JP7223736B2 - 反応処理装置および反応処理方法 - Google Patents

Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）に使用される反応処理装置、反応処理容器および反応処理方法に関する。

遺伝子検査は、各種医学分野における検査、農作物や病原性微生物の同定、食品の安全性評価、さらには病原性ウィルスや各種感染症の検査にも広く活用されている。遺伝子である微小量のＤＮＡを高感度に検出するために、ＤＮＡの一部を増幅して得られたものを分析する方法が知られている。中でもＰＣＲは、生体等から採取されたごく微量のＤＮＡのある部分を選択的に増幅する注目の技術である。

ＰＣＲは、ＤＮＡを含む生体サンプルと、プライマーや酵素などからなるＰＣＲ試薬とを混合した試料に、所定のサーマルサイクルを与え、変性、アニーリングおよび伸長といった反応を繰り返し起こさせて、ＤＮＡの特定の部分を選択的に増幅させるものである。

ＰＣＲなどの微量の試料を扱う反応処理は、バイアルと呼ばれる容器や、チップに形成された流路内で行うことが一般的である。小型化、高速化には、流路内でＰＣＲを行う技術が有利な場合もあり、その態様についても数多く実用化されている。

ＰＣＲのサーマルサイクルでは、増幅対象のＤＮＡとＰＣＲ試薬とを混ぜた試料に対して、少なくとも５０℃程度の低温から９５℃程度の高温までの温度サイクルを所定回数繰り返す必要がある。試料は通常水溶液であるため９５℃領域では蒸気圧が高くなり、試料の水成分が蒸発しやすい。試料の水成分が蒸発すると、試料の濃度が高くなったりして、試料の光学特性等のパラメータも予想外に変動し、反応処理工程の適正な管理ができないなどの問題が生じる可能性がある。特にリアルタイムＰＣＲなどでは、ＰＣＲを行いながら、試料の光学物性値等を絶えずモニタリングする必要があるので、反応処理の進捗を把握できなくなってしまう可能性がある。また、試料の蒸発によって流路内に気泡が発生すると、気泡により流路内に存在する試料の移動が妨げられる可能性がある。

特にＰＣＲを行う場所が、高地など気圧が低い環境である場合には、特に顕在化した問題点となる。つまり、気圧は標高が高くなるにつれ低下するため、そのような環境では沸点の低下も著しく、試料が沸騰しやすくなる。例えば標高が１０００ｍの場所では、気圧は大体８９７ｈＰａで沸点は計算上９６．６℃、標高が１５００ｍの場所では、気圧が８４５ｈＰａで沸点は９５℃、標高が２０００ｍの場所では、気圧が７９７ｈＰａで沸点は９３．４℃となる。このような高地に属する場所としてはデンバー（標高約１６００ｍ）、メキシコシティー（同２２００ｍ）等があり、このような場所では、試料は高温温度域で容易に沸騰して気化・発泡したり、試料の蒸発が著しくなったりするので、実質的にＰＣＲを行うことは難しくなってくる。

また航空旅客機内の気圧は、標高約２０００ｍに等しい約８００ｈＰａで沸点は大体９３℃程度であり、飛行中の航空機内でもＰＣＲを行うことが実質的に難しいということがわかる。このことは、ウィルスや病原体等の世界的蔓延を防ぐために、機内でそれらの存在をキャッチし水際で防ぐような迅速な防止策を講じることへの一つの障害事情が生じることを意味している。また平地においても、主に水溶液からなる試料を９５℃付近まで昇温することにより、沸騰に至らないまでも試料が部分的に蒸発する蓋然性は高く、流路内でＰＣＲを行う場合、蛍光信号を正確に測れないこともある。

そこで、従来、試料等の蒸発による体積の減少を防止する目的で、オイルのような蒸気圧の低い（沸点の高い）液体を、試料の両端に配置し、いわゆる「蓋」として機能させる構成が提案されている（例えば特許文献１参照）。試料の両側に不揮発性の液体によって「蓋」をすることで、試料の蒸発を防ぐことができる。

また、流路内にガス孔や疎水性のフィルタ等を設けることにより、流路内で発生した気泡を積極的に流路から排脱させるような構造も提案されている（例えば特許文献２参照）。

特開２００９－２３２７００号公報 特開平９－２６２０８４号公報

しかしながら、特許文献１に記載されるように、ＰＣＲの対象とする試料をサンドイッチするような態様で、オイル等で蓋をするような作業は、その準備作業が非常に煩わしく、また試料の汚染防止の観点からも問題がある。さらに特許文献１に係る態様では、試料の沸点が低くなるような環境下で、試料が沸騰することを抑えきれない場合があると考えられる。

また、特許文献２に記載されるように流路から積極的に気泡を抜くことは、試料の沸騰や蒸発による体積の減少を防ぐといった観点においては、抜本的な解決策にはならないし、何よりも試料の濃度が上昇するおそれがある。

