JP6584373B2

JP6584373B2 - 反応処理装置および反応処理方法

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Publication number: JP6584373B2
Application number: JP2016151287A
Authority: JP
Inventors: 福澤　隆; 隆福澤
Original assignee: Nippon Sheet Glass Co Ltd
Current assignee: Nippon Sheet Glass Co Ltd
Priority date: 2016-08-01
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2019-10-02
Anticipated expiration: 2036-08-01
Also published as: JP2018019606A

Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）に使用される反応処理装置およびその反応処理方法に関する。

遺伝子検査は、各種医学分野における検査、農作物や病原性微生物の同定、食品の安全性評価、さらには病原性ウィルスや各種感染症の検査にも広く活用されている。遺伝子である微小量のＤＮＡを高感度に検出するために、ＤＮＡの一部を増幅して得られたものを分析する方法が知られている。中でもＰＣＲは、生体等から採取されたごく微量のＤＮＡのある部分を選択的に増幅する注目の技術である。

ＰＣＲは、ＤＮＡを含む生体サンプルと、プライマーや酵素などからなるＰＣＲ試薬とを混合した試料に、所定のサーマルサイクルを与え、変性、アニーリングおよび伸長反応を繰り返し起こさせて、ＤＮＡの特定の部分を選択的に増幅させるものである。

ＰＣＲにおいては、対象の試料をＰＣＲチューブ又は複数の穴が形成されたマイクロプレート（マイクロウェル）などの反応処理容器に所定量入れて行うことが一般的であるが、近年、基板に形成された微細な流路を備える反応処理容器（チップとも呼ばれる）を用いて行うことが実用化されてきている（例えば特許文献１）。

特開２００９−２３２７００号公報

ＰＣＲに用いられる反応処理容器には、試料にサーマルサイクルを与えるためのサーマルサイクル領域と、所定量の試料を分注するための分注領域とを備える流路が形成されているものがある。分注領域には、所定量の試料を規定するための分注流路と、分注流路から分岐する支流路と、支流路の端に配置された試料導入口とが形成される。分注領域の分注流路に充填された試料はサーマルサイクル領域に移動されてＰＣＲに供されるが、支流路に試料が残留している可能性がある。

試料のサーマルサイクル中には、ヒータにより流路のサーマルサイクル領域が加熱されているが、このサーマルサイクル領域に与えられている熱量が、分注領域に伝達する可能性がある。サーマルサイクル領域から伝達された熱量により、試料導入口に存在する空気が温度上昇して膨張すると、支流路の残留試料が膨張した空気により流路に押し出される可能性がある。すなわち、流路には、分注されたＰＣＲに供される試料（「主試料」と称する）と、残留試料とが離間して存在することとなる。このように流路に主試料と残留試料とが離間して存在している場合、流路内を加圧しても推進力が主試料に好適に作用せず、主試料の移動を適切に行うことができない可能性がある。このように主試料の移動を適切に行うことができないと、安定したＰＣＲを行うことができない可能性がある。

本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、試料の移動を適切に行って、安定したＰＣＲを行うことができる技術を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明のある態様の反応処理装置は、試料にサーマルサイクルを与えるためのサーマルサイクル領域と、所定量の試料を分注するための分注領域とを備える流路が形成された反応処理容器であって、分注領域が、所定量の試料を規定するための分注流路と、分注流路と連通する試料導入口とを備える反応処理容器と、試料を流路内で移動および停止させる送液手段と、サーマルサイクル領域および分注領域の温度を制御する温度制御手段とを備える。温度制御手段は、試料にサーマルサイクルを与えているときの試料導入口付近の温度である動作時温度が、分注領域に試料が導入されているときの試料導入口付近の温度である初期温度よりも低くなるよう、分注領域の温度を制御する。

初期温度は、室温よりも高い温度に設定されてもよい。

サーマルサイクル領域と分注領域は、隣接して配置されてもよい。

分注領域は、分注流路から分岐する支流路をさらに備えてもよい。試料導入口は、支流路の端に配置されてもよい。

支流路は、分注流路から分岐する第１支流路および第２支流路を含んでもよい。試料導入口は、第１支流路の端に配置された第１試料導入口と、第２支流路の端に配置された第２試料導入口とを含んでもよい。

本発明の別の態様は、反応処理方法である。この方法は、試料にサーマルサイクルを与えるためのサーマルサイクル領域と、所定量の試料を分注するための分注領域とを備える流路が形成された反応処理容器であって、分注領域が、所定量の試料を規定するための分注流路と、分注流路と連通する試料導入口とを備える反応処理容器を準備するステップと、試料導入口から分注流路内に試料を導入するステップと、反応処理容器を反応処理装置にセットするステップと、試料にサーマルサイクルを与えているときの試料導入口付近の温度である動作時温度が、分注領域に試料が導入されているときの試料導入口付近の温度である初期温度よりも低くなるよう、分注領域の温度を制御するステップと、流路内の圧力を制御することで、サーマルサイクル領域内で試料を移動させるステップとを備える。

