JP6827581B2 - Ｐｃｒ反応容器、ｐｃｒ装置およびｐｃｒ方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）に使用されるＰＣＲ反応容器、該ＰＣＲ反応容器を用いたＰＣＲ装置およびＰＣＲ方法に関する。
遺伝子検査は、各種医学分野における検査、農作物や病原性微生物の同定、食品の安全性評価、さらには病原性ウィルスや各種感染症の検査にも広く活用されている。遺伝子である微小量のＤＮＡを高感度に検出するために、ＤＮＡの一部を増幅して得られたものを分析する方法が知られている。中でもＰＣＲ法は、生体等から採取されたごく微量のＤＮＡのある部分を選択的に増幅する注目の技術である。ＰＣＲ法では、ＤＮＡを含む生体サンプルと、プライマーや酵素などからなるＰＣＲ試薬とを混合した試料に、所定のサーマルサイクルを与え、変性、アニーリング及び伸長といった反応を繰り返し起こさせて、ＤＮＡの特定の部分を選択的に増幅させるものである。
ＰＣＲ法においては、対象の試料をＰＣＲチューブ又は複数の穴が形成されたマイクロプレート（マイクロウェル）などの反応容器に所定量入れて行うことが一般的であるが、近年、基板に形成された微細な流路を備える反応容器（チップとも呼ばれる）を用いて行うことが実用化されてきている。いずれの反応容器においても、様々な技術の進歩によって、その反応容器内で所定のサーマルサイクルを高速かつ高精度に与えることができる。
特許文献１には、ＰＣＲを行うための流路が形成された反応容器が開示されている。この反応容器では、重ね合わされた２枚の樹脂基板の間に流路が形成されており、樹脂基板に形成された貫通穴によって流路に試料を導入する試料導入口と試料を排出する試料排出口が確保されている。樹脂基板裏面の凹部には例えばペルチェ素子などからなる温度調節部が配置されている。反応容器の試料導入口にはノズルが配置され、該ノズルによる空気の供給と吸引によって、流路中で試料を移動させることができる。
特開２００９−２３２７００号公報
ＰＣＲ法では、試料の処理中に、外部から系内へのコンタミネーションは避けなければならない。コンタミネーションに処理対象以外の生体片等が含まれていると、この処理対象以外の生体片に含まれるＤＮＡを増幅してしまう可能性がある。この場合、処理対象の試料を用いてその後の分析を正確に行うことができない。従って、試料を反応容器に導入した後は、コンタミネーションが生じないように対策を講じる必要性がある。
しかしながら、特許文献１に開示された発明では、例えばノズルやノズルに空気を送るポンプに処理対象以外の生体片が付着していると、該処理対象以外の生体片が試料導入口から反応容器内に侵入してコンタミネーションが生じるおそれがある。また、ノズルやポンプの先端部品やアタッチメント等を１回のＰＣＲ処理毎に使い捨てにすることは、コスト面、環境面から見て現実的ではない。
本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、好適にコンタミネーションを防止できるＰＣＲ反応容器、該ＰＣＲ反応容器を用いたＰＣＲ装置およびＰＣＲ方法を提供することにある。
上記課題を解決するために、本発明のある態様のＰＣＲ反応容器は、基板と、基板に形成された流路と、流路の両端に設けられた一対のフィルタと、フィルタを通じて流路と連通する一対の空気連通口と、流路における一対のフィルタの間に形成されたサーマルサイクル領域と、流路における一対のフィルタの間に形成された分岐点と、一端が分岐点に接続された分岐流路と、分岐流路の他端に形成された試料導入口とを備える。
本発明の別の態様もまた、ＰＣＲ反応容器である。このＰＣＲ反応容器は、基板と、基板に形成された流路と、流路の両端に設けられた一対のフィルタと、フィルタを通じて流路と連通する一対の空気連通口と、流路における一対のフィルタの間に形成されたサーマルサイクル領域と、流路における一対のフィルタの間に形成された第１分岐点と、一端が第１分岐点に接続された第１分岐流路と、第１分岐流路の他端に形成された第１試料導入口と、流路における一対のフィルタの間に形成された第２分岐点と、一端が第２分岐点に接続された第２分岐流路と、第２分岐流路の他端に形成された第２試料導入口とを備える。
上述のＰＣＲ反応容器は、流路における第１分岐点と第２分岐点との間に形成された緩衝流路領域をさらに備えてもよい。
緩衝流路領域は、ＰＣＲ処理を施したい試料の量に応じた所定の体積に設定されてもよい。
サーマルサイクル領域は、蛇行流路を含んでもよい。サーマルサイクル領域は、それぞれ蛇行流路を含む一対の反応領域と、一対の反応領域を接続する接続領域とを備えてもよい。
空気連通口および試料導入口を封止するための封止フィルムをさらに備えてもよい。
封止フィルムは、ニードルで穿孔可能に形成されてもよい。
本発明の別の態様は、ＰＣＲ装置である。この装置は、上述のＰＣＲ反応容器と、サーマルサイクル領域の温度を調節するための温度調節部と、サーマルサイクル領域内で試料を移動させるために、空気連通口を介して流路内の圧力を制御するポンプシステムとを備えてもよい。
ポンプシステムは、停止時には一次側と二次側の圧力が等しくなるタイプのエアポンプを備えてもよい。
エアポンプは、先端に中空のニードルが設けられたノズルを備えてもよい。
ＰＣＲ装置は、流路内の試料から発生する蛍光を検出するための蛍光検出器をさらに備えてもよい。
ＰＣＲ装置は、蛍光検出器で検出された値に基づいて、ポンプシステムを制御するための制御部をさらに備えてもよい。
本発明のさらに別の態様は、ＰＣＲ方法である。この方法は、基板と、基板に形成された流路と、流路の両端に設けられた一対のフィルタと、フィルタを通じて流路と連通する一対の空気連通口と、流路における一対のフィルタの間に形成されたサーマルサイクル領域と、流路における一対のフィルタの間に形成された分岐点と、一端が分岐点に接続された分岐流路と、分岐流路の他端に形成された試料導入口と、を備えるＰＣＲ反応容器を準備するステップと、試料導入口を介して、ＰＣＲ反応容器内に試料を導入するステップと、ＰＣＲ反応容器を、ポンプを備えるＰＣＲ装置にセットするステップと、空気連通口にポンプのノズルを接続するステップと、ポンプにより流路内の圧力を制御することで、サーマルサイクル領域内で試料を移動させるステップとを備える。
試料を移動させるステップにおいて、分岐流路にはＰＣＲに供されない試料が留まってもよい。
本発明のさらに別の態様もまた、ＰＣＲ方法である。このＰＣＲ方法は、基板と、基板に形成された流路と、流路の両端に設けられた一対のフィルタと、フィルタを通じて流路と連通する一対の空気連通口と、流路における一対のフィルタの間に形成されたサーマルサイクル領域と、流路における一対のフィルタの間に形成された第１分岐点と、一端が第１分岐点に接続された第１分岐流路と、第１分岐流路の他端に形成された第１試料導入口と、流路における一対のフィルタの間に形成された第２分岐点と、一端が第２分岐点に接続された第２分岐流路と、第２分岐流路の他端に形成された第２試料導入口と、を備えるＰＣＲ反応容器を準備するステップと、第１試料導入口または第２試料導入口を介して、ＰＣＲ反応容器内に試料を導入するステップと、ＰＣＲ反応容器を、ポンプを備えるＰＣＲ装置にセットするステップと、空気連通口にポンプのノズルを接続するステップと、ポンプにより流路内の圧力を制御することで、サーマルサイクル領域内で試料を移動させるステップとを備える。
ＰＣＲ反応容器は、流路における第１分岐点と第２分岐点との間に形成された緩衝流路領域をさらに備え、上述のＰＣＲ方法は、緩衝流路領域を用いて試料を分注するステップをさらに備えてもよい。
試料を移動させるステップにおいて、第１分岐流路および第２分岐流路にはＰＣＲに供されない試料が留まってもよい。
本発明によれば、好適にコンタミネーションを防止できるＰＣＲ反応容器、該ＰＣＲ反応容器を用いたＰＣＲ装置およびＰＣＲ方法を提供できる。
図１（ａ）および（ｂ）は、本発明の第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器を説明するための図である。 図１（ａ）に示すＰＣＲ反応容器のＡ−Ａ断面図である。 図１（ａ）に示すＰＣＲ反応容器のＢ−Ｂ断面図である。 第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器が備える基板の平面図である。 第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器の構成を説明するための概念図である。 第１実施形態において、試料がＰＣＲ反応容器内に導入された様子を模式的に示す図である。 第１実施形態において、第３封止フィルムを再び基板に貼り戻した状態を示す図である。 第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器を用いたＰＣＲ装置を説明するための図である。 第１実施形態において、ＰＣＲ反応容器をＰＣＲ装置の所定の位置にセットした状態を説明するための図である。 第１実施形態において、ポンプシステムのノズルとＰＣＲ反応容器の空気連通口とを接続した様子を示す図である。 図１０に示すＰＣＲ反応容器のＣ−Ｃ断面図である。 第１実施形態において、ポンプシステムを作動させて試料を移動させている様子を示す図である。 図１３（ａ）および（ｂ）は、本発明の第２実施形態に係るＰＣＲ反応容器を説明するための図である。 図１３（ａ）に示すＰＣＲ反応容器のＡ−Ａ断面図である。 図１３（ａ）に示すＰＣＲ反応容器のＢ−Ｂ断面図である。 第２実施形態に係るＰＣＲ反応容器が備える基板の平面図である。 第２実施形態に係るＰＣＲ反応容器の構成を説明するための概念図である。 第２実施形態において、試料がＰＣＲ反応容器内に導入された様子を模式的に示す図である。 第２実施形態において、第３封止フィルムを再び基板に貼り戻した状態を示す図である。 第２実施形態に係るＰＣＲ反応容器を用いたＰＣＲ装置を説明するための図である。 第２実施形態において、ＰＣＲ反応容器をＰＣＲ装置の所定の位置にセットした状態を説明するための図である。 第２実施形態において、ポンプシステムのノズルとＰＣＲ反応容器の空気連通口とを接続した様子を示す図である。 図２２に示すＰＣＲ反応容器のＣ−Ｃ断面図である。 第２実施形態において、ポンプシステムを作動させて試料を移動させている様子を示す図である。