本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、気圧の低い場所でも、試料の沸騰や気泡の発生を防止しつつＰＣＲを行うことのできる反応処理装置、反応処理容器および反応処理方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明のある態様の反応処理装置は、試料が導入される流路を備える板状の反応処理容器を載置するための載置部と、流路内の試料を加熱するために、流路が存在する領域の温度を制御する温度制御システムと、反応処理容器の流路内の圧力を制御して試料を流路内で移動させるための送液システムとを備える。さらに送液システムは、試料の反応処理中の流路内の圧力を反応処理装置の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧以上に維持する。

送液システムは、内部の圧力が反応処理装置の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧以上に維持された加圧チャンバと、加圧チャンバ内に配置された送液用ポンプとを備えてもよい。送液用ポンプの出力と、反応処理容器の流路の一端に設けられた第１連通口とが連通され、加圧チャンバの内部と、反応処理容器の流路の他端に設けられた第２連通口とが連通されてもよい。反応処理装置は、試料を流路内で移動させるために、送液用ポンプを制御する制御部をさらに備えてもよい。

送液システムは、内部の圧力が反応処理装置の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧以上に維持された加圧チャンバと、加圧チャンバ内に配置された第１送液用ポンプと、加圧チャンバ内に配置された第２送液用ポンプと、を備えてもよい。第１送液用ポンプの出力と、反応処理容器の流路の一端に設けられた第１連通口とが連通され、第２送液用ポンプの出力と、反応処理容器の流路の他端に設けられた第２連通口とが連通されてもよい。反応処理装置は、試料を流路内で移動させるために、第１送液用ポンプおよび第２送液用ポンプを制御する制御部をさらに備えてもよい。

送液システムは、内部の圧力が反応処理装置の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧以上に維持された加圧チャンバと、内部の圧力が加圧チャンバ内よりも高い圧力に維持された送液チャンバと、加圧チャンバと送液チャンバのいずれか一方を反応処理容器の流路の一端に設けられた第１連通口に連通させる第１方向切換バルブと、加圧チャンバと送液チャンバのいずれか一方を反応処理容器の流路の他端に設けられた第２連通口に連通させる第２方向切換バルブとを備えてもよい。反応処理装置は、試料を流路内で移動させるために、第１方向切換バルブおよび第２方向切換バルブを制御する制御部をさらに備えてもよい。

本発明の別の態様は、反応処理方法である。この方法は、試料が導入される流路を備える反応処理容器を載置する工程と、流路内の試料を加熱するために、流路の温度を制御する工程と、試料を流路内で移動するために、反応処理容器の流路内の圧力を制御する工程とを備える。試料の反応処理中に、流路内の圧力が反応処理装置の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧以上に維持される。

本発明によれば、気圧の低い場所でも、試料の沸騰や気泡の発生を防止しつつＰＣＲを行うことのできる反応処理装置、反応処理容器および反応処理方法を提供できる。

図１（ａ）および（ｂ）は、本発明の第１実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器を説明するための図である。 試料が反応処理容器の流路内に導入された様子を模式的に示す図である。 本発明の第１実施形態に係る反応処理装置を説明するための模式図である。 反応処理容器を反応処理装置の所定の位置にセットした状態を説明するための図である。 図５（ａ）および（ｂ）は、本発明の第２実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器を説明するための図である。 本発明の第２実施形態に係る反応処理装置を説明するための模式図である。 反応処理容器を反応処理装置の所定の位置にセットした状態を説明するための図である。 本発明の第３実施形態に係る反応処理装置を説明するための模式図である。 方向切換バルブの構成を説明するための模式図である。

以下、本発明の実施形態に係る反応処理装置について説明する。この反応処理装置は、ＰＣＲを行うための装置である。なお、各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。

［第１実施形態］
図１（ａ）および（ｂ）は、本発明の第１実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器１０を説明するための図である。図１（ａ）は、反応処理容器１０の平面図であり、図１（ｂ）は、反応処理容器１０の正面図である。

図１（ａ）および（ｂ）に示すように、反応処理容器１０は、基板１４と、流路封止フィルム１６とから成る。

基板１４は、温度変化に対して安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１４は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス、シリコン（Ｓｉ）等の無機材料をはじめ、アクリル、ポリエステル、シリコーンなどの樹脂、中でもシクロオレフィンが好適である。基板１４の寸法の一例は、長辺７０ｍｍ、短辺４２ｍｍ、厚み３ｍｍである。

基板１４の下面１４ａには溝状の流路１２が形成されており、この流路１２は、流路封止フィルム１６により封止されている。流路１２は、平面視において、曲線（ターン）部と直線部とを組み合わせたいわゆる連続的に折り返す蛇行状に形成されている。具体的には、両側の一対のターン部（後述の高温領域と低温領域に相当）とそれらを結ぶ２本の直線部（同中温領域に相当）とからなる組合せを１ユニットとし、試料に与えるサーマルサイクルの予定回数以上のユニットを連続的に構成する。基板１４の下面１４ａに形成される流路１２の寸法の一例は、幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍである。基板１４における流路１２の一端の位置には、外部と連通する第１連通口１７が形成されている。基板１４における流路１２の他端の位置には、第２連通口１８が形成されている。流路１２の両端に形成された一対の第１連通口１７および第２連通口１８は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。このような基板は射出成形やＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。

