a fluorescence detector 50. As described above, a predetermined fluorescent probe is added to the sample 20. As the amplification of DNA progresses, the intensity of the fluorescent signal emitted from the sample 20 increases, so that the intensity value of the fluorescent signal can be used as an index as a determination material for the progress of PCR and the end of the reaction.
  • the fluorescence detector 50 an optical fiber type fluorescence detection manufactured by Nippon Sheet Glass Co., Ltd., which can measure rapidly with a very compact optical system and can detect fluorescence regardless of whether it is a bright place or a dark place.
  • the instrument FLE-510 can be used.
  • the wavelength characteristics of the excitation light / fluorescence can be tuned so as to be suitable for the fluorescence characteristics emitted by the sample 20, and an optimum optical / detection system for a sample having various characteristics can be obtained.
  • the small diameter of the light beam provided by the optical fiber type fluorescence detector is suitable for detecting fluorescence from a sample existing in a small or narrow area such as a flow path.
  • the optical fiber type fluorescence detector 50 includes an optical head 51, a fluorescence detector driver 52, and an optical fiber 53 that connects the optical head 51 and the fluorescence detector driver 52.
  • the fluorescence detector driver 52 includes an excitation light source (LED, laser or other light source adjusted to emit a specific wavelength), an optical fiber type multiplexer / demultiplexer, and a photoelectric conversion element (PD, APD, photomultiplier, etc.). Photo detector) (none of which are shown) and the like, and includes a driver for controlling them.
  • the optical head 51 includes an optical system such as a lens, and has a function of directing the excitation light to the sample and condensing fluorescence emitted from the sample. The condensed fluorescence is separated from the excitation light by the optical fiber type multiplexer / demultiplexer in the fluorescence detector driver 52 through the optical fiber 53 and converted into an electric signal by the photoelectric conversion element.
  • the optical head 51 is arranged so that fluorescence from the sample 20 in the flow path connecting the high temperature region and the low temperature region can be detected. Since the sample 20 is repeatedly reciprocated in the flow path, the reaction proceeds and a predetermined DNA contained in the sample 20 is amplified. Therefore, by monitoring the variation in the amount of detected fluorescence, the progress of DNA amplification Can be known in real time. Further, in the reaction processing apparatus 30 according to the present embodiment, the output value from the fluorescence detector 50 is used for movement control of the sample 20 as described later.
  • the fluorescence detector is not limited to the optical fiber fluorescence detector as long as it exhibits a function of detecting fluorescence from the sample.
  • 3 (a) and 3 (b) are diagrams for explaining the stop position of the sample.
  • the sample 20 is reciprocated in the flow path so as to give the sample 20 a thermal cycle, so that the temperature is different on the flow path 12.
  • a plurality of maintained temperature regions that is, a high temperature region and a low temperature region
  • the sample 20 needs to stop accurately in each temperature region. If the stop position varies, the reaction may not occur, the reaction may vary at the location of the sample, or the reaction such as DNA amplification may become inaccurate, which may lead to an error in judgment of workers and business workers.
  • the flow path 12 includes a connection region that connects the high temperature region and the low temperature region.
  • the optical head 51 of the fluorescence detector 50 is provided so as to detect fluorescence from the sample 20 passing through a partial region 65 (referred to as “fluorescence detection region 65”) in the connection region.
  • the fluorescence detector 50 detects a fluorescence signal from the sample 20 in the fluorescence detection region 65 and transmits the signal to the CPU 36 every 0.01 seconds.
  • the CPU 36 receives the fluorescent signal and performs arithmetic processing such as averaging such as smoothing and moving average of the fluorescent signal value, comparison with a predetermined threshold value (hereinafter sometimes referred to as “evaluation etc.” collectively). And a stop or activation signal is given to the liquid delivery system 37 based on the result.
  • the fluorescence detection region 65 is arranged near the middle between the high temperature region and the low temperature region, but the present invention is not limited to this.
  • the arrangement may be biased toward the high temperature region side or the low temperature region side. Since the low temperature heater 62 disposed in the low temperature region may have a lower output than the high temperature heater 60 disposed in the high temperature region, it is possible to use a smaller or thinner heater component. In that case, the optical head It is also possible to place 51 in a biased position near the low temperature region.
  • the sample 20 is stopped at a position separated from the center of the fluorescence detection region 65 by a predetermined distance. And represent the distance X corresponding to the position of the sample 20 to be stopped (target stop position) at a distance X 0.
  • the distance X 0 is the distance between the interface belonging to the end of the sample 20 closest to the fluorescence detection region 65 and the center of the fluorescence detection region 65 when the sample 20 passes through the fluorescence detection region 65 and stops at the target stop position. is there.
  • the distance corresponding to the target stop position on the high temperature region side and the target stop position on the low temperature region side is different.
  • X 01 a distance corresponding to the target stop position of the distance and the low-temperature region side corresponding to the target stop position of the high-temperature region side as described above Note that they do not have to be the same.
  • the distance corresponding to the target stop position on the high temperature region side is X 01
  • the distance corresponding to the target stop position on the low temperature region side is X 02 .
  • a flow for stopping the sample 20 is shown below.
  • the sample 20 passes through the fluorescence detection region 65 (the fluorescence detector 50 transmits a fluorescence signal to the CPU 36).
  • the CPU 36 detects that the sample 20 has passed based on the fluorescence signal from the fluorescence detector 50 (3)
  • the CPU 36 transmits a stop signal for the first pump 39 to the first pump driver 41, or A stop signal for the second pump 40 is transmitted to the second pump driver 42 (4) the first pump 39 or the second pump 40 is stopped (5) the sample 20 is stopped
  • FIG. 4 shows an aspect in which the sample 20 moving through the flow path 12 at a speed v (mm / s) passes through the fluorescence detection region 65 and stops at a target stop position corresponding to the distance X 0 (mm) after a predetermined time. This will be described with reference to the chart.
  • the chart of FIG. 4 schematically shows an aspect that generally occurs in the case of the control system as described above. In this description, there is no distinction between the high temperature region and the low temperature region on the flow channel 12, and the flow channel 12 having no temperature distribution within the moving range of the sample 20 is considered.
  • FIG. 4A schematically shows a mode of a fluorescence signal when the sample 20 passes through the fluorescence detection region 65 (fluorescence signal chart).
  • FIG. 4B shows a change in the distance X corresponding to the position of the sample 20 in a time series (sample position chart).
  • FIG. 4C shows a change in the moving speed of the sample 20 in a time series (sample speed chart).
  • the fluorescence detection region 65 is considered to have a very small substantial area.
  • the area of the fluorescence detection area 65 it is equal to the irradiation area of the excitation light is condensed by the objective lens, or less in diameter 1 mm, is very small compared further with the length and the distance X 0 of the sample 20 .
  • FIG. 4A shows an operation such as moving average processing performed by the CPU 36 on the fluorescence signal detected by the fluorescence detector 50 when the sample 20 having a certain length in the flow path 12 passes through the fluorescence detection region 65.
  • the fluorescence signal obtained by is shown by a solid line.
  • a substantially rectangular fluorescence signal as drawn by a dotted line that is, in FIG. 4A, point A ⁇ point B ⁇ point C ⁇ A fluorescent signal that follows the point D and the dotted line and converges again to the baseline should be detected.
  • the CPU 36 receives the fluorescence signals from the fluorescence detector 50 every 0.01 seconds and evaluates them, so in actuality, it is a solid line with a delay corresponding to the time required for the evaluation. From the drawn fluorescence signal, that is, from the point A in FIG. 4A, a peak is shown with a delay from the dotted line while following the solid line (corresponding to the region M), and after that, the peak is delayed from the dotted line to the point E while following the solid line. A fluorescence signal that decreases and converges to the baseline is detected.
  • sample passage criterion a half value (50% value) of the baseline value and the peak value of the fluorescence signal is used as a threshold value, and 0.01 second is obtained by calculation such as moving average processing.
  • a point that is equal to or exceeds the threshold value at the rising edge of the fluorescence signal obtained every time is a point F
  • a point that is equal to or below the threshold value at the falling edge of the fluorescence signal is a point G
  • FIG. the time when the CPU 36 detects that the tip of the sample has entered the fluorescence detection region and the time when the rear end of the sample has exited the fluorescence detection region.
  • t d1 which is the time difference corresponding to point C and point G, is from when the sample 20 actually passes through the fluorescence detection region 65 to when the CPU 36 detects that the sample 20 has passed through the fluorescence detection region 65. It can be regarded as a delay time. This is also the time required from (1) to (2) described in the above flow, which is specific to the control system and the evaluation method by the CPU 36, even if the moving speed of the sample changes. Is unchanged.
  • a stop signal is transmitted to the liquid feeding system 37 after t d2 seconds from the time corresponding to the point G.
  • the time from when the pump driver of the liquid delivery system 37 receives the stop signal to when the pump stops can be ignored. It is not necessary to evaluate the received signal or the like, and the pump used is not of the type that performs inertia operation.
  • the time t d2 is the time required for (2) to (3) described in the above flow, not the delay time that the apparatus inevitably has, but to control the apparatus, that is, place the sample 20 in a predetermined place. This is the time to be determined for the control for stopping.
  • the pump (the first pump 39 or the second pump 40) stops at the time corresponding to the point H, and then reaches the point K. There is a delay time t d3 until the sample stops at the corresponding time. It is common for a sample with substantial mass, which is moving at a predetermined speed (beyond resistance such as frictional force) to obtain a driving force from the outside, and stop simultaneously when the driving force is cut off. Because it is difficult to think.
  • t d3 is the time required for (3) to (5) described in the above flow.
  • the CPU 36 or the like can detect that it has passed through the fluorescence detection region 65 of the sample 20 at a time corresponding to the point G in FIG. is there. Accordingly, by transmitting a stop signal from time to t d2 seconds after the pump driver liquid feeding system 37 (41 or 42), it is possible to stop at the target stop position corresponding to the sample 20 at a distance X 0, It is a problem to obtain this time t d2 specifically.
  • This time t d2 indicates how long the CPU should wait before transmitting the stop signal, and is called “waiting time”.
  • equation (3) In general, when an object moving at an observation point at a speed v is to be stopped at a distance X 0 from the observation point, the object is stopped after X 0 / v after the object passes the observation point. You can do it. However, in this embodiment, as can be seen from FIG. 4A, the time required for evaluation by the CPU 36 and the transmission of the stop signal to the liquid feeding system 37, and after the pump 39 or 40 is stopped, the sample 20 is completely removed. It can be considered that the sum of the time required to stop is a so-called delay time and appears as t c in the equation (3).
  • the sample 20 has a finite length L (for example, about 40 mm) in the flow path.
  • L for example, about 40 mm
  • FIG. 5 shows changes in the fluorescence signal detected by the fluorescence detector 50 and obtained as a result of calculations such as moving average processing by the CPU 36.
  • the symbols in the figure are the same as those in FIG. 4A showing the relationship between the time and the fluorescence signal based on the correspondence.
  • the fluorescence signal graph shown in FIG. 5 is the initial reaction.
  • the horizontal axis indicates the time before the sample 20 enters the fluorescence detection region 65 and when the fluorescence signal starts to be detected, and the vertical axis is output from the fluorescence detector driver 52. It represents the intensity of the fluorescence signal (when a photoelectric conversion element such as APD is used as a fluorescence detection device, the direct output of the fluorescence signal is represented by a voltage).
  • the relationship between the time and the detected fluorescence signal is that the sample 20 enters the fluorescence detection region 65 and the fluorescence signal is zero or As the sample 20 increases from the baseline and the sample 20 exits the fluorescence detection region 65, the fluorescence signal decreases to zero or the baseline again.
  • a substantially rectangular shape (having a plateau-like peak) is illustrated as a graph representing a change in the fluorescence signal when passing through the sample.
  • the flatness of the plateau-like peak in the region M such as steep dents or kinks.
  • the flat portion of the plateau-like peak in the region M becomes narrow.
  • the sample 20 to generate fluorescence from the reaction beginning without that the reaction continues with the same threshold based on the fluorescence signal graph in the original, determining the time t p passes continuously from the reaction beginning to the end of the reaction Good. Since the sample 20 is given a thermal cycle, a predetermined DNA or the like is amplified, and the fluorescence intensity and the fluorescence signal from the sample 20 are inevitably increased. Therefore, the threshold value is changed according to the progress of the reaction of the sample 20. (That is, the threshold may be increased with an increase in the difference between the baseline and the peak value in the fluorescence signal graph).
  • FIG. 6 shows the change in the fluorescence signal when the reaction proceeds to some extent.
  • the fluorescence signal emitted from the sample 20 becomes stronger. Therefore, the peak at the time when the reaction has progressed to some extent is 7 to 7 times higher than the peak of the fluorescence signal graph at the beginning of the reaction (see FIG. 5). In some cases, it may reach 10 times or more.
  • the threshold value set to 50% of the difference between the peak value and the baseline may be lower than the baseline in the fluorescence signal graph at the time when the reaction has progressed to some extent or law to will be become equivalent, or no longer be calculated on the basis of the passing time t p the threshold, sometimes passing time t p will be determined that the longer.
  • the threshold value that is the basis for the passage of the sample 20 and the entry and exit of the sample 20 is not limited to being determined based directly on the fluorescence signal as described above.
  • the passage reference of the sample 20 may be determined based on a change in the fluorescence signal, and an n-th order derivative of the fluorescence signal, for example, a first-order derivative of the fluorescence signal (corresponding to a change rate of the fluorescence signal) is calculated. Then, when the differential coefficient increases or decreases beyond a certain threshold value, it is set as the entry / exit time of the sample 20, and the passage time of the sample 20 may be determined based on the difference.