温度を制御するステップにおいて、初期温度は、室温よりも高い温度に設定されてもよい。

本発明のさらに別の態様は、分注方法である。この方法は、試料にサーマルサイクルを与えるためのサーマルサイクル領域と、所定量の試料を分注するための分注領域とを備える流路が形成された反応処理容器であって、分注領域が、所定量の試料を規定するための分注流路と、分注流路と連通する試料導入口とを備える反応処理容器を準備するステップと、試料導入口から分注流路内に試料を導入するステップとを備える。

試料を導入するステップの後、試料導入口を封止するステップをさらに備えてもよい。

本発明によれば、試料の移動を適切に行って、安定したＰＣＲを行うことができる。

図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器を説明するための図である。図１（ａ）に示す反応処理容器のＡ−Ａ断面図である。図１（ａ）に示す反応処理容器のＢ−Ｂ断面図である。反応処理容器が備える基板の平面図である。試料が反応処理容器内に導入された様子を模式的に示す図である。反応処理容器の変形例を説明するための図である。本発明の実施形態に係る反応処理装置を説明するための模式図である。本実施形態に係る反応処理装置で解決すべき課題を説明するための図である。本発明の別の実施形態に係る反応処理容器を説明するための図である。

以下、本発明の実施形態に係る反応処理装置について説明する。この反応処理装置は、ＰＣＲを行うための装置である。各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。

図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器１０を説明するための図である。図１（ａ）は、反応処理容器１０の平面図であり、図１（ｂ）は、反応処理容器１０の正面図である。図２は、図１（ａ）に示す反応処理容器１０のＡ−Ａ断面図である。図３は、図１（ａ）に示す反応処理容器１０のＢ−Ｂ断面図である。図４は、反応処理容器１０が備える基板１４の平面図である。

反応処理容器１０は、下面１４ａに溝状の流路１２が形成された樹脂性の基板１４と、基板１４の下面１４ａ上に貼られた、流路１２を封止するための流路封止フィルム１６と、基板１４の上面１４ｂ上に貼られた２枚の封止フィルム（第１封止フィルム１８および第２封止フィルム２０）とから成る。

基板１４は、温度変化に対して安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１４は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自家蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス、シリコン（Ｓｉ）等の無機材料をはじめ、アクリル、ポリエステル、シリコーンなどの樹脂、中でもシクロオレフィンポリマー樹脂（ＣＯＰ）が好適である。基板１４の寸法の一例は、長辺７６ｍｍ、短辺２６ｍｍ、厚み４ｍｍである。

基板１４の下面１４ａには溝状の流路１２が形成されている。本実施形態に係る反応処理容器１０において、流路１２の大部分は基板１４の下面１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１４の下面１４ａ上に流路封止フィルム１６が貼られる。流路１２の寸法の一例は、幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍである。

流路封止フィルム１６は、一方の主面が粘着性を備えていてもよいし、押圧や紫外線などのエネルギー照射、加熱等により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１４の下面１４ａと密着して一体化できる機能を備える。流路封止フィルム１６は、粘着剤も含めて低い自家蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィンポリマー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、流路封止フィルム１６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、反応処理容器１０の反りや変形防止に役立つ。

基板１４における流路１２の一端１２ａの位置には、第１空気連通口２４が形成されている。基板１４における流路１２の他端１２ｂの位置には、第２空気連通口２６が形成されている。一対の第１空気連通口２４および第２空気連通口２６は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。

基板１４中における第１空気連通口２４と流路１２の一端１２ａとの間には、第１フィルタ２８が設けられている。基板１４中における第２空気連通口２６と流路１２の他端１２ｂとの間には、第２フィルタ３０が設けられている。流路１２の両端に設けられた一対の第１フィルタ２８および第２フィルタ３０は、低不純物特性が良好であるほか、空気のみを通し、ＰＣＲによって目的のＤＮＡの増幅やその検出を妨げないように、または目的のＤＮＡの品質が劣化しないようにコンタミネーションを防止する。フィルタ材料としては、例としてポリエチレンを撥水処理したものを用いることができるが、上記の機能を備えるようなものであれば公知の材料から選択できる。第１フィルタ２８および第２フィルタ３０の寸法は、基板１４に形成されたフィルタ設置スペースに隙間なく収まるような寸法に形成され、例えば直径４ｍｍ、厚さ２ｍｍであってよい。