基板１４の下面１４ａ上には、流路封止フィルム１６が貼られている。第１実施形態に係る反応処理容器１０において、流路１２の大部分は基板１４の下面１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１４の下面１４ａ上に流路封止フィルム１６が貼られる。

流路封止フィルム１６は、一方の主面が粘着性を備えていてもよいし、押圧により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１４の下面１４ａと密着して一体化できる機能を備える。流路封止フィルム１６は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィンポリマー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、流路封止フィルム１６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、反応処理容器１０の反りや変形防止に役立つ。

図２は、試料２０が反応処理容器１０の流路１２内に導入された様子を模式的に示す。なお、図２では、試料２０の位置を強調するために、試料２０を流路１２よりも太い実線で表している。試料２０が流路からはみ出している状態を表すものではない点に留意されたい。

試料２０は、第１連通口１７および第２連通口１８のいずれか一方から流路１２に導入される。導入の方法はこれらに限られないが、例えばピペットやスポイト、シリンジ等で該連通口から適量の試料を直接導入してもよい。あるいは、多孔質のＰＴＦＥやポリエチレンからなるフィルタが内蔵してあるコーン形状のニードルチップを介してコンタミネーションを防止しながらの導入方法であってもよい。このようなニードルチップは一般的に数多くの種類のものが販売され容易に入手でき、ピペットやスポイト、シリンジ等の先端に取り付けて使用することが可能である。さらにピペットやスポイト、シリンジ等による試料の吐出、導入後、さらに加圧して推すことにより図２のように流路の所定の場所まで試料を移動させてもよい。いわゆる試料の初期位置について、図４に示すように、後述する高温領域４０内の位置を初期位置とする一例を挙げたが、これに限られるものではない。

試料２０としては、例えば、二以上の種類のＤＮＡを含む混合物に、ＰＣＲ試薬として複数種類のプライマー、耐熱性酵素および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものがあげられる。さらに反応処理対象のＤＮＡに特異的に反応する蛍光プローブを混合する。市販されているリアルタイムＰＣＲ用試薬キット等も使用することができる。

図３は、本発明の第１実施形態に係る反応処理装置３０を説明するための模式図である。図４は、反応処理容器１０を反応処理装置３０の所定の位置にセットした状態を説明するための図である。

本第１実施形態に係る反応処理装置３０は、反応処理容器１０が載置される反応処理容器載置部（図示せず）と、温度制御システム３２と、ＣＰＵ３６とを備える。温度制御システム３２は、図４に示すように、反応処理容器載置部に載置される反応処理容器１０に対して、反応処理容器１０の流路１２における紙面下方略１／３の領域４０を約９５℃、紙面上方略１／３の領域４２を約５５℃、紙面中間の略１／３の領域４１を約７２℃の３水準の温度に精度よく維持、制御できるように構成されている。以下では適宜、流路１２の領域４０を「高温領域４０」と称し、流路１２の領域４１を「中温領域４１」と称し、流路１２の領域４２を「低温領域４２」と称し、総じてサーマルサイクル領域と称する。

温度制御システム３２は、サーマルサイクル領域の各温度領域の温度を維持するものであって、具体的には、流路１２の高温領域４０を加熱するための高温用ヒータ６０と、流路１２の中温領域４１を加熱するための中温用ヒータ６１と、流路１２の低温領域４２を加熱するための低温用ヒータ６２と、各温度領域の実温度を計測するための例えば熱電対等の温度センサ（図示せず）と、高温用ヒータ６０の温度を制御する高温用ヒータドライバ３３と、中温用ヒータ６１の温度を制御する中温用ヒータドライバ３４と、低温用ヒータ６２の温度を制御する低温用ヒータドライバ３５とを備える。温度センサによって計測された実温度情報は、ＣＰＵ３６に送られる。ＣＰＵ３６は、各温度領域の実温度情報に基づいて、各ヒータの温度が所定の温度となるよう各ヒータドライバを制御する。各ヒータは例えば抵抗加熱素子やペルチェ素子等であってよい。温度制御システム３２はさらに、各温度領域の温度制御性を向上させるための他の要素部品を備えてもよい。

本第１実施形態に係る反応処理装置３０は、さらに、試料２０を反応処理容器１０の流路１２内で移動させるための送液システム３７を備える。この送液システム３７を用いて流路１２内の圧力を制御することにより、試料２０を流路１２内を一方向に連続流的に移動させて、反応処理容器１０のサーマルサイクル領域内の各温度領域を通過させることができ、その結果、試料２０にサーマルサイクルを与えることが可能となる。より具体的には、高温領域４０において変性、低温領域４２においてアニーリング、そして中温領域４１において伸長の各工程を与えることにより、試料２０中の目的のＤＮＡを選択的に増幅させる。言い換えれば高温領域４０は変性温度域、低温領域４２はアニーリング温度域、中温領域４１は伸長温度域とみなすことができる。また各温度領域に滞留する時間は、試料が各温度領域の所定の位置で停止する時間、試料の移動する速さ、各温度領域の大きさ（面積）、各温度領域に該当する流路長などを変えることによって適宜設定することができる。また、アニーリング温度域と伸長温度域が一体となってアニーリング・伸長温度域としてもよい。この場合は変性のための高温領域とそれより低い温度領域（中低温領域）の２水準の温度領域からなるサーマルサイクル領域となる。