以下、本発明の実施形態に係るＰＣＲ反応容器およびＰＣＲ装置について説明する。各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。
［第１実施形態］
図１（ａ）および（ｂ）は、本発明の第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器１０を説明するための図である。図１（ａ）は、ＰＣＲ反応容器１０の平面図であり、図１（ｂ）は、ＰＣＲ反応容器１０の正面図である。図２は、図１（ａ）に示すＰＣＲ反応容器１０のＡ−Ａ断面図である。図３は、図１（ａ）に示すＰＣＲ反応容器１０のＢ−Ｂ断面図である。図４は、ＰＣＲ反応容器１０が備える基板１４の平面図である。図５は、ＰＣＲ反応容器１０の構成を説明するための概念図である。
ＰＣＲ反応容器１０は、下面１４ａに溝状の流路１２が形成された樹脂性の基板１４と、基板１４の下面１４ａ上に貼られた、流路１２を封止するための流路封止フィルム１６と、基板１４の上面１４ｂ上に貼られた３枚の封止フィルム（第１封止フィルム１８、第２封止フィルム２０および第３封止フィルム２２）とから成る。
基板１４は、熱伝導性がよく、温度変化に対しても安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１４は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス、シリコン等の無機材料をはじめ、アクリル、ポリエステル、シリコーンなどの樹脂、中でもシクロオレフィンが好適である。基板１４の寸法の一例は、長辺７０ｍｍ、短辺４２ｍｍ、厚み３ｍｍである。基板１４の下面１４ａに形成される流路１２の寸法の一例は、幅０．５ｍｍ、深さ０．５ｍｍである。
上述したように、基板１４の下面１４ａには溝状の流路１２が形成されており、この流路１２は、流路封止フィルム１６により封止されている（図２参照）。基板１４における流路１２の一端１２ａの位置には、第１空気連通口２４が形成されている。基板１４における流路１２の他端１２ｂの位置には、第２空気連通口２６が形成されている。一対の第１空気連通口２４および第２空気連通口２６は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。このような基板は射出成形やＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。
基板１４中における第１空気連通口２４と流路１２の一端１２ａとの間には、第１フィルタ２８が設けられている（図２参照）。基板１４中における第２空気連通口２６と流路１２の他端１２ｂとの間には、第２フィルタ３０が設けられている。流路１２の両端に設けられた一対の第１フィルタ２８および第２フィルタ３０は、低不純物特性が良好であるほか、空気のみを通し、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの品質が劣化しないようにコンタミネーションを防止する。フィルタ材料としては、ポリエチレンやＰＴＦＥなどが好適であり、多孔質または疎水性を備えていてもよい。第１フィルタ２８および第２フィルタ３０の寸法は、基板１４に形成されたフィルタ設置スペースに隙間なく収まるような寸法に形成される。
基板１４には、第１フィルタ２８と第２フィルタ３０との間の分岐点１１２ｃにおいて、流路１２から分岐した分岐流路１３１が形成されている。基板１４における分岐流路１３１の末端３１ａの位置には、試料導入口１３３が形成されている（図３参照）。試料導入口１３３は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。
流路１２における第１フィルタ２８と分岐点１１２ｃとの間の部分は、試料にサーマルサイクルを与えるために、高温領域と中温領域が予定されているサーマルサイクル領域１２ｅを形成する。流路１２のサーマルサイクル領域１２ｅは、蛇行流路を含んでいる。これは、ＰＣＲ工程でＰＣＲ装置から与えられる熱量を効率的に試料に与えるためと、ＰＣＲに供することのできる試料の体積を一定量以上にするためである。本第１実施形態においては、サーマルサイクル領域１２ｅと第２フィルタ３０との間に分岐点１１２ｃを設けたが、分岐点１１２ｃはそれに接続する分岐流路１３１と試料導入口１３３を通じて、ＰＣＲに供する試料を流路内に導入するためのものであるので、第１フィルタ２８と第２フィルタ３０の間に形成されれば機能上問題はない。ＰＣＲ反応容器１０はＰＣＲ装置に設置し、試料にサーマルサイクルを与え、かつ、試料から発せられる蛍光等の光学物性値を計測することを予定しているので、後述の温度調節部や蛍光検出用プローブの配置なども考慮に入れて、流路や分岐点をはじめとした各要素の配置を任意に選択すればよい。本第１実施形態においては、分岐点１１２ｃを第２フィルタ３０により近い側に配置し、サーマルサイクル領域は分岐点１１２ｃから第１フィルタ２８との間に設けた。このため、分岐点１１２ｃと第１フィルタ２８との流路上の距離を比較的大きくとることができ、サーマルサイクル領域や、またＰＣＲ装置に設置したときに、温度調節部を効率よく配置するスペースも生まれる。逆に分岐点１１２ｃを第１フィルタ２８に近い側に配置した場合は、分岐点１１２ｃと第２フィルタ３０との間にサーマルサイクル領域１２ｅを形成したほうが合理的といえる。
本第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器１０において、流路１２の大部分は基板１４の下面１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により容易に成形できるようにするためである。この溝を流路として活用するために、基板１４の下面１４ａ上に流路封止フィルム１６が貼られる。流路封止フィルム１６は、一方の主面が粘着性を備えていてもよいし、押圧により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１４の下面１４ａと密着して一体化できる機能を備える。流路封止フィルム１６は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィンポリマー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、流路封止フィルム１６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、ＰＣＲ反応容器１０の反りや変形防止に役立つ。
また、本第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器１０において、第１空気連通口２４、第２空気連通口２６、第１フィルタ２８、第２フィルタ３０および試料導入口１３３は、基板１４の上面１４ｂに露出している。そこで、第１空気連通口２４および第１フィルタ２８を封止するために第１封止フィルム１８を基板１４の上面１４ｂに貼り付ける。また、第２空気連通口２６および第２フィルタ３０を封止するために第２封止フィルム２０を基板１４の上面１４ｂに貼り付ける。また、試料導入口１３３を封止するために第３封止フィルム２２を基板１４の上面１４ｂに貼り付ける。
第１封止フィルム１８は第１空気連通口２４と第１フィルタ２８とを、第２封止フィルム２０は第２空気連通口２６と第２フィルタ３０とを同時に封止可能なサイズのものが用いられる。第１空気連通口２４、第２空気連通口２６への加圧式ポンプ（後述する）の接続は、ポンプ先端に備わった中空のニードル（先端がとがった注射針）で第１空気連通口２４、第２空気連通口２６に穿孔することにより行う。そのため、第１封止フィルム１８、第２封止フィルム２０は、ニードルによる穿孔が容易な材質や厚みから成るフィルムが好ましい。本第１実施形態では該当する空気連通口とフィルタとを同時に封止するサイズの封止フィルムについて記載したが、これらを別個に封止する態様でもよい。また、第１空気連通口２４、第１フィルタ２８、第２空気連通口２６及び第２フィルタ３０を一括（一枚）で封止することのできる封止フィルムであってもよい。