  • the change rate (first derivative) of the fluorescence signal at a certain time is, for example, the change rate at the time before the time.
  • the level of the difference can be set as a threshold value. Since this can also be compared with the change rate of the fluorescence signal at the immediately preceding time, the entry and exit of the sample 20 to the fluorescence detection region can be detected relatively early.
  • FIG. 7C shows a sample speed chart.
  • the symbols and the like in the figure are the same as those used in FIGS. 4 (a) to 4 (c). Since the standby time td2 is zero, the time corresponding to the point G and the point H is simultaneous. Therefore, a distance corresponding to the stop position of the sample 20 and X 1, when the moving speed of the sample 20 and v, FIG. 7 (b), the from the chart of FIG. 7 (c), below is established (4).
  • v ⁇ t d1 + v ⁇ t d3 / 2 X 1 (4)
  • this equation (4) is modified, the following equation (5) is obtained.
  • time t d1 + t d3 / 2 X 1 / v (5)
  • time t d1 and the time t d3 are the same as those in the above equation (2). This is because the time t d1 and the time t d3 are values specific to the apparatus regardless of the value of the standby time t d2 .
  • the inventor uses the applied voltage (pump voltage E) to the pump that can change the moving speed v of the sample 20 as a parameter, the distance X 1 corresponding to the position of the actually stopped sample 20, and the passage time t. p , moving speed v, and X 1 / v were determined by experiment or calculation. The results are shown in Table 1.
  • the sample 20 emits sufficiently high fluorescence, and the volume of the sample 20 is accurately adjusted so that the length L in the flow path is 40 mm in any experiment, and the temperature of the sample 20 is set to 40 during the experiment.
  • the reaction temperature was kept constant by keeping the temperature constant.
  • the distance X 1 was determined by the distance from the center of the fluorescence detection area 65 is measured by a digital caliper.
  • t d1 and t d3 cannot be obtained individually, it is possible to obtain the delay time t c by performing a moving / stopping experiment with t d2 set to 0.
  • the standby time t d2 needs to satisfy 0 ⁇ t d2 .
  • the CPU 36 cannot send a stop signal to the liquid feeding means before detecting the passage of the sample 20 through the fluorescence detection region 65. Therefore, 0 such that ⁇ t d2, it is necessary to determine the moving velocity v of the distance X 0 and sample 20 corresponding to the target stop position of the sample 20 in consideration of t C.
  • t d1 is a time required for the evaluation of the CPU 36 and the transmission of the stop signal, and is constant regardless of the moving speed v.
  • the inventor conducted a verification experiment on the validity of the expression (6).
  • the passing time t p As it emits fluorescence of sufficient intensity can be measured the passing time t p, and was charged with a sample 20 of a volume, such as length L in the channel is exactly 40mm in the channel 12.
  • the temperature of the sample 20 was maintained at 40 ° C. so that no reaction occurred.
  • the distance X 0 corresponding to the target stop position of the sample 20 is set to 30 mm, t C is set to 0.2 seconds, and the standby time t d2 is set based on the above examination result, and corresponds to the actual stop position of the sample. the distance X 1 to the measured.
  • the measurement was performed with a digital caliper in the same manner as described above, and an average value of 10 measurements was adopted. The experimental results are shown in Table 2.
  • the length of the sample used for PCR corresponds to each temperature region so that the sample 20 is included in each temperature region. It is easy to adjust the length of the flow path to be about 1 mm (or several millimeters with a margin) from the standpoint of designing the apparatus and adjusting the input amount of the sample.
  • the reason why the stop position is shifted is that the moving speed v of the sample 20 is calculated based on the passage time of the fluorescence detection region 65, so that it passes through the fluorescence detection region 65 and stops in any temperature region. It can be presumed that there is a difference in the moving speed of the sample during the period up to the time point, or that the delay time t d3 related to the stop of the sample 20 varies within a very small range.
  • the standby time t d2 may be determined based on the right side of the equation (6), that is, X 0 / v ⁇ t c .
  • the waiting time t d2 is calculated based on the right side of the equation (6): X 0 / v ⁇ t c to be a basic waiting time, and a temporal correction term t k is added to obtain the following (7 ) May be determined based on the formula.
  • t d2 X 0 / v ⁇ t c + t k (7)
  • a threshold value for determining the transit time t p may be set as follows.
  • the sample 20 is given a thermal cycle by continuously reciprocating between temperature regions having different set temperatures. Therefore, the CPU 36 may obtain a temporal change of the fluorescence signal for each cycle, and obtain the threshold value of the cycle from there. Thereby, an appropriate threshold value can be obtained according to the progress of the reaction.
  • a threshold value for a certain cycle may be obtained based on a temporal change in the fluorescence signal in the previous cycle.
  • the method of obtaining a threshold value of a certain cycle from the fluorescence signal graph of the cycle as described above requires more rapid calculation, so that the load on the CPU 36 is inevitably increased, and the sample 20 is required to reduce the load. It may be necessary to adjust the moving speed v of the head in a small direction. Therefore, in order to reduce the load on the control system including the CPU 36, it is effective to obtain the threshold value based on the fluorescence signal graph in the previous cycle.
  • the difference between the fluorescence signal at most once the previous cycle is extremely small, affect the calculation of the transit time t p of the sample 20, further probability to cause greater displacement in the stop position of the sample 20 is very small.
  • the experimental results are shown in Table 3.
  • the sample 20 is moved when the reaction has progressed to some extent (late reaction stage).
  • the X 1 in which the sample 20 corresponding to the actual stop position when varying the velocity v was measured.
  • the distances X 01 and X 02 corresponding to the target stop positions on the high temperature region side and the low temperature region side are both 30 mm.
  • the threshold value is fixed when the threshold value of each cycle is fixed to the initial threshold value of the reaction
  • the variable threshold value is when the threshold value of each cycle is the threshold value of the previous cycle.
  • the threshold is fixed system, deviation occurs in the reaction X 1 of the initial and latter stage of the reaction.
  • reaction X 1 of the initial and latter stage of the reaction is substantially the same.
  • using a variable threshold value is very effective in reducing variation in the stopping position of the sample 20.
  • a thermal cycle of about 40 to 50 cycles may be given to a sample containing it.
  • the time required for reciprocation between the denaturation region (high temperature region) of the reaction region and the annealing / elongation region (low temperature region) will be examined. If the time required for the forward path and the return path is, for example, 5 seconds each, and if 50 thermal cycles are required for PCR, the time required for movement between the high temperature and low temperature regions can be estimated as 500 seconds. In addition, when the time required for the forward path and the return path can be reduced to about 1 second, the time required for movement between the high temperature and low temperature regions can be estimated as 100 seconds, and a considerable reduction in time can be expected.
  • the transit time t p is the moving velocity v of the sample 20 is in inverse proportion, the transit time t p would be desirable to be small and constant.
  • the transit time t p may be sequentially calculated from the fluorescence signal graph during movement of the sample 20, also passing time t p is dependent on the increase or decrease of the pump applied voltage E, passing the target value of the time t p (target passing time) an agreement, P control, by varying the pump voltage E according to known control methods, such as PI control or PID control, close the passage time t p of the sample 20 to the target transit time, and can be maintained.
  • the pump voltage E may be previously provided with a table for determining increase / decrease. An example of the table is shown in Table 4.
  • the fluorescence signal is transmitted from the fluorescence detector driver every 0.01 seconds (100 Hz), and there is a time constant based on the evaluation of the fluorescence signal data by the CPU 36. setting transit time meaning not was 2-10 times the t c.
  • the sample 20 is an aqueous solution
  • its viscosity changes depending on the temperature. For example, at a high temperature, the viscosity becomes small and it tends to flow in the flow path. Therefore, the conditions for movement of the sample 20 are different between the case where the sample 20 moves from the low temperature region to the high temperature region and the case where the sample 20 moves from the high temperature region to the low temperature region. Therefore, in order to constant as possible transit time t p of the sample 20, it is desirable to separate the control according to the moving direction of the sample 20.
  • the graph is based on the first passage time t p1 from the low temperature region to the high temperature region in the previous cycle.
  • the first passage time tp1 is converged to the target passage time by changing the pump voltage E of the pump 40 in 2 (pump that moves the sample 20 from the low temperature region to the high temperature region by pressurization or air blowing).
  • the pump 39 the pump that moves the sample 20 from the high temperature region to the low temperature region
  • the second passage time tp2 is converged to the target passage time by changing the pump voltage E. Furthermore, by performing such control, any passing time can be reached earlier than the target passing time.
  • Figure 8 shows the experimental result of controlling the first passage time t p1 and the second passage time t p2 of sample 20 in accordance with the table 4 table.
  • the horizontal axis of FIG. 8 represents the number of thermal cycles, and the vertical axis represents the passage time.
  • Transit time t p is inversely related to the moving velocity v of the sample 20. It can be seen from FIG. 8 that control can be performed so that the first passage time t p1 and the second passage time tp 2 to be targeted converge to the target passage time (0.5 seconds to 0.6 seconds).
  • control is performed so that the target values of the first passage time t p1 and the second passage time t p2 are within the same range, and as a result, the sample 20 is reciprocated by substantially the same passage time. I confirmed that.
  • the first passage time t p1 controlled so that there is a difference in the target passing time of the second passage time t p2, resulting in a sample as the first passage time t p1 and the second passage time t p2 are different Twenty reciprocal movements may be made.
  • the first passage time t p1 related to the movement from the low temperature to the high temperature region Is set to be larger than the second passage time tp2 , and the sample 20 is moved relatively slowly, so that an effect of eliminating such a problem can be considered.
  • the standby time when the sample 20 moves from the low temperature to the high temperature region is the first standby time t d2 / 1 , and the sample 20 is from the high temperature to the low temperature.
  • the standby time when moving to the area is the second standby time td2 / 2
  • the second standby time td2 / 2 is set independently of the first standby time td2 / 1. Is.
  • the calculation method of the first standby time td2 / 1 and the second standby time td2 / 2 is not limited to this, but based on the equation (6), the first standby time td2 / 1 and the second standby time t d2 / 2 may be calculated separately.
  • the first waiting time t d2 / 1 and the second waiting time t d2 / 2 are calculated as in the following equations (8) and (9), and
  • the reaction processing apparatus is controlled based on the waiting time.
  • t d2 / 1 X 01 / v 1 -t C
  • t d2 / 2 X 02 / v 2 ⁇ t C (9)
  • reaction processing apparatus According to the reaction processing apparatus according to the embodiment as described above, it is possible to more accurately correspond to the difference in moving speed caused by the temperature difference of the sample 20 that reciprocates between the high temperature region and the low temperature region. It is possible to stop the sample 20 at an appropriate position.
  • the fluorescence detection region is provided in the connection flow path that connects the high temperature region and the low temperature region, when the sample 20 moves from the low temperature to the high temperature region, the temperature of the sample 20 that moves in the vicinity of the fluorescence detection region. Since the temperature of the sample 20 that moves by entering the high temperature region becomes higher, the viscosity of the sample 20 that moves in the high temperature region becomes lower. Then, the moving speed of the sample 20 moving in the high temperature region becomes larger than the speed of the sample 20 moving in the vicinity of the fluorescence detection region 65 in the connection region.
  • the moving speed of the sample 20 which is one of the examination factors of the waiting time set for stopping the sample 20 at the target stop position is determined based on the passing time of the sample 20 passing through the fluorescence detection region.
  • the sample 20 stops at a position that exceeds the preset target stop position in the high temperature region.
  • the sample 20 may stop at a position that does not reach the preset target stop position in the low temperature region. Therefore, there is a difference between the stop position when the sample 20 moves from the low temperature to the high temperature region and the stop position when the sample 20 moves from the high temperature to the low temperature region.
  • the moving speed of the sample 20 is different even in one stroke related to the movement from the low temperature region to the high temperature region and from the high temperature region to the low temperature region as described above. Then, a correction coefficient for the moving speed is introduced, and the first standby time t d2 / 1 and the second standby time t d2 / 2 are calculated.
  • the speed of the sample 20 moving in the high temperature region becomes larger than the speed of the sample 20 moving in the vicinity of the fluorescence detection region 65 in the connection region, and the sample 20 Is moved from the high temperature to the low temperature region, the speed of the sample 20 moving in the low temperature region is smaller than the speed of the sample 20 moving in the vicinity of the fluorescence detection region 65 in the connection region, so that 1 ⁇ f and / or
  • the first waiting time t d2 / 1 and the second waiting time t d2 / 2 are calculated as g ⁇ 1, and the reaction processing apparatus is controlled based on these waiting times.
  • t d2 / 1 X 01 / (f ⁇ v 1 ) ⁇ t C (10)
  • t d2 / 2 X 02 / (g ⁇ v 2 ) ⁇ t C (11)
  • the reaction processing apparatus corrects the distances X 01 and X 02 corresponding to the target stop positions on the high temperature region side and the low temperature region side, instead of introducing a correction coefficient for the moving speed.
  • a coefficient is introduced to calculate a first waiting time t d2 / 1 and a second waiting time t d2 / 2 . Since the moving speed is calculated every time the sample 20 passes through the fluorescence detection region 65, the first standby time t d2 / 1 and the second standby time t d2 / 2 are calculated in consideration of the correction coefficient as described above.
  • the target stop position is represented by a unique distance to the device or the like, there may be cases where such annoyance can be eliminated if a correction coefficient is taken into consideration before the reaction process. In either case, those skilled in the art can select as appropriate.
  • the products of the distances X 01 and X 02 corresponding to the target stop positions on the high temperature region side and the low temperature region side, and the correction coefficients k and h corresponding thereto are expressed by the following equations (8) and (9).