送液システム３７は、加圧チャンバ３８と、送液用ポンプ３９と、該送液用ポンプ３９を制御するための送液用ポンプドライバ４３と、加圧チャンバ用ポンプ４４と、該加圧チャンバ用ポンプ４４を制御するための加圧チャンバ用ポンプドライバ４５と、第１チューブ４６と、第２チューブ４７とを備える。

反応処理容器１０の第１連通口１７には、第１チューブ４６の第１端部４６ａが接続される。第１連通口１７と第１チューブ４６の第１端部４６ａの接続部には、気密性を確保するためのパッキンやシールが配置されることが好ましい。第１チューブ４６の第２端部４６ｂは、送液用ポンプ３９の出力に接続される。送液用ポンプ３９は、例えばダイアフラムポンプからなるマイクロブロアポンプであってよい。

ＣＰＵ３６は、送液用ポンプドライバ４３を介して、送液用ポンプ３９からの送風や加圧を制御する。送液用ポンプ３９からの送風や加圧は、第１連通口１７を通じて流路１２内の試料２０に作用し、推進力となって試料２０を移動させる。

送液用ポンプ３９としては、例えば株式会社村田製作所製のマイクロブロアポンプ（型式ＭＺＢ１００１Ｔ０２）などを使用することができる。このマイクロブロアポンプは、動作時に一次側より二次側の圧力を高めることができるが、停止した瞬間または停止時には一次側と二次側の圧力が等しくなる。本第１実施形態において、送液用ポンプ３９は、その全体が加圧チャンバ３８内に配置される。

反応処理容器１０の第２連通口１８には、第２チューブ４７の第１端部４７ａが接続される。第２連通口１８と第２チューブ４７の第１端部４７ａの接続部には、気密性を確保するためのパッキンやシールが配置されることが好ましい。第２チューブ４７の第２端部４７ｂは、加圧チャンバ３８内に連通するように接続される。これにより、反応処理容器１０の第２連通口１８は、加圧チャンバ３８内の雰囲気に連通する。

加圧チャンバ３８は、その内部に一定の体積を有する空間を形成している。加圧チャンバ３８には、加圧チャンバ用ポンプ４４が接続されている。加圧チャンバ用ポンプドライバ４５は、ＣＰＵ３６からの指示に従い、加圧チャンバ３８内の空間が所定の圧力となるよう加圧チャンバ用ポンプ４４を制御する。加圧チャンバ用ポンプ４４としては、例えば電装産業株式会社製の小型ＤＣダイアフラムポンプ（型式ＤＳＡ－１－１２ＢＬ）等を使用することができるほか、簡易的なところではゴム球やシリンジ等による加圧手段も使用することができる。本第１実施形態では、加圧チャンバ３８内の圧力は、反応処理中、反応処理装置３０の周辺環境の気圧より高めに設定され、より好ましくは１気圧（１０１３ｈＰａ）以上に維持される。反応処理装置の周辺環境の気圧とは、本発明に係る反応処理装置が設置されている場所、当該装置による反応処理が行われる場所、又は当該反応処理装置が周りから区画された場所に設置されている場合は、その区画された場所、における圧力（又は大気圧）のことを指す。加圧チャンバ３８内の圧力は、試料が高温（９５℃程度）に繰り返し曝されても、ＰＣＲ反応処理に影響するような著しい試料の蒸発や気泡等の発生を防止できる程度に加圧すればよい。加圧チャンバ３８内の圧力は高ければ高いほど、試料の蒸発等の影響を抑止することができるが、反面、その取扱いも含めて送液システム３７が複雑化したり大型化したりするため、当業者は装置の用途や目的、費用、効果等を総合的に判断し、全体のシステムの設計をすることができる。

加圧チャンバ３８には、大気圧開放バルブ４８が設けられている。大気圧開放バルブ４８は、反応処理容器１０の反応処理装置３０への脱着時に、送液システム３７（加圧チャンバ３８、第１チューブ４６及び第２チューブ４７等の内部）や反応処理容器１０の流路１２内の圧力が反応処理装置３０の周辺環境の気圧に等しくなるように制御される。これにより、試料２０の急激な移動やとびだしを防ぐことができる。

また、加圧チャンバ３８には、その内部空間の圧力を常時モニタするための圧力センサ（図示せず）が設けられてもよい。圧力センサで検出した実圧力をＣＰＵ３６に送ることで、加圧チャンバ３８内の圧力を好適に制御できる。

本第１実施形態に係る反応処理装置３０は、さらに、蛍光検出器５０を備える。蛍光検出器５０を用いて反応処理容器１０の流路１２内の試料２０からの蛍光を検出し、その値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。

蛍光検出器５０としては、非常にコンパクトな光学系で、迅速に測定でき、かつ明るい場所か暗い場所かにもかかわらず、蛍光を検出することができる日本板硝子株式会社製の光ファイバ型蛍光検出器ＦＬＥ－５１０を使用することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、その励起光／蛍光の波長特性を試料２０の発する蛍光特性に適するようにチューニングしておくことができ、様々な特性を有する試料について最適な光学・検出系を提供することが可能である。