第３封止フィルム２２は、試料導入口１３３を封止可能なサイズのものが用いられる。試料導入口１３３を通じての試料の流路１２内への導入は、第３封止フィルム２２を一旦、基板１４から剥がして行い、所定量の試料の導入後には第３封止フィルム２２を再び基板１４の上面１４ｂに戻し貼り付ける。そのため、第３封止フィルム２２としては、数サイクルの貼り付け／剥がしに耐久するような粘着性を備えるフィルムが望ましい。また第３封止フィルム２２は、試料導入後には新しいフィルムを貼り付ける態様であってもよく、この場合は貼り付け／剥がしに関する特性の重要性は緩和されうる。
また試料導入時には、第１封止フィルム１８又は第２封止フィルム２０のいずれかを第３封止フィルム２２と同様に一旦剥がす必要がある。空気の出口を作ってやらないと試料が流路内に入っていかないからである。そのため第１封止フィルム１８と第２封止フィルム２０は、同じく数サイクルの貼り付け／剥がしに耐久するような粘着性を備えるフィルムが望ましい。また、試料導入後には新しいフィルムを貼りつける態様であってもよい。
第１封止フィルム１８、第２封止フィルム２０及び第３封止フィルム２２は、流路封止フィルム１６と同様に、一方の主面に粘着剤層が形成され、または押圧により粘着性や接着性を発揮する機能層が形成されていてもよい。第１封止フィルム１８、第２封止フィルム２０及び第３封止フィルム２２は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン又はアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また上述したように複数回の貼り付け／剥離によっても、その粘着性等の特性が使用に影響をきたす程度に劣化しないことが望ましいが、剥離して試料等の導入後に、新たなフィルムを貼り付ける態様である場合は、この貼り付け／剥がしに関する特性の重要性は緩和されうる。
次に、以上のように構成されたＰＣＲ反応容器１０の使用方法について説明する。まず、サーマルサイクルにより増幅すべき試料を準備する。試料としては、二以上の種類のＤＮＡを含む混合物に、ＰＣＲ試薬として複数種類のプライマー、耐熱性酵素及び４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものがあげられる。次に、第１封止フィルム１８と第３封止フィルム２２を基板１４から剥がし、第１空気連通口２４と試料導入口１３３を開放する。第１封止フィルム１８が第１空気連通口２４と第１フィルタ２８を同時に封止できるサイズのものであった場合、第１封止フィルム１８を完全に基板１４から剥がして、第１空気連通口２４と第１フィルタ２８を大気中に開放してもよいが、第１封止フィルム１８を完全に基板１４から剥がさずに、第１空気連通口２４のみを開放することによって、第１フィルタ２８が大気中に晒されることがなく、コンタミネーション防止には効果がある。また第１空気連通口２４と第１フィルタ２８を別個に封止できる封止フィルムを用いた場合にも同様に第１フィルタ２８が大気中に晒されることがなく、コンタミネーション防止には効果がある。
次に、試料導入口１３３に試料をスポイトやシリンジ等で導入する。図６は、試料７０がＰＣＲ反応容器１０内に導入された様子を模式的に示す。なお、図６では、試料７０の位置を強調するために、試料７０を流路１２よりも太い実線で表している。試料７０が流路からはみ出している状態を表すものではない点に留意されたい。
図６に示すように、試料導入口１３３に導入された試料７０は、スポイトやシリンジ等により押し込まれるか、毛細管現象により流路を満たしていく。試料７０は、流路１２における分岐点１１２ｃを超えてサーマルサイクル領域１２ｅの方向（第１空気連通口２４の方向）に充填される。しかしながら、試料７０は、分岐点１１２ｃを超えて、第２空気連通口２６の方向には充填されない。第２空気連通口２６は封止されており、空気に逃げ口がないためである。
次に、図７に示すように、第１封止フィルム１８と第３封止フィルム２２を再び基板１４に貼り戻し、第１空気連通口２４と試料導入口１３３を封止する。上述したように、新たな第１封止フィルム１８と第３封止フィルム２２を貼ってもよい。以上でＰＣＲ反応容器１０への試料７０の導入は完了である。
図８は、ＰＣＲ反応容器１０を用いたＰＣＲ装置１００を説明するための図である。図９は、ＰＣＲ反応容器１０をＰＣＲ装置１００の所定の位置にセットした状態を説明するための図である。
ＰＣＲ装置１００は、蛍光検出用光学プローブ１２２と、第１ヒータ１３４と、第２ヒータ１３５とを備える。図９に示すように、ＰＣＲ反応容器１０は、流路１２のサーマルサイクル領域１２ｅの二つの反応領域が、それぞれ第１ヒータ１３４および第２ヒータ１３５上に配置され、且つ、蛍光検出用光学プローブ１２２が、二つの反応領域の間の接続領域に配置されるように、ＰＣＲ装置１００に設置されている。
ＰＣＲ装置１００は、さらに、試料７０をサーマルサイクル領域１２ｅ内で往復運動させるためのポンプシステム１１０を備える。このポンプシステム１１０は、第１ノズル１０１、第２ノズル１０２、第１ポンプ１０３、第２ポンプ１０４、第１ドライバ１０５、第２ドライバ１０６、および制御部１０７を備える。ポンプシステム１１０の第１ノズル１０１がＰＣＲ反応容器１０の第１空気連通口２４に接続され、ポンプシステム１１０の第２ノズル１０２がＰＣＲ反応容器１０の第２空気連通口２６に接続される。ノズルと空気連通口の具体的な接続方法は後述する。ポンプシステム１１０は、第１空気連通口２４および第２空気連通口２６を介して流路１２内の圧力を制御することで、サーマルサイクル領域１２ｅ内で試料を移動させる。
本第１実施形態に係るＰＣＲ装置１００において、第１ヒータ１３４と第２ヒータ１３５は異なる温度に設定される。各ヒータはサーマルサイクル領域１２ｅのうち二つのの反応領域の温度を個別に制御するために熱量を与えるものであり、また、各反応領域の面積をカバーするような面積を有している。またそれぞれのヒータは、抵抗加熱やペルチェ素子などの手段や構成であってもよい。例えば、第１ヒータ１３４は、流路１２のサーマルサイクル領域１２ｅのうち、紙面右側の反応領域の温度を一定の９４℃に維持するように、第１ヒータドライバ１３０によって制御される。また、第２ヒータ１３５は、紙面左側の反応領域の温度を一定の６０℃に維持するように、第２ヒータドライバ１３２によって制御される。各反応領域の温度は、熱電対などの温度センサ（図示せず）によって計測され、その電気信号に基づいて各ヒータへの出力を各ドライバによって制御されるものであってもよい。このように、第１ヒータ１３４、第２ヒータ１３５、第１ヒータドライバ１３０、第２ヒータドライバ１３２および温度センサは、サーマルサイクル領域１２ｅの温度を調節するための温度調節部を構成し、温度の制御性が向上するその他の要素を含んでいてもよい。以下では、流路１２における雰囲気温度９４℃の反応領域を「高温部１１１」と称し、流路１２における雰囲気温度６０℃の反応領域を「中温部１１２」と称する。また本実施形態では二つの反応領域として２水準の温度領域を設定するようなサーマルサイクル領域を備えるＰＣＲ反応容器と温度制御部とを備えるＰＣＲ装置について詳細に説明するが、３水準以上の温度領域を設定することができるようなサーマルサイクル領域を備えるＰＣＲ反応容器と温度制御部とを備えるＰＣＲ装置であってもよい。この場合は（図示しないが）、一例として、紙面の左側から低温部、中温部、高温部と配列される反応領域を備えるようなＰＣＲ反応容器と温度制御部を備えるＰＣＲ装置であってもよい。このような場合、例えば、低温部を５０〜７０℃、中温部を７２℃、高温部を９４℃に維持されるように制御される。
ポンプシステム１１０は、上述したように、試料７０を流路１２のサーマルサイクル領域１２ｅ内で往復運動させるために配置される。制御部１０７により第１ドライバ１０５、第２ドライバ１０６を通じて第１ポンプ１０３、第２ポンプ１０４を一定の条件のもと、交互に動作させることによって、試料７０を流路１２の高温部１１１と中温部１１２との間で往復運動させることができ、試料７０に一定条件のもとサーマルサイクルを与えることができる。本第１実施形態に係るＰＣＲ装置１００では、第１ポンプ１０３、第２ポンプ１０４は、いずれも停止した場合は瞬時に一次側と二次側の気圧が等しくなり、また、いずれも停止しているときは、一次側と二次側の気圧が等しくなるタイプのエアポンプ若しくはブロアポンプである。このようなタイプのポンプを用いない、すなわち停止しても直前の圧力を維持するようなポンプを用いた場合には、ポンプが停止しても、わずかながら試料が移動し続ける現象が起こり、所定の反応領域に試料が停止せず、適正に試料の温度を制御することができない可能性がある。一方で本第１実施形態に係るＰＣＲ装置１００においては、停止時（開放時）に、外部空気とＰＣＲ反応容器の流路とが気圧的に連通し、大気圧に等しくなるが、空気連通口と流路との間にフィルタが備わっているために、流路内へのコンタミネーションを防止することができる。
