ES2863232T3 - Recipiente de reacción de PCR, dispositivo para PCR y procedimiento de PCR - Google Patents

Recipiente de reacción de PCR, dispositivo para PCR y procedimiento de PCR Download PDF

Info

Publication number
ES2863232T3
ES2863232T3 ES16870611T ES16870611T ES2863232T3 ES 2863232 T3 ES2863232 T3 ES 2863232T3 ES 16870611 T ES16870611 T ES 16870611T ES 16870611 T ES16870611 T ES 16870611T ES 2863232 T3 ES2863232 T3 ES 2863232T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
channel
sample
pcr
reaction vessel
pump
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16870611T
Other languages
English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nippon Sheet Glass Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Go Foton Inc
Original Assignee
Nippon Sheet Glass Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Go Foton Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=58796747&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2863232(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Nippon Sheet Glass Co Ltd, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST, Go Foton Inc filed Critical Nippon Sheet Glass Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2863232T3 publication Critical patent/ES2863232T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502723—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by venting arrangements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B01L7/525—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/08—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a stream of discrete samples flowing along a tube system, e.g. flow injection analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0689—Sealing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/14—Process control and prevention of errors
    • B01L2200/143—Quality control, feedback systems
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/041—Connecting closures to device or container
    • B01L2300/044—Connecting closures to device or container pierceable, e.g. films, membranes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0883—Serpentine channels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/14—Means for pressure control
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un procedimiento de PCR que comprende el paso de: · preparar un recipiente de reacción de PCR (10), comprendiendo el citado recipiente de reacción : un sustrato (14); un canal (12) formado sobre el sustrato (14); un par de filtros (28, 30) proporcionados en los extremos respectivos del canal (12) en el sustrato; un par de puertos de comunicación de aire (24, 26) que se encuentran en comunicación con el canal (12) a través de los filtros respectivos (28, 30); una región de ciclo térmico (12e) formada entre el par de filtros (28, 30) en el canal (12), incluyendo la re- gión de ciclo térmico (12e) una parte de temperatura alta (111) y una parte de temperatura media (112); un punto de ramificación (112c) formado entre el par de filtros (28, 30) en el canal (12); un canal ramificado (131) cuyo extremo está conectado al punto de ramificación (112c); y. un puerto de introducción de la muestra (133) formado en el otro extremo del canal ramificado (131) en el sustrato, el procedimiento comprende además los pasos de: - introducir una muestra en el recipiente de reacción de PCR (10) a través del puerto de introducción de muestra (133); - colocar el recipiente de reacción de PCR (10) en un dispositivo para PCR (100) provisto de una bomba (103, 104); - conectar una boquilla (101, 102) de la bomba (103, 104) a los puertos de comunicación de aire (24, 26); - detectar la fluorescencia generada desde la muestra en la región de ciclo térmico (12e); - mover una muestra en la región de ciclo térmico (12e) entre la parte de temperatura alta (111) y la parte de temperatura media (112) controlando la presión dentro del canal (12) por medio de la bomba (103, 104) en base a un cambio en la cantidad de fluorescencia, mientras una muestra no sometida a PCR permanece en el canal ramificado (131); y. detectar, mediante la monitorización de la fluorescencia de la muestra dentro de la región de ciclo térmico (12e), el progreso de la reacción de la muestra en tiempo real.

Description

DESCRIPCIÓN
Recipiente de reacción de PCR, dispositivo para PCR y procedimiento de PCR
Campo Técnico
La presente invención se refiere a los procedimientos de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) en los cuales se utilizan los recipientes de reacción de PCR.
Técnica Anterior
Las pruebas genéticas se utilizan ampliamente para realizar exámenes en una amplia variedad de campos médicos, identificación de productos agrícolas y microorganismos patógenos, evaluación de la seguridad de los productos alimenticios, e incluso para exámenes de virus patógenos y una variedad de enfermedades infecciosas. Con el fin de detectar con alta sensibilidad una cantidad diminuta de ADN de los genes, se conocen procedimientos de análisis del resultado obtenido amplificando una porción de ADN. Sobre todo, un procedimiento de PCR es una tecnología destacable en la que una cierta porción de una cantidad muy pequeña de ADN recogida de un organismo o similar se amplifica selectivamente. En un procedimiento de PCR, se aplica un ciclo térmico predeterminado a una muestra en el que se mezclan una muestra biológica que contiene ADN y un reactivo de pCr compuesto por iniciadores, enzimas y similares para provocar reacciones tales como desnaturalización, recocido y elongación que deben ser repetidas de modo que una porción específica del ADN es amplificada selectivamente.
Es una práctica común realizar un procedimiento de PCR poniendo una cantidad predeterminada de una muestra objetivo en un tubo de PCR o en un recipiente de reacción tal como una micro placa (micro pocillos) en la que hay formados una pluralidad de orificios. Sin embargo, en los últimos años, se ha puesto en uso práctico realizar un procedimiento de PCR mientras se utiliza un recipiente de reacción (también conocido como "chip") provisto de con un micro - canal que está formado sobre un sustrato. En cualquier recipiente de reacción, el progreso de varias tec­ nologías permite que se proporcione un ciclo térmico predeterminado con alta velocidad y alta precisión en el reci­ piente de reacción.
El documento de patente núm. 1 revela un recipiente de reacción en el que hay formado un canal para realizar la PCR. En este recipiente de reacción, el canal está formado entre dos sustratos de resina superpuestos, y un puerto de introducción de muestra para introducir una muestra en el canal y un puerto de descarga de muestra para des­ cargar la muestra a través de orificios pasantes formados en los sustratos de resina. En una porción rebajada en la superficie trasera de un sustrato de resina, se dispone una unidad de ajuste de temperatura que consiste, por ejem­ plo, en un elemento Peltier o similar. Una boquilla está dispuesta en el puerto de introducción de muestra del reci­ piente de reacción y la muestra se puede mover en el canal alimentando y/o aspirando el aire a través de la boquilla. Documento de patente número 1 : Publicación Japonesa de Solicitud de Patente Núm. 2009 - 232700.
Los documentos US 2012/178091 y WO 2008/147382 revelan procedimientos de PCR utilizando cartuchos de reac­ ción.
Divulgación de la invención
Problema a ser resuelto por la invención
En un procedimiento de PCR, es necesario evitar la contaminación en el sistema desde el exterior durante el proce­ samiento de una muestra. Si una contaminación incluye piezas biológicas o similares que no sean las de un objeto que se va a procesar, existe la posibilidad de amplificar el ADN contenido en las piezas biológicas que no sean las del objeto que se va a procesar. En este caso, el análisis que sigue no se puede realizar con precisión utilizando la muestra que se va a procesar. Por lo tanto, después de introducir la muestra en el recipiente de reacción, es necesa­ rio tomar medidas para evitar la contaminación.
Sin embargo, en la invención divulgada en el documento de patente Núm. 1, por ejemplo, si las piezas biológicas distintas de las del objeto a ser procesado están unidas a la boquilla o a una bomba que envía el aire a la boquilla, las piezas biológicas distintas de las del objeto que se va a procesar pueden entrar en el recipiente de reacción a través del puerto de introducción de muestra y, por lo tanto, se puede producir una contaminación. Además, no es realista por los aspectos de costo y ambientales desechar las boquillas, las partes de la punta de las bombas, los accesorios, y otros elementos similares cada vez que se realiza un proceso de PCR.
Con estos antecedentes, un propósito de la presente invención es proporcionar un recipiente de reacción de PCR capaz de prevenir adecuadamente la contaminación y un dispositivo para PCR y un procedimiento de PCR en el cual es utilizado el recipiente de reacción de PCR.
Medios para solucionar el problema
Un recipiente de reacción de PCR de acuerdo con una realización de la presente descripción incluye: un sustrato; un canal formado en el sustrato; un par de filtros proporcionados en los respectivos extremos del canal; un par de puer­ tos de comunicación de aire que se comunican con el canal a través de los filtros respectivos; una región de ciclo térmico formada entre el par de filtros en el canal; un punto de ramificación formado entre el par de filtros en el canal; un canal ramificado cuyo un extremo está conectado al punto de ramificación; y un puerto de introducción de mues­ tra formado en el otro extremo del canal ramificado.
El recipiente de reacción de PCR puede comprender además un segundo punto de ramificación formado entre el par de filtros en el canal; un segundo canal ramificado cuyo un extremo está conectado al segundo punto de ramifica­ ción; y un segundo puerto de introducción de muestra formado en el otro extremo del segundo canal ramificado. El recipiente de reacción de PCR puede incluir además una región de canal tampón formada entre el primer punto de ramificación y el segundo punto de ramificación en el canal.
Solamente como referencia, la región de canal tampón puede ajustarse para que tenga un volumen predeterminado de acuerdo con la cantidad de una muestra en la que se pretende realizar un proceso de PCR.
Solamente como referencia, la región de ciclo térmico puede incluir un canal en serpentina. La región de ciclo térmi­ co puede estar provista de un par de regiones de reacción, incluyendo cada una un canal en serpentina y con una región de conexión que conecte el par de regiones de reacción.
Se puede proporcionar adicionalmente una película de sellado para sellar los puertos de comunicación de aire y los puertos de introducción de muestra.
La película de sellado puede estar formada de tal manera que la película de sellado pueda ser perforada con una aguja.
Como referencia únicamente, un dispositivo para PCR podrá incluir: el recipiente de reacción de PCR que se ha descrito más arriba; una unidad de ajuste de la temperatura para ajustar la temperatura de la región de ciclo térmico; y un sistema de bomba que controla la presión en el interior del canal por medio de los puertos de comunicación de aire con el fin de mover la muestra dentro de la región de ciclo térmico.
El sistema de bomba puede estar provisto de una bomba de aire de un tipo que permita que la presión en un lado primario y la presión en un lado secundario sean iguales una a la otra cuando está parada.
La bomba de aire puede estar provista de una boquilla con una aguja hueca en la punta de la boquilla.
El dispositivo para PCR puede incluir además un detector de fluorescencia para detectar la fluorescencia generada desde la muestra en el interior del canal.
El dispositivo para PCR puede incluir además una unidad de control para controlar el sistema de bomba en función de un valor detectado por el detector de fluorescencia.
Como referencia solamente, un procedimiento de PCR puede incluir: preparar un recipiente de reacción de PCR que incluya: un sustrato; un canal formado en el sustrato; un par de filtros dispuestos en los extremos respectivos del canal; un par de puertos de comunicación de aire que se comunican con el canal a través de los filtros respectivos; una región de ciclo térmico formada entre el par de filtros en el canal; un punto de ramificación formado entre el par de filtros en el canal; un canal ramificado cuyo un extremo está conectado al punto de ramificación; y un puerto de introducción de muestra formado en el otro extremo del canal ramificado; introducir una muestra en el recipiente de reacción de PCR a través del puerto de introducción de muestra; colocar el recipiente de reacción de pCr en un dispositivo para PCR provisto de una bomba; conectar una boquilla de la bomba a los puertos de comunicación de aire; y mover una muestra en la región de ciclo térmico controlando la presión en el interior del canal por la bomba. Una muestra no sometida a PCR puede permanecer en el canal ramificado en el movimiento de una muestra.
Como referencia solamente, un método para la PCR puede incluir: preparar un recipiente de reacción de PCR que incluya: un sustrato; un canal formado en el sustrato; un par de filtros proporcionados en los extremos respectivos del canal; un par de puertos de comunicación de aire que se comunican con el canal a través de los filtros respecti­ vos; una región de ciclo térmico formada entre el par de filtros en el canal; un primer punto de ramificación formado entre el par de filtros en el canal; un primer canal ramificado cuyo un extremo está conectado al primer punto de ramificación; un primer puerto de introducción de muestra formado en el otro extremo del primer canal ramificado; un segundo punto de ramificación formado entre el par de filtros en el canal; un segundo canal ramificado cuyo un ex­ tremo está conectado al segundo punto de ramificación; y un segundo puerto de introducción de muestra formado en el otro extremo del segundo canal ramificado; introducir una muestra en el recipiente de reacción de PCR a través del primer puerto de introducción de muestra y el segundo puerto de introducción de muestra; colocar el recipiente de reacción de PCR en un dispositivo para PCR provisto de una bomba; conectar una boquilla de la bomba a los puertos de comunicación de aire; y mover una muestra en la región de ciclo térmico controlando la presión en el interior del canal por medio de la bomba.
El recipiente de reacción de PCR puede incluir además una región de canal tampón formada entre el primer punto de ramificación y el segundo punto de ramificación del canal, y el procedimiento de PCR que se ha descrito más arriba puede incluir además: dispensar la muestra utilizando la región de canal tampón.