図１（ａ）に示すように、流路１２は、試料にサーマルサイクルを与えるためのサーマルサイクル領域３２と、所定量の試料を抽出する所謂分注を行うための分注領域３４とを備える。サーマルサイクル領域３２は、流路１２における第１空気連通口２４側に位置している。分注領域３４は、流路１２における第２空気連通口２６側に位置している。サーマルサイクル領域３２と分注領域３４は連通している。分注領域３４で分注した試料をサーマルサイクル領域３２に移動させて、サーマルサイクル領域３２に含まれる所定の温度に維持された反応領域間を連続的に往復移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる。

流路１２のサーマルサイクル領域３２は、後述の反応処理装置に反応処理容器１０が搭載された際に、比較的高温（約９５℃）に設定される反応領域（以下「高温領域３６」と称する）と、それより低温（約５５℃）に設定される反応領域（以下、「中温領域３８」と称する）と、高温領域３６と中温領域３８を接続する接続領域４０とを含む。高温領域３６は第１空気連通口２４側に位置しており、中温領域３８は第２空気連通口２６側（言い換えると分注領域３４側）に位置している。

高温領域３６および中温領域３８はそれぞれ、曲線部と直線部とを組み合わせた連続的に折り返す蛇行状の流路を含んでいる。このように蛇行状の流路とした場合、後述の温度制御手段を構成するヒータ等の限られた実効面積を有効に使うことができ、反応領域内での温度のばらつきを低減することが容易であるとともに、反応処理容器の実体的な大きさを小さくでき、反応処理装置の小型化に貢献できるという利点がある。接続領域４０は、直線状の流路であってよい。

流路１２の分注領域３４は、サーマルサイクル領域３２の中温領域３８と第２フィルタ３０との間に位置している。上述したように、分注領域３４は、ＰＣＲに供される所定量の試料を抽出する分注機能を有する。分注領域３４は、所定量の試料を規定するための分注流路４２と、分注流路４２から分岐する２つの支流路（第１支流路４３および第２支流路４４）と、第１支流路４３の端に配置された第１試料導入口４５と、第２支流路４４の端に配置された第２試料導入口４６とを備える。第１試料導入口４５は、第１支流路４３を介して分注流路４２と連通している。第２試料導入口４６は、第２支流路４４を介して分注流路４２と連通している。分注流路４２は、最小限の面積で所定量の試料を分注するために蛇行状の流路とされている。第１試料導入口４５および第２試料導入口４６は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。第１試料導入口４５は比較的小径に形成され、第２試料導入口４６は比較的大径に形成されている。第１支流路４３が分注流路４２から分岐する分岐点を第１分岐点４３１とし、第２支流路４４が分注流路４２から分岐する分岐点を第２分岐点４４１としたとき、ＰＣＲに供される試料の体積は第１分岐点４３１と第２分岐点４４１の間の分注流路４２内の体積によって決まる。

本実施形態においては、サーマルサイクル領域３２と第２フィルタ３０との間に分注領域３４を設けたが、分注領域３４の位置はこれに限定されず、サーマルサイクル領域３２と第１フィルタ２８の間に設けられてもよい。

第１空気連通口２４、第２空気連通口２６、第１フィルタ２８、第２フィルタ３０、第１試料導入口４５および第２試料導入口４６は、基板１４の上面１４ｂに露出している。そこで、第１空気連通口２４、第２空気連通口２６、第１フィルタ２８および第２フィルタ３０を封止するために第１封止フィルム１８が基板１４の上面１４ｂに貼り付けられる。第１試料導入口４５および第２試料導入口４６を封止するために第２封止フィルム２０が基板１４の上面１４ｂに貼り付けられる。第１封止フィルム１８および第２封止フィルム２０を貼った状態では、全流路は閉空間となっている。

第１封止フィルム１８は、第１空気連通口２４、第２空気連通口２６、第１フィルタ２８および第２フィルタ３０を同時に封止可能なサイズのものが用いられる。第１空気連通口２４、第２空気連通口２６への加圧式ポンプ（後述する）の接続は、ポンプ先端に備わった中空のニードル（先端がとがった注射針）で第１空気連通口２４、第２空気連通口２６に穿孔することにより行う。そのため、第１封止フィルム１８は、ニードルによる穿孔が容易な材質や厚みから成るフィルムが好ましい。本実施形態では、第１空気連通口２４、第２空気連通口２６、第１フィルタ２８および第２フィルタ３０を同時に封止するサイズの封止フィルムについて記載したが、これらを別個に封止する態様でもよい。また、第１空気連通口２４、第２空気連通口２６を封止しているフィルムを剥がして加圧式ポンプと接続してもよい。