試料７０は、上述のサーマルサイクルによってＰＣＲを実施することができるが、流路内の試料７０からの蛍光を検出し、その値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。蛍光検出用光学プローブ１２２とドライバ１２１としては、非常にコンパクトな光学系で、迅速に測定でき、かつ明暗雰囲気にかかわらず、蛍光を検出することができる日本板硝子株式会社製の光ファイバ型蛍光検出器ＦＬＥ−５１０を使用することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、サーマルサイクル領域内の２つの反応領域の間の狭小なスペースにも容易に配置することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、その励起光／蛍光の波長特性を試料７０の蛍光特性に適するようにチューニングしておくことができ、様々な特性を有する試料について最適な光学・検出系を提供することが可能である。またサーマルサイクル領域１２ｅ内に渡って複数個所設置された蛍光検出用光学プローブ１２２とドライバ１２１を備えていてもよい。例えば高温部１１１や中温部１１２にある流路内の試料７０からの蛍光を検出するために設置してもよい。ＰＣＲの進捗や終了の判断材料の取得といった機能以外に、試料７０が高温部１１１または中温部１１２にあるか、ないかということを確実に検出する位置センサとしても機能させることができる。
以上のように構成されたＰＣＲ装置１００において、ポンプシステム１１０の制御部１０７、蛍光検出用光学プローブ１２２のドライバ１２１、第１ヒータドライバ１３０および第２ヒータドライバ１３２は、ＣＰＵ１４１によって最適に動作するように制御される。また、先述にように３水準の温度が設定される反応領域を備えるような場合には、上記に加えて第３のヒータドライバ（図示せず）もＣＰＵによって制御される。
図１０は、ポンプシステムのノズルとＰＣＲ反応容器の空気連通口とを接続した様子を示す図である。図１１は、図１０に示すＰＣＲ反応容器１０のＣ−Ｃ断面図である。上述したように、第１ノズル１０１が第１空気連通口２４に接続され、第２ノズル１０２が第２空気連通口２６に接続される。
図１１に示すように、第１ノズル１０１の先端には中空のニードル１５０が設けられている。このニードル１５０で第１封止フィルム１８を穿孔することにより、第１ノズル１０１が第１空気連通口２４に接続される。第２ノズル１０２と第２空気連通口２６の接続も同様である。
ニードル１５０には、接続部周辺の気密性を確保するために、封止フィルムの表面と密着する軟性樹脂からなるパッキン１５１が設けられている。ＰＣＲ反応容器１０がＰＣＲ装置１００にセットされた直後は、ポンプシステム１１０は動作しておらず大気に解放されているために、圧力的には流路内は大気圧に等しい状態にある。
図１２は、ポンプシステム１１０を作動させて試料７０を移動させている様子を示す。第１ポンプ１０３および第２ポンプ１０４のいずれか一方を作動させ、試料７０をサーマルサイクル領域１２ｅの高温部１１１または中温部１１２に移動させる。図１２では、第２ノズル１０２が接続された第２ポンプ１０４を作動させ、第１ノズル１０１が接続された第１ポンプ１０３は停止している。すなわち、第１ポンプ１０３から延びる第１ノズル１０１が接続された第１空気連通口２４は、大気圧に開放されている。第２ポンプ１０４を作動させて第２ノズル１０２から第２空気連通口２６に空気を送り込むと、試料７０が動き、中温部１１２を通過して高温部１１１に移動する。この状態を初期状態とする。
より具体的には、第２ポンプ１０４の動作の開始とともに、あるいはその直前に、蛍光検出用光学プローブ１２２を用いて、流路中の試料から発せられる蛍光のモニタを開始する。蛍光検出用光学プローブ１２２の測定ポイントに何もないときは検出される蛍光はゼロかバックグラウンドレベルにあるが、測定ポイントに試料７０が存在するときは蛍光が検出される。従って、第２ポンプ１０４の動作開始前から蛍光のモニタを開始し、蛍光値がバックグラウンドレベルから上昇し、再びバックグラウンドレベルに下降したことで、試料７０が高温部１１１に移動が完了したことを認知し、この時点で第２ポンプ１０４の動作を停止することで初期状態のセッティングが完了する。また蛍光検出用光学プローブがさらに高温部１１１にある場合はより確実に試料７０を高温部１１１に停止させることもできる。
ここで、分岐流路１３１内に位置している試料７０は、第２ポンプ１０４を動作させても、殆どその場所に留まることに留意されたい。これは、試料導入口１３３は第３封止フィルム２２で封止されているためである。この分岐流路１３１内に位置している試料７０は、ＰＣＲに供されない。
初期状態にセッティング後、試料７０にサーマルサイクルを与えＰＣＲを進行させる。蛍光検出用光学プローブ１２２による蛍光の測定は継続する。
（Ａ）まず、試料７０を高温部１１１（約９４℃雰囲気）に１〜３０秒間待機させる（Ｄｅｎｅｔｕｒａｔｉｏｎ：熱変性工程）。この工程により２本鎖のＤＮＡが１本鎖に変性される。
（Ｂ）次に、第１ノズル１０１が接続された第１ポンプ１０３を動作させ、試料７０を中温部１１２（約６０℃雰囲気）に移動させる。具体的には、試料７０は、第１ポンプ１０３の作用により、高温部１１１から中温部１１２の方向に押される。蛍光検出用光学プローブ１２２による蛍光測定は継続しているので、蛍光検出用光学プローブ１２２の測定ポイントを試料７０が通過することによって、蛍光量がバックグラウンドのレベルから上昇し、再び下降した時点（あるいは蛍光量が下降して一定時間経過後）に第１ポンプ１０３の動作を停止させる。また蛍光検出用光学プローブ１２２が中温部１１２にある場合はより確実に試料７０を中温部１１２に停止させることもできる。
（Ｃ）中温部１１２では、試料７０を３〜６０秒間待機させる（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ＋Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ：アニーリング工程＋伸長工程）。この工程によってあらかじめ試料７０に含有されていたプライマーが結合し更に伸長したＤＮＡになる。
（Ｄ）次に、第２ノズル１０２が接続された第２ポンプ１０４を作動させ、試料７０を中温部１１２から高温部１１１に移動させる。ポンプ動作停止のタイミングは、上記と同様に、蛍光検出用光学プローブ１２２で測定された蛍光量の変動から判断する。試料７０を高温部１１１に移動後、１〜３０秒間待機させ熱変性させる。
（Ｅ）上記の（Ｂ）〜（Ｄ）を所定のサイクル数繰り返し、試料７０にサーマルサイクルを与え、試料７０に含まれるＤＮＡに複数サイクルの熱変性−アニーリング−伸長工程を経らせることによって、ＤＮＡの増幅を行う。サイクル数は、対象のＤＮＡやプライマー、酵素等の組合せにより適宜決定される。
所定のサイクル数のサーマルサイクルが終了後、第１ポンプ１０３および第２ポンプ１０４を停止し、ＰＣＲを終了させる。所定のサイクル数のサーマルサイクルが与えられているときでも、蛍光検出用光学プローブ１２２により蛍光が測定されており、試料７０に含まれるＤＮＡが増幅するにつれ、試料７０から検出される蛍光が増大する。これにより、試料７０の濃度を正確に知ることができる。
第１実施形態に係るＰＣＲ反応容器１０によれば、第１空気連通口２４と流路１２との間に第１フィルタ２８を設け、第２空気連通口２６と流路１２との間に第２フィルタ３０を設けたことにより、流路１２内のコンタミネーションを防止できる。ポンプシステム１１０側にコンタミネーション防止の対策を施すことはコストが高くなりがちであるが、本第１実施形態のＰＣＲ反応容器１０では、ＰＣＲ反応容器１０側のみでコンタミネーションを防止でき、経済的である。またＰＣＲ反応容器はディスポーザブルとして使用する場合は、フィルタが常に新しいものであるので、低コストでコンタミネーションの防止がさらに図られる。さらにＰＣＲ反応容器の廃棄処分についても、試料はＰＣＲ反応容器に略封止された状態にあるので安全面や環境面でも有意義である。
本第１実施形態に係るＰＣＲ装置１００では、停止時には一次側と二次側の圧力が等しくなる第１ポンプ１０３および第２ポンプ１０４を交互に動作させることでＰＣＲ反応容器１０の流路１２内で試料を往復移動させることができる。この場合、送液（流路中の試料に圧力をかける）中の試料に過剰な圧力がかからず、さらに流路内の減圧をしないため、高温部１１１の作用による試料を含む液の蒸発や沸騰（発泡）を防止することができる。
また、本第１実施形態に係るＰＣＲ装置１００では、サーマルサイクル領域において、ＰＣＲ中も試料からの蛍光が常時モニタされている（リアルタイムＰＣＲ）。これにより、測定された蛍光量に基づいて、ＰＣＲの終了タイミングを判定できる。また、蛍光検出用光学プローブ１２２によって蛍光の変化をモニタすることで試料の通過を知ることができ、その通過に伴う蛍光量の変化に基づいて、第１ポンプ１０３および第２ポンプ１０４の交互動作を制御することができるため、ＰＣＲに供する試料を正確にサーマルサイクル領域の高温部１１１または中温部１１２に位置決めすることができる。