光ファイバ型の蛍光検出器５０は、光学ヘッド５１と、蛍光検出器ドライバ５２と、光学ヘッド５１と蛍光検出器ドライバ５２とを接続する光ファイバ５３とを備える。蛍光検出器ドライバ５２には励起光用光源（ＬＥＤ、レーザその他特定の波長を出射するように調整された光源）、光ファイバ型合分波器及び光電変換素子（ＰＤ，ＡＰＤ又はフォトマル等の光検出器）（いずれも図示せず）等が含まれており、これらを制御するためのドライバ等からなる。光学ヘッド５１はレンズ等の光学系からなり、励起光の試料への指向性照射と試料から発せられる蛍光の集光の機能を担う。集光された蛍光は光ファイバ５３を通じて蛍光検出器ドライバ５２内の光ファイバ型合分波器により励起光と分けられ、光電変換素子によって電気信号に変換される。光学ヘッド５１は、例えば図４に示すように、反応処理容器１０の第２連通口１８付近に配置されてよい。この場合、一連の反応処理が終了し第２連通口１８付近に送液された試料２０からの蛍光を検出することにより、ＤＮＡの増幅が完了したことを知ることができる。また光学ヘッド５１は、第１連通口１７付近や途中の流路１２内の試料２０からの蛍光を検出できるように複数配置してもよい。流路１２に沿って蛍光信号の変化をモニタリングすることで、ＤＮＡの増幅を時系的に知ることが可能となる。蛍光検出器は、試料からの蛍光を検出する機能を発揮するものであれば光ファイバ型蛍光検出器に限定されない。

以上のように構成された反応処理装置３０を用いた反応処理方法について説明する。初期の装置の状態において、第１チューブ４６の第２端部４６ｂは送液用ポンプ３９の出力に接続されており、第１チューブ４６の第１端部４６ａは開放されているものとする。また、第２チューブ４７の第２端部４７ｂは加圧チャンバ３８に接続されており、第２チューブ４７の第１端部４７ａは開放されているものとする。

まず、反応処理容器１０に試料２０を導入し初期位置まで移動させた後、反応処理容器１０を反応処理装置３０の反応処理容器載置部に設置する。

次に、加圧チャンバ３８に設けられた大気圧開放バルブ４８を開け、加圧チャンバ３８や、反応処理容器１０の第１連通口１７、第２連通口１８に接続される予定の第１チューブ４６、第２チューブ４７内の圧力を大気圧と同じくする。続いて、送液用ポンプ３９から延びる第１チューブ４６の第１端部４６ａを反応処理容器１０の第１連通口１７に接続し、加圧チャンバ３８から延びる第２チューブ４７の第１端部４７ａを反応処理容器１０の第２連通口１８に接続する。送液用ポンプ３９および加圧チャンバ用ポンプ４４はいずれも、この時点では動作させない。続いて、加圧チャンバ３８に設けられた大気圧開放バルブ４８を閉める。

次に、加圧チャンバ用ポンプ４４を動作させ、加圧チャンバ３８内およびそれに連通する反応処理容器１０の流路１２の圧力を、反応処理装置３０の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧（１０１３ｈＰａ）以上にする。この時点で送液用ポンプ３９は動作していないので一次側と二次側の圧力が等しく、すなわち送液用ポンプ３９の二次側と連通している第１連通口１７の圧力も加圧チャンバ３８内の圧力と等しくなっている。従って、反応処理容器１０の流路１２内の試料２０の両側の空間（第１連通口１７側と第２連通口１８側）の圧力は均等であるので試料２０は移動しない。試料２０とそれを含む流路１２内の圧力は反応処理装置３０の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧以上であるので、高地などの低い大気圧の環境下においても、主に水溶液からなる試料２０の沸点が低下して試料２０が沸騰・発泡することを防ぐことができる。

続いて、温度制御システム３２を動作させて、反応処理容器１０中の各温度領域の温度制御を開始する。各温度領域の温度が安定するまで所定の時間待機してもよい。温度制御の開始は流路１２内の圧力が、送液システム３７により安定した後に行うほうが好ましい。

次に、送液用ポンプドライバ４３によって送液用ポンプ３９を動作させる。これにより、試料２０の両側の流路１２のうち、第１連通口１７側の流路１２内の圧力が第２連通口１８側のそれより高くなるので、試料２０は第２連通口１８の方に流路１２内を推されて移動することができる。試料２０は、連続した蛇行流路１２に沿って、変性領域（高温領域４０）－アニーリング領域（低温領域４２）－伸長領域（中温領域４１）の各温度領域をサイクル的に連続して通過する。また、２水準の温度領域が設定された反応処理装置の場合は、変性領域（高温領域）－アニーリング・伸長領域（中低温領域）の各温度領域をサイクル的に連続して通過する。これにより、試料２０は所定回数のサーマルサイクルを与えられ、ＰＣＲが起こり、所定のＤＮＡを選択的に増幅させることができる。