  • the first standby time t d2 / 1 and the second standby time t d2 / 2 are calculated based on the following equations (12) and (13), and the reaction processing device is calculated based on these standby times: It is characterized by controlling.
  • the speed of the sample 20 moving in the high temperature region is higher than the speed of the sample 20 moving in the vicinity of the fluorescence detection region 65 in the connection region. Tends to stop over X 01 corresponding to the target stop position, and when the sample 20 moves from the high temperature to the low temperature region, the speed of the sample 20 moving in the low temperature region is within the connection region.
  • the first standby time t d2 / 1 and the second standby time t d2 / 2 are calculated as 1 ⁇ h, and the reaction processing apparatus is controlled based on these standby times.
  • t d2 / 1 (k ⁇ X 01 ) / v 1 ⁇ t C (12)
  • t d2 / 2 (h ⁇ X 02 ) / v 2 ⁇ t C (13)
  • the reaction processing apparatus when the movement speed of the sample 20 in the flow channel 12 in the fluorescence detection region 65 and the high temperature region is different, or in the flow channel 12 in the fluorescence detection region 65 and the low temperature region. Even when the moving speed of the sample 20 is different, the stop position of the sample 20 can be corrected, and the sample 20 can be stopped at an appropriate position in each temperature region more accurately. .
  • the flow path 12 is not wet with the sample solution and is dry.
  • an adjustment voltage ⁇ E corresponding to the transit time tp2 required for the movement of high temperature (0) ⁇ low temperature (1) is applied, and low temperature (2) ⁇ high temperature (
  • an adjustment voltage ⁇ E corresponding to the transit time tp1 required for the movement from the low temperature (1) to the high temperature (1) may be added.
  • n is an integer of 1 or more
  • the movement from high temperature (n) to low temperature (n + 1) is the adjustment voltage ⁇ E corresponding to the transit time tp2 required for the movement from high temperature (n-1) to low temperature (n).
  • an adjustment voltage ⁇ E corresponding to the transit time tp1 required for the movement from low temperature (n) to high temperature (n) may be applied.
  • the reference pump voltage E The pump is operated at 12.5 V, and the adjustment voltage ⁇ E corresponding to the transit time tp1 required for the movement from the low temperature (0) to the high temperature (1) is applied for the movement from the low temperature (1) to the high temperature (2).
  • an adjustment voltage ⁇ E corresponding to the transit time tp2 required for the movement from high temperature (1) to low temperature (1) may be added.
  • n is an integer of 1 or more
  • the movement from low temperature (n) ⁇ high temperature (n + 1) corresponds to the transit time tp1 required for the movement from low temperature (n ⁇ 1) ⁇ high temperature (n).
  • the adjustment voltage ⁇ E corresponding to the transit time tp2 required for the movement from the high temperature (n) to the low temperature (n) may be added.
  • the pump 40 when moving from the low temperature to the high temperature region, the pump 40 is controlled based on the first passage time tp1 when moving from the low temperature to the high temperature region.
  • the pump 39 is controlled based on the second passage time tp2 when moving from the high temperature to the low temperature region, so that control suitable for the temperature and viscosity of the sample 20 provided for each movement is performed. It is possible to reach an appropriate target passing time and thus a target moving speed without requiring a quick and complicated mechanism, and the first passing time t p1 and the second passing time t p2 that are different depending on the situation. Can also be set.
  • the passage time in an environment where conditions vary greatly due to the influence of the wettability and drying of the channel 12 in the initial state can be controlled.
  • the target transit time can be reached more accurately and quickly.
  • the above-described equations (6) to (13) are defined from the time when the passage of the sample 20 through the fluorescence detection region 65 is detected.
  • the waiting time t d2 (or the first waiting time t d2 / 1 and the second waiting time t d2 / 2 ) elapses, the sample 20 is sent to the first pump driver 41 and the second pump driver 42 of the liquid feeding system 37.
  • the stop By instructing the stop, the sample 20 can be accurately stopped at a predetermined position in the temperature region.
  • the reaction processing apparatus 30 according to these embodiments even when the moving speed v of the sample 20 varies due to fluctuations in various physical property values, the sample can always be stopped at a predetermined position. It can be performed.
  • reaction processing apparatus 30 it is not necessary to add an optical measurement system other than this by using the fluorescence detector 50 responsible for the progress management of the real-time PCR as a means for positioning the sample 20. Therefore, it is possible to reduce the manufacturing cost of the device while contributing to the downsizing of the device.
  • reaction processing container 10 reaction processing container, 12 flow path, 14 substrate, 17 1st communication port, 18 2nd communication port, 20 samples, 30 reaction processing device, 32 temperature control system, 33 high temperature heater driver, 35 low temperature heater driver, 36 CPU, 37 liquid feeding system, 39 first pump, 40 second pump, 41 first pump driver, 42 second pump driver, 43 first tube, 44 second tube, 45,46 packing, 50 fluorescence detector, 51 Optical head, 52 fluorescence detector driver, 53 optical fiber, 60 high temperature heater, 62 low temperature heater, 65 fluorescence detection area.
  • the present invention can be used for polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction

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Abstract

反応処理装置３０は、流路１２が形成された反応処理容器１０と、送液システム３７と、流路１２に高温領域と低温領域を提供する温度制御システム３２と、流路１２の蛍光検出領域を通過する試料２０を検出する蛍光検出器５０と、検出された信号に基づいて送液システム３７を制御するＣＰＵ３６とを備える。試料２０が低温領域から高温領域に移動するとき、ＣＰＵ３６は、蛍光検出器５０により試料２０の蛍光検出領域の通過が検出された時刻から、所定の第１待機時間が経過したとき、送液システム３７に試料２０の停止を指示する。試料２０が高温領域から低温領域に移動するとき、ＣＰＵ３６は、蛍光検出器５０により試料２０の蛍光検出領域の通過が検出された時刻から、第１待機時間とは独立して設定された所定の第２待機時間が経過したとき、送液システム３７に試料２０の停止を指示する。

Description

反応処理装置および反応処理装置の制御方法
　本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）に使用される反応処理装置およびその制御方法に関する。
　遺伝子検査は、各種医学分野における検査、農作物や病原性微生物の同定、食品の安全性評価、さらには病原性ウィルスや各種感染症の検査にも広く活用されている。遺伝子である微小量のＤＮＡを高感度に検出するために、ＤＮＡの一部を増幅して得られたものを分析する方法が知られている。中でもＰＣＲは、生体等から採取されたごく微量のＤＮＡのある部分を選択的に増幅する注目の技術である。