一方で先述の高温部、中温部及び低温部の３水準の温度が制御された反応領域を備えるＰＣＲ反応容器とＰＣＲ装置に場合は、高温部で熱変性、中温部でアニーリングそして低温部で伸長の各工程を担わせることが可能となり、それらの制御についても上記の詳細な説明に基づいて当業者が容易に発展、改良できる事項である。また反応領域を２水準とするか３水準とするかについては、試料の特性に応じて当業者が適宜選択できる。
［第２実施形態］
図１３（ａ）および（ｂ）は、本発明の第２実施形態に係るＰＣＲ反応容器２１０を説明するための図である。図１３（ａ）は、ＰＣＲ反応容器２１０の平面図であり、図１３（ｂ）は、ＰＣＲ反応容器２１０の正面図である。図１４は、図１３（ａ）に示すＰＣＲ反応容器２１０のＡ−Ａ断面図である。図１５は、図１３（ａ）に示すＰＣＲ反応容器２１０のＢ−Ｂ断面図である。図１６は、ＰＣＲ反応容器２１０が備える基板２１４の平面図である。図１７は、ＰＣＲ反応容器２１０の構成を説明するための概念図である。第２実施形態におけるＰＣＲ反応容器２１０は、分岐点を２個（第１分岐点２１２ｃと第２分岐点２１２ｄ）とそこから延長される分岐流路と試料導入口を２個（第１分岐流路２３１と第１試料導入口２３３、第２分岐流路２３２と第２試料導入口２３４）を備え、第１分岐点２１２ｃと第２分岐点２１２ｄとの間に緩衝流路領域２１２ｆを備える点などが第１実施形態と異なる。
ＰＣＲ反応容器２１０は、下面２１４ａに溝状の流路２１２が形成された樹脂性の基板２１４と、基板２１４の下面２１４ａ上に貼られた、流路２１２を封止するための流路封止フィルム２１６と、基板２１４の上面２１４ｂ上に貼られた３枚の封止フィルム（第１封止フィルム２１８、第２封止フィルム２２０および第３封止フィルム２２２）とから成る。
基板２１４は、熱伝導性がよく、温度変化に対しても安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板２１４は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス、シリコン等の無機材料をはじめ、アクリル、ポリエステル、シリコーン等の樹脂、中でもシクロオレフィンが好適である。基板２１４の寸法の一例は、長辺７０ｍｍ、短辺４２ｍｍ、厚み３ｍｍである。基板２１４の下面２１４ａに形成される流路２１２の寸法の一例は、幅０．５ｍｍ、深さ０．５ｍｍである。
上述したように、基板２１４の下面２１４ａには溝状の流路２１２が形成されており、この流路２１２は、流路封止フィルム２１６により封止されている（図１４参照）。基板２１４における流路２１２の一端２１２ａの位置には、第１空気連通口２２４が形成されている。基板２１４における流路２１２の他端２１２ｂの位置には、第２空気連通口２２６が形成されている。一対の第１空気連通口２２４および第２空気連通口２２６は、基板２１４の上面２１４ｂに露出するように形成されている。このような基板は射出成形やＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。
基板２１４中における第１空気連通口２２４と流路２１２の一端２１２ａとの間には、第１フィルタ２２８が設けられている（図１４参照）。基板２１４中における第２空気連通口２２６と流路２１２の他端２１２ｂとの間には、第２フィルタ２３０が設けられている。この流路２１２の両端に設けられた一対の第１フィルタ２２８および第２フィルタ２３０は、低不純物特性が良好であるほか、空気のみを通し、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの品質が劣化しないようにコンタミネーションを防止する。フィルタ材料としては、ポリエチレンやＰＴＦＥなどが好適であり、多孔質又は疎水性を備えていてもよい。第１フィルタ２２８および第２フィルタ２３０の寸法は、基板２１４に形成されたフィルタ設置スペースに隙間なく収まるような寸法に形成される。
基板２１４には、第１フィルタ２２８と第２フィルタ２３０との間の第１分岐点２１２ｃにおいて、流路２１２から分岐した第１分岐流路２３１が形成されている。基板２１４における第１分岐流路２３１の末端２３１ａの位置には、第１試料導入口２３３が形成されている（図１５参照）。基板２１４にはさらに、第１分岐点２１２ｃと第２フィルタ２３０との間の第２分岐点２１２ｄにおいて、流路２１２から分岐した第２分岐流路２３２が形成されている。基板２１４における第２分岐流路２３２の末端２３２ａの位置には、第２試料導入口２３４が設けられている。第１試料導入口２３３および第２試料導入口２３４は、基板２１４の上面２１４ｂに露出するように形成されている。
流路２１２における第１フィルタ２２８と第１分岐点２１２ｃとの間の部分は、試料にサーマルサイクルを与えるために、高温領域と中温領域が予定されているサーマルサイクル領域２１２ｅを形成する。流路２１２のサーマルサイクル領域２１２ｅは、蛇行流路を含んでいる。これは、ＰＣＲ工程でＰＣＲ装置から与えられる熱量を効率的に試料に与えるためと、ＰＣＲに供することのできる試料の体積を一定量以上にするためである。サーマルサイクル領域２１２ｅは、それぞれ蛇行流路を含む一対の反応領域と、一対の反応領域を接続する接続領域とを備える。
流路２１２における第１分岐点２１２ｃと第２分岐点２１２ｄとの間の部分は、緩衝流路領域２１２ｆを形成する。流路２１２の緩衝流路領域２１２ｆは、蛇行流路を含んでいる。流路２１２の緩衝流路領域２１２ｆの体積は、ＰＣＲ処理を施したい試料の量に応じた所定の体積に設定される。緩衝流路領域の機能については後述する。
本第２実施形態に係るＰＣＲ反応容器２１０において、流路２１２の大部分は基板２１４の下面２１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により容易に成形できるようにするためである。この溝を流路として活用するために、基板２１４の下面２１４ａ上に流路封止フィルム２１６が貼られる。流路封止フィルム２１６は、一方の主面が粘着性を備えていてもよいし、押圧により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板２１４の下面２１４ａと密着して一体化できる機能を備える。流路封止フィルム２１６は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィンポリマー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、流路封止フィルム２１６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、ＰＣＲ反応容器２１０の反りや変形防止に役立つ。
また、本第２実施形態に係るＰＣＲ反応容器２１０において、第１空気連通口２２４、第２空気連通口２２６、第１試料導入口２３３、第２試料導入口２３４、第１フィルタ２２８および第２フィルタ２３０は、基板２１４の上面２１４ｂに露出している。そこで、第１空気連通口２２４および第１フィルタ２２８を封止するために第１封止フィルム２１８を基板２１４の上面２１４ｂに貼り付ける。また、第２空気連通口２２６および第２フィルタ２３０を封止するために第２封止フィルム２２０を基板２１４の上面２１４ｂに貼り付ける。また、第１試料導入口２３３および第２試料導入口２３４を封止するために第３封止フィルム２２２を基板１４の上面２１４ｂに貼り付ける。
第１封止フィルム２１８は第１空気連通口２２４と第１フィルタ２２８とを、第２封止フィルム２２０は第２空気連通口２２６と第２フィルタ２３０とを同時に封止可能なサイズのものが用いられる。第１空気連通口２２４、第２空気連通口２２６への加圧式ポンプ（後述する）の接続は、ポンプ先端に備わった中空のニードル（先端がとがった注射針）で第１空気連通口２２４、第２空気連通口２２６に穿孔することにより行う。そのため、第１封止フィルム２１８、第２封止フィルム２２０は、ニードルによる穿孔が容易な材質や厚みから成るフィルムが好ましい。本第２実施形態では該当する空気連通口とフィルタとを同時に封止するサイズの封止フィルムについて記載したが、これらを別個に封止する態様でもよい。また、第１空気連通口２２４、第１フィルタ２２８、第２空気連通口２２６及び第２フィルタ２３０を一括（一枚）で封止することのできる封止フィルムであってもよい。
第３封止フィルム２２２は、第１試料導入口２３３および第２試料導入口２３４を同時に封止可能なサイズのものが用いられる。第１試料導入口２３３、第２試料導入口２３４を通じての試料の流路２１２内への導入は、第３封止フィルム２２２を一旦、基板２１４から剥がして行い、所定量の試料の導入後には第３封止フィルム２２２を再び基板２１４の上面２１４ｂに戻し貼り付ける。そのため、第３封止フィルム２２２としては、数サイクルの貼り付け／剥がしに耐久するような粘着性を備えるフィルムが望ましい。また第３封止フィルム２２２は、試料導入後には新しいフィルムを貼りつける態様であってもよく、この場合は貼り付け／剥がしに関する特性の重要性は緩和されうる。また本第２実施形態では、第１試料導入口２３３および第２試料導入口２３４を同時に封止するサイズの封止フィルムについて記載したが、これらを別個に封止する態様でもよい。