Una muestra no sometida a PCR puede permanecer en el primer canal ramificado y en el segundo canal ramificado en el movimiento de una muestra.
Ventaja de la invención
De acuerdo con la presente revelación, se describe un recipiente de reacción de PCR que puede impedir adecua­ damente la contaminación y un dispositivo para PCR y un procedimiento de PCR en el que se utiliza el recipiente de reacción de PCR.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A y 1B son diagramas para explicar un recipiente de reacción de PCR de acuerdo con una primera realización de la presente invención ;
la figura 2 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR que se muestra en la figu­ ra 1A que está seccionado a lo largo de la línea A - A;
la figura 3 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR que se muestra en la figu­ ra 1A que está seccionado a lo largo de la línea B - B;
la figura 4 es una vista en planta de un sustrato proporcionado en el recipiente de reacción de PCR de acuerdo con la primera realización;
la figura 5 es un diagrama conceptual para explicar la configuración del recipiente de reacción de PCR de acuerdo con la primera realización;
la figura 6 es un diagrama que muestra esquemáticamente una condición en la que se introduce una mues­ tra en el recipiente de reacción de PCR en la primera realización;
la figura 7 es un diagrama que muestra un estado en el que una tercera película de sellado se vuelve a unir al sustrato en la primera realización;
la figura 8 es un diagrama para explicar un dispositivo para PCR en el que se utiliza el recipiente de reac­ ción de PCR de acuerdo con la primera realización;
la figura 9 es un diagrama para explicar un estado en el que el recipiente de reacción de PCR se coloca en una posición predeterminada del dispositivo para PCR en la primera realización;
la figura 10 es un diagrama que muestra una condición en la que una boquilla de un sistema de bomba y un puerto de comunicación de aire del recipiente de reacción de PCR están conectados en la primera realiza­ ción;
la figura 11 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR que se muestra en la fi­ gura 10 que está seccionado a lo largo de la línea C - C;
la figura 12 es un diagrama que muestra una condición en la que el sistema de bomba se opera para mover la muestra en la primera realización;
las figuras 13A y 13B son diagramas para explicar un recipiente de reacción de PCR de acuerdo con una segunda realización de la presente invención ;
la figura 14 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR que se muestra en la fi­ gura 13A, que está seccionado a lo largo de la línea A - A;
la figura 15 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR que se muestra en la fi­ gura 13A, que está seccionado a lo largo de la línea B - B;
la figura 16 es una vista en planta de un sustrato proporcionado en el recipiente de reacción de PCR de acuerdo con la segunda realización;
la figura 17 es un diagrama conceptual para explicar la configuración del recipiente de reacción de PCR de acuerdo con la segunda realización;
la figura 18 es un diagrama que muestra esquemáticamente una condición en la que se introduce una muestra en el recipiente de reacción de PCR en la segunda realización;
la figura 19 es un diagrama que muestra un estado en el que una tercera película de sellado se vuelve a unir al sustrato en la segunda realización;
la figura 20 es un diagrama para explicar un dispositivo para PCR en el que se utiliza el recipiente de reac­ ción de PCR de acuerdo con la segunda realización;
la figura 21 es un diagrama para explicar un estado en el que el recipiente de reacción de PCR se dispone en una posición predeterminada del dispositivo para PCR en la segunda realización;
la figura 22 es un diagrama que muestra una condición en la que una boquilla de un sistema de bomba y un puerto de comunicación de aire del recipiente de reacción de PCR están conectados en la segunda realiza­ ción;
la figura 23 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR que se muestra en la fi­ gura 22, que está seccionado a lo largo de la línea C - C; y.
la figura 24 es un diagrama que muestra una condición en la que el sistema de bomba es operado para mover la muestra en la segunda realización.
Modo para realizar la invención
En lo que sigue se dará una explicación con respecto a un recipiente de reacción de PCR y un dispositivo para PCR de acuerdo con una realización de la presente revelación. Los mismos elementos, miembros y procesos constituti­ vos o equivalentes ilustrados en cada dibujo se denotarán con los mismos números de referencia, y las explicacio­ nes duplicadas se omitirán apropiadamente. Se debe entender que no todas las características y la combinación de las mismas explicadas son esenciales para la invención.
Primera realización
Las figuras 1A y 1B son diagramas para explicar un recipiente de reacción de PCR 10 de acuerdo con una primera realización de la presente invención. La figura 1A es una vista en planta del recipiente de reacción de PCR 10, y la figura 1B es una vista frontal del recipiente de reacción de PCR 10. La figura 2 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR 10 que se muestra en la figura 1A que está seccionado a lo largo de la línea A -A. La figura 3 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR 10 que se muestra en la figura 1A que está seccionado a lo largo de la línea B - B. La figura 4 es una vista en planta de un sustrato 14 proporciona­ do en el recipiente de reacción de PCR 10. La figura 5 es un diagrama conceptual para explicar la configuración del recipiente de reacción de PCR 10.
El recipiente de reacción de PCR 10 comprende un sustrato resinoso 14 que tiene un canal en forma de ranura 12 formado en una superficie inferior 14a del mismo, una película de sellado 16 del canal, que se une a la superficie inferior 14a del sustrato 14, para sellar el canal 12, y tres películas de sellado (una primera película de sellado 18, una segunda película de sellado 20 y una tercera película de sellado 22) adheridas a una superficie superior 14b del sustrato 14.
El sustrato 14 está formado preferentemente de un material que tiene buena conductividad térmica, es estable bajo cambios de temperatura, y es resistente a una solución de muestra que se utiliza. Además, el sustrato 14 se forma preferentemente de un material que tiene buena capacidad de moldeo, unas buenas transparencia y propiedad de barrera, y una baja propiedad de auto - fluorescencia. Para un material de este tipo, son preferibles un material inor­ gánico tales como el vidrio, silicio, una resina como acrílico, poliéster, silicona, y en particular cicloolefina. Un ejem­ plo de dimensiones del sustrato 14 incluye un lado largo de 70 mm, un lado corto de 42 mm y un grosor de 3 mm. Un ejemplo de las dimensiones del canal 12 formado en la superficie inferior 14a del sustrato 14 incluye una anchura de 0,5 mm y una profundidad de 0,5 mm.
Como se ha descrito más arriba, el canal en forma de ranura 12 está formado en la superficie inferior 14a del sustra­ to 14, y este canal 12 se sella mediante la película 16 de sellado del canal (ver la figura 2). Un primer puerto de co­ municación de aire 24 está formado en la posición de un extremo 12a del canal 12 en el sustrato 14. Se forma un segundo puerto de comunicación de aire 26 en la posición del otro extremo 12b del canal 12 en el sustrato 14. El par, el primer puerto de comunicación de aire 24 y el segundo puerto de comunicación de aire 26, están formados de modo que queden expuestos en la superficie superior 14b del sustrato 14. Un sustrato de este tipo puede ser produ­ cido por moldeo por inyección o por trabajos de corte con una máquina de procesamiento NC u otros procedimientos disponibles.
Se proporciona un primer filtro 28 entre el primer puerto de comunicación de aire 24 y un extremo 12a del canal 12 en el sustrato 14 (ver la figura 2). Se proporciona un segundo filtro 30 entre el segundo puerto de comunicación de aire 26 y el otro extremo 12b del canal 12 en el sustrato 14. El par, el primer filtro 28 y el segundo filtro 30, propor­ cionados en los extremos respectivos del canal 12, tienen buenas características de baja impureza y también permi­ ten que solo el aire pase a través de los mismos para evitar la contaminación de tal manera que la calidad del ADN amplificado por PCR no se deteriore. Como material filtrante, el polietileno y el PTFE son adecuados, y el material filtrante puede ser poroso o hidrófobo. Con respecto a las dimensiones del primer filtro 28 y del segundo filtro 30, el primer filtro 28 y el segundo filtro 30 se forman de manera que se ajusten sin ningún espacio de separación en un espacio de instalación del filtro formado en el sustrato 14.
En un punto de ramificación 112c situado entre el primer filtro 28 y el segundo filtro 30, se forma un canal ramificado 131 en el sustrato 14 que se ramifica desde el canal 12. Se forma un puerto de introducción de muestra 133 en la posición de un extremo terminal 31A del canal ramificado 131 en el sustrato 14 (ver la figura 3). El puerto de intro­ ducción de muestra 133 se forma de modo que quede expuesto sobre la superficie superior 14b del sustrato 14.
Una sección del canal 12 que está situada entre el primer filtro 28 y el punto de ramificación 112c forma una región de ciclo térmico 12e destinada a una región de temperatura alta y a una región de temperatura media con el fin de aplicar un ciclo térmico a la muestra. La región de ciclo térmico 12e del canal 12 incluye un canal en serpentina. Esto sirve para proporcionar de forma eficaz la cantidad de calor proporcionada por el dispositivo para PCR durante un paso de pCr a una muestra y para permitir que el volumen de una muestra que puede someterse a la PCR sea una cantidad determinada o superior. En la primera realización, el punto de ramificación 112c se proporciona entre la región de ciclo térmico 12e y el segundo filtro 30. Sin embargo, puesto que el punto 112c de la ramificación se refie­ re a la introducción de una muestra sometida a PCR a través del canal ramificado 131 y del puerto de introducción de muestra 133, que están conectados al punto de ramificación 112c, no hay ningún problema funcional mientras el punto de ramificación 112c esté formado entre el primer filtro 28 y el segundo filtro 30. Puesto que el recipiente de reacción de PCR 10 está destinado a instalarse en el dispositivo para PCR, para proporcionar un ciclo térmico a una muestra, y para medir las propiedades ópticas tales como la fluorescencia emitida por la muestra, la disposición de cada elemento, incluidos los canales y el punto de ramificación, debe ser seleccionada arbitrariamente teniendo en cuenta también, por ejemplo, la disposición de una unidad de ajuste de temperatura y una sonda para la detección de fluorescencia, que se describirán más adelante. En la primera realización, el punto de ramificación 112c está dispuesto en el lado más cercano al segundo filtro 30, y la región de ciclo térmico está dispuesta entre el punto de ramificación 112c y el primer filtro 28. Por lo tanto, la distancia en el canal entre el punto de ramificación 112c y el primer filtro 28 puede mantenerse relativamente grande, y se forma un espacio para disponer eficazmente la unidad de ajuste de temperatura, cuando se instala en la región de ciclo térmico y también en el dispositivo para PCR. Por el contrario, cuando el punto 112c de la ramificación está dispuesto en el lado más próximo al primer filtro 28, se puede considerar más razonable formar la región de ciclo térmico 12e entre el punto 112c de la ramificación y el segundo filtro 30.
En el recipiente de reacción de PCR 10 de acuerdo con la primera realización, la mayor parte del canal 12 está for­ mada en forma de una ranura expuesta sobre la superficie inferior 14a del sustrato 14. Esto permite un moldeado más fácil por medio de moldeo por inyección con un molde de metal. Para hacer uso de esta ranura como canal, la película de sellado 16 del canal está unida en la superficie inferior 14a del sustrato 14. La película de sellado del canal 16 puede ser pegajosa en una de las superficies principales de la misma o puede tener una capa funcional que exhibe pegajosidad o adhesividad al presionar, que está formada sobre una de las superficies principales. Por lo tanto, la película de sellado del canal 16 tiene una función de ser fácilmente capaz de convertirse en integral con la superficie inferior 14a del sustrato 14 mientras está en contacto estrecho con la superficie inferior 14a. La película de sellado 16 del canal está formada de forma deseable de un material, incluyendo un adhesivo, que tiene una propie­ dad de auto - fluorescencia baja. En lo que a esto se refiere, es conveniente una película transparente hecha de una resina tal como un polímero de cicloolefina, poliéster, polipropileno, polietileno o acrilato. Además, la película de sellado 16 del canal puede estar formada por un vidrio o resina similar a una placa. Puesto que se puede esperar rigidez en este caso, la película de sellado 16 del canal es útil para evitar el distorsionado y la deformación del reci­ piente de reacción de PCR 10.
Además, en el recipiente de reacción de PCR 10 de acuerdo con la primera realización, el primer puerto de comuni­ cación de aire 24, el segundo puerto de comunicación de aire 26, el primer filtro 28, el segundo filtro 30 y el puerto de introducción 133 de la muestra están expuestos sobre la superficie superior 14b del sustrato 14. Por lo tanto, para sellar el primer puerto de comunicación de aire 24 y el primer filtro 28, la primera película de sellado 18 se une a la superficie superior 14b del sustrato 14. Además, para sellar el segundo puerto de comunicación de aire 26 y el se­ gundo filtro 30, la segunda película de sellado 20 se une a la superficie superior 14b del sustrato 14. Además, para sellar el puerto de introducción 133 de la muestra, la tercera película de sellado 22 se une a la superficie superior 14b del sustrato 14.