　ＰＣＲは、ＤＮＡを含む生体サンプルと、プライマーや酵素などからなるＰＣＲ試薬とを混合した試料に、所定のサーマルサイクルを与え、変性、アニーリングおよび伸長反応を繰り返し起こさせて、ＤＮＡの特定の部分を選択的に増幅させるものである。
　ＰＣＲにおいては、対象の試料をＰＣＲチューブ又は複数の穴が形成されたマイクロプレート（マイクロウェル）などの反応処理容器に所定量入れて行うことが一般的であるが、近年、基板に形成された微細な流路を備える反応処理容器（チップとも呼ばれる）を用いて行うことが実用化されてきている（例えば特許文献１）。
特開２００９－２３２７００号公報
　往復式流路タイプの反応容器によるＰＣＲでは、試料を流路中で往復式に移動させることによって試料にサーマルサイクルを与えるために、流路上にそれぞれ異なる温度に維持された複数の温度領域が設定される。試料に適切にサーマルサイクルを与えるためには、試料がそれぞれの温度領域に正確に停止する必要がある。停止位置がばらつくと、反応が起こらなかったり、反応の進度が試料の場所でばらついたり、ＤＮＡの増幅等の反応が不正確になり、ひいては作業者や業務従事者の判断ミスを招来するおそれがある。
　本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、異なる温度領域が設定されている流路内で試料を往復式に移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる反応処理装置において、試料を温度領域の所定の位置に正確に停止させることのできる技術を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明のある態様の反応処理装置は、試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、試料を流路内で移動および停止させる送液手段と、流路に、第１温度に維持された第１温度領域と、第１温度よりも低い第２温度に維持された第２温度領域を提供する温度制御手段と、流路の第１温度領域と第２温度領域の間に設定された検出領域を通過する試料を検出する検出手段と、検出手段によって検出された信号に基づいて、送液手段を制御する制御手段と、を備える。試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するとき、制御手段は、検出手段により試料の検出領域の通過が検出された時刻から、所定の第１待機時間が経過したとき、送液手段に試料の停止を指示する。試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するとき、制御手段は、検出手段により試料の検出領域の通過が検出された時刻から、第１待機時間とは独立して設定された所定の第２待機時間が経過したとき、送液手段に試料の停止を指示する。
　本発明の別の態様も反応処理装置である。この反応処理装置は、試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、試料を流路内で移動および停止させる送液手段と、流路に、第１温度に維持された第１温度領域と、第１温度よりも低い第２温度に維持された第２温度領域を提供する温度制御手段と、流路の第１温度領域と第２温度領域の間に設定された検出領域を通過する試料を検出する検出手段と、検出手段によって検出された信号に基づいて、送液手段を制御する制御手段と、を備える。試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するとき、試料の検出領域における移動速度を第１移動速度ｖ１とし、流路内の所定の位置に停止する試料の最も検出領域に近い端部と検出領域の中心との距離をＸ０１とし、試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するとき、試料の検出領域における移動速度を第２移動速度ｖ２とし、流路内の所定の位置に停止する試料の最も検出領域に近い端部と検出領域の中心との距離をＸ０２とし、当該反応処理装置に固有の一定の時間をｔＣとしたときに、制御手段は、試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するときには、ｔｄ２/１＝Ｘ０１／ｖ１－ｔＣで規定される第１待機時間が経過したとき、試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するときには、ｔｄ２/２＝Ｘ０２／ｖ２－ｔＣで規定される第２待機時間が経過したとき、送液手段に試料の停止を指示する。
　本発明の別の態様も反応処理装置である。この反応処理装置は、試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、試料を流路内で移動および停止させる送液手段と、流路に、第１温度に維持された第１温度領域と、第１温度よりも低い第２温度に維持された第２温度領域を提供する温度制御手段と、流路の第１温度領域と第２温度領域の間に設定された検出領域を通過する試料を検出する検出手段と、検出手段によって検出された信号に基づいて、送液手段を制御する制御手段と、を備える。試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するとき、試料の検出領域における移動速度を第１移動速度ｖ１とし、流路内の所定の位置に停止する試料の最も検出領域に近い端部と検出領域の中心との距離をＸ０１とし、試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するとき、試料の検出領域における移動速度を第２移動速度ｖ２とし、流路内の所定の位置に停止する試料の最も検出領域に近い端部と検出領域の中心との距離をＸ０２とし、当該反応処理装置に固有の一定の時間をｔＣとし、αおよびβを補正係数としたときに、制御手段は、試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するときには、ｔｄ２/１＝α×（Ｘ０１／ｖ１）－ｔＣで規定される第１待機時間が経過したとき、試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するときには、ｔｄ２/２＝β×（Ｘ０２／ｖ２）－ｔＣで規定される第２待機時間が経過したとき、送液手段に試料の停止を指示する。
　ｔＣは、試料が検出領域を実際に通過した時刻と、検出手段が試料が検出領域を通過したことを検出した時刻との差に相当する時間であってもよい。
　試料は、ＤＮＡと、ＰＣＲ試薬と、蛍光を発する試薬を含んでもよい。検出手段は、試料から発せられる蛍光を検出する蛍光検出器を含んでもよい。試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するときの試料の検出領域を通過する時間を第１通過時間ｔｐ１とし、試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するときの試料の検出領域を通過する時間を第２通過時間ｔｐ２としたとき、制御手段は、蛍光検出器からの信号または当該信号に対して所定の演算処理をした値と、所定の閾値とに基づいて、第１通過時間ｔｐ１および第２通過時間ｔｐ２を求め、制御手段は、第１通過時間ｔｐ１と試料の長さＬとから第１移動速度ｖ１＝Ｌ／ｔｐ１、第２通過時間ｔｐ２と試料の長さＬとから第２移動速度ｖ２＝Ｌ／ｔｐ２を演算してもよい。
　制御手段は、試料の反応の進捗に応じて、閾値を変化させてもよい。
　制御手段は、第１通過時間ｔｐ１および第２通過時間ｔｐ２が所定の目標通過時間となるよう送液手段を制御してもよい。
　本発明のさらに別の態様は、試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、試料を流路内で移動および停止させる送液手段と、流路に、第１温度に維持された第１温度領域と、第１温度よりも低い第２温度に維持された第２温度領域を提供する温度制御手段と、流路の第１温度領域と第２温度領域の間に設定された検出領域を通過する試料を検出する検出手段と、を備える反応処理装置の制御方法である。この制御方法は、試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するとき、検出手段により試料の検出領域の通過が検出された時刻から、所定の第１待機時間が経過したとき、送液手段に試料の停止を指示することと、試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するとき、検出手段により試料の検出領域の通過が検出された時刻から、第１待機時間とは独立して設定された所定の第２待機時間が経過したとき、送液手段に試料の停止を指示することを備える。
　本発明のさらに別の態様も、試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、試料を流路内で移動および停止させる送液手段と、流路に、第１温度に維持された第１温度領域と、第１温度よりも低い第２温度に維持された第２温度領域を提供する温度制御手段と、流路の第１温度領域と第２温度領域の間に設定された検出領域を通過する試料を検出する検出手段と、を備える反応処理装置の制御方法である。この制御方法は、試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するとき、試料の検出領域における移動速度を第１移動速度ｖ１とし、流路内の所定の位置に停止する試料の最も検出領域に近い端部と検出領域の中心との距離をＸ０１とし、試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するとき、試料の検出領域における移動速度を第２移動速度ｖ２とし、流路内の所定の位置に停止する試料の最も検出領域に近い端部と検出領域の中心との距離をＸ０２とし、当該反応処理装置に固有の一定の時間をｔＣとしたときに、制御手段は、試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するときには、ｔｄ２/１＝Ｘ０１／ｖ１－ｔＣで規定される第１待機時間が経過したとき、試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するときには、ｔｄ２/２＝Ｘ０２／ｖ２－ｔＣで規定される第２待機時間が経過したとき、送液手段に試料の停止を指示することを含む。
　本発明のさらに別の態様も、試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、試料を流路内で移動および停止させる送液手段と、流路に、第１温度に維持された第１温度領域と、第１温度よりも低い第２温度に維持された第２温度領域を提供する温度制御手段と、流路の第１温度領域と第２温度領域の間に設定された検出領域を通過する試料を検出する検出手段と、を備える反応処理装置の制御方法である。この制御方法は、試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するとき、試料の検出領域における移動速度を第１移動速度ｖ１とし、流路内の所定の位置に停止する試料の最も検出領域に近い端部と検出領域の中心との距離をＸ０１とし、試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するとき、試料の検出領域における移動速度を第２移動速度ｖ２とし、流路内の所定の位置に停止する試料の最も検出領域に近い端部と検出領域の中心との距離をＸ０２とし、当該反応処理装置に固有の一定の時間をｔＣとし、αおよびβを補正係数としたときに、制御手段は、試料が第２温度領域から第１温度領域に移動するときには、ｔｄ２/１＝α×（Ｘ０１／ｖ１）－ｔＣで規定される第１待機時間が経過したとき、試料が第１温度領域から第２温度領域に移動するときには、ｔｄ２/２＝β×（Ｘ０２／ｖ２）－ｔＣで規定される第２待機時間が経過したとき、送液手段に試料の停止を指示することを含む。
　上記の「試料が検出領域を通過」について説明する。ＰＣＲに供される試料は一定の体積があるため、流路内で空気との界面によって区画された所定の長さを有する。ＰＣＲに供される試料がある方向に移動するときには先頭の界面を含む先端部と最後尾の界面を含む後端部を有する。「試料が検出領域を通過した」とは、試料がある一定の方向に移動しているとき、試料の先端部が検出領域に進入し、後端部が検出領域を退出したことをいう。
　「試料が検出領域を通過した時刻」とは、試料の後端部が検出領域を退出した時刻をいう。また、「試料の（検出領域の）通過時間」とは、試料の先端部が検出領域に進入した時刻から試料の後端部が検出領域を退出した時刻（試料が検出領域を通過した時刻）までの時間をいい、所定の長さを有する試料が検出領域の通過に要する時間である。
　次に「試料の位置」について説明する。本明細書等において、流路内の試料が、検出領域を通過して離れていく方向に移動、または離れていく方向に移動して停止する場合には、検出領域に最も近い試料の端部に属する界面と検出領域の中心との距離Ｘによって「試料の位置」を表すこととする。
　本発明によれば、異なる温度領域が設定されている流路内で試料を往復式に移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる反応処理装置において、試料を温度領域の所定の位置に正確に停止させることのできる技術を提供できる。
図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器を説明するための図である。 本発明の実施形態に係る反応処理装置を説明するための模式図である。 図３（ａ）および図３（ｂ）は、試料の停止位置について説明するための図である。 図４（ａ）～図４（ｃ）は、待機時間を設定して試料が蛍光検出領域を通過して停止するまでの蛍光信号チャート図、試料位置チャート図、試料速度チャート図である。 蛍光信号の変化を示す図である。 反応がある程度進んだ時点での蛍光信号の変化を示す図である。 図７（ａ）～図７（ｃ）は、待機時間をゼロとして試料が蛍光検出領域を通過して停止するまでの蛍光信号チャート図、試料位置チャート図、試料速度チャート図である。 表４のテーブルに則って試料の通過時間を制御した実験結果を示す図である。
　以下、本発明の実施形態に係る反応処理装置について説明する。この反応処理装置は、ＰＣＲを行うための装置である。なお、各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。
　図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器１０を説明するための図である。図１（ａ）は、反応処理容器１０の平面図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）に示す反応処理容器１０のＡ－Ａ断面図である。
　図１（ａ）および図１（ｂ）に示すように、反応処理容器１０は、基板１４と、流路封止フィルム１６とから成る。
　基板１４は、温度変化に対して安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１４は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス、シリコン（Ｓｉ）等の無機材料をはじめ、アクリル、ポリエステル、シリコーンなどの樹脂、中でもシクロオレフィンが好適である。基板１４の寸法の一例は、長辺７５ｍｍ、短辺２５ｍｍ、厚み４ｍｍである。