このように、本第１実施形態に係る反応処理装置３０では、反応処理中に、反応処理容器１０の流路１２内の圧力は、常に反応処理装置３０の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧以上に維持される。すなわち、反応処理中は、試料２０は常に反応処理装置３０の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧以上の加圧がなされている。そのため、高地や航空機内のような気圧の低い場所でも、試料の沸騰や気泡の発生を防止しつつＰＣＲを行うことができる。

［第２実施形態］
図５（ａ）および（ｂ）は、本発明の第２実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器１１０を説明するための図である。図５（ａ）は、反応処理容器１１０の平面図であり、図５（ｂ）は、反応処理容器１１０の正面図である。

図５（ａ）および（ｂ）に示すように、反応処理容器１１０は、基板１１４と、流路封止フィルム１１６とから成る。基板１１４と流路封止フィルム１１６の材質や寸法等の構成は第１実施形態で説明した反応処理容器１０と同様である。基板１１４の下面１１４ａには溝状の流路１１２が形成されており、この流路１１２は、流路封止フィルム１１６により封止されている。基板１１４の下面１１４ａに形成される流路１１２の寸法の一例は、幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍである。基板１１４における流路１１２の一端の位置には、外部と連通する第１連通口１１７が形成されている。基板１１４における流路１１２の他端の位置には、第２連通口１１８が形成されている。流路１１２の両端に形成された一対の第１連通口１１７および第２連通口１１８は、基板１１４の上面１１４ｂに露出するように形成されている。基板１１４の下面１１４ａ上には、流路封止フィルム１１６が貼られている。第２実施形態に係る反応処理容器１１０において、流路１１２の大部分は基板１１４の下面１１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形やＮＣ加工機による切削加工により容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１１４の下面１１４ａ上に流路封止フィルム１１６が貼られる。

第２実施形態の反応処理容器１１０は、第１実施形態の反応処理容器１０と同じように一対の連通口の間の流路１１２に、複数水準の温度制御が可能な温度領域を備えるが、流路１１２がいわゆる連続的に折り返す蛇行流路ではない点が第１実施形態の反応処理容器１０と異なる。これは後述するが、第１実施形態の反応処理容器１０のように連続的に折り返す蛇行流路に一方通行の連続流で試料を送液するのではなく、少なくとも１本の流路１１２の複数水準の温度が維持された温度領域間を、連続的に往復するように試料を送液することを予定しているからである。流路１１２のうち各温度領域に該当する流路１１２の部分は、各温度領域内で曲線（ターン）部と直線部とからなる（第１実施形態と比較して小さい）蛇行状の形態であってよく、各温度領域は例えば短い流路で接続される。各温度領域はその面積や流路長を第１実施形態のものより小さくできるので、各温度領域内で温度のばらつきを低減することが比較的容易であるとともに、流路長全体を短くでき、反応処理容器と反応処理装置を小さくできるというメリットがある。

図６は、本発明の第２実施形態に係る反応処理装置１３０を説明するための模式図である。図７は、反応処理容器１１０を反応処理装置１３０の所定の位置にセットした状態を説明するための図である。図７では、反応処理容器１１０の流路１１２内に試料１２０が導入されている。図７では、第１実施形態と同様に、試料１２０の位置を強調するために、試料１２０を流路１１２よりも太い実線で表している。試料１２０が流路からはみ出している状態を表すものではない点に留意されたい。また第２実施形態において、試料１２０とその導入方法などについても第１実施形態と同様である。試料１２０の初期位置についても、図７に示すように、後述する高温領域１４０内の位置を初期位置とする一例を挙げたが、これに限定されるものではない。

本第２実施形態に係る反応処理装置１３０は、反応処理容器１１０が載置される反応処理容器載置部（図示せず）と、温度制御システム１３２と、ＣＰＵ１３６とを備える。温度制御システム１３２は、図７に示すように、反応処理容器載置部に載置される反応処理容器１１０に対して、反応処理容器１１０の流路１１２における紙面右側略１／３の領域１４０を約９５℃、紙面左側略１／３の領域１４２を約５５℃、紙面中間の略１／３の領域１４１を約７２℃の３水準の温度に精度よく維持、制御できるように構成されている。以下では適宜、流路１１２の領域１４０を「高温領域１４０」と称し、流路１１２の領域１４１を「中温領域１４１」と称し、流路１１２の領域１４２を「低温領域１４２」と称し、総じてサーマルサイクル領域と称する。

温度制御システム１３２は、サーマルサイクル領域の各温度領域を維持するものであって、具体的には、流路１１２の高温領域１４０を加熱するための高温用ヒータ１６０と、流路１１２の中温領域４１を加熱するための中温用ヒータ１６１と、流路１１２の低温領域４０を加熱するための低温用ヒータ１６２と、各温度領域の実温度を計測するための例えば熱電対等の温度センサ（図示せず）と、高温用ヒータ１６０の温度を制御する高温用ヒータドライバ１３３と、中温用ヒータ１６１の温度を制御する中温用ヒータドライバ１３４と、低温用ヒータ１６２の温度を制御する低温用ヒータドライバ１３５とを備える。温度センサによって計測された実温度情報は、ＣＰＵ１３６に送られる。ＣＰＵ１３６は、各温度領域の実温度情報に基づいて、各ヒータの温度が所定の温度となるよう各ヒータドライバを制御する。各ヒータは例えば抵抗加熱素子やペルチェ素子等であってよい。温度制御システム１３２はさらに、各温度領域の温度制御性を向上させるための他の要素部品を備えてもよい。