La primera película de sellado 18 que se utiliza tiene un tamaño que puede sellar el primer puerto de comunicación de aire 24 y el primer filtro 28 al mismo tiempo, y la segunda película de sellado 20 que se utiliza tiene un tamaño que puede sellar el segundo puerto de comunicación de aire 26 y el segundo filtro 30 al mismo tiempo. Una bomba de presión (que se describirá más adelante) se conecta al primer puerto de comunicación de aire 24 y al segundo puerto de comunicación de aire 26 perforando el primer puerto de comunicación de aire 24 y el segundo puerto de comunicación de aire 26 con una aguja hueca (aguja de jeringa con punta afilada) en la punta de la bomba. Por lo tanto, la primera película de sellado 18 y la segunda película de sellado 20 son preferentemente películas hechas de un material que es fácilmente perforado por la aguja y/o tienen un grosor que es fácilmente perforado por la aguja. En la primera realización, las películas de sellado se describen de manera que cada una tenga un tamaño que per­ mita el sellado de un puerto de comunicación de aire y un filtro que están implicados al mismo tiempo. Sin embargo, estos puertos y filtros de comunicación de aire pueden ser sellados por separado. Alternativamente, se puede utilizar una película de sellado que pueda sellar el primer puerto de comunicación de aire 24, el primer filtro 28, el segundo puerto de comunicación de aire 26 y el segundo filtro 30 todos a la vez (por una única lámina).
Como tercera película de sellado 22, se utiliza una película de sellado de un tamaño que permite el sellado del puer­ to de introducción de muestra 133. La introducción de una muestra en el canal 12 a través del puerto de introducción de muestra 133 se realiza despegando una vez la tercera película de sellado 22 del sustrato 14, y, después de la introducción de una cantidad predeterminada de muestra, la tercera película de sellado 22 se vuelve a colocar sien­ do fijada de nuevo a la superficie superior 14b del sustrato 14. Por lo tanto, como tercera película de sellado 22 se desea una película que sea lo suficientemente pegajosa para mantenerse a lo largo de varios ciclos de fijación y despegado. Alternativamente, como tercera película de sellado 22, se puede unir una nueva película después de la introducción de una muestra. En este caso, la importancia de la propiedad relacionada con la unión y el despegado puede disminuir.
Además, en el momento de la introducción de una muestra, es necesario despegar una vez ya sea la primera pelícu­ la de sellado 18 o la segunda película de sellado 20 de la misma manera que con la tercera película de sellado 22. Esto se debe a que la muestra no entra en el canal si no se crea una salida de aire. Por lo tanto, la primera película de sellado 18 y la segunda película de sellado 20 son películas deseables que son lo suficientemente pegajosas como para mantenerse a lo largo de varios ciclos de fijación y despegado. Como alternativa, se puede unir una nue­ va película después de la introducción de una muestra.
Del mismo modo que en la película de sellado 16 del canal, la primera película de sellado 18, la segunda película de sellado 20, y la tercera película de sellado 22 pueden tener una capa adhesiva o una capa funcional que exhibe pegajosidad o adhesividad presionando, que están formadas en una de las superficies principales de la misma. La primera película de sellado 18, la segunda película de sellado 20, y la tercera película de sellado 22 están constitui­ das de forma deseable por un material, incluyendo un adhesivo, que tiene una propiedad de auto - fluorescencia baja. En lo que a esto se refiere, es conveniente una película transparente hecha de una resina tal como cicloolefina, poliéster, polipropileno, polietileno o acrilato. Como se ha descrito más arriba, la propiedad como la pegajosidad no se degrada hasta tal punto que el uso se vea afectado incluso después de pegar y despegar varias veces. Sin em­ bargo, en el caso de que se junte una nueva película después del despegado y la introducción de una muestra, la importancia de esta propiedad relacionada con la fijación y despegado puede reducirse.
A continuación se dará una explicación referente a un procedimiento de uso del recipiente de reacción de PCR 10 configurado que se ha descrito más arriba. En primer lugar, se prepara una muestra que se amplificará por medio de un ciclo térmico. La muestra incluye aquellos obtenidos añadiendo una pluralidad de tipos de iniciadores, una enzi­ ma termoestable y cuatro tipos de trifosfatos desoxirribonucleósidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) como reactivos de PCR a una mezcla que contiene dos o más tipos de ADN. A continuación, la primera película de sellado 18 y la ter­ cera película de sellado 22 se despegan del sustrato 14 de forma que el primer puerto de comunicación de aire 24 y el puerto de introducción de muestra 133 estén abiertos. En el caso de que la primera película de sellado 18 sea de un tamaño que pueda sellar el primer puerto de comunicación de aire 24 y el primer filtro 28 al mismo tiempo, la primera película de sellado 18 se puede despegar completamente del sustrato 14 de manera que el primer puerto de comunicación de aire 24 y el primer filtro 28 estén abiertos al aire atmosférico. Sin embargo, abrir solo el primer puerto de comunicación de aire 24 sin despegar completamente la primera película de sellado 18 del sustrato 14 es eficaz en la prevención de la contaminación, ya que el primer filtro 28 no está expuesto al aire atmosférico. Además, en el caso de utilizar una película de sellado capaz de sellar por separado el primer puerto de comunicación de aire 24 y el primer filtro 28, el primer filtro 28 no se expone al aire atmosférico de la misma manera, y por lo tanto la pelí­ cula es eficaz en la prevención de la contaminación.
La muestra se introduce a continuación en el puerto de introducción de muestra 133 por medio de un gotero, una jeringa u otros medios. La figura 6 muestra esquemáticamente una condición en la que se introduce una muestra 70 en el recipiente de reacción de PCR 10. En la figura 6, para resaltar la posición de la muestra 70, la muestra 70 se presenta por medio de una línea continua más gruesa que la del canal 12. Se debe tener en cuenta que la línea continua no indica un estado en el que la muestra 70 rebosa fuera del canal.
Como se presenta en la figura 6, la muestra 70 introducida en el puerto de introducción de muestra 133 llena el ca­ nal al ser empujada por un gotero, una jeringa u otros medios, o por un fenómeno capilar. La muestra 70 en empa­ quetada en la dirección de la región de ciclo térmico 12e (en la dirección del primer puerto de comunicación de aire 24) más allá del punto de ramificación 112c del canal 12. Sin embargo, la muestra 70 no está empaquetada en la dirección del segundo puerto de comunicación de aire 26 más allá del punto 112c de la ramificación. Esto es porque el segundo puerto de comunicación de aire 26 está sellado de tal manera que no hay salida para que el aire escape.
A continuación, como se representa en la figura 7, la primera película de sellado 18 y la tercera película de sellado 22 se conectan al sustrato 14 de nuevo para sellar el primer puerto de comunicación de aire 24 y el puerto de intro­ ducción 133 de la muestra. Como se ha descrito más arriba, se pueden unir una nueva primera película de sellado 18 y una nueva tercera película de sellado 22. Con ello se completa la introducción de la muestra 70 en el recipiente de reacción de PCR 10.
La figura 8 es un diagrama para explicar un dispositivo para PCR 100 en el que se utiliza el recipiente de reacción de PCR 10. La figura 9 es un diagrama para explicar un estado en el que el recipiente de reacción de PCR 10 se coloca en una posición predeterminada del dispositivo para PCR 100.
El dispositivo para PCR 100 está provisto de una sonda óptica de detección de fluorescencia 122, un primer calen­ tador 134 y un segundo calentador 135. Como se representa en la figura 9, en el recipiente de reacción de PCR 10, dos regiones de reacción de la región de ciclo térmico 12e del canal 12 están dispuestas en el primer calentador 134 y en el segundo calentador 135, respectivamente, y la sonda óptica de detección de fluorescencia 122 se instala en el dispositivo para PCR 100 para que se encuentre en una región de conexión entre las dos regiones de reacción.
El dispositivo para PCR 100 está provisto además de un sistema de bomba 110 para hacer que la muestra 70 se mueva con movimiento alternativo en la región de ciclo térmico 12e. Este sistema de bomba 110 se suministra con una primera boquilla 101, una segunda boquilla 102, una primera bomba 103, una segunda bomba 104, un accionador 105 de la primera de bomba, un accionador 106 de la segunda de bomba y una unidad de control 107. La prime­ ra boquilla 101 del sistema de bombeo 110 está conectada al primer puerto de comunicación de aire 24 del recipien­ te de reacción de PCR 10, y la segunda boquilla 102 del sistema de bombeo 110 está conectada al segundo puerto de comunicación de aire 26 del recipiente de reacción de PCR 10. Más adelante se describirá un procedimiento específi
En el dispositivo para PCR 100 de acuerdo con la primera realización, el primer calentador 134 y el segundo calen­ tador 135 se ajustan a diferentes temperaturas. Cada calentador proporciona la cantidad de calor para controlar individualmente las temperaturas de las dos regiones de reacción en la región de ciclo térmico 12e y tiene un área que cubre el área de cada una de las regiones de reacción. Además, cada calentador puede ser un medio o una estructura tal como un calentamiento resistivo o un elemento Peltier. Por ejemplo, el primer calentador 134 es con­ trolado por el primer accionador 130 del calentador para mantener la temperatura de la región de reacción en el lado derecho de la página de figura en la región de ciclo térmico 12e del canal 12 para sea constantemente de 94°C. Además, el segundo calentador 135 es controlado por el segundo accionador 132 del calentador para mantener la temperatura de la región de reacción en el lado izquierdo de la página de figura para que sea constantemente de 60°C. La temperatura de cada región de reacción puede medirse por medio de un sensor de temperatura (no mos­ trado), tal como un termopar, y la salida a cada resistencia puede ser controlada por cada accionador en función de una señal eléctrica que proviene de la misma. De esta manera, el primer calentador 134, el segundo calentador 135, el primer accionador 130 de calentador, el segundo accionador 132 de calentador, y el sensor de temperatura puede constituir una unidad de ajuste de temperatura para ajustar la temperatura de la región de ciclo térmico 12e y puede incluir otros elementos que mejoren el control de la temperatura. En lo que sigue, la región de reacción a la tempera­ tura de la atmósfera a 94°C en el canal 12 se denomina "parte de temperatura alta 111", y la región de reacción a la temperatura de la atmósfera a 60°C en el canal 12 se denomina "parte de temperatura media 112". Además, en la presente realización, se dará una explicación detallada con respecto a un dispositivo para PCR que está provisto de un recipiente de reacción de PCR provisto con una región de ciclo térmico en el que los rangos de temperatura de dos niveles se establecen como dos regiones de reacción y se proporciona con una unidad de control de temperatu­ ra. Sin embargo, el dispositivo para PCR puede suministrarse con un recipiente de reacción de PCR provisto de una región de ciclo térmico en la que se pueden establecer rangos de temperatura de tres o más niveles y que está pro­ visto de una unidad de control de temperatura. En este caso, (aunque no se muestra), por ejemplo, el dispositivo para PCR puede ser suministrado con un recipiente de reacción de PCR provisto de regiones de reacción en las que una parte de temperatura baja, una parte de temperatura media, y una parte de temperatura alta está dispuestas desde el lado izquierdo de la página de la figura y con una unidad de control de temperatura. En tal caso, por ejem­ plo, la parte de temperatura baja, la parte de temperatura media y la parte de temperatura alta se controlan para mantener 50 a 70°C, a 72°C, y 94°C, respectivamente.
El sistema de bombas 110 está dispuesto para hacer que la muestra 70 realice un movimiento alternativo dentro de la región de ciclo térmico 12e del canal 12, como se ha descrito más arriba. Operando alternativamente la primera bomba 103 y la segunda bomba 104 por medio del accionador 105 de la primera bomba y el accionador 106 de la segunda bomba en una determinada condición por la unidad de control 107, la muestra 70 puede ser movida alter­ nativamente entre la parte de temperatura alta 111 y la parte de temperatura media 112 del canal 12, y un ciclo tér­ mico puede ser aplicado a la muestra 70 bajo una condición determinada. En el dispositivo para PCR 100 de acuer­ do con la primera realización, la primera bomba 103 y la segunda bomba 104 son bombas de aire o bombas sopla­ doras de un tipo en el que, cuando tanto la primera bomba 103 y la segunda bomba 104 se detienen, las presiones atmosféricas en un lado primario y en un lado secundario se vuelven instantáneamente iguales una a la otra, y cuando se detienen la primera bomba 103 y la segunda bomba 104, la presión atmosférica en el lado primario y la presión atmosférica en el lado secundario son iguales una a la otra. Si no se utiliza este tipo de bomba, es decir, si se utiliza una bomba que mantiene la presión inmediatamente precedente incluso cuando se detiene, existe la posi­ bilidad de que se produzca un fenómeno en el que la muestra continúe moviéndose ligeramente incluso cuando se detenga la bomba, de modo que la muestra no se detenga en una región de reacción predeterminada y la tempera­ tura de la muestra no se pueda controlar adecuadamente. Por otra parte, en el dispositivo para PCR 100 de acuerdo con la primera realización, el aire externo y el canal del recipiente de reacción de PCR se comunican uno con el otro en términos de presión atmosférica cuando se detiene (cuando se abre), teniendo la misma presión atmosférica; sin embargo, puesto que se proporciona un filtro entre el puerto de comunicación de aire y el canal, se puede evitar la contaminación en el canal.