第１封止フィルム２１８、第２封止フィルム２２０及び第３封止フィルム２２２は、流路封止フィルム２１６と同様に、一方の主面に粘着剤層が形成され、または押圧により粘着性や接着性を発揮する機能層が形成されていてもよい。第１封止フィルム２１８、第２封止フィルム２２０及び第３封止フィルム２２２は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィン（ＣＯＰ）、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン又はアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また上述したように複数回の貼り付け／剥離によっても、その粘着性等の特性が使用に影響をきたす程度に劣化しないことが望ましいが、剥離して試料等の導入後に、新たなフィルムを貼り付ける態様である場合は、この貼り付け／剥がしに関する特性の重要性は緩和されうる。
次に、以上のように構成されたＰＣＲ反応容器２１０の使用方法について説明する。まず、サーマルサイクルにより増幅すべき試料を準備する。試料としては、二以上の種類のＤＮＡを含む混合物に、ＰＣＲ試薬として複数種類のプライマー、耐熱性酵素及び４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものがあげられる。次に、第３封止フィルム２２２を基板２１４から剥がし、第１試料導入口２３３および第２試料導入口２３４を開放する。
次に、第１試料導入口２３３および第２試料導入口２３４のいずれか一方に、試料をスポイトやシリンジ等で導入する。図１８は、試料２７０がＰＣＲ反応容器２１０内に導入された様子を模式的に示す。なお、図１８では、試料２７０の位置を強調するために、試料２７０を流路２１２よりも太い実線で表している。試料２７０が流路からはみ出している状態を表すものではない点に留意されたい。
図１８に示すように、第１試料導入口２３３および第２試料導入口２３４のいずれか一方に導入された試料２７０は、スポイトやシリンジにより押し込まれるか、毛細管現象により流路を満たしていく。試料２７０は、流路２１２における第１分岐点２１２ｃと第２分岐点２１２ｄとの間の緩衝流路領域２１２ｆに充填される。しかしながら、試料２７０は、緩衝流路領域の両端にある第１分岐点２１２ｃ、第２分岐点２１２ｄを超えて、流路２１２のサーマルサイクル領域２１２ｅや第２空気連通口２６の方面には侵入しない。当該流路の両端（すなわち第１空気連通口２２４および第２空気連通口２２６）はこの時点では封止されており、空気に逃げ口がないためである。
次に、図１９に示すように、第３封止フィルム２２２を再び基板２１４に貼り戻し、第１試料導入口２３３および第２試料導入口２３４を封止する。上述したように新たな第３封止フィルム２２２を貼ってもよい。以上でＰＣＲ反応容器２１０への試料２７０の導入は完了である。
図２０は、ＰＣＲ反応容器２１０を用いたＰＣＲ装置３００を説明するための図である。図２１は、ＰＣＲ反応容器２１０をＰＣＲ装置３００の所定の位置にセットした状態を説明するための図である。
ＰＣＲ装置３００は、蛍光検出用光学プローブ２１２２と、第１ヒータ２１３４と、第２ヒータ２１３５とを備える。図２１に示すように、ＰＣＲ反応容器２１０は、流路２１２のサーマルサイクル領域２１２ｅの一対の反応領域が、第１ヒータ２１３４および第２ヒータ２１３５上に配置され、且つ、蛍光検出用光学プローブ２１２２が、一対の反応領域の間の接続領域に配置されるように、ＰＣＲ装置３００に設置される。ＰＣＲ装置３００は、第１実施形態に係るＰＣＲ用反応容器において適用したＰＣＲ装置を援用可能である。
ＰＣＲ装置３００は、さらに、試料２７０をサーマルサイクル領域２１２ｅ内で往復運動させるためのポンプシステム２１１０を備える。このポンプシステム２１１０は、第１ノズル２１０１、第２ノズル２１０２、第１ポンプ２１０３、第２ポンプ２１０４、第１ドライバ２１０５、第２ドライバ２１０６、および制御部２１０７を備える。ポンプシステム２１１０の第１ノズル２１０１がＰＣＲ反応容器２１０の第１空気連通口２２４に接続され、ＰＣＲ反応容器２１０の第２ノズル２１０２がＰＣＲ反応容器２１０の第２空気連通口２２６に接続される。ノズルと空気連通口の具体的な接続方法は後述する。ポンプシステム２１１０は、第１空気連通口２２４および第２空気連通口２２６を介して流路２１２内の圧力を制御することで、サーマルサイクル領域２１２ｅ内で試料を移動させる。
本第２実施形態に係るＰＣＲ装置３００において、第１ヒータ２１３４と第２ヒータ２１３５は異なる温度に設定される。各ヒータはサーマルサイクル領域２１２ｅのうち一対の反応領域の温度を個別に制御するために熱量を与えるものであり、抵抗加熱やペルチェ素子などの手段や構成であってもよい。例えば、第１ヒータ２１３４は、流路２１２のサーマルサイクル領域２１２ｅのうち、紙面右側の反応領域の温度を一定の９４℃に維持するように、第１ヒータドライバ２１３０によって制御される。また、第２ヒータ２１３５は、紙面左側の反応領域の温度を一定の６０℃に維持するように、第２ヒータドライバ２１３２によって制御される。各反応領域の温度は、熱電対などの温度センサ（図示せず）によって計測され、その電気信号に基づいて各ヒータへの出力を各ドライバによって制御されるものであってもよい。このように、第１ヒータ２１３４、第２ヒータ２１３５、第１ヒータドライバ２１３０、第２ヒータドライバ２１３２および温度センサは、サーマルサイクル領域２１２ｅの温度を調節するための温度調節部を構成し、温度の制御性が向上するその他の要素を含んでいてもよい。この温度調節部により、流路２１２のサーマルサイクル領域２１２ｅを雰囲気温度が異なる２つの領域に分割することができる。各ヒータ近傍には該当箇所の温度を計測する熱電対のような温度センサ（図示なし）が含まれていてもよく、温度の制御性が向上するその他の構成を含んでいてもよい。以下では、流路２１２における雰囲気温度９４℃の反応領域を「高温部２１１１」と称し、流路２１２における雰囲気温度６０℃の反応領域を「中温部２１１２」と称する。また本実施形態では二つの反応領域として２水準の温度領域を設定するようなサーマルサイクル領域を備えるＰＣＲ反応容器と温度制御部とを備えるＰＣＲ装置について詳細に説明するが、３水準以上の温度領域を設定することができるようなサーマルサイクル領域を備えるＰＣＲ反応容器と温度制御部とを備えるＰＣＲ装置であってもよい。この場合は（図示しないが）、一例として、紙面の左側から低温部、中温部、高温部と配列される反応領域を備えるようなＰＣＲ反応容器と温度制御部を備えるＰＣＲ装置であってもよい。このような場合、例えば、低温部を５０〜７０℃、中温部を７２℃、高温部を９４℃に維持されるように制御される。
ポンプシステム２１１０は、上述したように、試料２７０を流路２１２のサーマルサイクル領域２１２ｅ内で往復運動させるために配置される。制御部２１０７により第１ドライバ２１０５、第２ドライバ２１０６を通じて第１ポンプ２１０３、第２ポンプ２１０４を一定の条件のもと、交互に動作させることによって、試料２７０を流路２１２の高温部２１１１と中温部２１１２との間で往復運動させることができ、試料２７０に一定条件のもとサーマルサイクルを与えることができる。本第２実施形態に係るＰＣＲ装置３００では、第１ポンプ２１０３、第２ポンプ２１０４は、いずれも停止した場合は瞬時に一次側と二次側の気圧が等しくなり、また、いずれも停止しているときは、一次側と二次側の気圧が等しくなるタイプのエアポンプ若しくはブロアポンプである。このようなタイプのポンプを用いない、すなわち停止しても直前の圧力を維持するようなポンプを用いた場合には、ポンプを停止した場合であっても、わずかながら試料が移動し続ける現象が起こり、所定の反応領域に試料が停止せず、適正に試料の温度を制御することができない可能性がある。一方で停止時（開放時）には、外部空気とＰＣＲ反応容器の流路とが気圧的に連通し、大気圧に等しくなるが、空気連通口と流路との間にフィルタが備わっているために、流路内へのコンタミネーションを防止することができる。
試料２７０は、上述のサーマルサイクルによってＰＣＲを実施することができるが、流路内の試料２７０からの蛍光を検出し、その値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。蛍光検出用光学プローブ２１２２とドライバ２１２１としては、非常にコンパクトな光学系で、迅速に測定でき、かつ明暗雰囲気にかかわらず、蛍光を検出することができる日本板硝子株式会社製の光ファイバ型蛍光検出器ＦＬＥ−５１０を使用することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、サーマルサイクル領域内の２つの温度領域の間の狭小なスペースにも容易に配置することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、その励起光／蛍光の波長特性を試料２７０の蛍光特性に適するようにチューニングしておくことができ、様々な特性を有する試料について最適な光学・検出系を提供することが可能である。またサーマルサイクル領域２１２ｅに渡って複数個所設置された蛍光検出用光学プローブ２１２２とドライバ２１２１を備えていてもよい。例えば高温部２１１１や中温部２１１２にある流路内の試料２７０からの蛍光を検出するために設置してもよい。ＰＣＲの進捗や終了の判断材料の取得といった機能以外に、試料２７０が高温部２１１１または中温部２１１２にあるか、ないかということを確実に検出する位置センサとしても機能させることができる。