第２封止フィルム２０は、第１試料導入口４５および第２試料導入口４６を封止可能なサイズのものが用いられる。第１試料導入口４５および第２試料導入口４６を通じての試料の流路１２内への導入は、第２封止フィルム２０を一旦、基板１４から剥がして行い、所定量の試料の導入後には第２封止フィルム２０を再び基板１４の上面１４ｂに戻し貼り付ける。そのため、第２封止フィルム２０としては、数サイクルの貼り付け／剥がしに耐久するような粘着性を備えるフィルムが望ましい。また第２封止フィルム２０は、試料導入後には新しいフィルムを貼り付ける態様であってもよく、この場合は繰り返しの貼り付け／剥がしに関する特性の重要性は緩和されうる。

第１封止フィルム１８および第２封止フィルム２０は、流路封止フィルム１６と同様に、一方の主面に粘着剤層が形成され、または押圧により粘着性や接着性を発揮する機能層が形成されていてもよい。第１封止フィルム１８および第２封止フィルム２０は、粘着剤も含めて低い自家蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィンポリマー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン又はアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また上述したように複数回の貼り付け／剥離によっても、その粘着性等の特性が使用に影響をきたす程度に劣化しないことが望ましいが、剥離して試料等の導入後に、新たなフィルムを貼り付ける態様である場合は、この貼り付け／剥がしに関する特性の重要性は緩和されうる。

次に、以上のように構成された反応処理容器１０の使用方法について説明する。まず、サーマルサイクルにより増幅すべき試料を準備する。試料としては、例えば、一または二以上の種類のＤＮＡを含む混合物に、ＰＣＲ試薬として蛍光プローブ、耐熱性酵素および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものがあげられる。さらに反応処理対象のＤＮＡに特異的に反応するプライマーを混合する。市販されているリアルタイムＰＣＲ用試薬キット等も使用することができる。

次に、第２封止フィルム２０を基板１４から剥がし、第１試料導入口４５および第２試料導入口４６を開放する。

次に、試料導入口に試料をスポイトやシリンジ等で導入する。図５は、試料５０が反応処理容器１０内に導入された様子を模式的に示す。試料５０は、第１試料導入口４５および第２試料導入口４６のいずれか一方から分注流路４２に導入される。導入の方法はこれらに限られないが、例えばピペットやスポイトで適量の試料５０を直接導入してよい。ピペットで導入する場合、比較的小径の第１試料導入口４５から試料５０を導入する。この場合、試料５０は、分注流路４２内を第２試料導入口４６に向かって充填される。スポイトで導入する場合、比較的大径の第２試料導入口４６から試料５０を導入する。この場合、試料５０は、分注流路４２内を第１試料導入口４５に向かって充填される。いずれか一方の試料導入口から導入された試料のうち、支流路の体積を超えて余剰なものはもう一方の試料導入口に溜まる。それ故試料導入口部分を一種のサーバーとして活用する目的で、ある一定のスペースを有するように作製してもよい。後述するように、第１空気連通口２４、第２空気連通口２６からの加圧により、第１分岐点４３１および第２分岐点４４１間の分注流路４２に充填された試料５０がＰＣＲに供されることになる。このように、反応処理容器１０の分注領域３４は、所定量の試料を抽出する分注機能を果たす。

次に、第２封止フィルム２０を再び基板１４に貼り戻し、第１試料導入口４５および第２試料導入口４６を封止する。剥がした第２封止フィルム２０に代えて、新たな第２封止フィルム２０を貼ってもよい。以上で反応処理容器１０への試料５０の導入は完了である。

図６は、反応処理容器の変形例を説明するための図である。図６に示す反応処理容器６０は、第１試料導入口４５と第２試料導入口４６が分注流路４２に直結するように設けられている点が図１（ａ）に示す反応処理容器１０と異なる。すなわち、反応処理容器６０は、支流路を備えておらず、第１試料導入口４５および第２試料導入口４６が分注流路４２に直接連通している。また、反応処理容器６０は、第１試料導入口４５と第２試料導入口４６に、余剰な試料を溜めることができる程度に、サーバーとしての一定のスペースを備えている。

反応処理容器６０の分注流路４２も、所定量の試料を抽出する分注機能を果たす。反応処理容器６０では、分注されない（ＰＣＲに供されない）試料は、第１試料導入口４５と第２試料導入口４６のいずれかに設けられたスペースに留まることになる。

上記の反応処理容器における分注機能は、ピペット単体で試料を精密に分注しながら導入することを妨げるものではない。

図７は、本発明の実施形態に係る反応処理装置１００を説明するための模式図である。

本実施形態に係る反応処理装置１００は、反応処理容器１０が載置される反応処理容器載置部（図示せず）と、温度制御システム１０２と、ＣＰＵ１０５とを備える。温度制御システム１０２は、図７に示すように、反応処理容器載置部に載置される反応処理容器１０に対して、反応処理容器１０の流路１２における高温領域３６を約９５℃（高温領域）、中温領域３８を約５５℃に精度よく維持、制御できるように構成されている。