La muestra 70 puede someterse a PCR por el ciclo térmico que se ha descrito más arriba, y se puede detectar la fluorescencia de la muestra 70 en el canal, y el valor de la misma puede ser utilizado como un índice que sirve como información para determinar el progreso de la PCR o la terminación de la reacción. Como la sonda óptica de detec­ ción de fluorescencia 122 y el accionador 121, se puede utilizar el detector de fluorescencia de tipo fibra óptica FLE -510 (fabricado por Nippon Sheet Glass Co., Ltd.), que es un sistema óptico muy compacto que permite la medición rápida y la detección de fluorescencia independientemente de una atmósfera de luz y/o oscuridad. Este detector de fluorescencia de tipo de fibra óptica también se puede disponer fácilmente en un espacio estrecho entre las dos regiones de reacción en la región de ciclo térmico. Este detector de fluorescencia de tipo de fibra óptica permite ajustar la longitud de onda característica de la luz/fluorescencia de excitación de modo que la característica de longi­ tud de onda sea adecuada para la característica de fluorescencia de la muestra 70 y, por lo tanto, permite que se proporcione un sistema óptico y de detección óptimo para una muestra con diversas características. Además, las sondas ópticas de detección de fluorescencia 122 y los accionadores 121 pueden ser instalados en una pluralidad de sitios a lo largo del interior de la región de ciclo térmico 12e. Por ejemplo, se pueden instalar las sondas ópticas de detección de fluorescencia 122 y los accionadores 121 para detectar la fluorescencia de la muestra 70 en el canal situado en la parte 111 de temperatura alta o la parte 112 de temperatura media. Además de la función de adquirir información para determinar el progreso o la finalización de la PCR, las sondas ópticas de detección de fluorescen­ cia 122 y los accionadores 121 también pueden provocar una función como sensores de posición para detectar, sin fallos, si la muestra 70 se encuentra o no en la parte de temperatura alta 111 o en la parte de temperatura media 112.
En el dispositivo para PCR 100 configurado como se ha descrito más arriba, la unidad de control 107 del sistema de bomba 110, el accionador 121 de la sonda óptica de detección de fluorescencia 122, el primer accionador de calen­ tador 130 y el segundo accionador de calentador 132 se controlan para funcionar de forma óptima mediante una CPU 141. Además, como se ha descrito más arriba, en el caso de una región de reacción en la que se establecen temperaturas de tres niveles, la CPU también controla un tercer accionador de calentador (no mostrado), además de lo anterior.
La figura 10 es un diagrama que muestra una condición en la que una boquilla de un sistema de bomba y un puerto de comunicación de aire del recipiente de reacción de PCR están conectados. La figura 11 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR 10 que se muestra en la figura 10 que está seccionado a lo largo de la línea C - C. Como se ha descrito más arriba, la primera boquilla 101 está conectada al primer puerto de comunica­ ción de aire 24, y la segunda boquilla 102 está conectada al segundo puerto de comunicación de aire 26.
Como se representa en la figura 11, una aguja hueca 150 está provista en la punta de la primera boquilla 101. Perfo­ rando la primera película de sellado 18 con esta aguja 150, la primera boquilla 101 se conecta al primer puerto de comunicación de aire 24. Lo mismo se aplica a la conexión entre la segunda boquilla 102 y el segundo puerto de comunicación de aire 26.
La aguja 150 está provista de un material de empaquetado 151 hecho de una resina suave que entra en contacto con la superficie de una película de sellado para asegurar la estanqueidad al aire alrededor de la conexión. Inmedia­ tamente después de que el recipiente de reacción de PCR 10 se haya ajustado en el dispositivo para PCR 100, el sistema de bomba 110 no está en funcionamiento y está abierto al aire atmosférico, y la presión dentro del canal se encuentra, por lo tanto, en un estado en el que la presión es igual a la presión atmosférica.
La figura 12 muestra una condición en la que el sistema de bomba 110 se utiliza para mover la muestra 70. Ya sea una de la primera bomba 103 o de la segunda bomba 104 se acciona para mover la muestra 70 a la parte de tempe­ ratura alta 111 o a la parte de temperatura media 112 de la región de ciclo térmico 12e. En la figura 12, se opera la segunda bomba 104 a la que está conectada la segunda boquilla 102 y se para la primera bomba 103 a la que está conectada la primera boquilla 101. En otras palabras, el primer puerto de comunicación de aire 24 al que se conecta la primera boquilla 101 que se extiende desde la primera bomba 103 está abierto a la presión atmosférica. Cuando se opera la segunda bomba 104 para alimentar el aire de la segunda boquilla 102 al segundo puerto de comunica­ ción de aire 26, la muestra 70 se mueve, pasando por la parte de temperatura media 112 y desplazándose a la parte de temperatura alta 111. Se supone que este estado es un estado inicial.
Más específicamente, al inicio del funcionamiento de la segunda bomba 104 o inmediatamente antes del inicio del funcionamiento de la segunda bomba 104, se inicia la monitorización de la fluorescencia emitida por la muestra en el canal utilizando la sonda óptica de detección de fluorescencia 122. Cuando no hay nada en un punto de medición de la sonda óptica de detección de fluorescencia 122, la fluorescencia que se detecta está a cero o a un nivel de fondo. Cuando la muestra 70 se encuentra en el punto de medición, se detecta fluorescencia. Por lo tanto, la monitorización de la fluorescencia se inicia antes de que se inicie el funcionamiento de la segunda bomba 104, la finalización del movimiento de la muestra 70 a la parte de temperatura alta 111 se reconoce por medio de un valor de fluorescencia que se eleva desde el nivel de fondo y vuelve a caer al nivel de fondo, y la detención del funcionamiento de la se­ gunda bomba 104 en este punto completa el ajuste del estado inicial. Además, cuando la sonda óptica de detección de fluorescencia se encuentra más allá en la parte de temperatura alta 111, también es posible detener la muestra 70 a la parte de temperatura alta 111 con más certeza.
Se debe hacer notar que la muestra 70 situada dentro del canal ramificado 131 permanece alrededor del lugar inclu­ so cuando se opera la segunda bomba 104. Esto se debe a que el puerto de introducción de la muestra 133 está sellado con la tercera película de sellado 22. La muestra 70 situada dentro del canal ramificado 131 no se somete a PCR.
Después del ajuste al estado inicial, se aplica un ciclo térmico a la muestra 70 para hacer progresar a la PCR. Se continúa la medición de la fluorescencia mediante la sonda óptica de detección de fluorescencia 122.
A) En primer lugar, se permite que la muestra 70 se asiente durante 1 a 30 segundos en la parte de tempera­ tura alta 111 (atmósfera de alrededor de 94°C) (desnaturalización: paso de desnaturalización térmica). Por medio de este paso, el ADN de cadena sencilla se desnaturalizan en cadenas simples.
B) A continuación, la primera bomba 103 a la que se conecta la primera boquilla 101 es operada para despla­ zar la muestra 70 a la parte 112 de temperatura media (atmósfera de alrededor de 60°C). Más concreta­ mente, la muestra 70 se empuja en una dirección desde la parte de temperatura alta 111 a la parte de tem­ peratura media 112 por la acción de la primera bomba 103. Puesto que la medición de fluorescencia por la sonda óptica de detección de fluorescencia 122 continúa, el funcionamiento de la primera bomba 103 se detiene en el momento en que una cantidad de fluorescencia sube desde el nivel de fondo y vuelve a caer debido a que la muestra 70 pasa por el punto de medición de la sonda óptica de detección de fluorescencia 122 (o después de que haya pasado un cierto período de tiempo después de que la cantidad de fluores­ cencia haya disminuido). Además, cuando la sonda óptica de detección de fluorescencia 122 se encuentra en la parte de temperatura media 112, también es posible detener con más seguridad la muestra 70 en la parte de temperatura media 112.
C) En la parte de temperatura media 112, se permite que la muestra 70 se asiente durante 3 a 60 segundos (recocido elongación: paso de recocido paso de elongación). Por medio de estos pasos, se produce la unión de los iniciadores contenidos en la muestra 70 con antelación dando como resultado un ADN adicio­ nalmente alargado.
D) A continuación, se acciona la segunda bomba 104 a la que está conectada la segunda boquilla 102 para mover la muestra 70 desde la parte de temperatura media 112 a la parte de temperatura alta 111. El tiempo para detener el funcionamiento de la bomba se determina en función de los cambios en la cantidad de fluo­ rescencia medida por la sonda óptica de detección de fluorescencia 122 de la misma manera que se ha descrito más arriba. Después de mover la muestra 70 a la parte de temperatura alta 111, la muestra 70 se deja reposar durante 1 a 30 segundos para someterse a la desnaturalización por calor.
E) Repitiendo los pasos anteriores (B) a (D) durante un número predeterminado de ciclos, aplicando un ciclo térmico a la muestra 70 y permitiendo que el ADN contenido en la muestra 70 se someta a una pluralidad de ciclos de desnaturalización térmica, recocido y elongación, se realiza la amplificación del ADN. El núme­ ro de ciclos se determina adecuadamente mediante una combinación de ADN diana, iniciadores y enzimas. Después de la finalización de un número predeterminado de ciclos térmicos, la primera bomba 103 y la segunda bomba 104 se detienen, y la PCR es finalizada. Incluso cuando se aplica el número predeterminado de ciclos térmi­ cos, la fluorescencia es medida por medio de la sonda óptica de detección de fluorescencia 122, y la fluorescencia detectada de la muestra 70 aumenta a medida que se amplifica el ADN contenido en la muestra 70. Por lo tanto, la concentración de la muestra 70 puede conocerse con precisión.
De acuerdo con el recipiente de reacción de PCR 10 de acuerdo con la primera realización, al proporcionar el primer filtro 28 entre el primer puerto de comunicación de aire 24 y el canal 12 y el segundo filtro 30 entre el segundo puerto de comunicación de aire 26 y el canal 12, se puede evitar la contaminación en el interior del canal 12. Aunque es probable que la aplicación de medidas para prevenir la contaminación en el lado del sistema de bombeo 110 aumen­ te el costo, en el recipiente de reacción de PCR 10 de acuerdo con la primera realización las medidas permiten evi­ tar la contaminación únicamente en el lado del recipiente de reacción de PCR 10 y, por lo tanto, son económicas. Además, cuando el recipiente de reacción de PCR se utiliza como recipiente desechable, puesto que el filtro siempre es uno nuevo, la contaminación se puede prevenir aún más a bajo coste. Además, en lo que respecta a la elimina­ ción del recipiente de reacción de PCR, puesto que la muestra está sustancialmente sellada en el recipiente de reacción de PCR, la eliminación también es significativa en términos de seguridad y medio ambiente.
En el dispositivo para PCR 100 de acuerdo con la primera realización, se puede hacer que la muestra realice un movimiento alternativo dentro del canal 12 del recipiente de reacción de PCR 10 accionando alternativamente la primera bomba 103 y la segunda bomba 104 que permiten que las presiones en el lado primario y el lado secundario se igualen cuando se detienen. En este caso, puesto que no se aplica una presión excesiva a la muestra durante la alimentación de líquido (aplicando presión a la muestra en el canal) y, además, la presión en el canal no se reduce, se puede prevenir la evaporación y la ebullición (espumado) del líquido que contiene la muestra debido a la acción de la parte de temperatura alta 111.