以上のように構成されたＰＣＲ装置３００において、ポンプシステム２１１０の制御部２１０７、蛍光検出用光学プローブ２１２２のドライバ２１２１、第１ヒータドライバ２１３０および第２ヒータドライバ２１３２は、ＣＰＵ２１４１によって最適に動作するように制御される。また、先述にように３水準の温度が設定される反応領域を備えるような場合には、上記に加えて第３のヒータドライバ（図示なし）もＣＰＵによって制御される。
図２２は、ポンプシステムのノズルとＰＣＲ反応容器の空気連通口とを接続した様子を示す図である。図２３は、図２３に示すＰＣＲ反応容器２１０のＣ−Ｃ断面図である。上述したように、第１ノズル２１０１が第１空気連通口２２４に接続され、第２ノズル２１０２が第２空気連通口２２６に接続される。
図２３に示すように、第１ノズル２１０１の先端にはニードル２１５０が設けられている。このニードル２１５０で第１封止フィルム２１８を穿孔することにより、第１ノズル２１０１が第１空気連通口２２４に接続される。第２ノズル２１０２と第２空気連通口２２６の接続も同様である。
ニードル２１５０には、接続部周辺の気密性を確保するために、封止フィルムの表面と密着する軟性樹脂からなるパッキン２１５１が設けられている。ＰＣＲ反応容器２１０がＰＣＲ装置３００にセットされた直後は、ポンプシステム２１１０は動作しておらず大気に解放されているために、圧力的には流路内は大気圧に等しい状態にある。
図２４は、ポンプシステム２１１０を作動させて試料２７０を移動させている様子を示す。第１ポンプ２１０３および第２ポンプ２１０４のいずれか一方を作動させ、試料２７０を流路２１２の緩衝流路領域２１２ｆから、サーマルサイクル領域２１２ｅの高温部２１１１または中温部２１１２に移動させる。図２４では、第２ノズル２１０２が接続された第２ポンプ２１０４を作動させ、第１ノズル２１０１が接続された第１ポンプ２１０３は停止している。すなわち、第１ポンプ２１０３から延びる第１ノズル２１０１が接続された第１空気連通口２２４は、大気圧に開放されている。第２ポンプ２１０４を作動させて第２ノズル２１０２から第２空気連通口２２６に空気を送り込むと、試料２７０が流路２１２の緩衝流路領域２１２ｆから動き、中温部２１１２を通過して高温部２１１１に移動する。この状態を初期状態とする。
より具体的には、第２ポンプ２１０４の動作の開始とともに、あるいはその直前に、蛍光検出用光学プローブ２１２２を用いて、流路中から発せられる蛍光のモニタを開始する。蛍光検出用光学プローブ２１２２の測定ポイントに何もないときは検出される蛍光はゼロかバックグラウンドレベルにあるが、測定ポイントに試料２７０が存在するときは蛍光が検出される。従って、第２ポンプ２１０４の動作開始から蛍光のモニタを開始し、蛍光値がバックグラウンドレベルから上昇し、再びバックグラウンドレベルに下降したことで、試料２７０が高温部２１１１に移動が完了したことを認知し、この時点で第２ポンプ２１０４の動作を停止することで初期状態のセッティングが完了する。また蛍光検出用光学プローブ２１２２がさらに高温部２１１１にある場合はより確実に試料２７０を高温部２１１１に停止させることもできる。
ここで、第１分岐流路２３１および第２分岐流路２３２内に位置している試料２７０は、第２ポンプ２１０４を動作させても、その場所に留まることに留意されたい。これは、第１試料導入口２３３および第２試料導入口２３４は第３封止フィルム２２２で封止されているためである。この第１分岐流路２３１および第２分岐流路２３２内に位置している試料２７０は、ＰＣＲに供されない。従って、ＰＣＲ反応容器２１０に最初に導入した試料の量にばらつきがあったとしても、ＰＣＲ反応容器２１０に形成されている流路２１２の緩衝流路領域２１２ｆの体積を、ＰＣＲ処理を施したい試料の量に応じた所定の体積に設定することで、常に所望の一定量の試料を流路２１２のサーマルサイクル領域２１２ｅに送り込むことができ、ＰＣＲの進捗や終端の判断に影響を及ぼす蛍光量を略一定にすることができる。すなわち、流路２１２の緩衝流路領域２１２ｆは、所望の一定量の試料を抽出できる分注機能を備える。
初期状態にセッティング後、試料２７０にサーマルサイクルを与えＰＣＲを進行させる。蛍光検出用光学プローブ２１２２による蛍光の測定は継続する。
（Ａ）まず、試料２７０を高温部２１１１（約９４℃雰囲気）に１〜３０秒間待機させる（Ｄｅｎｅｔｕｒａｔｉｏｎ：熱変性工程）。この工程により２本鎖のＤＮＡが１本鎖に変性される。
（Ｂ）次に、第１ノズル２１０１が接続された第１ポンプ２１０３を動作させ、試料２７０を中温部２１１２（約６０℃雰囲気）に移動させる。具体的には、試料２７０は、第１ポンプ２１０３の作用により、高温部２１１１から中温部２１１２の方向に押される。蛍光検出用光学プローブ２１２２による蛍光測定は継続しているので、蛍光検出用光学プローブ２１２２の測定ポイントを試料２７０が通過することによって、蛍光量がバックグラウンドのレベルから上昇し、再び下降した時点（あるいは蛍光量が下降して一定時間経過後）に第１ポンプ２１０３の動作を停止させる。また蛍光検出用光学プローブ２１２２が中温部２１１２にある場合はより確実に試料２７０を中温部２１１２に停止させることもできる。
（Ｃ）中温部２１１２では、試料２７０を３〜６０秒間待機させる（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ＋Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ：アニーリング工程＋伸長工程）。この工程によってあらかじめ試料２７０に含有されていたプライマーが結合し更に伸長したＤＮＡになる。
（Ｄ）次に、第２ノズル２１０２が接続された第２ポンプ２１０４を作動させ、試料２７０を中温部２１１２から高温部２１１１に移動させる。ポンプ動作停止のタイミングは、上記と同様に、蛍光検出用光学プローブ２１２２で測定された蛍光量の変動から判断する。試料２７０を高温部２１１１に移動後、１〜３０秒間待機させ熱変性させる。
（Ｅ）上記の（Ｂ）〜（Ｄ）を所定のサイクル数繰り返し、試料２７０にサーマルサイクルを与え、試料２７０に含まれるＤＮＡに複数サイクルの熱変性−アニーリング−伸長工程を経らせることによって、ＤＮＡの増幅を行う。サイクル数は、対象のＤＮＡやプライマー、酵素等の組合せにより適宜決定される。
所定のサイクル数のサーマルサイクルが終了後、第１ポンプ２１０３および第２ポンプ２１０４を停止し、ＰＣＲを終了させる。所定のサイクル数のサーマルサイクルが与えられているときでも、蛍光検出用光学プローブ１２２により蛍光が測定されており、試料２７０に含まれるＤＮＡが増幅するにつれ、試料２７０から検出される蛍光が増大する。これにより、試料２７０の濃度を正確に知ることができる。
本第２実施形態に係るＰＣＲ反応容器２１０によれば、第１空気連通口２２４と流路２１２との間に第１フィルタ２２８を設け、第２空気連通口２２６と流路２１２との間に第２フィルタ２３０を設けたことにより、流路２１２内のコンタミネーションを防止できる。ポンプシステム２１１０側にコンタミネーション防止の対策を施すことはコストが高くなりがちであるが、本第２実施形態のＰＣＲ反応容器２１０では、ＰＣＲ反応容器２１０側のみでコンタミネーションを防止でき、経済的である。またＰＣＲ反応容器はディスポーザブルとして使用する場合は、フィルタが常に新しいものであるので、低コストでコンタミネーションの防止がさらに図られる。さらにＰＣＲ反応容器の廃棄処分についても、試料はＰＣＲ反応容器に略封止された状態にあるので安全面や環境面でも有意義である。
また、本第２実施形態に係るＰＣＲ反応容器２１０によれば、流路２１２に緩衝流路領域を設けたことにより、ＰＣＲに供する試料の分注を行い、常に必要量の試料のみを流路２１２のサーマルサイクル領域に試料を送り込むことができる。
本第２実施形態に係るＰＣＲ装置３００では、停止時には一次側と二次側の圧力が等しくなる第１ポンプ２１０３および第２ポンプ２１０４を交互に動作させることでＰＣＲ反応容器２１０の流路２１２内で試料を往復移動させることができる。この場合、送液（流路中の試料に圧力をかける）中の試料に過剰な圧力がかからず、さらに流路内の減圧をしないため、高温部２１１１の作用による試料を含む液の蒸発や沸騰（発泡）を防止することができる。
また、本第２実施形態に係るＰＣＲ装置３００では、サーマルサイクル領域において、ＰＣＲ中も試料からの蛍光が常時モニタされている（リアルタイムＰＣＲ）。これにより、測定された蛍光量に基づいて、ＰＣＲの終了タイミングを判定できる。また、蛍光検出用光学プローブ２１２２によって蛍光の変化をモニタすることで試料の通過を知ることができ、その通過に伴う蛍光量の変化に基づいて、第１ポンプ２１０３および第２ポンプ２１０４の交互動作を制御することができるため、ＰＣＲに供する試料を正確にサーマルサイクル領域の高温部２１１１または中温部２１１２に位置決めすることができる。