温度制御システム１０２は、サーマルサイクル領域の各温度領域の温度を維持するものであって、具体的には、流路１２の高温領域３６を加熱するための高温用ヒータ１０４と、流路１２の中温領域３８を加熱するための中温用ヒータ１０６と、各温度領域の実温度を計測するための例えば熱電対等の温度センサ（図示せず）と、高温用ヒータ１０４の温度を制御する高温用ヒータドライバ１０８と、中温用ヒータ１０６の温度を制御する中温用ヒータドライバ１１０とを備える。さらに、本実施形態に係る反応処理装置１００は、流路１２の分注領域３４を加熱するための分注用ヒータ１１２と、分注用ヒータ１１２の温度を制御する分注用ヒータドライバ１１４とを備える。温度センサによって計測された実温度情報は、ＣＰＵ１０５に送られる。ＣＰＵ１０５は、各温度領域の実温度情報に基づいて、各ヒータの温度が所定の温度となるよう各ヒータドライバを制御する。各ヒータは例えば抵抗加熱素子やペルチェ素子等であってよい。温度制御システム１０２はさらに、各温度領域の温度制御性を向上させるための他の要素部品を備えてもよい。

本実施形態に係る反応処理装置１００は、さらに、試料５０を反応処理容器１０の流路１２内で移動および停止させるための送液システム１２０を備える。送液システム１２０は、第１ポンプ１２２と、第２ポンプ１２４と、第１ポンプ１２２を駆動するための第１ポンプドライバ１２６と、第２ポンプ１２４を駆動するための第２ポンプドライバ１２８と、第１チューブ１３０と、第２チューブ１３２とを備える。

反応処理容器１０の第１空気連通口２４には、第１チューブ１３０の一端が接続される。第１空気連通口２４と第１チューブ１３０の一端の接続部には、気密性を確保するためのパッキン１３４やシールが配置されることが好ましい。第１チューブ１３０の他端は、第１ポンプ１２２の出力に接続される。同様に、反応処理容器１０の第２空気連通口２６には、第２チューブ１３２の一端が接続される。第２空気連通口２６と第２チューブ１３２の一端の接続部には、気密性を確保するためのパッキン１３６やシールが配置されることが好ましい。第２チューブ１３２の他端は、第２ポンプ１２４の出力に接続される。

第１ポンプ１２２、第２ポンプ１２４は、例えばダイアフラムポンプからなるマイクロブロアポンプであってよい。第１ポンプ１２２、第２ポンプ１２４としては、例えば株式会社村田製作所製のマイクロブロアポンプ（型式ＭＺＢ１００１Ｔ０２）などを使用することができる。このマイクロブロアポンプは、動作時に一次側より二次側の圧力を高めることができるが、停止した瞬間または停止時には一次側と二次側の圧力が等しくなる。

ＣＰＵ１０５は、第１ポンプドライバ１２６、第２ポンプドライバ１２８を介して、第１ポンプ１２２、第２ポンプ１２４からの送風や加圧を制御する。第１ポンプ１２２、第２ポンプ１２４からの送風や加圧は、第１空気連通口２４、第２空気連通口２６を通じて流路１２内の試料５０に作用し、推進力となって試料５０を移動させる。より詳細には、第１ポンプ１２２、第２ポンプ１２４を交互に動作させることにより、試料５０のいずれかの端面にかかる圧力が他端にかかる圧力より大きくなるため、試料５０の移動に係る推進力が得られる。第１ポンプ１２２、第２ポンプ１２４を交互に動作させることによって、試料５０を流路内で往復式に移動させて、反応処理容器１０の流路１２の各温度領域に繰り返し曝すことができ、その結果、試料５０にサーマルサイクルを与えることが可能となる。より具体的には、高温領域において変性、中温領域においてアニーリング・伸長の各工程を繰り返し与えることにより、試料５０中の目的のＤＮＡを選択的に増幅させる。言い換えれば高温領域は変性温度域、中温領域はアニーリング・伸長温度域とみなすことができる。また各温度領域に滞留する時間は、試料５０が各温度領域の所定の位置で停止する時間を変えることによって適宜設定することができる。

本実施形態に係る反応処理装置１００は、さらに、蛍光検出器１４０を備える。上述したように、試料５０には所定の蛍光プローブが添加されている。ＤＮＡの増幅が進むにつれ試料５０から発せられる蛍光信号の強度が増加するので、その蛍光信号の強度値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。