　基板１４の下面１４ａには溝状の流路１２が形成されており、この流路１２は、流路封止フィルム１６により封止されている。基板１４の下面１４ａに形成される流路１２の寸法の一例は、幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍである。基板１４における流路１２の一端の位置には、外部と連通する第１連通口１７が形成されている。基板１４における流路１２の他端の位置には、第２連通口１８が形成されている。流路１２の両端に形成された一対の第１連通口１７および第２連通口１８は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。このような基板は射出成形やＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。
　基板１４の下面１４ａ上には、流路封止フィルム１６が貼られている。実施形態に係る反応処理容器１０において、流路１２の大部分は基板１４の下面１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１４の下面１４ａ上に流路封止フィルム１６が貼られる。
　流路封止フィルム１６は、一方の主面が粘着性を備えていてもよいし、押圧や紫外線などのエネルギー照射、加熱等により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１４の下面１４ａと密着して一体化できる機能を備える。流路封止フィルム１６は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、流路封止フィルム１６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、反応処理容器１０の反りや変形防止に役立つ。
　流路１２は、後述する反応処理装置により複数水準の温度の制御が可能な反応領域を備える。複数水準の温度が維持された反応領域を連続的に往復するように試料を移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる。図１（ａ）および図１（ｂ）に示す流路１２は、直線状に形成されている。後述の反応処理装置に反応処理容器１０が搭載された際に、流路１２の紙面右側が比較的高温（約９５℃）の反応領域（以下、「高温領域」と称する）となり、流路１２の左側がそれより低温（約５５℃）の領域（以下、「低温領域」と称する）となることが予定されている。
　図１（ａ）および図１（ｂ）では流路１２の反応領域は直線状に形成されているが、反応領域の形態はこれに限定されず、例えば曲線部と直線部とを組み合わせたいわゆる連続的に折り返す蛇行状に形成されてもよい。この場合、後述の温度制御手段を構成するヒータ等の実効面積を有効に使うことができ、反応領域内での温度のばらつきを低減することが容易であるとともに、反応処理容器の実体的な大きさを小さくでき、反応処理装置を小さくできるという利点がある。
　図１（ａ）および図１（ｂ）は、試料２０が反応処理容器１０の流路内に導入された様子を示す。試料２０は、第１連通口１７および第２連通口１８のいずれか一方から流路１２に導入される。導入の方法はこれらに限られないが、例えばピペットやスポイト、シリンジ等で該連通口から適量の試料を直接導入してもよい。あるいは、多孔質のＰＴＦＥやポリエチレンからなるフィルタが内蔵してあるコーン形状のニードルチップを介してコンタミネーションを防止しながらの導入方法であってもよい。このようなニードルチップは一般的に数多くの種類のものが販売され容易に入手でき、ピペットやスポイト、シリンジ等の先端に取り付けて使用することが可能である。さらにピペットやスポイト、シリンジ等による試料の吐出、導入後、さらに加圧して推すことにより流路の所定の場所まで試料を移動させてもよい。
　試料２０としては、例えば、一または二以上の種類のＤＮＡを含む混合物に、ＰＣＲ試薬として蛍光プローブ、耐熱性酵素および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものがあげられる。さらに反応処理対象のＤＮＡに特異的に反応するプライマーを混合する。市販されているリアルタイムＰＣＲ用試薬キット等も使用することができる。
　図２は、本発明の実施形態に係る反応処理装置３０を説明するための模式図である。
　本実施形態に係る反応処理装置３０は、反応処理容器１０が載置される反応処理容器載置部（図示せず）と、温度制御システム３２と、ＣＰＵ３６とを備える。温度制御システム３２は、図２に示すように、反応処理容器載置部に載置される反応処理容器１０に対して、反応処理容器１０の流路１２における紙面右側の領域を約９５℃（高温領域）、紙面左側の領域を約５５℃（低温領域）に精度よく維持、制御できるように構成されている。
　温度制御システム３２は、サーマルサイクル領域の各温度領域の温度を維持するものであって、具体的には、流路１２の高温領域を加熱するための高温用ヒータ６０と、流路１２の低温領域を加熱するための低温用ヒータ６２と、各温度領域の実温度を計測するための例えば熱電対等の温度センサ（図示せず）と、高温用ヒータ６０の温度を制御する高温用ヒータドライバ３３と、低温用ヒータ６２の温度を制御する低温用ヒータドライバ３５とを備える。温度センサによって計測された実温度情報は、ＣＰＵ３６に送られる。ＣＰＵ３６は、各温度領域の実温度情報に基づいて、各ヒータの温度が所定の温度となるよう各ヒータドライバを制御する。各ヒータは例えば抵抗加熱素子やペルチェ素子等であってよい。温度制御システム３２はさらに、各温度領域の温度制御性を向上させるための他の要素部品を備えてもよい。
　本実施形態に係る反応処理装置３０は、さらに、試料２０を反応処理容器１０の流路内で移動させるための送液システム３７を備える。送液システム３７は、第１ポンプ３９と、第２ポンプ４０と、第１ポンプ３９を駆動するための第１ポンプドライバ４１と、第２ポンプ４０を駆動するための第２ポンプドライバ４２と、第１チューブ４３と、第２チューブ４４とを備える。
　反応処理容器１０の第１連通口１７には、第１チューブ４３の一端が接続される。第１連通口１７と第１チューブ４３の一端の接続部には、気密性を確保するためのパッキン４５やシールが配置されることが好ましい。第１チューブ４３の他端は、第１ポンプ３９の出力に接続される。同様に、反応処理容器１０の第２連通口１８には、第２チューブ４４の一端が接続される。第２連通口１８と第２チューブ４４の一端の接続部には、気密性を確保するためのパッキン４６やシールが配置されることが好ましい。第２チューブ４４の他端は、第２ポンプ４０の出力に接続される。
　第１ポンプ３９、第２ポンプ４０は、例えばダイアフラムポンプからなるマイクロブロアポンプであってよい。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０としては、例えば株式会社村田製作所製のマイクロブロアポンプ（型式ＭＺＢ１００１Ｔ０２）などを使用することができる。このマイクロブロアポンプは、動作時に一次側より二次側の圧力を高めることができるが、停止した瞬間または停止時には一次側と二次側の圧力が等しくなる。
　ＣＰＵ３６は、第１ポンプドライバ４１、第２ポンプドライバ４２を介して、第１ポンプ３９、第２ポンプ４０からの送風や加圧を制御する。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０からの送風や加圧は、第１連通口１７、第２連通口１８を通じて流路内の試料２０に作用し、推進力となって試料２０を移動させる。より詳細には、第１ポンプ３９、第２ポンプ４０を交互に動作させることにより、試料２０のいずれかの端面にかかる圧力が他端にかかる圧力より大きくなるため、試料２０の移動に係る推進力が得られる。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０を交互に動作させることによって、試料２０を流路内で往復式に移動させて、反応処理容器１０の流路１２の各温度領域を通過させることができ、その結果、試料２０にサーマルサイクルを与えることが可能となる。より具体的には、高温領域において変性、低温領域においてアニーリング・伸長の各工程を繰り返し与えることにより、試料２０中の目的のＤＮＡを選択的に増幅させる。言い換えれば高温領域は変性温度域、低温領域はアニーリング・伸長温度域とみなすことができる。また各温度領域に滞留する時間は、試料２０が各温度領域の所定の位置で停止する時間を変えることによって適宜設定することができる。
　本実施形態に係る反応処理装置３０は、さらに、蛍光検出器５０を備える。上述したように、試料２０には所定の蛍光プローブが添加されている。ＤＮＡの増幅が進むにつれ試料２０から発せられる蛍光信号の強度が増加するので、その蛍光信号の強度値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。
　蛍光検出器５０としては、非常にコンパクトな光学系で、迅速に測定でき、かつ明るい場所か暗い場所かにもかかわらず、蛍光を検出することができる日本板硝子株式会社製の光ファイバ型蛍光検出器ＦＬＥ－５１０を使用することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、その励起光／蛍光の波長特性を試料２０の発する蛍光特性に適するようにチューニングしておくことができ、様々な特性を有する試料について最適な光学・検出系を提供することが可能であり、さらに光ファイバ型蛍光検出器によってもたらされる光線の径の小ささから、流路などの小さいまたは細い領域に存在する試料からの蛍光を検出するのに適している。
　光ファイバ型の蛍光検出器５０は、光学ヘッド５１と、蛍光検出器ドライバ５２と、光学ヘッド５１と蛍光検出器ドライバ５２とを接続する光ファイバ５３とを備える。蛍光検出器ドライバ５２には励起光用光源（ＬＥＤ、レーザその他特定の波長を出射するように調整された光源）、光ファイバ型合分波器及び光電変換素子（ＰＤ，ＡＰＤ又はフォトマル等の光検出器）（いずれも図示せず）等が含まれており、これらを制御するためのドライバ等からなる。光学ヘッド５１はレンズ等の光学系からなり、励起光の試料への指向性照射と試料から発せられる蛍光の集光の機能を担う。集光された蛍光は光ファイバ５３を通じて蛍光検出器ドライバ５２内の光ファイバ型合分波器により励起光と分けられ、光電変換素子によって電気信号に変換される。
　本実施形態に係る反応処理装置３０においては、高温領域と低温領域とを接続する流路内の試料２０からの蛍光を検出することができるように光学ヘッド５１が配置される。試料２０は流路内を繰り返し往復移動させられることで反応が進み、試料２０に含まれる所定のＤＮＡが増幅するので、検出された蛍光の量の変動をモニタリングすることで、ＤＮＡの増幅の進度をリアルタイムで知ることができる。また、本実施形態に係る反応処理装置３０においては、後述するように、蛍光検出器５０からの出力値を利用して、試料２０の移動制御に活用する。蛍光検出器は、試料からの蛍光を検出する機能を発揮するものであれば光ファイバ型蛍光検出器に限定されない。
　図３（ａ）および図３（ｂ）は、試料の停止位置について説明するための図である。上述したように、本実施形態に係る反応処理装置３０においては、試料２０を流路中で往復式に移動させることによって試料２０にサーマルサイクルを与えるために、流路１２上にそれぞれ異なる温度に維持された複数の温度領域（すなわち、高温領域および低温領域）が設定される。試料２０に適切にサーマルサイクルを与えるためには、試料２０がそれぞれの温度領域内に正確に停止する必要がある。停止位置がばらつくと、反応が起こらなかったり、反応が試料の場所でばらついたり、ＤＮＡの増幅等の反応が不正確になり、ひいては作業者、業務従事者の判断ミスを招来するおそれがある。
　図３（ｂ）に示すように、流路１２は、高温領域と低温領域の間に両者を接続する接続領域を備える。蛍光検出器５０の光学ヘッド５１は、この接続領域内の一部の領域６５（「蛍光検出領域６５」と称する）を通過する試料２０から蛍光を検出するように設けられている。蛍光検出器５０は、蛍光検出領域６５にある試料２０からの蛍光信号を検出し、その信号を０．０１秒毎にＣＰＵ３６に送信する。ＣＰＵ３６は、蛍光信号を受信し、蛍光信号値のスムージングや移動平均のような平均化等の演算処理や予め決められた閾値との比較等（以降まとめて「評価等」という場合もある）を行い、その結果に基づいて送液システム３７に停止または作動信号を与える。
　図３（ａ）および図３（ｂ）では、蛍光検出領域６５を、高温領域と低温領域との中間付近に配置したがこれに限られるものではない。例えば、高温領域側あるいは低温領域側にその配置が偏っていてもよい。低温領域に配される低温用ヒータ６２は高温領域に配される高温用ヒータ６０よりも出力が低くてよいので、その分小型あるいは薄型のヒータ部品を使用することができ、その場合は光学ヘッド５１を低温領域寄りに偏って配置することもできる。
　ここで、蛍光検出領域６５の中心から所定距離だけ離間した位置に試料２０を停止させることを考える。停止させたい試料２０の位置（目標停止位置）に対応する距離Ｘを距離Ｘ０で表すこととする。距離Ｘ０は、試料２０が蛍光検出領域６５を通過して目標停止位置に停止したとき、蛍光検出領域６５に最も近い試料２０の端部に属する界面と蛍光検出領域６５の中心との距離である。この距離Ｘ０で表される位置に試料２０があるときに、試料２０が最も適切に所定の温度に加熱、維持され、この位置は装置の温度領域の範囲や位置、反応処理容器１０の構成から定まる。
　先述のように、蛍光検出領域６５の位置が、高温領域あるいは低温領域のいずれかの側に偏っている場合などは、高温領域側の目標停止位置に対応する距離と低温領域側の目標停止位置に対応する距離とは異なる。以下、一般的に目標停止位置について検討する場合は単にＸ０と記載するが、上記のように高温領域側の目標停止位置に対応する距離と低温領域側の目標停止位置に対応する距離とは同じでなくてもよいということに留意されたい。本明細書においては、高温領域側の目標停止位置に対応する距離をＸ０１、低温領域側の目標停止位置に対応する距離をＸ０２とする。
　試料２０を停止させる際のフローを以下に示す。
（１）試料２０が蛍光検出領域６５を通過する（蛍光検出器５０は蛍光信号をＣＰＵ３６に送信している）
（２）蛍光検出器５０からの蛍光信号に基づきＣＰＵ３６が試料２０の通過したことを検知する
（３）ＣＰＵ３６が、第１ポンプドライバ４１に対して第１ポンプ３９の停止信号を送信する、または第２ポンプドライバ４２に対して第２ポンプ４０の停止信号を送信する
（４）第１ポンプ３９または第２ポンプ４０が停止する
（５）試料２０が停止する
　速度ｖ（ｍｍ／ｓ）で流路１２を移動している試料２０が、蛍光検出領域６５を通過し所定の時間後に距離Ｘ０（ｍｍ）に対応する目標停止位置に停止する態様を図４のチャート図を使って説明する。図４のチャート図は、上記のような制御系の場合の一般的に生じる態様について模式的に表したものである。この説明では流路１２上の高温領域及び低温領域の区別がなく、試料２０の移動範囲内で温度分布がない流路１２を考える。