Además, en el dispositivo para PCR 100 de acuerdo con la primera realización, la fluorescencia de la muestra se monitoriza todo el tiempo incluso durante la PCR en la región de ciclo térmico (PCR en tiempo real). Como resulta­ do, la temporización final de la PCR se puede determinar en función de la cantidad de fluorescencia que se haya medido. Además, mediante la monitorización de un cambio en la fluorescencia por medio de la sonda óptica de detección de fluorescencia 122, se puede conocer el paso de la muestra, y, en función del cambio en la cantidad de fluorescencia que acompaña al paso de la muestra, se puede controlar el funcionamiento alternativo de la primera bomba 103 y de la segunda bomba 104. Por lo tanto, la muestra que se va a someter a la PCR puede colocarse con precisión en la parte de temperatura alta 111 o en la parte de temperatura media 112 de la región de ciclo térmico. Por otra parte, en el caso de un recipiente de reacción de PCR y un dispositivo para PCR con una región de reac­ ción en la que existen las temperaturas que se han descrito más arriba de tres niveles: la parte de temperatura alta; la parte de temperatura media; y la parte de temperatura baja se controlan, los pasos, la desnaturalización por calor, el recocido, y la elongación, se pueden realizar en la parte de temperatura alta, en la parte de temperatura media, y en la parte de temperatura baja, respectivamente. Además, el control de los mismos puede ser fácilmente desarro­ llado y mejorado por los expertos en la técnica sobre la base de la descripción que se ha detallado más arriba. Los expertos en la técnica pueden elegir apropiadamente, dependiendo de las características de la muestra, si la región de reacción está fijada para tener dos niveles o tres niveles.
Segunda realización
Las figuras 13A y 13B son diagramas para explicar un recipiente de reacción de PCR 210 de acuerdo con una se­ gunda realización de la presente revelación. La figura 13A es una vista en planta del recipiente de reacción de PCR 210, y la figura 13B es una vista frontal del recipiente de reacción de PCR 210. La figura 14 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR 210 que se muestra en la figura 13A que está seccionada a lo largo de la línea A - A. La figura 15 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR 210 que se muestra en la figura 13A que está seccionada a lo largo de la línea B - B. La figura 16 es una vista en planta de un sustrato 214 proporcionado en el recipiente de reacción de PCR 210. La figura 17 es un diagrama conceptual para explicar la configuración del recipiente de reacción de PCR 210. El recipiente de reacción de PCR 210 en la segunda realización es diferente del de la primera realización en que el recipiente de reacción de PCR se proporciona con dos puntos de ramificación (un primer punto de ramificación 212c y un segundo punto de ramificación 212d), dos canales ramificados y dos puertos de introducción de muestra que se extienden desde los puntos de ramificación (un primer canal ramificado 231 y un primer puerto de introducción de muestra 233, un segundo canal ramificado 232 y un segundo puerto de introducción de muestra 234), y una región de canal tampón 212f entre el primer punto de ramificación 212c y el segundo punto de ramificación 212d.
El recipiente de reacción de PCR 210 comprende un sustrato resinoso 214 que tiene un canal en forma de ranura 212 formado en una superficie inferior 214a del mismo, una película de sellado de canal 216, que está unida a la superficie inferior 214a del sustrato 214, para sellar el canal 212, y tres películas de sellado (una primera película de sellado 218, una segunda película de sellado 220 y una tercera película de sellado 222) unidas a una superficie superior 214b del sustrato 214.
El sustrato 214 está formado preferentemente por un material que tiene buena conductividad térmica, es estable contra el cambio de temperatura, y es resistente a la solución de muestra que se utiliza. Además, el sustrato 214 se forma preferentemente de un material que tiene buena capacidad de moldeo, buena transparencia y propiedad de barrera, y baja propiedad de auto - fluorescencia. Como un material de este tipo, se prefiere un material inorgánico tal como el vidrio, el silicio, una resina como acrilato, poliéster, silicona, y, en particular, la cicloolefina. Un ejemplo de las dimensiones del sustrato 214 incluye un lado largo de 70 mm, un lado corto de 42 mm y un grosor de 3 mm. Un ejemplo de las dimensiones del canal 212 formado en la superficie inferior 214a del sustrato 214 incluye una anchu­ ra de 0,5 mm y una profundidad de 0,5 mm.
Como se ha descrito más arriba, el canal en forma de ranura 212 se forma en la superficie inferior 214a del sustrato 214, y este canal 212 es sellado por la película de sellado 216 del canal (véase la figura 14). Un primer puerto de comunicación de aire 224 se forma en la posición de un extremo 212a del canal 212 en el sustrato 214. Se forma un segundo puerto de comunicación de aire 226 en la posición del otro extremo 212b del canal 212 en el sustrato 214. El par, el primer puerto de comunicación de aire 224 y el segundo puerto de comunicación de aire 226, se forman de modo que queden expuestos en la superficie superior 214b del sustrato 214. Un sustrato de este tipo puede ser producido por moldeo por inyección o trabajos de corte con una máquina de procesamiento NC u otros procedimien­ tos disponibles.
Se proporciona un primer filtro 228 entre el primer puerto de comunicación de aire 224 y un extremo 212a del canal 212 en el sustrato 214 (ver la figura 14). Se proporciona un segundo filtro 230 entre el segundo puerto de comunica­ ción de aire 226 y el otro extremo 212b del canal 212 en el sustrato 214. El par, el primer filtro 228 y el segundo filtro 230, proporcionados en los extremos respectivos del canal 212 tiene buenas características de baja impureza y también permite que solo el aire pase a través de los mismos para evitar la contaminación de tal manera que la calidad del ADN amplificado por la PCR no se deteriore. Como material filtrante, el polietileno y el PTFE son ade­ cuados, y el material filtrante puede ser poroso o hidrófobo. Con respecto a las dimensiones del primer filtro 228 y del segundo filtro 230, el primer filtro 228 y el segundo filtro 230 se forman de manera que se ajusten sin ningún espacio de separación en un espacio de instalación de filtro formado en el sustrato 214.
En un primer punto de ramificación 212c situado entre el primer filtro 228 y el segundo filtro 230, se forma en el sus­ trato 214 un primer canal ramificado 231 que se ramifica desde el canal 212. Se forma un primer puerto de introduc­ ción de muestra 233 en la posición de un extremo terminal 231a del primer canal ramificado 231 en el sustrato 214 (ver la figura 15). En un segundo punto de ramificación 212d situado entre el primer punto de ramificación 212c y el segundo filtro 230, se forma adicionalmente en el sustrato 214 un segundo canal ramificado 232 que se ramifica desde el canal 212. Se proporciona un segundo puerto de introducción de muestra 234 en la posición de un extremo terminal 232a del segundo canal ramificado 232 en el sustrato 214. El primer puerto 233 de introducción de la mues­ tra y el segundo puerto de introducción de muestra 234 se forman de manera que queden expuestos sobre la super­ ficie superior 214b del sustrato 214.
Una sección del canal 212 que se encuentra situada entre el primer filtro 228 y el primer punto de ramificación 212c forma una región de ciclo térmico 212e destinada a una región de temperatura alta y a una región de temperatura media con el fin de aplicar un ciclo térmico a la muestra. La región de ciclo térmico 212e del canal 212 incluye un canal en serpentina. Esto sirve para proporcionar de forma eficaz la cantidad de calor proporcionada por el dispositi­ vo para PCR durante un paso de PCR a una muestra y para permitir que el volumen de una muestra que puede ser sometida a PCR sea una cantidad determinada o superior. La región de ciclo térmico 212e está provista de un par de regiones de reacción incluyendo cada una de ellas un canal en serpentina y una región de conexión que conecta el par de regiones de reacción.
Una sección del canal 212 que se encuentra situada entre el primer punto de ramificación 212c y el segundo punto de ramificación 212d forma la región del canal tampón 212F. La región de canal tampón 212F del canal 212 incluye un canal en serpentina. El volumen de la región de canal tampón 212F del canal 212 se establece en un volumen predeterminado de acuerdo con la cantidad de una muestra en la que está previsto realizar un proceso de PCR. La función de la región de canal tampón se describirá más adelante.
En el recipiente de reacción de PCR 210 de acuerdo con la segunda realización, la mayor parte del canal 212 está formada en forma de una ranura expuesta en la superficie inferior 214a del sustrato 214. Esto permite un moldeado más fácil mediante el moldeo por inyección con un molde de metal. Para hacer uso de esta ranura como un canal, la película de sellado 216 del canal se une en la superficie inferior 214a del sustrato 214. La película de sellado 216 del canal puede ser pegajosa en una de las superficies principales de la misma o puede tener una capa funcional que exhibe pegajosidad o adhesividad al presionar, estando formada en una de las superficies principales. Por lo tanto, la película de sellado 216 del canal tiene la función de ser fácilmente capaz de convertirse en integral con la superfi­ cie inferior 214a del sustrato 214 mientras está en contacto estrecho con la superficie inferior 214a. La película de sellado 216 del canal está formada de forma deseable de un material, incluyendo un adhesivo, que tiene una propie­ dad de auto - fluorescencia baja. En lo que a esto se refiere, es conveniente una película transparente hecha de una resina tal como un polímero de cicloolefina, poliéster, polipropileno, polietileno o acrilato. Además, la película de sellado 216 del canal puede estar formada por un vidrio o resina similar a una placa. Puesto que se puede esperar rigidez en este caso, la película de sellado 16 del canal es útil para evitar la distorsión y la deformación del recipiente de reacción de PCR 210.
Además, en el recipiente de reacción de PCR 210 de acuerdo con la segunda realización, el primer puerto de comu­ nicación de aire 224, el segundo puerto de comunicación de aire 226, el primer puerto de introducción de muestra 233, el segundo puerto de introducción de muestra 234, el primer filtro 228, y el segundo filtro 230 están expuestos en la superficie superior 214b del sustrato 214. Por lo tanto, para sellar el primer puerto de comunicación de aire 224 y el primer filtro 228, la primera película de sellado 218 se une a la superficie superior 214b del sustrato 214. Por lo tanto, para sellar el segundo puerto de comunicación de aire 226 y el segundo filtro 230, la segunda película de sellado 220 se une a la superficie superior 214b del sustrato 214. Por lo tanto, para sellar el primer puerto de intro­ ducción de la muestra 233 y el segundo puerto de introducción de la muestra 234, la tercera película de sellado 222 se fija a la superficie superior 214b del sustrato 214.
La primera película de sellado 218 que se utiliza tiene un tamaño que puede sellar el primer puerto de comunicación de aire 224 y el primer filtro 228 al mismo tiempo, y la segunda película de sellado 220 que se utiliza tiene un tamaño que puede sellar el segundo puerto de comunicación de aire 226 y el segundo filtro 230 al mismo tiempo. Una bom­ ba de tipo de presión (que se describirá más adelante) se conecta al primer puerto de comunicación de aire 224 y al segundo puerto de comunicación de aire 226 perforando el primer puerto de comunicación de aire 224 y el segundo puerto de comunicación de aire 226 por medio de una aguja hueca (aguja de jeringa con punta afilada) en la punta de la bomba. Por lo tanto, la primera película de sellado 128 y la segunda película de sellado 220 preferentemente son películas hechas de un material que es fácilmente perforado por la aguja y/o tienen un grosor que es fácilmente perforado por la aguja. En la segunda realización, se describen las películas de sellado cada una de ellas con un tamaño que puede sellar el puerto de comunicación y filtro de aire correspondiente al mismo tiempo. Sin embargo, estos puertos y filtros de comunicación de aire pueden ser sellados por separado. Alternativamente, se puede utilizar una película de sellado que pueda sellar el primer puerto de comunicación de aire 224, el primer filtro 228, el segun­ do puerto de comunicación de aire 226 y el segundo filtro 230 todos a la vez (por una única lámina).
Como tercera película de sellado 222, se utiliza una película de sellado de un tamaño que puede sellar el primer puerto de introducción de muestra 233 y el segundo puerto de introducción de muestra 234 al mismo tiempo. La introducción de una muestra en el canal 212 a través del primer puerto de introducción de muestra 233 y el segundo puerto de introducción de muestra 234 se realiza despegando una vez la tercera película de sellado 222 del sustrato 214, y, después de la introducción de una cantidad predeterminada de muestra, la tercera película de sellado 222 se vuelve a colocar siendo fijado de nuevo a la superficie superior 214b del sustrato 214. Por lo tanto, como tercera película de sellado 222, se desea una película que sea lo suficientemente pegajosa para mantenerse a lo largo de varios ciclos de fijación y despegado. Alternativamente, como tercera película de sellado 222, se puede unir una nueva película después de la introducción de una muestra. En este caso, la importancia de la propiedad relacionada con el pegado y el despegado puede disminuir. En la segunda realización, se describen las películas de sellado, cada una de ellas de un tamaño capaz de sellar el primer puerto de introducción de la muestra 233 y el segundo puerto de introducción de la muestra 234 al mismo tiempo. Sin embargo, estos puertos y filtros de comunicación de aire pueden ser sellados por separado.