蛍光検出器１４０としては、非常にコンパクトな光学系で、迅速に測定でき、かつ明るい場所か暗い場所かにもかかわらず、蛍光を検出することができる日本板硝子株式会社製の光ファイバ型蛍光検出器ＦＬＥ−５１０を使用することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、その励起光／蛍光の波長特性を試料５０の発する蛍光特性に適するようにチューニングしておくことができ、様々な特性を有する試料について最適な光学・検出系を提供することが可能であり、さらに光ファイバ型蛍光検出器によってもたらされる光線の径の小ささから、流路などの小さいまたは細い領域に存在する試料からの蛍光を検出するのに適している。

光ファイバ型の蛍光検出器１４０は、光学ヘッド１４２と、蛍光検出器ドライバ１４４と、光学ヘッド１４２と蛍光検出器ドライバ１４４とを接続する光ファイバ１４６とを備える。蛍光検出器ドライバ１４４には励起光用光源（ＬＥＤ、レーザその他特定の波長を出射するように調整された光源）、光ファイバ型合分波器及び光電変換素子（ＰＤ，ＡＰＤ又はフォトマル等の光検出器）（いずれも図示せず）等が含まれており、これらを制御するためのドライバ等からなる。光学ヘッド１４２はレンズ等の光学系からなり、励起光の試料への指向性照射と試料から発せられる蛍光の集光の機能を担う。集光された蛍光は光ファイバ１４６を通じて蛍光検出器ドライバ１４４内の光ファイバ型合分波器により励起光と分けられ、光電変換素子によって電気信号に変換される。

本実施形態に係る反応処理装置１００においては、高温領域と中温領域とを接続する流路内の試料５０からの蛍光を検出することができるように光学ヘッド１４２が配置される。試料５０は流路内を繰り返し往復移動させられることで反応が進み、試料５０に含まれる所定のＤＮＡが増幅するので、検出された蛍光の量の変動をモニタリングすることで、ＤＮＡの増幅の進度をリアルタイムで知ることができる。また、本実施形態に係る反応処理装置１００においては、後述するように、蛍光検出器１４０からの出力値を利用して、試料５０の移動制御に活用する。蛍光検出器は、試料からの蛍光を検出する機能を発揮するものであれば光ファイバ型蛍光検出器に限定されない。

図８は、本実施形態に係る反応処理装置で解決すべき課題を説明するための図である。図８に示す反応処理容器１０では、分注領域３４の第１分岐点４３１および第２分岐点４４１間の分注流路４２に充填された試料５０が、サーマルサイクル領域３２に移動されている。具体的には、試料５０が充填された反応処理容器１０を反応処理装置１００にセットし、第２ポンプ１２４のみを作動させることにより、分注領域３４内の試料５０をサーマルサイクル領域３２に推進させる。その後、上述したように、第１ポンプ１２２、第２ポンプ１２４（図７参照）を交互に動作させることによって、試料５０を流路１２内で往復式に移動させて、高温領域３６と中温領域３８とを連続的に往復移動させることにより、試料５０にサーマルサイクルを与えることができる。

高温領域３６と中温領域３８との間での往復移動中（すなわちＰＣＲのサーマルサイクル中）には、中温領域３８に与えられている熱量が、隣接する分注領域３４に伝達する可能性がある。上記において、図５を参照して、分注領域３４の第１分岐点４３１および第２分岐点４４１間の分注流路４２に充填された試料５０がＰＣＲに供される（以下、ＰＣＲに供される試料５０のことを適宜「主試料５０」と称する）ことを説明したが、第１支流路４３、第２支流路４４、第１試料導入口４５、第２試料導入口４６にＰＣＲに供されることを予定せず、分注されない試料が残留している場合がある（以下、適宜「残留試料」と称する）。中温領域３８から伝達された熱量により、第１試料導入口４５、第２試料導入口４６と第２封止フィルム２０との間に閉じ込められた空気が温度上昇して膨張すると、第１支流路４３、第２支流路４４の残留試料が膨張した空気により流路１２に押し出される可能性がある。図８には、流路１２に押し出された残留試料７０が図示されている。なお、図８に示す残留試料７０は、中温領域３８に近い第２支流路４４に残留したものであるが、当然ながら、中温領域３８から伝達される熱量によっては、第１支流路４３の残留試料７２が流路１２に押し出される可能性もある。

図８に示すように、主試料５０と残留試料７０は離間しており、該離間部分には空気が存在している。本発明者は、このように流路１２に主試料５０と残留試料７０とが存在している場合、主試料５０を移動するために第１空気連通口２４、第２空気連通口２６から加圧を行っても、推進力が主試料５０に好適に作用せず、主試料５０の移動が停止する、または主試料５０の移動速度が非常に遅くなることを見いだした。