　図４（ａ）は、試料２０が蛍光検出領域６５を通過する際の蛍光信号の態様を模式的に表している（蛍光信号チャート）。図４（ｂ）は、試料２０の位置に対応する距離Ｘの変化を時系的に表している（試料位置チャート）。図４（ｃ）は、試料２０の移動速度の変化を時系的に表している（試料速度チャート）。なお、蛍光検出領域６５は、ここでは実体的な面積が非常に小さいものとみなしている。蛍光検出領域６５の面積は、対物レンズで集光された励起光の照射面積に相当するので、直径１ｍｍ以下であり、さらに試料２０の長さや距離Ｘ０と比較して非常に小さいからである。
　図４（ａ）は、流路１２内である一定の長さを有する試料２０が蛍光検出領域６５を通過する際に蛍光検出器５０が検出した蛍光信号をＣＰＵ３６の移動平均化処理等の演算によって得られた蛍光信号を実線で示している。蛍光検出器５０やＣＰＵ３６等に時間的な遅れがない理想的な場合は、点線で描かれるような略矩形状の蛍光信号、すなわち図４（ａ）において、点Ａ→点Ｂ→点Ｃ→点Ｄと点線を辿り、再びベースラインに収束する蛍光信号が検出されるはずである。しかしながら、上述のようにＣＰＵ３６は、蛍光検出器５０から０．０１秒毎に蛍光信号を受信し、それらの評価等を行うので、実際には、評価等に要する時間分の遅れを伴う実線で描かれた蛍光信号、すなわち図４（ａ）上での点Ａから、実線を辿りながら点線から遅れてピークを示し（領域Ｍに相当）、その後実線を辿りながら点線から遅れて点Ｅに向かって減少しベースラインに収束する蛍光信号が検出される。
　本実施形態において、ＣＰＵ３６が検出した図４（ａ）のような態様の蛍光信号に基づいて、蛍光信号がどのような状態になった場合に、ＣＰＵ３６が「試料が蛍光検出領域を通過した」と認識するかをあらかじめ決めておく必要がある（以降「試料の通過基準」という）。試料の通過基準についてはこれに限られるものではないが、本実施形態ではベースラインと蛍光信号のピーク値の半値（５０％値）を閾値とし、移動平均化処理等の演算によって０．０１秒毎に得られる蛍光信号の立ち上がり時にこの閾値と同じになるか上回った点を点Ｆとし、蛍光信号の立ち下がり時に閾値と同じになるか下回った点を点Ｇとしたとき、図４（ａ）の蛍光信号チャートにおいて点Ｆおよび点Ｇに相当する時刻が、それぞれ試料の先端部が蛍光検出領域に進入したとＣＰＵ３６が検知した時刻および試料の後端部が蛍光検出領域を退出したとＣＰＵ３６が検知した時刻に相当する。さらに点Ｃおよび点Ｇに相当する時刻の差であるｔｄ１は、試料２０が実際に蛍光検出領域６５を通過してから、試料２０が蛍光検出領域６５を通過したとＣＰＵ３６が検知するまでの遅れ時間とみなすことができる。これはまた上記フローで記載したところの（１）～（２）までに要した時間であり、制御系や上記のＣＰＵ３６による評価等の方法に固有のもので試料の移動速度などが変わっても不変である。
　また図４（ａ）の蛍光信号チャートにおいて、時間ｔｐは、流路１２内で一定の長さを有する試料２０が蛍光検出領域６５を通過するのに要した時間であることに留意する。試料２０の移動速度ｖが変わるとき、例えばｖが増大するときはｔｐが小さくなり、蛍光信号チャートの略矩形状のパルス状のチャートが、その幅を小さくするような態様に変化する。ｖが減少するときは逆にその幅が大きくなるような蛍光信号のチャートとなって現れる。
　図４（ａ）の蛍光信号チャートにおいては、点Ｇに相当する時刻からｔｄ２秒後に送液システム３７に対して停止信号を送信する。送液システム３７のポンプドライバが停止信号を受信してからポンプが停止するまでの時間は無視することができる。受信信号の評価等も必要ではなく、使用されるポンプは慣性運転するようなタイプのものではない。時間ｔｄ２は上記フローで記載したところの（２）～（３）に要する時間であり、装置が必然的に有する遅れ時間ではなく、本装置をコントロールするためにすなわち試料２０を所定の場所に停止させるための制御のために決定すべき時間である。
　図４（ｂ）の試料位置チャートと図４（ｃ）の試料速度チャートにおいては、点Ｈに相当する時刻にポンプ（第１ポンプ３９または第２ポンプ４０）が停止してから、点Ｋに相当する時刻に試料が停止するまでに遅れ時間ｔｄ３が生じる。外部からの推進力を得て（摩擦力などの抵抗を超えて）所定の速度で移動している実体的に質量のある試料等が、その推進力を遮断したところで、同時に停止するとは一般的に考えにくいからである。ｔｄ３は上記フローで記載したところの（３）～（５）に要する時間である。
　本実施形態に係る制御系を備える往復流路式ＰＣＲ装置においては、ＣＰＵ３６等が試料２０の蛍光検出領域６５を通過したことを検知できるのは図４（ａ）の点Ｇに相当する時刻である。従って、この時刻からｔｄ２秒後に停止信号を送液システム３７のポンプドライバ（４１または４２）に送信することで、試料２０を距離Ｘ０に対応した目標停止位置に停止することができるので、この時間ｔｄ２を具体的に求めることが課題となる。この時間ｔｄ２は、ＣＰＵがどの程度の時間を待って停止信号を送信すればよいかを表しているので「待機時間」と呼ぶ。
　図４（ｂ）、図４（ｃ）のチャート図から、移動速度×時間＝距離なので、以下の（１）式が成り立つ。
　ｖ×ｔｄ１＋ｖ×ｔｄ２＋ｖ×ｔｄ３／２＝Ｘ０　・・・（１）
　この（１）式を変形すると、以下の（２）式が得られる。
　ｔｄ２＝Ｘ０／ｖ－（ｔｄ１＋ｔｄ３／２）　・・・（２）
　この（２）式のうち（ｔｄ１＋ｔｄ３／２）は装置や試料等に依存する固有的な時間でありこれを「遅れ時間」ｔｃとすると（３）式が得られる。
　ｔｄ２＝Ｘ０／ｖ－ｔｃ　・・・（３）
　この（３）式の意味を考える。一般的に、観察地点を速度ｖで移動する物体を、観察地点から距離Ｘ０だけ離れた位置に止めようとすると、物体が観察地点を通過してからＸ０／ｖの時間後に物体を停止させればよい。しかしながら、本実施形態においては、図４（ａ）からわかるようにＣＰＵ３６による評価等および送液システム３７への停止信号の送信に要する時間、さらにポンプ３９または４０が停止した後に試料２０が完全に停止するまでに要する時間などの合計がいわゆる遅れ時間となり、（３）式にｔｃとして現れると考えることができる。
　待機時間ｔｄ２を具体的に求める前に、試料２０の移動速度ｖの求め方について、実際得られた蛍光信号データに基づいて詳細に説明する。試料２０は、流路内で有限の長さＬ（例えば４０ｍｍ程度）を有している。従って、試料２０が蛍光検出領域６５を通過する時間ｔｐが分かれば、ｖ＝Ｌ／ｔｐとして試料２０の移動速度ｖを算出することができる。
　図５は、蛍光検出器５０で検出され、ＣＰＵ３６による移動平均化処理等の演算の結果得られた蛍光信号の変化を示す。図中の記号は、その対応関係に基づいて、時刻と蛍光信号との関係を示した図４（ａ）のものと同様のものを使用した。図５に示す蛍光信号グラフは、反応当初のものである。図５において、横軸は試料２０が蛍光検出領域６５に進入する前であって、蛍光信号を検出し始めたときを０とした時刻を示し、縦軸は蛍光検出器ドライバ５２から出力される蛍光信号の強度（ＡＰＤ等の光電変換素子を蛍光検出デバイスとして使用した場合、蛍光信号の直接の出力は電圧で表される）を表している。図５に示すように、蛍光検出領域６５を試料２０が通過する場合、時間と検出される蛍光信号との関係は、試料２０が蛍光検出領域６５に進入してくるとともに、蛍光信号がゼロ又はベースラインから増加し、試料２０が蛍光検出領域６５から退出するとともに、蛍光信号が再びゼロ又はベースラインに低下する。
　なお、図５では、試料通過時の蛍光信号の変化を表すグラフとして、略矩形状のもの（台地状のピークを有するもの）を例示した。しかしながら、これ以外にも、例えば試料２０に気泡が混入している場合や試料２０中に反応のバラツキがある場合などは、急峻な凹みやキンクが生じるなど領域Ｍの台地状のピークの平坦性に大小の変化が現れる可能性がある。また、流路中の試料２０の長さが小さい場合や試料２０の移動速度が速い場合は、領域Ｍの台地状のピークの平坦な部分が狭くなったりするような態様が現れる可能性がある。また、点Ａから領域Ｍへの立ち上がり、領域Ｍから点Ｅへの立ち下がりの部分においては、図４（ａ）で説明したように、ＣＰＵ３６の評価等に費やされる時間のために、一定の時定数を有することに起因して斜めの態様を示していると考えられる。本実施形態では安定した蛍光信号を得るために、先述のＣＰＵ３６による評価等の信号処理を行っているが、これは電気的処理または評価の一例であり、このような処理の有無や評価方法に限定されない。
　図５に示すグラフから、試料２０の蛍光検出領域６５の通過時間ｔｐを求める。通過時間ｔｐは時刻の差であるので、装置の遅れ時間には影響されない。本実施形態における試料の通過基準として、図４での説明における同様の基準により、ベースラインとピーク値との差の５０％を閾値とし、図５中の点Ｆに相当する時刻を試料２０（の先端部）の進入時刻、点Ｇに相当する時刻を試料２０（の後端部）の退出時刻とし、点Ｆと点Ｇに相当する時刻の差を、試料２０の通過時間ｔｐとする。なお、蛍光信号のピーク値とベースラインとの差の何％を閾値とするかは、当業者が適宜自由に設定できる。ＣＰＵ３６は、既知の試料２０の長さＬと、試料２０の通過時間ｔｐとから、ｖ＝Ｌ／ｔｐとして試料２０の移動速度ｖを算出することができる。
　試料２０は反応当初から蛍光を発生させるが、この反応当初における蛍光信号グラフに基づく同一の閾値を用い続けて、反応当初から反応終了まで継続して通過時間ｔｐを求めることをしなくてもよい。試料２０はサーマルサイクルを与えられることにより、所定のＤＮＡ等が増幅し必然的に試料２０からの蛍光強度、蛍光信号は増大するので、試料２０の反応の進捗に応じて、閾値を変化させていってもよい（すなわち、蛍光信号グラフでのベースラインとピーク値との差の増加とともに閾値を増大させていってもよい）。
　図６は、反応がある程度進んだ時点での蛍光信号の変化を示す。一般的には、反応が進むにつれ試料２０から発せられる蛍光信号は強くなるので、反応がある程度進んだ時点でのピークは反応当初の蛍光信号グラフ（図５参照）のピークに比して７～１０倍、またはそれ以上に達する場合もある。反応当初に、ピーク値とベースラインとの差の５０％のラインに設定した閾値は、反応がある程度進んだ時点での蛍光信号グラフにおいては、ベースラインより下回ってしまうか、ピーク形状の裾野のほうに相当してしまうことになり、通過時間ｔｐを閾値に基づいて算出できなくなってしまうか、通過時間ｔｐが長くなったと判定してしまうことがある。試料２０の反応の進捗に応じて、閾値を変化させることにより、このような事態を回避して、適切に試料２０の移動速度ｖを求めることができる。
　試料２０の通過基準や試料２０の進入や退出の根拠となる閾値については、上記のような蛍光信号に直接基づいて決定することに限定されない。例えば、蛍光信号の変化に基づいて試料２０の通過基準を決定してもよく、蛍光信号のｎ階の微分係数、例えば蛍光信号の一階の微分係数（蛍光信号の変化率に相当）を算出し、この微分係数がある閾値を増加してまたは減少して超えることをもって試料２０の進入や退出の時刻とし、その差に基づいて試料２０の通過時間を決めてもよい。またこの場合は蛍光信号のｎ階の微分係数に基づいて試料２０の通過基準を定めるので、例えばある時刻での蛍光信号の変化率（一階微分係数）が、当該時刻前の時刻における変化率と比較して、所定の差異が生じた場合に試料２０が通過したと判断することも可能であり、当該差異のレベルを閾値と設定することも可能である。これは直前の時刻における蛍光信号の変化率と比較することもできるので、試料２０の蛍光検出領域への進入や退出を比較的早く検出することができる。
　次に、待機時間ｔｄ２を求めるために、ｔｃすなわち時間ｔｄ１と時間ｔｄ３について検討する。まず待機時間ｔｄ２がゼロのとき、つまりＣＰＵ３６が試料２０の蛍光検出領域６５の通過を検知したと同時に、送液システム３７に停止信号を送信し、送液システム３７の第１ポンプ３９または第２ポンプ４０を停止し試料２０を停止させる系について検討する。このときのチャート図を、図７（ａ）～図７（ｃ）に示す。図４（ａ）～図４（ｃ）と同様に、図７（ａ）は蛍光信号チャート、図７（ｂ）は試料位置チャート、図７（ｃ）は試料速度チャートを示す。図中の記号等は図４（ａ）～図４（ｃ）に使用したものと同じものを使用した。待機時間ｔｄ２がゼロであるので、点Ｇと点Ｈに相当する時刻が同時ということになる。従って、試料２０の停止位置に対応する距離をＸ１とし、試料２０の移動速度をｖとすると、図７（ｂ）、図７（ｃ）のチャートから、以下の（４）式が成り立つ。
　ｖ×ｔｄ１＋ｖ×ｔｄ３／２＝Ｘ１　・・・（４）
　この（４）式を変形すると、以下の（５）式が得られる。
　ｔｄ１＋ｔｄ３／２＝Ｘ１／ｖ　・・・（５）
　このとき時間ｔｄ１および時間ｔｄ３は、上記の（２）式のものと同一であることに留意されたい。時間ｔｄ１および時間ｔｄ３は、待機時間ｔｄ２の値に関係なく装置に固有の値であるからである。
　本発明者は、試料２０の移動速度ｖを変化させることのできるポンプへの印加電圧（ポンプ電圧Ｅ）をパラメータにして、実際に停止した試料２０の位置に対応する距離Ｘ１、通過時間ｔｐ、移動速度ｖ、およびＸ１／ｖを実験または計算によって求めた。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　試料２０は十分に高い蛍光を発するものであり、試料２０のボリュームはいずれの実験においても流路中の長さＬが４０ｍｍとなるように正確に調節し、実験中は試料２０の温度を４０℃の一定に維持して反応が起こらないようにした。距離Ｘ１は蛍光検出領域６５の中心からの距離をデジタルノギスによって測定して求めた。測定方法は、レチクロを装備した顕微鏡下の測定や拡大モニタを利用した画面上で測定することも可能であり、これらに限られない。上記で説明したように試料２０の通過時間ｔｐを求め、第１ポンプドライバ４１、第２ポンプドライバ４２には、試料２０が退出したとＣＰＵ３６が認識したと同時に停止信号を送信した。試料２０の移動速度ｖはｖ＝Ｌ／ｔｐとして求めた。なお、表１中のデータは各ポンプ電圧Ｅにおいて１０回の平均値を採用した。
　表１の結果から分かるように、ポンプ電圧Ｅを変えて試料２０の移動速度ｖを変えてもＸ１／ｖは、０．１９～０．２１秒（平均約０．２秒）であった。ここでＸ１／ｖ＝ｔｄ１＋ｔｄ３／２＝ｔＣであるので、下記の（６）式が得られ、待機時間ｔｄ２を具体的に求めることができる。
　ｔｄ２＝Ｘ０／ｖ－ｔＣ　・・・（６）
　本実施形態の場合、ｔＣ＝約０．２秒となる。
　従って、ｔｄ１やｔｄ３が個別に求めることができないような場合であっても、ｔｄ２を０として移動・停止実験を行うことにより、遅れ時間ｔｃを求めることが可能である。なお待機時間ｔｄ２は０≦ｔｄ２である必要があることに留意すべきである。ＣＰＵ３６は、試料２０の蛍光検出領域６５の通過を検知するより前に、送液手段に停止信号を送ることができないからである。
　従って、０≦ｔｄ２となるように、ｔＣを考慮して試料２０の目標停止位置に対応する距離Ｘ０および試料２０の移動速度ｖを決める必要がある。
　ちなみに、ｔｄ１は、ＣＰＵ３６の評価等および停止信号の送信に要する時間であり、移動速度ｖにかかわらず一定である。