本第２実施形態に係る反応処理装置１３０は、さらに、試料１２０を反応処理容器１１０の流路１１２内で移動させるための送液システム１３７を備える。この送液システム１３７を用いて流路１１２内の圧力を制御することにより、試料１２０を流路１１２内で連続的に往復式に移動させて、反応処理容器１１０のサーマルサイクル領域内の各温度領域を通過させることができ、その結果、試料１２０にサーマルサイクルを与えることが可能となる。より具体的には、高温領域１４０において変性、低温領域１４２においてアニーリング、そして中温領域１４１において伸長の各工程を与えることにより、試料１２０中の目的のＤＮＡを選択的に増幅させる。言い換えれば高温領域１４０は変性温度域、低温領域１４２はアニーリング温度域、中温領域１４１は伸長温度域とみなすことができる。また各温度領域に滞留する時間は、試料が各温度領域の所定の位置に停止する時間、試料の移動する速さ、各温度領域の大きさ（面積）、各温度領域に該当する流路長などを変えることによって適宜設定することができる。また、アニーリング温度域と伸長温度域が一体となってアニーリング・伸長温度域としてもよい。この場合は変性のための高温領域とそれより低い温度領域（中低温領域）の２水準の温度領域からなるサーマルサイクル領域となる。

送液システム１３７は、加圧チャンバ１３８と、第１送液用ポンプ１３９と、該第１送液用ポンプ１３９を制御するための第１送液用ポンプドライバ１４３と、第２送液用ポンプ１６５と、該第２送液用ポンプ１６５を制御するための第２送液用ポンプドライバ１６６と、加圧チャンバ用ポンプ１４４と、該加圧チャンバ用ポンプ１４４を制御するための加圧チャンバ用ポンプドライバ１４５と、第１チューブ１４６と、第２チューブ１４７とを備える。

反応処理容器１１０の第１連通口１１７には、第１チューブ１４６の第１端部１４６ａが接続される。第１連通口１１７と第１チューブ１４６の第１端部１４６ａの接続部には、気密性を確保するためのパッキンやシールが配置されることが好ましい。第１チューブ１４６の第２端部１４６ｂは、第１送液用ポンプ１３９の出力に接続される。第１送液用ポンプ１３９は、例えばダイアフラムポンプからなるマイクロブロアポンプであってよい。同様に、反応処理容器１１０の第２連通口１１８には、第２チューブ１４７の第１端部１４７ａが接続される。第２連通口１１８と第２チューブ１４７の第１端部１４７ａの接続部には、気密性を確保するためのパッキンやシールが配置されることが好ましい。第２チューブ１４７の第２端部１４７ｂは、第２送液用ポンプ１６５の出力に接続される。第２送液用ポンプ１６５は、例えばダイアフラムポンプからなるマイクロブロアポンプであってよい。

ＣＰＵ１３６は、第１送液用ポンプドライバ１４３、第２送液用ポンプドライバ１６６を介して、第１送液用ポンプ１３９、第２送液用ポンプ１６５からの送風や加圧を制御する。第１送液用ポンプ１３９、第２送液用ポンプ１６５からの送風や加圧は、第１連通口１１７、第２連通口１１８を通じて流路１１２内の試料１２０に作用し、推進力となって試料１２０を移動させる。

第１送液用ポンプ１３９、第２送液用ポンプ１６５としては、例えば株式会社村田製作所製のマイクロブロアポンプ（型式ＭＺＢ１００１Ｔ０２）などを使用することができる。本第２実施形態において、第１送液用ポンプ１３９と第２送液用ポンプ１６５はともに、それらの全体が加圧チャンバ１３８内に配置される。

加圧チャンバ１３８は、その内部に一定の体積を有する空間を形成している。加圧チャンバ１３８には、加圧チャンバ用ポンプ１４４が接続されている。加圧チャンバ用ポンプドライバ１４５は、ＣＰＵ１３６からの指示に従い、加圧チャンバ１３８内の空間が所定の圧力となるよう加圧チャンバ用ポンプ１４４を制御する。加圧チャンバ用ポンプ１４４としては、電装産業株式会社製の小型ＤＣダイアフラムポンプ（型式ＤＳＡ－１－１２ＢＬ）等を使用することができるほか、簡易的なところではゴム球やシリンジ等による加圧手段も使用することができる。本第２実施形態では、加圧チャンバ１３８内の圧力は、反応処理中、反応処理装置１３０の周辺環境の気圧より高めに設定され、より好ましくは１気圧（１０１３ｈＰａ）以上に維持される。加圧チャンバ１３８内の圧力は、試料が高温（９５℃程度）に繰り返し曝されても、ＰＣＲ反応処理に影響するような著しい試料の蒸発や気泡等の発生を防止できる程度に加圧すればよい。加圧チャンバ１３８内の圧力は高ければ高いほど、試料の蒸発等の影響を抑止することができるが、反面、その取扱いも含めて送液システム１３７が複雑化したり大型化したりするため、当業者は装置の用途や目的、費用、効果等を総合的に判断し、全体のシステムの設計をすることができる。