Del mismo modo que en la película de sellado 216 del canal, la primera película de sellado 218, la segunda película de sellado 220, y la tercera película de sellado 222 puede tener una capa adhesiva o una capa funcional que exhibe pegajosidad o adhesividad cuando se presiona, que está formada en una de las superficies principales de la misma. La primera película de sellado 218, la segunda película de sellado 220, y la tercera película de sellado 222 están constituidas de forma deseable por un material, incluyendo un adhesivo, que tiene una propiedad de auto - fluores­ cencia baja. En lo que a esto se refiere, es conveniente una película transparente hecha de una resina como cicloolefina (COP), poliéster, polipropileno, polietileno o acrilato. Como se ha descrito más arriba, la propiedad como la pegajosidad deseable no se degrada hasta tal punto que el uso se vea afectado incluso después de pegar y despe­ gar de varias veces. Sin embargo, en el caso de que se fije una nueva película después del despegado y la intro­ ducción de una muestra, la importancia de esta propiedad relacionada con la unión y despegado puede reducirse.
A continuación se dará una explicación sobre un procedimiento de uso del recipiente de reacción de PCR 210 confi­ gurado como se ha descrito más arriba. En primer lugar, se prepara una muestra que se debe amplificar por medio de un ciclo térmico. La muestra incluye aquellos obtenidos añadiendo una pluralidad de tipos de iniciadores, una enzima termoestable y cuatro tipos de trifosfatos desoxirribonucleósido (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) como reactivos de PCR a una mezcla que contiene dos o más tipos de ADN. A continuación, la tercera película de sellado 222 se despegará del sustrato 214 de forma que el primer puerto de introducción de muestra 233 y el segundo puerto de introducción de muestra 234 estén abiertos.
La muestra se introduce entonces ya sea en el primer puerto de introducción 233 de la muestra o el segundo puerto de introducción 234 de la muestra por medio de un cuentagotas, una jeringa u otros medios. La figura 18 muestra esquemáticamente una condición en la que se introduce una muestra 270 en el recipiente de reacción de PCR 210. En la figura 18, para resaltar la posición de la muestra 270, la muestra 270 se representa por medio de una línea sólida más gruesa que la del canal 212. Se debe tener en cuenta que la línea sólida no indica un estado en el que la muestra 270 se desborda fuera del canal.
Como se representa en la figura 18, la muestra 270 introducida en uno cualquiera de entre el primer puerto de intro­ ducción 233 de la muestra y el segundo puerto de introducción 234 de la muestra llena el canal al ser empujada por un gotero, una jeringa u otros medios, o por un fenómeno capilar. La muestra 270 se empaquetará en la región 212F del canal tampón situada entre el primer punto de ramificación 212c y el segundo punto de ramificación 212d en el canal 212. Sin embargo, la muestra 270 no entra en el lado de la región de ciclo térmico 212e ni en el segundo puer­ to de comunicación de aire 26 del canal 212 más allá del primer punto de ramificación 212c y del segundo punto de ramificación 212d, que se encuentran respectivamente en ambos extremos de la región del canal tampón 212f. Esto se debe a que los dos extremos del canal (es decir, el primer puerto de comunicación de aire 224 y el segundo puer­ to de comunicación de aire 226) están sellados en este punto de tal manera que no hay salida para que escape el aire.
A continuación, como se representa en la figura 19, la tercera película de sellado 222 se vuelve a colocar sobre el sustrato 214 para sellar el primer puerto de introducción 233 de la muestra y el segundo puerto de introducción 234 de la muestra. Como se ha descrito más arriba, se puede adjuntar una tercera película de sellado nueva 222. Con ello se completa la introducción de la muestra 270 en el recipiente de reacción de PCR 210.
La figura 20 es un diagrama para explicar un dispositivo para PCR 300 en el que se utiliza el recipiente de reacción de PCR 210. La figura 21 es un diagrama para explicar un estado en el que el recipiente de reacción de PCR 210 se coloca en una posición predeterminada del dispositivo para PCR 300.
El dispositivo para PCR 300 está provisto de una sonda óptica de detección de fluorescencia 2122, un primer calen­ tador 2134 y un segundo calentador 2135. Como se representa en la figura 21, en el recipiente de reacción de PCR 210, se disponen un par de regiones de reacción de la región de ciclo térmico 212e del canal 212 en el primer calen­ tador 2134 y en el segundo calentador 2135, respectivamente, y la sonda óptica de detección de fluorescencia 2122 se instala en el dispositivo para PCR 300 para que se encuentre en una región de conexión entre el par de regiones de reacción. Para el dispositivo para PCR 300, se puede emplear el dispositivo para PCR aplicado en el recipiente de reacción de PCR de acuerdo con la primera realización.
El dispositivo para PCR 300 está provisto además de un sistema de bomba 2110 para hacer que la muestra 270 realice un movimiento alternativo en la región de ciclo térmico 212e. Este sistema de bomba 2110 se suministra con una primera boquilla 2101, una segunda boquilla 2102, una primera bomba 2103, una segunda bomba 2104, un primer accionador 2105, un segundo accionador 2106 y una unidad de control 2107. La primera boquilla 2101 del sistema de bombeo 2110 está conectada al primer puerto de comunicación de aire 224 del recipiente de reacción de PCR 210, y la segunda boquilla 2102 del recipiente de reacción de PCR 210 está conectada al segundo puerto de comunicación de aire 226 del recipiente de reacción de PCR 210. Más adelante se describirá un procedimiento es­ pecífi
En el dispositivo para PCR 300 de acuerdo con la segunda realización, el primer calentador 2134 y el segundo ca­ lentador 2135 están dispuestos a diferentes temperaturas. Cada calentador proporciona la cantidad de calor para controlar individualmente las temperaturas de un par de regiones de reacción en la región de ciclo térmico 212e y puede ser un medio o una estructura tal como un calentamiento resistivo o un elemento Peltier. Por ejemplo, el pri­ mer calentador 2134 es controlado por el primer accionador de calentador 2130 para mantener la temperatura de la región de reacción en el lado derecho de la página de la figura en la región de ciclo térmico 212e del canal 212 para que sea constantemente de 94°C. Además, el segundo calentador 2135 es controlado por el segundo accionador de calentador 2132 para mantener la temperatura de la región de reacción en el lado izquierdo de la página de la figura para que sea constantemente de 60 °C. La temperatura de cada región de reacción puede ser medida por medio de un sensor de temperatura (no mostrado), tal como un termopar, y la salida de cada resistencia puede ser controlada por cada en función de una señal eléctrica que proviene de la misma. De esta manera, el primer calentador 2134, el segundo calentador 2135, el primer accionador de calentador 2130, el segundo accionador de calentador 2132, y el sensor de temperatura puede constituir una unidad de ajuste de temperatura para ajustar la temperatura de la región de ciclo térmico 212e y pueden incluir otros elementos que mejoren el control de la temperatura. Esta unidad de ajuste de temperatura permite dividir la región de ciclo térmico 212e del canal 212 en dos regiones de diferentes temperaturas atmosféricas. Cerca de cada resistencia, se puede incluir un sensor de temperatura (no mostrado), tal como un termopar que mide la temperatura de una parte correspondiente, y se pueden incluir otras estructuras que mejoran el control de la temperatura. A continuación, la región de reacción a la temperatura de la atmósfera a 94°C en el canal 212 se denomina "parte de temperatura alta 2111", y la región de reacción a la temperatura de la atmós­ fera a 60 °C en el canal 212 se denomina "parte de temperatura media 2112". Además, en la presente realización, se dará una explicación detallada con respecto a un dispositivo para PCR que se proporciona con un recipiente de reacción de PCR provisto de una región de ciclo térmico en el que los rangos de temperatura de dos niveles se es­ tablecen como dos regiones de reacción y en que está provisto de una unidad de control de temperatura. Sin em­ bargo, el dispositivo para PCR puede suministrarse con un recipiente de reacción de PCR provisto de una región de ciclo térmico en la que se pueden establecer rangos de temperatura de tres o más niveles y que está provisto de una unidad de control de temperatura. En este caso, (aunque no se muestra), por ejemplo, el dispositivo para PCR pue­ de suministrarse con un recipiente de reacción de PCR provisto de regiones de reacción en las que una parte de baja temperatura, una parte de temperatura media, y una parte de temperatura alta está dispuestas desde el lado izquierdo de la página de la figura y con una unidad de control de temperatura. En tal caso, por ejemplo, la parte de temperatura baja, la parte de temperatura media y la parte de temperatura alta se controlan para mantener 50 a 70°C, a 72°C, y a 94°C, respectivamente.
El sistema de bombeo 2110 está dispuesto para hacer que la muestra 270 realice un movimiento alternativo dentro de la región de ciclo térmico 212e del canal 212, como se ha descrito más arriba. Accionando alternativamente la primera bomba 2103 y la segunda bomba 2104 a través del primer accionador 2105 y del segundo accionador 2106 en una determinada condición por la unidad de control 2107, la muestra 270 puede realizar un movimiento alternati­ vo entre la parte de temperatura alta 2111 y la parte de temperatura media 112 del canal 212, y un ciclo térmico puede ser aplicado a la muestra 270 bajo una condición determinada. En el dispositivo para PCR 300 de acuerdo con la segunda realización, la primera bomba 2103 y la segunda bomba 2104 son bombas de aire o bombas de soplado de un tipo en el que, cuando tanto la primera bomba 2103 como la segunda bomba 2104 están detenidas, las presiones atmosféricas en un lado primario y en un lado secundario se hacen instantáneamente iguales una a la otra, y cuando se detienen la primera bomba 2103 y la segunda bomba 2104, la presión atmosférica en el lado pri­ mario y la presión atmosférica en el lado secundario son iguales una a la otra. Si no se utiliza este tipo de bomba, es decir, si se utiliza una bomba que mantiene la presión inmediatamente anterior incluso cuando se detiene, existe la posibilidad de que se produzca un fenómeno en el que la muestra continúe moviéndose ligeramente incluso en el caso de que la bomba se detenga, de tal forma que la muestra no se detenga en una región de reacción predetermi­ nada y la temperatura de la muestra no pueda controlarse adecuadamente. Por otra parte, el aire exterior y el canal del recipiente de reacción de PCR se comunican uno con el otro en términos de presión atmosférica cuando se de­ tiene (cuando se abre), con la misma presión atmosférica; sin embargo, puesto que se proporciona un filtro entre el puerto de comunicación de aire y el canal, se puede evitar la contaminación en el canal.
La muestra 270 puede ser sometida a PCR por el ciclo térmico que se ha descrito más arriba, y se puede detectar la fluorescencia de la muestra 270 en el canal, y su valor puede ser utilizado como un índice que sirve como informa­ ción para determinar el progreso de la PCR o la finalización de la reacción. Como sonda óptica de detección de fluorescencia 2122 y el accionador 2121, se puede utilizar el detector de fluorescencia de tipo fibra óptica FLE - 510 (fabricado por Nippon Sheet Glass Co., Ltd ), que es un sistema óptico muy compacto que permite la medición rápi­ da y la detección de fluorescencia independientemente de una atmósfera de luz y/o oscuridad. Este detector de fluorescencia de tipo de fibra óptica también se puede disponer fácilmente en un espacio estrecho entre las dos regiones de temperatura en la región de ciclo térmico. Este detector de fluorescencia de tipo de fibra óptica permite ajustar la longitud de onda característica de la luz/fluorescencia de excitación de modo que la característica de longi­ tud de onda sea adecuada para la característica de fluorescencia de la muestra 270 y, por lo tanto, permite un sis­ tema óptico y de detección óptimo para una muestra con diversas características. Además, se pueden proporcionar sondas ópticas de detección de fluorescencia 2122 y accionadores 2121 que se instalan en una pluralidad de luga­ res a lo largo de la región de ciclo térmico 212e. Por ejemplo, se pueden instalar las sondas ópticas de detección de fluorescencia 2122 y los accionadores 2121 para detectar la fluorescencia de la muestra 270 en el canal situado en la parte de temperatura alta 111 o la parte de temperatura media 2112. Además de la función de adquirir información para determinar el progreso o la finalización de la PCR, las sondas ópticas de detección de fluorescencia 2122 y los accionadores 2121 también pueden funcionar como sensores de posición para detectar, sin fallos, si la muestra 270 se encuentra o no en la parte de temperatura alta 2111 o en la parte de temperatura media 2112.
En el dispositivo para PCR 300 configurado como se ha descrito más arriba, la unidad de control 2107 del sistema de bomba 2110, el accionador 2121 de la sonda óptica de detección de fluorescencia 2122, el primer accionador de calentador 2130 y el segundo accionador de calentador 2132 se controlan para funcionar de forma óptima mediante una CPU 2141. Además, como se ha descrito más arriba, en el caso de una región de reacción en la que se esta­ blecen temperaturas de tres niveles, la CPU también controla un tercer accionador de calentador (no mostrado), además de lo anterior.