　本発明者は、（６）式の妥当性について検証実験を行った。検証実験では、通過時間ｔｐを計測できる十分な強度の蛍光を発するもので、且つ、流路中の長さＬが正確に４０ｍｍとなるようなボリュームの試料２０を流路１２に投入した。実験中は反応が起こらないように試料２０の温度を４０℃に維持した。さらにポンプ電圧Ｅを変えて試料２０の移動速度ｖを変化させた。試料２０の移動速度ｖはポンプ電圧Ｅ毎に得られる蛍光信号グラフから、ピークとベースラインとの差の５０％の閾値に基づいて、試料２０の通過時間ｔｐを求め、ｖ＝Ｌ／ｔｐとして算出した。試料２０の目標停止位置に対応する距離Ｘ０を３０ｍｍとし、ｔＣを０．２秒とした上で待機時間ｔｄ２を上記の検討結果に基づいて設定し、実際の試料の停止位置に対応する距離Ｘ１を測定した。測定は上記と同様にデジタルノギスで行い１０回の測定の平均値を採用した。実験結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、実際の停止位置に対応する距離Ｘ１は、目標停止位置に対応する距離Ｘ０＝３０ｍｍに対して、１ｍｍ程度のずれが生じているが、この程度のずれであれば、往復流路式ＰＣＲ装置においては差し支えないものと考えられる。例えばＰＣＲに供される試料２０の停止位置が流路中で１ｍｍ程度ずれたとしても、試料２０が各温度領域に含まれるように、ＰＣＲに供される試料の長さを各温度領域に対応する流路の長さより１ｍｍ（もしくは余裕をみて数ｍｍ）程度小さくすることは、装置等の設計や試料の投入量の調整上容易である。
　また上記停止位置のずれが生じる理由としては、試料２０の移動速度ｖは蛍光検出領域６５の通過時間に基づいて算出されるので、蛍光検出領域６５を通過していずれかの温度領域に停止するまでの間の試料の移動速度と差異が生じる、または試料２０の停止に係る遅れ時間ｔｄ３が、非常に小さい範囲であるがばらつくといった理由が推定できる。
　停止位置のずれを補償する対策の一例として、待機時間ｔｄ２は（６）式の右辺、すなわちＸ０／ｖ－ｔｃに基づいて定めてもよい。具体的には、待機時間ｔｄ２を（６）式の右辺：Ｘ０／ｖ－ｔｃに基づいて算出して基礎待機時間とし、時間的な補正項ｔｋを加えて、次の（７）式に基づいて決めてもよい。
ｔｄ２＝Ｘ０／ｖ－ｔｃ＋ｔｋ・・・（７）
　上記において、反応当初と反応がある程度進んだときの蛍光信号のピーク強度の差について言及した（図５および図６参照）。蛍光信号のピーク強度とベースラインとの差の所定割合（例えば５０％）を閾値とし、該閾値に基づいて試料２０の蛍光検出領域６５の通過時間ｔｐを求める場合、反応当初の閾値を継続して用いると、反応がある程度進んだときには蛍光信号グラフに基づいて得た通過時間ｔｐが実際の通過時間より長くなる可能性がある。
　そこで、本発明の別の実施形態に係る反応処理装置においては、通過時間ｔｐを求めるための閾値を以下のように設定してもよい。試料２０は設定温度の異なる温度領域間を連続的に往復することによってサーマルサイクルを与えられる。そこで、ＣＰＵ３６は、サイクルごとに蛍光信号の時系的な変化を求め、そこから当該サイクルの閾値を求めてよい。これにより、反応の進捗に応じて適切な閾値を求めることができる。
　さらに、あるサイクルの閾値を、前回のサイクルにおける蛍光信号の時系的な変化に基づいて求めてもよい。上記のようにあるサイクルの閾値を当該サイクルの蛍光信号グラフから求めるという方法は、計算の迅速性が一層求められるため、ＣＰＵ３６の負荷が必然的に大きくなり、その負荷を低減しようとすると試料２０の移動速度ｖを小さい方向に調整しなければならない可能性がある。従って、ＣＰＵ３６を含めた制御系の負荷を小さくするためには、前回のサイクルにおける蛍光信号グラフに基づいて閾値を求める方法が効果的である。たかだか１回前のサイクルにおける蛍光信号との差は非常に小さいものであり、試料２０の通過時間ｔｐの算出に影響を及ぼし、さらに試料２０の停止位置に大きくずれを生じさせる蓋然性は非常に小さい。
　通過時間ｔｐを求めるための閾値を反応当初の閾値に固定した場合、以下のような弊害が生じる可能性もある。試料２０は流路内を連続往復的に移動するが、蛍光検出領域６５内であって流路１２の内壁に移動に供さない試料の残渣がある場合がある。このような試料の残渣からも蛍光が発生する可能性があるため、その蛍光が反応当初の閾値より大きい場合は、ベースラインが反応当初の閾値を上回ってしまい、試料２０の通過を検知できないおそれがある。
　本発明者は、閾値の求め方を変えた場合の試料２０の停止位置の違いについて知見を得るために実験を行った。実験結果を表３に示す。本実験では、ＤＮＡや蛍光プローブ等を含む試料２０にサーマルサイクルを与え、実際の所定のＤＮＡの増幅を図った場合に、反応当初と反応がある程度進んだとき（反応後期）の試料２０の移動速度ｖを変えたときの試料２０が実際に停止した位置に対応するＸ１を測定した。ここでは高温領域側および低温領域側の目標停止位置に対応する距離Ｘ０１およびＸ０２をいずれも３０ｍｍとした。実際の試料の停止位置に対応する距離Ｘ１は、温度領域の違いによって左右されないように、高温側のＸ１を測定した。表３において、閾値が固定制とは、各サイクルの閾値を反応当初の閾値に固定した場合であり、閾値が変動制は、各サイクルの閾値を前回のサイクルの閾値とした場合である。表３から分かるように、閾値が固定制の場合、反応当初と反応後期のＸ１にずれが生じている。一方、閾値が変動制の場合、反応当初と反応後期のＸ１はほぼ同じとなっている。表３に示す検証実験から分かるように、閾値を変動制とすることは、試料２０の停止位置のばらつきを小さくする上で非常に有効である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　所定のＤＮＡ等を増幅するＰＣＲにおいては、一般的にそれを含んだ試料に４０～５０サイクル程度のサーマルサイクルを与える場合がある。反応領域の変性領域（高温領域）とアニーリング・伸長領域（低温領域）との間の往復に要する時間について検討する。往路、復路に要する時間が例えば各５秒であるとした場合、ＰＣＲに要するサーマルサイクルが５０サイクル必要なときは、高温・低温領域間の移動に要する時間は５００秒と見積もることができる。また、往路、復路にかかる時間が約１秒に短縮できた場合、高温・低温領域間の移動に要する時間は１００秒と見積もることができ、相当の時間の短縮を期待できる。
　従って、制御系や各ドライバの制約の中で、試料２０の移動速度ｖを大きくすることが求められ、当然のことながら安定した移動速度ｖを発揮することも求められる。通過時間ｔｐは試料２０の移動速度ｖとは反比例の関係にあるので、通過時間ｔｐは小さく且つ一定となることが望ましいことになる。通過時間ｔｐは試料２０の移動に際して蛍光信号グラフから逐次算出することができ、また通過時間ｔｐはポンプ印加電圧Ｅの増減に依存するので、通過時間ｔｐの目標値（目標通過時間）を定め、Ｐ制御、ＰＩ制御又はＰＩＤ制御等の公知の制御方法に従ってポンプ電圧Ｅを変化させることによって、試料２０の通過時間ｔｐを目標通過時間に近づけ、かつ維持することができる。
　本発明のさらに別の実施形態に係る反応処理装置においては、ＰＩＤ制御等のほか、単純に試料２０の蛍光検出領域６５の通過時間ｔｐと目標通過時間の差に応じて、ポンプ電圧Ｅの増減を定めるようなテーブルを予めＣＰＵ３６が備えていてもよい。テーブルの一例を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すテーブルでは、例示として、基準のポンプ電圧Ｅを１２．５Ｖとした場合に、試料２０の通過時間ｔｐが表４の左列に示す範囲に該当したとき、それに対応する調整電圧ΔＥを、次回のサイクルにおけるポンプ電圧Ｅに加えるものとしている。ここでは目標通過時間は０．５秒～０．６秒とした。反応処理装置に必然的に求められる性能として、通過時間ｔｐは小さい（移動速度ｖは大きい）ほうが好ましいが、あまりに通過時間ｔｐが小さすぎると各ドライバの時定数等の制約により不適切な場合が生じる。本実施形態においては、例示として蛍光検出器ドライバからの蛍光信号の送信が０．０１秒ごと（１００Ｈｚ）であり、ＣＰＵ３６による蛍光信号のデータの評価等に基づく時定数もあるため、小さすぎる目標通過時間の設定は意味がなく、ｔｃの２～１０倍程度とした。
　また、試料２０は水溶液であるので温度によってその粘度が変わる。例えば高温においては粘度が小さくなり流路内を流れやすくなる。従って、試料２０が低温領域から高温領域に移動する場合と、高温領域から低温領域に移動する場合とでは、試料２０の移動の条件が異なる。そこで、試料２０の通過時間ｔｐをできるだけ一定にするためには、試料２０の移動方向に応じて制御を別々にすることが望ましい。
　本発明のさらに別の実施形態に係る反応処理装置においては、試料２０が低温領域から高温領域に移動するときには、前サイクルにおける低温領域から高温領域への第１通過時間ｔｐ１に基づいて、図２におけるポンプ４０（加圧または送風により試料２０を低温領域から高温領域に移動させるポンプ）のポンプ電圧Ｅを変化させることによって、第１通過時間ｔｐ１を目標通過時間に収束させるようにする。一方、試料２０が高温領域から低温領域に移動するときには、高温領域から低温領域への第２通過時間ｔｐ２に基づいて、ポンプ３９（同、試料２０を高温領域から低温領域に移動させるポンプ）のポンプ電圧Ｅを変化させることによって、第２通過時間ｔｐ２を目標通過時間に収束させるようにする。さらに、このような制御を行うことにより、いずれの通過時間も目標通過時間により早く到達させることが可能となる。
　図８は、表４のテーブルに則って試料２０の第１通過時間ｔｐ１および第２通過時間ｔｐ２を制御した実験結果を示す。目標停止位置についてはそれらの対応する距離について、高温領域側及び低温領域側の目標停止位置に対応する距離をそれぞれＸ０１及びＸ０２として、Ｘ０１＝Ｘ０２＝３０ｍｍとした。図８の横軸はサーマルサイクルのサイクル数を表し、縦軸は通過時間を表す。通過時間ｔｐは、試料２０の移動速度ｖとは反比例の関係にある。図８から、目標とすべき第１通過時間ｔｐ１および第２通過時間ｔｐ２が目標通過時間（０．５秒～０．６秒）に収束するように制御できていることが分かる。
　上記の実施形態においては、第１通過時間ｔｐ１および第２通過時間ｔｐ２の目標値が同じ範囲内になるように制御し、結果的にほぼ同じ通過時間によって試料２０の往復移動がなされること確認した。しかしながら、第１通過時間ｔｐ１と第２通過時間ｔｐ２の目標通過時間に差があるように制御し、結果的に第１通過時間ｔｐ１と第２通過時間ｔｐ２とが異なるように試料２０の往復移動がなされてもよい。例えば試料２０のより粘度が大きい低温から高温領域への移動において流路１２の内壁等に通過後に残渣が生じる傾向があるときなどは、低温から高温領域への移動に係る第１通過時間ｔｐ１を第２通過時間ｔｐ２より大きく設定し試料２０を比較的ゆっくり移動させることによって、このような不具合を解消するような効果も考えられる。
また、試料２０の、低温領域から高温領域および高温領域から低温領域に移動する際の移動速度をそれぞれｖ１およびｖ２とし、試料２０の流路内の長さをＬとして、第１通過時間ｔｐ１と第２通過時間ｔｐ２からｖ１＝Ｌ／ｔｐ１、ｖ２＝Ｌ／ｔｐ２と算出することができる。これから試料２０の移動速度を低温領域から高温領域、高温領域から低温領域への移動について、それぞれ独立の移動速度を制御に用いることができる。
具体的には、本発明の別の実施形態に係る反応処理装置は、試料２０が低温から高温領域に移動するときの待機時間を第１待機時間ｔｄ２/１とし、試料２０が高温から低温領域に移動するときの待機時間を第２待機時間ｔｄ２/２としたとき、第２待機時間ｔｄ２/２を第１待機時間ｔｄ２/１とは独立して設定することを特徴とするものである。
第１待機時間ｔｄ２/１と第２待機時間ｔｄ２/２の算出方法は、これに限られないが、（６）式に基づいて、第１待機時間ｔｄ２/１および第２待機時間ｔｄ２/２について別個に算出してもよく、第１待機時間ｔｄ２/１および第２待機時間ｔｄ２/２は、以下の（８）および（９）式のように算出し、これらの待機時間に基づいて反応処理装置を制御することを特徴とする。
　ｔｄ２/１＝Ｘ０１／ｖ１－ｔＣ　・・・（８）
　ｔｄ２/２＝Ｘ０２／ｖ２－ｔＣ　・・・（９）
以上のような実施形態に係る反応処理装置によれば、高温領域と低温領域とを繰り返して往復する試料２０の温度差に起因する移動速度の違いに対応して、より正確に各温度領域の適切な位置に試料２０を停止させることが可能である。
一方で、蛍光検出領域は、高温領域と低温領域とを接続する接続流路に設けられているので、試料２０が低温から高温領域に移動する場合、蛍光検出領域付近を移動する試料２０の温度より、高温領域に進入して移動する試料２０の温度のほうが高くなるため、高温領域内を移動する試料２０の粘度が低くなる。そうすると高温領域を移動する試料２０の移動速度は、接続領域内の蛍光検出領域６５付近を移動する試料２０の速度より大きくなる。試料２０を目標停止位置に停止させるために設定される待機時間の検討要素の一つである試料２０の移動速度は、蛍光検出領域を通過する試料２０の通過時間に基づいて決定されるので、高温領域において予め設定した目標停止位置より行き過ぎた位置に試料２０が停止する場合がある。逆に、試料２０が高温から低温領域に移動する場合は、低温領域において、予め設定した目標停止位置に達しない位置に試料２０が停止する場合がある。したがって試料２０が低温から高温領域に移動したときの停止位置と、高温から低温領域に移動したときの停止位置とに差が生じることになる。
本発明のさらに別の実施形態に係る反応処理装置は、上記のように低温領域から高温領域および高温領域から低温領域への移動に係る一つの行程内においても試料２０の移動速度が異なることから、移動速度に対する補正係数を導入し、第１待機時間ｔｄ２/１および第２待機時間ｔｄ２/２を算出することを特徴とする。具体的には試料２０の移動速度ｖ１およびｖ２とそれらの補正係数ｆおよびｇとのそれぞれの積を、（８）および（９）式に適用して、次の（１０）および（１１）式に基づいて第１待機時間ｔｄ２/１および第２待機時間ｔｄ２/２を算出して、これらの待機時間に基づいて反応処理装置を制御することを特徴とする。
また、試料２０が低温から高温領域に移動する場合には、高温領域を移動する試料２０の速度が接続領域内の蛍光検出領域６５付近を移動する試料２０の速度より大きくなること、および試料２０が高温から低温領域に移動する場合には、低温領域を移動する試料２０の速度が接続領域内の蛍光検出領域６５付近を移動する試料２０の速度より小さくなることから、１＜ｆおよび／またはｇ＜１として第１待機時間ｔｄ２/１および第２待機時間ｔｄ２/２を算出して、これらの待機時間に基づいて反応処理装置を制御することを特徴とする。
ｔｄ２/１＝Ｘ０１／（ｆ×ｖ１）－ｔＣ　・・・（１０）
　ｔｄ２/２＝Ｘ０２／（ｇ×ｖ２）－ｔＣ　・・・（１１）
　また、本発明のさらに別の実施形態に係る反応処理装置は、移動速度に対する補正係数を導入する代わりに、高温領域側および低温領域側の目標停止位置に対応する距離Ｘ０１およびＸ０２に対する補正係数を導入し、第１待機時間ｔｄ２/１および第２待機時間ｔｄ２/２を算出することを特徴とする。移動速度は試料２０が蛍光検出領域６５を通過する毎に算出されるので上記のように都度補正係数を考慮して第１待機時間ｔｄ２/１および第２待機時間ｔｄ２/２を算出するのは煩わしい場合があるが、目標停止位置は装置等に固有の距離で表されるので、反応処理前に一旦補正係数を考慮しておけばこのような煩わしさを除外できる場合があるが、いずれの場合も当業者が適宜選択できるものである。