そこで、本実施形態に係る反応処理装置１００では、温度制御システム１０２は、ＣＰＵ１０５からの指示の下、主試料５０にサーマルサイクルを与えているときの第１試料導入口４５、第２試料導入口４６付近の温度である動作時温度Ｔ_１が、分注領域３４に試料が導入されているときの第１試料導入口４５、第２試料導入口４６付近の温度である初期温度Ｔ_０よりも低くなるよう（すなわち、Ｔ_１＜Ｔ_０）、分注領域３４の温度を制御する。これにより、主試料５０のサーマルサイクル中に中温領域３８からの熱量が第１試料導入口４５、第２試料導入口４６に伝達された場合であっても、第１試料導入口４５、第２試料導入口４６と第２封止フィルム２０との間に閉じ込められた空気の膨張を抑制できるので、第１支流路４３、第２支流路４４の残留試料が流路１２に押し出される事態を防止することができる。その結果、流路１２には主試料５０のみが存在することとなり、第１空気連通口２４、第２空気連通口２６からの加圧により主試料５０の移動を適切に行って、安定したＰＣＲを行うことができる。

次に、本発明者が行った実験結果について説明する。

（実験１）
分注領域３４の分注流路４２に試料を導入した反応処理容器１０を用意し、反応処理装置１００にセットした。そして、分注領域３４の温度を４０℃に設定した。分注領域３４の温度が４０℃に上がったことを確認した後１０秒待って、第２空気連通口２６から空気を送り込み、サーマルサイクル領域３２に試料を移動開始したのとほぼ同時に（すなわち第２ポンプ１２４の作動とほぼ同時に）、分注領域３４の温度設定を３０℃に変更した。実験に使用した反応処理装置１００の場合、通常１分程度で設定温度まで分注領域３４の温度が下がる。その後、５０サイクルのＰＣＲを５回行ったところ、途中で試料が停止することなく、ＰＣＲが終了した。ＰＣＲ終了後の反応処理容器１０を観察したところ、残留試料が流路１２に押し出される現象は確認されなかった。

（実験２）
分注領域３４の分注流路４２に試料を導入した反応処理容器１０を用意し、反応処理装置１００にセットした。そして、分注領域３４の温度を４０℃に設定した。分注領域３４の温度が４０℃に上がったことを確認した後１０秒待って、第２空気連通口２６から空気を送り込み、サーマルサイクル領域３２に試料を移動開始したのとほぼ同時に（すなわち第２ポンプ１２４の作動とほぼ同時に）、分注用ヒータ１１２をオフにした。このときの室温は１８℃であった。その後、５０サイクルのＰＣＲを５回行ったところ、途中で試料が停止することなく、ＰＣＲが終了した。ＰＣＲ終了後の反応処理容器１０を観察したところ、残留試料が流路１２に押し出される現象は確認されなかった。

（比較実験）
分注領域３４の分注流路４２に試料を導入した反応処理容器１０を用意し、反応処理装置１００にセットした。そして、分注領域３４の温度を４０℃に設定した。分注領域３４の温度が４０℃に上がったことを確認した後、そのまま分注領域３４が４０℃の状態で５０サイクルのＰＣＲを行った。結果は、１回目は４サイクルで試料が停止、２回目は６サイクルで試料が停止、３回目は４サイクルで試料が停止した。反応処理容器１０の観察によるところ、いずれの実験においても主試料から数ｍｍ〜数十ｍｍ離間して、１ｍｍ〜２ｍｍの長さの押し出された残留試料が確認された。

以上の実験結果から、本実施形態に係る反応処理装置１００によれば、試料導入口付近の動作時温度Ｔ_１を初期温度Ｔ_０よりも低くすることで、残留試料が流路に押し出される事態を防止でき、主試料の移動を適切に行って安定したＰＣＲを実行できることが分かる。

上記実験では、試料導入口付近の初期温度Ｔ_０を室温（通常２０℃前後）よりも高い温度（実験では４０℃）に設定した。試料導入口付近の初期温度Ｔ_０を室温程度に設定した場合、Ｔ_１＜Ｔ_０を満たすためには動作時温度Ｔ_１を室温よりも低い温度に制御する必要があるが、そのために冷却装置を用意しなければならない。一方、上記実験のように初期温度Ｔ_０を室温よりも高い温度に設定しておけば、分注用ヒータ１１２の設定温度を低くしたり、分注用ヒータ１１２をオフしたりすることで対応できるので、動作時温度Ｔ_１の制御が容易である。