La figura 22 es un diagrama que muestra una condición en la que una boquilla de un sistema de bomba y un puerto de comunicación de aire del recipiente de reacción de PCR están conectados. La figura 23 es una vista en sección transversal del recipiente de reacción de PCR 210 que se muestra en la figura 23 que está seccionado a lo largo de la línea C - C. Como se ha descrito más arriba, la primera boquilla 2101 está conectada al primer puerto de comuni­ cación de aire 224, y la segunda boquilla 2102 está conectada al segundo puerto de comunicación de aire 226. Como se representa en la figura 23, se proporciona una aguja 2150 en la punta de la primera boquilla 2101. Perfo­ rando la primera película de sellado 218 con esta aguja 2150, la primera boquilla 2101 se conecta al primer puerto de comunicación de aire 224. Lo mismo se aplica a la conexión entre la segunda boquilla 2102 y el segundo puerto de comunicación de aire 226.
La aguja 2150 está provista de un material de empaquetado 2151 hecho de una resina suave que entra en contacto con la superficie de una película de sellado para asegurar la estanqueidad alrededor de la conexión. Inmediatamente después de que el recipiente de reacción de PCR 210 se haya ajustado en el dispositivo para PCR 300, el sistema de bomba 2110 no está en funcionamiento y está abierto al aire atmosférico, y la presión en el interior del canal se encuentra, por lo tanto, en un estado en el que la presión es igual a la presión atmosférica.
La figura 24 muestra una condición en la que el sistema de bomba 2110 es operado para mover la muestra 270. Ya sea una primera bomba 2103 o segunda bomba 2104 se acciona para mover la muestra 270 de la región del canal tampón 212F del canal 212 a la parte de temperatura alta 2111 o a la parte de temperatura media 2112 de la región de ciclo térmico 12e. En la figura 24, se acciona la segunda bomba 2104 a la que está conectada la segunda boqui­ lla 2102 y se detiene la primera bomba 2103 a la que está conectada la primera boquilla 2101. En otras palabras, el primer puerto de comunicación de aire 224 al que se conecta la primera boquilla 2101 que se extiende desde la primera bomba 2103 está abierto a la presión atmosférica. Cuando se opera la segunda bomba 2104 para alimentar el aire de la segunda boquilla 2102 al segundo puerto de comunicación de aire 226, la muestra 270 se desplaza desde la región 212F del canal tampón 212, pasa a través de la parte de temperatura media 2112, y pasa a la parte de temperatura alta 2111. Se supone que este estado es un estado inicial.
Más específicamente, al inicio de la operación de la segunda bomba 2104 o inmediatamente antes del inicio de la operación de la segunda bomba 2104, la monitorización de la fluorescencia emitida desde el interior del canal se inicia utilizando la sonda óptica de detección de fluorescencia 2122. Cuando no hay nada en un punto de medición de la sonda óptica de detección de fluorescencia 2122, la fluorescencia que se detecta está a cero o a un nivel de fondo. Cuando la muestra 270 existe en el punto de medición, se detecta fluorescencia. Por lo tanto, la monitoriza­ ción de la fluorescencia se inicia al inicio de la operación de la segunda bomba 2104, la finalización del movimiento de la muestra 270 a la parte de temperatura alta 2111 se reconoce por medio de un valor de fluorescencia que se eleva desde el nivel de fondo y vuelve a caer hasta el nivel de fondo, y detener el funcionamiento de la segunda bomba 2104 en este punto completa el ajuste del estado inicial. Además, cuando la sonda óptica de detección de fluorescencia 2122 se encuentra más allá en la parte de temperatura alta 2111, también es posible detener la mues­ tra 270 en la parte de temperatura alta 2111 con más seguridad.
Se debe hacer notar que la muestra 270 situada dentro del primer canal ramificado 231 y del segundo canal ramifi­ cado 232 permanece en el lugar incluso cuando se opera la segunda bomba 2104. Esto se debe a que el primer puerto de introducción de la muestra 233 y el segundo puerto de introducción de la muestra 234 están sellados con la tercera película de sellado 222. La muestra 270 situada dentro del primer canal ramificado 231 y el segundo canal ramificado 232 no se somete a PCR. Por lo tanto, incluso cuando la cantidad de una muestra introducida inicialmen­ te en el recipiente de reacción de PCR 210 varíe, al ajustar el volumen de la región del canal tampón 212F del canal 212 formado en el recipiente de reacción de PCR 210 a un volumen predeterminado de acuerdo con la cantidad de la muestra en la que se pretende realizar un proceso de PCR, siempre se puede enviar una determinada cantidad de muestra deseada a la región de ciclo térmico 212e del canal 212, y una cantidad de fluorescencia que afecta a la determinación del progreso o la terminación de la PCR puede mantenerse aproximadamente constante. En otras palabras, la región 212F del canal tampón del canal 212 tiene una función de dispensación que permite la extracción de una determinada cantidad deseada de la muestra.
Después de ajustarse al estado inicial, se aplica un ciclo térmico a la muestra 270 para hacer progresar la PCR. Se continúa la medición de la fluorescencia mediante la sonda óptica de detección de fluorescencia 2122.
A) En primer lugar, se permitirá que la muestra 270 se asiente durante 1 a 30 segundos en la parte de tempe­ ratura alta 2111 (atmósfera alrededor de 94°C de ) (desnaturalización: paso de desnaturalización térmica). Por medio de este paso, el ADN de cadena doble se desnaturalizan en cadenas simples.
B) A continuación, se acciona la primera bomba 2103 a la que se conecta la primera boquilla 2101 para des­ plazar la muestra 270 a la parte de temperatura media 2112 (atmósfera alrededor de 60°C ). Más específi­ camente, la muestra 270 se empuja en una dirección desde la parte de temperatura alta 2111 a la parte de temperatura media 2112 por la acción de la primera bomba 2103. Puesto que continúa la medición de fluo­ rescencia por la sonda óptica de detección de fluorescencia 2122, el funcionamiento de la primera bomba 2103 se detiene en el momento en que una cantidad de fluorescencia sube desde el nivel de fondo y vuelve a caer debido a que la muestra 270 pasa por el punto de medición de la sonda óptica de detección de fluo­ rescencia 2122 (o después de que haya transcurrido un cierto período de tiempo después de que la canti­ dad de fluorescencia haya disminuido). Además, cuando la sonda óptica de detección de fluorescencia 2122 se encuentra en la parte de temperatura media 2112, también es posible detener con más seguridad la muestra 270 en la parte de temperatura media 2112.
C) En la parte de temperatura media 2112, se permite que la muestra 270 se asiente durante 3 a 60 segundos (recocido elongación: Paso de recocido paso de elongación). Por medio de estos pasos, se produce la unión de los iniciadores contenidos en la muestra 270 con anterioridad dando como resultado una mayor elongación del ADN.
D) A continuación, se acciona la segunda bomba 2104 a la que está conectada la segunda boquilla 2102 para mover la muestra 270 desde la parte de temperatura media 2112 a la parte de temperatura alta 2111. El tiempo para detener el funcionamiento de la bomba es determinado en función de los cambios en la canti­ dad de fluorescencia medida por la sonda óptica de detección de fluorescencia 2122 de la misma manera que se ha descrito más arriba. Después de mover la muestra 270 a la parte de temperatura alta 2111, la muestra 270 se deja reposar durante 1 a 30 segundos para que realice la desnaturalización por calor. E) Repitiendo los pasos anteriores (B) a (D) durante un número predeterminado de ciclos, aplicando un ciclo térmico a la muestra 270 y permitiendo que el ADN contenido en la muestra 270 se someta a una pluralidad de ciclos de desnaturalización térmica, recocido y elongación, se realiza la amplificación del ADN. El núme­ ro de ciclos se determina adecuadamente mediante una combinación de ADN diana, iniciadores y enzimas. Después de la finalización de un número predeterminado de ciclos térmicos, la primera bomba 2103 y la segunda bomba 2104 se detienen, y la PCR finaliza. Incluso cuando se aplica el número predeterminado de ciclos térmicos, la fluorescencia se mide por medio de la sonda óptica de detección de fluorescencia 122, y la fluorescencia detecta­ da a partir de la muestra 270 aumenta a medida que se amplifica el ADN contenido en la muestra 270. Por lo tanto, la concentración de la muestra 270 puede conocerse con precisión.
De acuerdo con el recipiente de reacción de PCR 210 de acuerdo con la segunda realización, al proporcionar el primer filtro 228 entre el primer puerto de comunicación de aire 224 y el canal 212 y el segundo filtro 230 entre el segundo puerto de comunicación de aire 226 y el canal 212, se puede evitar la contaminación en el interior del canal 212. Aunque es probable que la aplicación de medidas para prevenir la contaminación en el lado del sistema de bombeo 2110 aumente el costo, en el recipiente de reacción de PCR 210 de acuerdo con la segunda realización, las medidas permiten evitar la contaminación únicamente en el lado del recipiente de reacción de PCR 210 y, por lo tanto, son económicas. Además, cuando el recipiente de reacción de PCR se utiliza como recipiente desechable, puesto que el filtro siempre es nuevo, la contaminación se puede prevenir aún más a bajo coste. Además, en lo que respecta a la eliminación del recipiente de reacción de PCR, puesto que la muestra está sustancialmente sellada en el recipiente de reacción de PCR, la eliminación también es significativa en términos de seguridad y medio ambiente. Además, de acuerdo con el recipiente de reacción de PCR 210 de acuerdo con la segunda realización, al proporcio­ nar la región del canal tampón en el canal 212, se puede dispensar una muestra sometida a PCR, y solo una canti­ dad necesaria de muestra puede enviarse siempre a la región de ciclo térmico del canal 212.
En el dispositivo para PCR 300 de acuerdo con la segunda realización, se puede hacer que la muestra realice un movimiento alternativo dentro del canal 212 del recipiente de reacción de PCR 210 accionando alternativamente la primera bomba 2103 y la segunda bomba 2104 lo que permiten que las presiones en el lado primario y en el lado secundario se igualen cuando se detienen. En este caso, puesto que no se aplica una presión excesiva a la muestra durante la alimentación de líquido (aplicando presión a la muestra en el canal) y, además, la presión en el canal no se reduce, se puede prevenir la evaporación y la ebullición (espuma) del líquido que contiene la muestra debido a la acción de la parte de temperatura alta 2111.
Además, en el dispositivo para PCR 300 de acuerdo con la segunda realización, la fluorescencia de la muestra se supervisa todo el tiempo incluso durante la PCR en la región de ciclo térmico (PCR en tiempo real). Como resultado, el momento final de la PCR puede determinarse en función de la cantidad de fluorescencia que se haya medido. Además, mediante la monitorización de un cambio en la fluorescencia por medio de la sonda óptica de detección de fluorescencia 2122, se puede conocer el paso de la muestra, y, en función del cambio en la cantidad de fluorescen­ cia que acompaña al paso de la muestra, se puede controlar el funcionamiento alternativo de la primera bomba 2103 y de la segunda bomba 2104. Por lo tanto, la muestra que se va a someter a la PCR puede colocarse con precisión en la parte de temperatura alta 2111 o en la parte de temperatura media 2112 de la región de ciclo térmico.
Por otra parte, en el caso de un recipiente de reacción de PCR y un dispositivo para PCR con una región de reac­ ción en la que las temperaturas que se han descrito más arriba son de tres niveles: la parte de temperatura alta; la parte de temperatura media; y la parte de temperatura baja, son controladas, los pasos, la desnaturalización de calor, recocido, y elongación, se puede realizar en la parte de temperatura alta, en la parte de temperatura media, y en la parte de temperatura baja, respectivamente. Además, el control de los mismos puede ser fácilmente desarro­ llado y mejorado por los expertos en la técnica sobre la base de la descripción detallada anterior. Los expertos en la técnica pueden elegir adecuadamente, en función de las características de la muestra, si la región de reacción está configurada para tener dos niveles o tres niveles.
Más arriba se ha descrito una explicación de la presente invención basada en las realizaciones. Estas realizaciones tienen la intención de ser ilustrativas solamente, y será obvio para los expertos en la técnica que varias modificacio­ nes a los elementos y procesos constitutivos podrían ser desarrollados.
En las realizaciones que se han mencionado más arriba, un par de bombas que permiten que las presiones en un lado primario y un lado secundario sean iguales cuando se detiene, se disponen en los extremos respectivos de un canal. Alternativamente, una bomba capaz de presurizar y aspirar puede ser proporcionada solamente en uno cual­ quiera de los extremos del canal, y el otro extremo puede estar abierto a la presión atmosférica. En otras palabras, una muestra se mueve en una región de ciclo térmico controlando la presión dentro de un canal a través de un pri­ mer puerto de comunicación de aire y un segundo puerto de comunicación de aire. En este caso, no es necesario un proceso de conmutación de las operaciones de un par de bombas a una sincronización fija, y el control de la bomba se facilita.