　具体的には、高温領域側および低温領域側の目標停止位置に対応する距離Ｘ０１およびＸ０２と、それらに対する補正係数ｋおよびｈとのそれぞれの積を、（８）および（９）式に適用して、次の（１２）および（１３）式に基づいて、第１待機時間ｔｄ２/１および第２待機時間ｔｄ２/２を算出して、これらの待機時間に基づいて反応処理装置を制御することを特徴とするものである。
　また、試料２０が低温から高温領域に移動する場合には、高温領域を移動する試料２０の速度が接続領域内の蛍光検出領域６５付近を移動する試料２０の速度より大きくなることから、試料２０が目標停止位置に対応するＸ０１よりも行き過ぎて停止してしまう傾向があること、および試料２０が高温から低温領域に移動する場合には、低温領域を移動する試料２０の速度が接続領域内の蛍光検出領域６５付近を移動する試料２０の速度より小さくなることから、試料２０が目標停止位置に対応するＸ０２よりも手前に停止してしまう傾向があることなどから、ｋ＜１および／または１＜ｈとして第１待機時間ｔｄ２/１および第２待機時間ｔｄ２/２を算出して、これらの待機時間に基づいて反応処理装置を制御することを特徴とする。
ｔｄ２/１＝（ｋ×Ｘ０１）／ｖ１－ｔＣ　・・・（１２）
　ｔｄ２/２＝（ｈ×Ｘ０２）／ｖ２－ｔＣ　・・・（１３）
　以上のような実施形態に係る反応処理装置によれば、蛍光検出領域６５と高温領域における流路１２内の試料２０の移動速度とが異なる場合または蛍光検出領域６５と低温領域における流路１２内の試料２０の移動速度とが異なる場合であっても、試料２０の停止位置を補正することが可能であり、さらに正確に各温度領域の適切な位置に試料２０を停止させることが可能である。
　一方で、試料２０が最初に移動する場合は、流路１２が試料溶液で濡れておらず乾燥しているので、例えば最初に低温領域から高温領域に移動する場合と、２回目以降に低温領域から高温領域に移動する場合とでは、流路１２の環境が異なる。従って、低温領域から高温領域への２回目の移動のときには、前回（１回目）の移動に要する通過時間ｔｐに基づいてポンプ電圧Ｅを調整しなくてもよい（基準のポンプ電圧Ｅ（例えばＥ＝１２．５Ｖ）で動作）。
　より具体的には、試料２０が低温又は高温領域にある状態を、サイクル数をｎ（ｎは整数）として「低温（ｎ）」、「高温（ｎ）」と表した場合、「低温（０）→高温（０）→低温（１）→高温（１）→低温（２）→高温（２）→低温（３）→高温（３）→・・・低温（ｎ）→高温（ｎ）→・・・」のサイクルを仮定したとき、低温（０）→高温（０）→低温（１）→高温（１）の３個の移動においては、基準のポンプ電圧Ｅ＝１２．５Ｖでポンプを動作させ、高温（１）→低温（２）の移動については高温（０）→低温（１）の移動に要した通過時間ｔｐ２に対応する調整電圧ΔＥを加え、低温（２）→高温（２）の移動については低温（１）→高温（１）の移動に要した通過時間ｔｐ１に対応する調整電圧ΔＥを加えてもよい。一般的にはｎを１以上の整数として、高温（ｎ）→低温（ｎ＋１）の移動は高温（ｎ－１）→低温（ｎ）の移動に要した通過時間ｔｐ２に対応する調整電圧ΔＥを、低温（ｎ＋１）→高温（ｎ＋１）の移動は低温（ｎ）→高温（ｎ）の移動に要した通過時間ｔｐ１に対応する調整電圧ΔＥを加えてもよい。逆に「高温（０）→低温（０）→高温（１）→低温（１）→高温（２）→低温（２）→高温（３）→低温（３）→・・・高温（ｎ）→低温（ｎ）→・・・」のサイクルを仮定したとき、高温（０）→低温（０）→高温（１）→低温（１）の３個の移動においては、基準のポンプ電圧Ｅ＝１２．５Ｖでポンプを動作させ、低温（１）→高温（２）の移動については低温（０）→高温（１）の移動に要した通過時間ｔｐ１に対応する調整電圧ΔＥを加え、高温（２）→低温（２）の移動については高温（１）→低温（１）の移動に要した通過時間ｔｐ２に対応する調整電圧ΔＥを加えてもよい。一般的には、ｎを１以上の整数として、低温（ｎ）→高温（ｎ＋１）の移動については、低温（ｎ－１）→高温（ｎ）の移動に要した通過時間ｔｐ１に対応する調整電圧ΔＥを、高温（ｎ＋１）→低温（ｎ＋１）の移動については、高温（ｎ）→低温（ｎ）の移動に要した通過時間ｔｐ２に対応する調整電圧ΔＥを加えてもよい。
　このような実施形態に係る反応処理装置によれば、低温から高温領域に移動するときには低温から高温領域に移動するときの第１通過時間ｔｐ１に基づいてポンプ４０が制御され、高温から低温領域に移動するときには高温から低温領域に移動するときの第２通過時間ｔｐ２に基づいてポンプ３９が制御されることにより、それぞれの移動に供される試料２０の温度や粘度に適した制御を行うことができ、迅速かつ複雑な機構を必要とせずに、適切な目標通過時間ひいては目標移動速度に到達することが可能となり、状況に応じて異なる第１通過時間ｔｐ１と第２通過時間ｔｐ２を設定することも可能である。さらに、サーマルサイクルの開始から１．５往復分の移動については制御をしないことによって、初期状態の流路１２の濡れ性や乾燥等の影響により条件が大きく異なる環境下での通過時間を制御のパラメータから外すことができ、より正確かつ迅速に目標通過時間に到達できる。
　以上説明したように、上記一連の実施形態に係る反応処理装置３０によれば、試料２０の蛍光検出領域６５の通過が検出された時刻から、上記の（６）式～（１３）式で規定される待機時間ｔｄ２（または第１待機時間ｔｄ２/１および第２待機時間ｔｄ２/２）が経過したとき、送液システム３７の第１ポンプドライバ４１および第２ポンプドライバ４２に試料２０の停止を指示することにより、試料２０を温度領域の所定の位置に正確に停止させることができる。さらにこれらの実施形態に係る反応処理装置３０によれば、様々な物性値の変動により試料２０の移動速度ｖがばらついても、常に所定の位置に試料を停止することができるので、安定したＰＣＲを行うことができる。
　また、これらの実施形態に係る反応処理装置３０では、リアルタイムＰＣＲの進度管理を担う蛍光検出器５０を、試料２０の位置決めの手段として援用することにより、これ以外の光学測定系を加える必要がないので、装置の小型化に貢献するとともに、装置の製造コストの低減を図ることが可能である。
　以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
　１０　反応処理容器、　１２　流路、　１４　基板、　１７　第１連通口、　１８　第２連通口、　２０　試料、　３０　反応処理装置、　３２　温度制御システム、　３３　高温用ヒータドライバ、　３５　低温用ヒータドライバ、　３６　ＣＰＵ、　３７　送液システム、　３９　第１ポンプ、　４０　第２ポンプ、　４１　第１ポンプドライバ、　４２　第２ポンプドライバ、　４３　第１チューブ、　４４　第２チューブ、　４５，４６　パッキン、　５０　蛍光検出器、　５１　光学ヘッド、　５２　蛍光検出器ドライバ、　５３　光ファイバ、　６０　高温用ヒータ、　６２　低温用ヒータ、　６５　蛍光検出領域。
　本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に利用できる。

Claims (11)

  1. 　試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、
    　前記試料を前記流路内で移動および停止させる送液手段と、
    　前記流路に、第１温度に維持された第１温度領域と、前記第１温度よりも低い第２温度に維持された第２温度領域を提供する温度制御手段と、
    　前記流路の前記第１温度領域と前記第２温度領域の間に設定された検出領域を通過する試料を検出する検出手段と、
    　前記検出手段によって検出された信号に基づいて、前記送液手段を制御する制御手段と、
    　を備える反応処理装置であって、
    　前記試料が前記第２温度領域から前記第１温度領域に移動するとき、前記制御手段は、前記検出手段により前記試料の前記検出領域の通過が検出された時刻から、所定の第１待機時間が経過したとき、前記送液手段に前記試料の停止を指示し、
    　前記試料が前記第１温度領域から前記第２温度領域に移動するとき、前記制御手段は、前記検出手段により前記試料の前記検出領域の通過が検出された時刻から、第１待機時間とは独立して設定された所定の第２待機時間が経過したとき、前記送液手段に前記試料の停止を指示することを特徴とする反応処理装置。
  2. 　前記試料が前記第２温度領域から前記第１温度領域に移動するとき、前記試料の前記検出領域における移動速度を第１移動速度ｖ１とし、前記流路内の所定の位置に停止する前記試料の最も前記検出領域に近い端部と、前記検出領域の中心との距離をＸ０１とし、
    前記試料が前記第１温度領域から前記第２温度領域に移動するとき、前記試料の前記検出領域における移動速度を第２移動速度ｖ２とし、前記流路内の所定の位置に停止する前記試料の最も前記検出領域に近い端部と、前記検出領域の中心との距離をＸ０２とし、
    　当該反応処理装置に固有の一定の時間をｔＣとしたときに、
    　第１待機時間ｔｄ２/１は下記の式：
    　ｔｄ２/１＝Ｘ０１／ｖ１－ｔＣ
    　で規定され、
    　第２待機時間ｔｄ２/２は下記の式：
    　ｔｄ２/２＝Ｘ０２／ｖ２－ｔＣ
    　で規定されることを特徴とする請求項１に記載の反応処理装置。
  3. 　前記試料が前記第２温度領域から前記第１温度領域に移動するとき、前記試料の前記検出領域における移動速度を第１移動速度ｖ１とし、前記流路内の所定の位置に停止する前記試料の最も前記検出領域に近い端部と、前記検出領域の中心との距離をＸ０１とし、
    前記試料が前記第１温度領域から前記第２温度領域に移動するとき、前記試料の前記検出領域における移動速度を第２移動速度ｖ２とし、前記流路内の所定の位置に停止する前記試料の最も前記検出領域に近い端部と、前記検出領域の中心との距離をＸ０２とし、
    　当該反応処理装置に固有の一定の時間をｔＣとし、αおよびβを補正係数としたときに、
    　第１待機時間ｔｄ２/１は下記の式：
    　ｔｄ２/１＝α×（Ｘ０１／ｖ１）－ｔＣ
    　で規定され、
    　第２待機時間ｔｄ２/２は下記の式：
    　ｔｄ２/２＝β×（Ｘ０２／ｖ２）－ｔＣ
    　で規定されることを特徴とする請求項１に記載の反応処理装置。
  4. 　α＜１および／または１＜βであることを特徴とする請求項３に記載の反応処理装置。
  5. 　ｔＣは、前記試料が検出領域を実際に通過した時刻と、前記試料が検出領域を通過したことを前記検出手段が検出した時刻との差に相当する時間であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の反応処理装置。
  6. 　前記試料は、ＤＮＡと、ＰＣＲ試薬と、蛍光を発する試薬を含み、
    　前記検出手段は、前記試料から発せられる蛍光を検出する蛍光検出器を含み、
    　前記試料が前記第２温度領域から前記第１温度領域に移動するときの前記試料の前記検出領域を通過する時間を第１通過時間ｔｐ１とし、
    　前記試料が前記第１温度領域から前記第２温度領域に移動するときの前記試料の前記検出領域を通過する時間を第２通過時間ｔｐ２としたとき、
    　前記制御手段は、前記蛍光検出器からの信号または当該信号に対して所定の演算処理をした値と、所定の閾値とに基づいて、第１通過時間ｔｐ１および第２通過時間ｔｐ２を求め、
    　前記制御手段は、第１通過時間ｔｐ１と試料の長さＬとから、第１移動速度ｖ１＝Ｌ／ｔｐ１、および第２通過時間ｔｐ２と試料の長さＬとから、第２移動速度ｖ２＝Ｌ／ｔｐ２を演算することを特徴とする請求項２から５のいずれかに記載の反応処理装置。
  7. 　前記制御手段は、前記試料の反応の進捗に応じて、前記閾値を変化させることを特徴とする請求項６に記載の反応処理装置。
  8. 　前記制御手段は、前記第１通過時間ｔｐ１および前記第２通過時間ｔｐ２が所定の目標通過時間となるよう前記送液手段を制御することを特徴とする請求項６または７に記載の反応処理装置。
  9. 　試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、
    　前記試料を前記流路内で移動および停止させる送液手段と、
    　前記流路に、第１温度に維持された第１温度領域と、前記第１温度よりも低い第２温度に維持された第２温度領域を提供する温度制御手段と、
    　前記流路の前記第１温度領域と前記第２温度領域の間に設定された検出領域を通過する試料を検出する検出手段と、
    　を備える反応処理装置の制御方法であって、
    　前記試料が前記第２温度領域から前記第１温度領域に移動するとき、前記検出手段により前記試料の前記検出領域の通過が検出された時刻から、所定の第１待機時間が経過したとき、前記送液手段に前記試料の停止を指示することと、
    　前記試料が前記第１温度領域から前記第２温度領域に移動するとき、前記検出手段により前記試料の前記検出領域の通過が検出された時刻から、第１待機時間とは独立して設定された所定の第２待機時間が経過したとき、前記送液手段に前記試料の停止を指示することと、
    　を備えることを特徴とする反応処理装置の制御方法。
  10. 　前記試料が前記第２温度領域から前記第１温度領域に移動するとき、前記試料の前記検出領域における移動速度を第１移動速度ｖ１とし、前記流路内の所定の位置に停止する前記試料の最も前記検出領域に近い端部と、前記検出領域の中心との距離をＸ０１とし、
    前記試料が前記第１温度領域から前記第２温度領域に移動するとき、前記試料の前記検出領域における移動速度を第２移動速度ｖ２とし、前記流路内の所定の位置に停止する前記試料の最も前記検出領域に近い端部と、前記検出領域の中心との距離をＸ０２とし、
    　当該反応処理装置に固有の一定の時間をｔＣとしたときに、
    　第１待機時間ｔｄ２/１は下記の式：
    　ｔｄ２/１＝Ｘ０１／ｖ１－ｔＣ
    　で規定され、
    　第２待機時間ｔｄ２/２は下記の式：
    　ｔｄ２/２＝Ｘ０２／ｖ２－ｔＣ
    　で規定されることを特徴とする請求項９に記載の反応処理装置の制御方法。
  11. 　前記試料が前記第２温度領域から前記第１温度領域に移動するとき、前記試料の前記検出領域における移動速度を第１移動速度ｖ１とし、前記流路内の所定の位置に停止する前記試料の最も前記検出領域に近い端部と、前記検出領域の中心との距離をＸ０１とし、
    前記試料が前記第１温度領域から前記第２温度領域に移動するとき、前記試料の前記検出領域における移動速度を第２移動速度ｖ２とし、前記流路内の所定の位置に停止する前記試料の最も前記検出領域に近い端部と、前記検出領域の中心との距離をＸ０２とし、
    　当該反応処理装置に固有の一定の時間をｔＣとし、
    αおよびβを補正係数としたときに、
    　第１待機時間ｔｄ２/１は下記の式：
    　ｔｄ２/１＝α×（Ｘ０１／ｖ１）－ｔＣ
    　で規定され、
    　第２待機時間ｔｄ２/２は下記の式：
    　ｔｄ２/２＝β×（Ｘ０２／ｖ２）－ｔＣ
    　で規定されることを特徴とする請求項９に記載の反応処理装置の制御方法。
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