一方で先述の高温部、中温部及び低温部の３水準の温度が制御された反応領域を備えるＰＣＲ反応容器とＰＣＲ装置に場合は、高温部で熱変性、中温部でアニーリングそして低温部で伸長の各工程を担わせることが可能となり、それらの制御についても上記の詳細な説明に基づいて当業者が容易に発展、改良できる事項である。また反応領域を２水準とするか３水準とするかについては、試料の特性に応じて当業者が適宜選択できるものである。
以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
上述の実施形態では、流路の両端に停止時には一次側と二次側の圧力が等しくなる一対のポンプを配置したが、流路のいずれか一方の端のみに、加圧と吸引が可能なポンプを設け、他方の端は大気圧に開放されていてもよい。すなわち、第１空気連通口または第２空気連通口を介して流路内の圧力を制御することで、サーマルサイクル領域内で試料を移動させる。この場合、１対のポンプの動作を一定のタイミングで切り替える処理が不要となるため、ポンプの制御が容易となる。
また、上述の実施形態では、高温部と中温部の中間に蛍光検出用光学プローブの測定ポイントを配置したが、高温部および中温部にそれぞれ蛍光検出用光学プローブの測定ポイントを配置してもよい。この場合、試料の位置決め精度を向上することができる。
１０、２１０ ＰＣＲ反応容器、 １２、２１２ 流路、 １４、２１４ 基板、 １６、２１６ 流路封止フィルム、 １８、２１８ 第１封止フィルム、 ２０、２２０ 第２封止フィルム、 ２２、２２２ 第３封止フィルム、 ２４、２２４ 第１空気連通口、 ２６、２２６ 第２空気連通口、 ２８、２２８ 第１フィルタ、 ３０、２３０ 第２フィルタ、 ７０、２７０ 試料、 １００、３００ ＰＣＲ装置、 １０１、２１０１ 第１ノズル、 １０２、２１０２ 第２ノズル、 １０３、２１０３ 第１ポンプ、 １０４、２１０４ 第２ポンプ、 １０５、２１０５ 第１ドライバ、 １０６、２１０６ 第２ドライバ、 １０７、２１０７ 制御部、 １１０、２１１０ ポンプシステム、 １１１、２１１１ 高温部、 １１２、２１１２ 中温部、 １２１、２１２１ ドライバ、 １２２、２１２２ 蛍光検出用光学プローブ、 １３０、２１３０ 第１ヒータドライバ、 １３１ 分岐流路、 １３２、２１３２ 第２ヒータドライバ、 １３３ 試料導入口、 １３４、２１３４ 第１ヒータ、 １３５、２１３５ 第２ヒータ、 １４１、２１４１ ＣＰＵ、 ２３１ 第１分岐流路、 ２３２ 第２分岐流路、 ２３３ 第１試料導入口、 ２３４ 第２試料導入口。
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に利用できる。

Claims (18)

  1. 基板と、
    前記基板に形成された流路と、
    前記流路の両端に設けられ、前記流路内のコンタミネーションを防止するための一対のフィルタと、
    前記フィルタを通じて前記流路と連通する一対の空気連通口と、
    ＰＣＲに供される試料を前記流路内に導入するための試料導入口と、
    前記流路における前記一対のフィルタの間に形成された、試料にＰＣＲを生じさせることが可能な異なる複数の温度領域を含むサーマルサイクル領域と、
    を備え、
    前記複数の温度領域の間で試料が繰り返し往復移動し、
    前記基板は、平行平板状の基板であり、
    前記フィルタは、前記基板よりも厚みが小さく、
    前記フィルタは、前記基板に形成されたフィルタ設置スペースに収まることを特徴とするＰＣＲ反応容器。
  2. 前記複数の温度領域は、それぞれ蛇行流路を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰＣＲ反応容器。
  3. 前記空気連通口、前記フィルタおよび前記試料導入口を封止するための封止フィルムと、
    少なくとも前記流路における前記複数の温度領域を封止するための流路封止フィルムと、
    をさらに備えることを特徴とする請求項１または２に記載のＰＣＲ反応容器。
  4. 前記サーマルサイクル領域は、試料に熱変性を生じさせる高温部と、アニーリングおよび伸長を生じさせる中温部とを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のＰＣＲ反応容器。
  5. 前記試料導入口と前記中温部との距離は、前記試料導入口と前記高温部との距離よりも短いことを特徴とする請求項４に記載のＰＣＲ反応容器。
  6. 請求項１から５のいずれかに記載のＰＣＲ反応容器と、
    前記サーマルサイクル領域の温度を調節するための温度調節部と、
    前記サーマルサイクル領域内で試料を移動させるために、前記空気連通口に接続して前記流路内の圧力を制御するポンプシステムと、
    を備えることを特徴とするＰＣＲ装置。
  7. 前記ポンプシステムは、前記一対の空気連通口にそれぞれ接続する一対のポンプを備え、
    前記ポンプは、停止時に一次側と二次側の圧力が等しくなるポンプであり、
    前記一対のポンプを交互に動作させることによって前記複数の温度領域の間で試料が繰り返し往復移動することを特徴とする請求項６に記載のＰＣＲ装置。
  8. 前記ポンプシステムは中空のニードルを備え、
    前記ニードルで前記空気連通口を封止する封止フィルムを穿孔することにより、前記ポンプシステムと前記流路とが連通することを特徴とする請求項６または７に記載のＰＣＲ装置。
  9. 前記流路内の試料から発生する蛍光を検出するための蛍光検出器をさらに備えることを特徴とする請求項６から８のいずれかに記載のＰＣＲ装置。
  10. 前記サーマルサイクル領域は、前記複数の温度領域を接続する接続領域を備え、
    前記蛍光検出器は、前記接続領域からの蛍光を検出することを特徴とする請求項９に記載のＰＣＲ装置。
  11. 前記蛍光検出器で検出された値に基づいて、前記ポンプシステムを制御するための制御部をさらに備え、
    前記制御部は、前記蛍光検出器で検出された値に基づいてＰＣＲの進捗を判定することを特徴とする請求項９または１０に記載のＰＣＲ装置。
  12. 平行平板状の基板と、
    前記基板に形成された流路と、
    前記流路の両端に形成された設置スペースに収まり、厚みが前記基板よりも厚みが小さい一対のフィルタと、
    前記フィルタを通じて前記流路と連通する一対の空気連通口と、
    ＰＣＲに供される試料を前記流路内に導入するための試料導入口と、
    前記流路における前記一対のフィルタの間に形成された、試料にＰＣＲを生じさせることが可能な異なる複数の温度領域を含むサーマルサイクル領域と、を備えるＰＣＲ反応容器を準備するステップと、
    前記サーマルサイクル領域内において、試料のＰＣＲが可能となるように前記複数の温度領域の温度をそれぞれ制御するステップと、
    前記流路内の圧力を制御するためのポンプシステムを前記空気連通口に接続するステップと、
    前記ポンプシステムを作動させることによって、前記流路内の試料にかかる圧力を制御して、前記サーマルサイクル領域内において、試料を前記複数の温度領域の間で繰り返し往復移動させて、試料にＰＣＲを生じさせるステップと、
    を備えることを特徴とするＰＣＲ方法。
  13. 前記サーマルサイクル領域は、試料に熱変性を生じさせる高温部と、アニーリングおよび伸長を生じさせる中温部とを含むことを特徴とする請求項１２に記載のＰＣＲ方法。
  14. 前記サーマルサイクル領域は、試料に熱変性を生じさせる高温部と、アニーリングを生じさせる中温部と、伸長を生じさせる低温部とを含むことを特徴とする請求項１２に記載のＰＣＲ方法。
  15. 前記ＰＣＲ反応容器は、
    前記空気連通口、前記フィルタおよび前記試料導入口を封止するための封止フィルムと、
    少なくとも前記流路における前記複数の温度領域を封止するための流路封止フィルムと、
    をさらに備えることを特徴とする請求項１２から１４のいずれかに記載のＰＣＲ方法。
  16. 前記ポンプシステムは中空のニードルを備え、
    前記ニードルで前記空気連通口を封止する封止フィルムを穿孔することにより、前記ポンプシステムと前記流路とを連通するステップをさらに備えることを特徴とする請求項１２から１５のいずれかに記載のＰＣＲ方法。
  17. 前記サーマルサイクル領域は、前記複数の温度領域を接続する接続領域を備え、
    前記接続領域内の試料から発生する蛍光を検出するステップと、
    検出された蛍光をモニタするステップと、
    をさらに備えることを特徴とする請求項１２から１６のいずれかに記載のＰＣＲ方法。
  18. 検出された蛍光の変化に基づいて、前記ポンプシステムを制御するステップをさらに備えることを特徴とする請求項１７に記載のＰＣＲ方法。
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