Además, en las realizaciones que se han descrito más arriba, un punto de medición de una sonda óptica de detec­ ción de fluorescencia está dispuesto entre una parte de temperatura alta y una parte de temperatura media. Alterna­ tivamente, se puede disponer un punto de medición de una sonda óptica de detección de fluorescencia en cada una de las partes de temperatura alta y de temperatura media. En este caso, se puede aumentar la precisión de posicionamiento de una muestra.
Descripción de los números de referencia
10, 210 recipiente de reacción de PCR,
12, 212 canal,
14, 214 sustrato,
16, 216 película de sellado de canal,
18, 218 primera película de sellado,
20, 220 segunda película de sellado,
22, 222 t ercera película de sellado,
24, 224 primer puerto de comunicación de aire,
26, 226 segundo puerto de comunicación de aire,
28, 228 primer filtro,
30, 230 segundo filtro,
70, 270 muestra,
100, 300 dispositivo para PCR,
101, 2101 primera boquilla,
102, 2102 segunda boquilla,
103, 2103 primera bomba,
104, 2104 segunda bomba,
105, 2105 primer accionador,
106, 2106 segundo accionador,
107, 2107 unidad de control,
110, 2110 sistema de bomba,
111, 2111 parte de temperatura alta,
112,2112 parte de temperatura media,
121, 2121 accionador,
122, 2122 sonda óptica de detección de fluorescencia
130, 2130 primer accionador de calentador,
131 canal ramificado,
132, 2132 segundo accionador de calentador,
133 puerto de introducción de muestra,
134, 2134 primer calentador,
135, 2135 segundo calentador,
141, 2141 CPU,
231 primer canal ramificado,
232 segundo canal ramificado,
233 primer puerto de introducción de muestra,
234 segundo puerto de introducción de muestra
Aplicabilidad industrial
La presente invención es aplicable a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de PCR que comprende el paso de:
• preparar un recipiente de reacción de PCR (10), comprendiendo el citado recipiente de reacción :
un sustrato (14);
un canal (12) formado sobre el sustrato (14);
un par de filtros (28, 30) proporcionados en los extremos respectivos del canal (12) en el sustrato;
un par de puertos de comunicación de aire (24, 26) que se encuentran en comunicación con el canal (12) a través de los filtros respectivos (28, 30);
una región de ciclo térmico (12e) formada entre el par de filtros (28, 30) en el canal (12), incluyendo la re­ gión de ciclo térmico (12e) una parte de temperatura alta (111) y una parte de temperatura media (112); un punto de ramificación (112c) formado entre el par de filtros (28, 30) en el canal (12);
un canal ramificado (131) cuyo extremo está conectado al punto de ramificación (112c); y.
un puerto de introducción de la muestra (133) formado en el otro extremo del canal ramificado (131) en el sustrato, el procedimiento comprende además los pasos de:
- introducir una muestra en el recipiente de reacción de PCR (10) a través del puerto de introducción de muestra (133);
- colocar el recipiente de reacción de PCR (10) en un dispositivo para PCR (100) provisto de una bomba (103, 104);
- conectar una boquilla (101, 102) de la bomba (103, 104) a los puertos de comunicación de aire (24, 26);
- detectar la fluorescencia generada desde la muestra en la región de ciclo térmico (12e); - mover una muestra en la región de ciclo térmico (12e) entre la parte de temperatura alta (111) y la parte de temperatura media (112) controlando la presión dentro del canal (12) por medio de la bomba (103, 104) en base a un cambio en la cantidad de fluorescencia, mientras una muestra no sometida a PCR permanece en el canal ramificado (131); y.
detectar, mediante la monitorización de la fluorescencia de la muestra dentro de la región de ciclo térmico (12e), el progreso de la reacción de la muestra en tiempo real.
2. El procedimiento de PCR de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:
el recipiente comprende además un segundo punto de ramificación (212d) formado entre el par de filtros (228, 230) del canal (212);
el recipiente comprende además un segundo canal ramificado (232) cuyo extremo está conectado al se­ gundo punto de ramificación (212d); y.
el recipiente comprende además un segundo puerto de introducción de la muestra (234) formado en el otro extremo del segundo canal ramificado (232),
la introducción de una muestra comprende la introducción de una muestra en el recipiente de reacción de PCR a través del primer puerto de introducción de muestra y del segundo puerto de introducción de mues­ tra, y.
el movimiento de una muestra incluye hacer que una muestra no sujeta a PCR permanezca en el primer canal ramificado y en el segundo canal ramificado
3. El procedimiento de PCR de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el recipiente de reacción de PCR (210) incluye además una región del canal tampón (212F) formada entre el primer punto de ramificación (212c) y el segundo punto de ramificación (212d) en el canal (212) y el procedimiento comprende además el paso de: - dispensar una muestra utilizando la región de canal tampón (212f).
4. El procedimiento de PCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el recipiente de reacción de PCR (10) incluye una película de sellado (18, 20, 22) para sellar los puertos de co­ municación de aire (24, 26) y los puertos de introducción de muestra (133), la boquilla (101, 102) incluye una aguja hueca (150) en la punta de la boquilla (101, 102), y la perforación de la película de sellado (18, 20, 22) con la aguja (150) hace que la bomba (103, 104) y el canal (12) se comuniquen una con el otro.
ES16870611T 2015-12-01 2016-11-28 Recipiente de reacción de PCR, dispositivo para PCR y procedimiento de PCR Active ES2863232T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015235129 2015-12-01
PCT/JP2016/085216 WO2017094674A1 (ja) 2015-12-01 2016-11-28 Ｐｃｒ反応容器、ｐｃｒ装置およびｐｃｒ方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2863232T3 true ES2863232T3 (es) 2021-10-11

Family

ID=58796747

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16870611T Active ES2863232T3 (es) 2015-12-01 2016-11-28 Recipiente de reacción de PCR, dispositivo para PCR y procedimiento de PCR

Country Status (7)

Country Link
US (2) US10988800B2 (es)
EP (2) EP3385365B8 (es)
JP (6) JP6803030B2 (es)
CN (2) CN114807322A (es)
ES (1) ES2863232T3 (es)
SG (2) SG11201804584WA (es)
WO (1) WO2017094674A1 (es)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11285478B2 (en) 2016-04-04 2022-03-29 Combinati Incorporated Microfluidic siphoning array for nucleic acid quantification
CN109072159B (zh) 2016-05-18 2022-05-10 日本板硝子株式会社 反应处理装置以及反应处理装置的控制方法
CN109844091B (zh) * 2016-11-01 2022-12-30 日本板硝子株式会社 反应处理容器及反应处理装置
WO2018235766A1 (ja) 2017-06-23 2018-12-27 日本板硝子株式会社 反応処理装置
TWI738328B (zh) 2017-09-28 2021-09-01 美商伊路米納有限公司 流體施配器總成與用於將流體施配至流體匣中的方法
JP7036126B2 (ja) * 2017-12-28 2022-03-15 株式会社ニコン 流体デバイスおよび流路供給システム
JP6694120B2 (ja) * 2018-01-15 2020-05-13 日本板硝子株式会社 反応処理装置
WO2019195391A1 (en) * 2018-04-04 2019-10-10 Combinati Incorporated Microfluidic siphoning array for nucleic acid quantification
WO2020045591A1 (ja) 2018-08-30 2020-03-05 国立研究開発法人産業技術総合研究所 Ｐｃｒ反応容器
WO2020129116A1 (ja) * 2018-12-17 2020-06-25 日本板硝子株式会社 反応処理装置、反応処理容器および反応処理方法
CN113286657B (zh) * 2019-01-17 2023-04-04 美国西门子医学诊断股份有限公司 使用珀耳帖模块作为聚合酶链反应的原动机的流动池
US11465143B2 (en) 2019-06-07 2022-10-11 Nippon Sheet Glass Company, Limited Reaction processing vessel
JP6652673B1 (ja) * 2019-06-07 2020-02-26 日本板硝子株式会社 反応処理容器
CN111304051B (zh) * 2020-02-20 2023-08-11 珠海黑马生物科技有限公司 一种pcr仪及使用方法
EP4198116A1 (en) 2020-08-11 2023-06-21 Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. Nucleic acid amplification chip
EP4209574A4 (en) * 2020-09-02 2024-04-17 Hitachi High Tech Corp TEMPERATURE REGULATION DEVICE
WO2023089992A1 (ja) * 2021-11-16 2023-05-25 アルプスアルパイン株式会社 サーマルサイクル用流路プレート及びサーマルサイクル装置

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003279471A (ja) * 2002-03-20 2003-10-02 Nippon Sheet Glass Co Ltd マイクロ化学システム用チップ及びマイクロ化学システム
JP2004309270A (ja) * 2003-04-04 2004-11-04 Nippon Sheet Glass Co Ltd マイクロ化学システム
KR100552706B1 (ko) * 2004-03-12 2006-02-20 삼성전자주식회사 핵산 증폭 방법 및 장치
JP3952036B2 (ja) 2004-05-13 2007-08-01 コニカミノルタセンシング株式会社 マイクロ流体デバイス並びに試液の試験方法および試験システム
JP4756835B2 (ja) 2004-07-14 2011-08-24 キヤノン株式会社 生化学反応カートリッジ
ES2892751T3 (es) * 2006-01-18 2022-02-04 Coimmune Inc Sistemas y métodos para el procesamiento de muestras en un recipiente cerrado y dispositivos relacionados
WO2008147382A1 (en) * 2006-09-27 2008-12-04 Micronics, Inc. Integrated microfluidic assay devices and methods
JP5303983B2 (ja) 2008-03-26 2013-10-02 株式会社島津製作所 反応処理方法及び反応処理装置
US9731297B2 (en) * 2011-01-06 2017-08-15 Meso Scale Technologies, Llc. Assay cartridges and methods of using the same
CN102220225A (zh) * 2011-05-23 2011-10-19 北京工业大学 聚合酶链式反应器及实时机电扫描检测装置
CN202898426U (zh) * 2012-07-12 2013-04-24 北京工业大学 一种面向空间的螺旋式微流控pcr实时荧光检测系统
JP6202713B2 (ja) * 2013-02-22 2017-09-27 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生化学用カートリッジおよび生化学用送液システム
JP6004486B2 (ja) 2013-04-23 2016-10-12 国立研究開発法人産業技術総合研究所 マイクロ流体装置を活用した核酸増幅方法
JP2015139379A (ja) 2014-01-27 2015-08-03 国立研究開発法人産業技術総合研究所 核酸増幅装置及び核酸増幅方法
JP2016049064A (ja) * 2014-09-01 2016-04-11 国立研究開発法人産業技術総合研究所 マイクロチップを用いたｐｃｒ装置

Also Published As

Publication number Publication date
EP3892712B1 (en) 2023-11-22
EP3385365B1 (en) 2021-03-10
US10988800B2 (en) 2021-04-27
SG10202101750UA (en) 2021-04-29
JP2023101673A (ja) 2023-07-21
JP6719636B2 (ja) 2020-07-08
CN114807322A (zh) 2022-07-29
EP3385365A1 (en) 2018-10-10
CN108291184B (zh) 2022-07-01
EP3385365B8 (en) 2021-05-05
SG11201804584WA (en) 2018-06-28
JP6709319B2 (ja) 2020-06-10
JPWO2017094674A1 (ja) 2018-09-20
US20180274019A1 (en) 2018-09-27
JP6827581B2 (ja) 2021-02-10
JP2020168008A (ja) 2020-10-15
CN108291184A (zh) 2018-07-17
JP2020022520A (ja) 2020-02-13
WO2017094674A1 (ja) 2017-06-08
US20210207205A1 (en) 2021-07-08
US11827924B2 (en) 2023-11-28
EP3385365A4 (en) 2019-06-26
JP6803030B2 (ja) 2020-12-23
JP2021065235A (ja) 2021-04-30
JP2020022519A (ja) 2020-02-13
EP3892712A1 (en) 2021-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2863232T3 (es) Recipiente de reacción de PCR, dispositivo para PCR y procedimiento de PCR
EP3394293B1 (en) Sample-to-answer system for microorganism detection featuring target enrichment, amplification and detection
US11351552B2 (en) Reaction processor, reaction processing vessel, and reaction processing method
JP7369475B2 (ja) 反応処理容器、反応処理装置、反応処理方法および反応処理容器の使用方法
JP6584373B2 (ja) 反応処理装置および反応処理方法
US20210245162A1 (en) Reaction processor
JP7330514B2 (ja) 反応処理装置
ES2796534T3 (es) Dispositivo para la detección de ácidos nucleicos
JP6652677B2 (ja) 反応処理装置および反応処理方法