図９は、異なる実施形態に係る反応処理容器８０を説明するための図である。本実施形態に係る反応処理容器８０は、基板１４におけるサーマルサイクル領域３２と分注領域３４との間に、切欠部８２が形成されている点が図１（ａ）に示す反応処理容器１０と異なる。サーマルサイクル領域３２と分注領域３４との間に切欠部８２を設けることにより、サーマルサイクル中に、サーマルサイクル領域３２の中温領域３８に与えられている熱量が分注領域３４に伝達するのを防止できる。これにより、第１試料導入口４５、第２試料導入口４６と第２封止フィルム２０との間に閉じ込められた空気が温度上昇して膨張するのを防止できるので、第１支流路４３、第２支流路４４の残留試料が膨張した空気により流路１２に押し出されることを防ぐことができる。

上述の実施形態では、反応処理装置１００の温度制御システム１０２によって分注領域３４の温度制御を行うことにより、第１支流路４３、第２支流路４４の残留試料が流路１２に押し出されることを防止した。一方、本実施形態に係る反応処理容器８０によれば、分注領域３４の温度制御を行うことなく、残留試料が流路１２に押し出されることを防止できる。

以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

１０，６０反応処理容器、１２流路、１４基板、１６流路封止フィルム、１８第１封止フィルム、２０第２封止フィルム、２４第１空気連通口、２６第２空気連通口、２８第１フィルタ、３０第２フィルタ、３２サーマルサイクル領域、３４分注領域、３６高温領域、３８中温領域、４０接続領域、４２分注流路、４３第１支流路、４４第２支流路、４５第１試料導入口、４６第２試料導入口、５０試料、７０，７２残留試料、８２切欠部、１００反応処理装置、１０２温度制御システム、１０４高温用ヒータ、１０５ＣＰＵ、１０６中温用ヒータ、１０８高温用ヒータドライバ、１１０中温用ヒータドライバ、１１２分注用ヒータ、１１４分注用ヒータドライバ、１２０送液システム、１２２第１ポンプ、１２４第２ポンプ、１２６第１ポンプドライバ、１２８第２ポンプドライバ、１３０第１チューブ、１３２第２チューブ、１３４，１３６パッキン、１４０蛍光検出器、１４２光学ヘッド、１４４蛍光検出器ドライバ、１４６光ファイバ、４３１第１分岐点、４４１第２分岐点。

Claims

試料にサーマルサイクルを与えるためのサーマルサイクル領域と、所定量の試料を分注するための分注領域とを備える流路が形成された反応処理容器であって、前記分注領域が、所定量の試料を規定するための分注流路と、前記分注流路と連通する試料導入口とを備える反応処理容器と、
試料を前記流路内で移動および停止させる送液手段と、
前記サーマルサイクル領域および前記分注領域の温度を制御する温度制御手段と、
を備える反応処理装置であって、
前記温度制御手段は、試料にサーマルサイクルを与えているときの前記試料導入口付近の温度である動作時温度が、前記分注領域に試料が導入されているときの前記試料導入口付近の温度である初期温度よりも低くなるよう、前記分注領域の温度を制御することを特徴とする反応処理装置。
前記初期温度は、室温よりも高い温度に設定されることを特徴とする請求項１に記載の反応処理装置。
前記サーマルサイクル領域と前記分注領域は、隣接して配置されることを特徴とする請求項１または２に記載の反応処理装置。
前記分注領域は、前記分注流路から分岐する支流路をさらに備え、
前記試料導入口は、前記支流路の端に配置されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の反応処理装置。
前記支流路は、前記分注流路から分岐する第１支流路および第２支流路を含み、
前記試料導入口は、前記第１支流路の端に配置された第１試料導入口と、前記第２支流路の端に配置された第２試料導入口とを含むことを特徴とする請求項４に記載の反応処理装置。
試料にサーマルサイクルを与えるためのサーマルサイクル領域と、所定量の試料を分注するための分注領域とを備える流路が形成された反応処理容器であって、前記分注領域が、所定量の試料を規定するための分注流路と、前記分注流路と連通する試料導入口とを備える反応処理容器を準備するステップと、
前記試料導入口から前記分注流路内に試料を導入するステップと、
前記反応処理容器を反応処理装置にセットするステップと、
試料にサーマルサイクルを与えているときの前記試料導入口付近の温度である動作時温度が、前記分注領域に試料が導入されているときの前記試料導入口付近の温度である初期温度よりも低くなるよう、前記分注領域の温度を制御するステップと、
前記流路内の圧力を制御することで、前記サーマルサイクル領域内で試料を移動させるステップと、
を備えることを特徴とする反応処理方法。
温度を制御するステップにおいて、前記初期温度は、室温よりも高い温度に設定されることを特徴とする請求項６に記載の反応処理方法。