加圧チャンバ１３８には、大気圧開放バルブ１４８が設けられている。大気圧開放バルブ１４８は、反応処理容器１１０の脱着時に、送液システム１３７や反応処理容器１１０の流路１１２内の圧力が大気圧に等しくなるように制御される。これにより、試料１２０の急激な移動やとびだしを防ぐことができる。

また、加圧チャンバ１３８には、その内部空間の圧力を常時モニタするための圧力センサ（図示せず）が設けられてもよい。圧力センサで検出した実圧力をＣＰＵ１３６に送ることで、加圧チャンバ１３８内の圧力を好適に制御できる。

本第２実施形態に係る反応処理装置１３０は、さらに、蛍光検出器１５０を備える。蛍光検出器１５０を用いて反応処理容器１１０の流路１１２内の試料１２０からの蛍光を検出し、その値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。

蛍光検出器１５０としては、上述の第１実施形態と同様に、光ファイバ型蛍光検出器を使用することができる。光ファイバ型の蛍光検出器１５０は、第１光学ヘッド１５１と、第２光学ヘッド１５４と、第１蛍光検出器ドライバ１５２と、第２蛍光検出器ドライバ１５５と、第１光学ヘッド１５１と第１蛍光検出器ドライバ１５２とを接続する第１光ファイバ１５３と、第２光学ヘッド１５４と第２蛍光検出器ドライバ１５５とを接続する第２光ファイバ１５６とを備える。第１光学ヘッド１５１、第１蛍光検出器ドライバ１５２及び第１光ファイバ１５３の組合せについては第１蛍光検出器と称し、第２光学ヘッド１５４、第２蛍光検出器ドライバ１５５及び第２光ファイバ１５６の組合せについては第２蛍光検出器と称することもできる。さらに第３、第４以上の蛍光検出器を備えていてもよい。第１及び第２蛍光検出器については、ぞれぞれ第１実施形態と同様の構成のものを用いることができるため詳細な説明を省略する。また第１及び第２蛍光検出器は、同じ特性(例えば励起光や蛍光の対象波長が同じなど)を備えていてもよいし、異なる特性（該対象波長を違えるなど）を備えていてもよい。この場合は、蛍光特性の異なる複数種類のＤＮＡの増幅について知得することが可能な場合もある点で有利である。

第１光学ヘッド１５１は、図７に示すように、高温領域１４０と中温領域１４１を接続する流路に配置される。第２光学ヘッド１５４は、中温領域１４１と低温領域１４２を接続する流路に配置される。試料１２０は流路１１２内を往復送液されながら反応が進み、試料１２０に含まれる所定のＤＮＡが増幅するので、試料から得られる蛍光の量の変動をモニタリングすることで、ＤＮＡの増幅の進捗をリアルタイムで知ることができる。第１実施形態における一方向移動の連続流的な蛇行状の流路においては、ＤＮＡの増幅の進捗をリアルタイムで確認することは実質上困難である。長い流路上に適宜、第２実施形態よりはるかに多い台数の蛍光検出器の設置や、蛍光検出器の流路の沿った走査をしなければならないからである。第２実施形態に係る往復流的な蛇行状の流路からなる反応処理容器においてはこの点においても有利である。

以上のように構成された反応処理装置１３０を用いた反応処理方法について説明する。初期の装置の状態において、第１チューブ１４６の第２端部１４６ｂは第１送液用ポンプ１３９の出力に接続されており、第１チューブ１４６の第１端部１４６ａは開放されているものとする。また、第２チューブ１４７の第２端部１４７ｂは第２送液用ポンプ１６５の出力に接続されており、第２チューブ１４７の第１端部１４７ａは開放されているものとする。

まず、反応処理容器１１０に試料１２０を導入し初期位置まで移動させた後、反応処理容器１１０を反応処理装置１３０の反応処理容器載置部に設置する。

次に、加圧チャンバ１３８に設けられた大気圧開放バルブ１４８を開け、加圧チャンバ１３８や、反応処理容器１１０の第１連通口１１７、第２連通口１１８に接続される予定の第１チューブ１４６、第２チューブ１４７内の圧力を大気圧と同じくする。続いて、第１送液用ポンプ１３９から延びる第１チューブ１４６の第１端部１４６ａを反応処理容器１１０の第１連通口１１７に接続し、第２送液用ポンプ１６５から延びる第２チューブ１４７の第１端部１４７ａを反応処理容器１１０の第２連通口１１８に接続する。第１送液用ポンプ１３９、第２送液用ポンプ１６５および加圧チャンバ用ポンプ１４４はいずれも、この時点では動作させない。続いて、加圧チャンバ１３８に設けられた大気圧開放バルブ１４８を閉める。

次に、加圧チャンバ用ポンプドライバ１４５によって加圧チャンバ用ポンプ１４４を動作させ、加圧チャンバ１３８内およびそれに連通する反応処理容器１１０の流路１１２の圧力を反応処理装置１３０の周辺環境の気圧より高め、より好ましくは１気圧（１０１３ｈＰａ）以上にする。この時点で第１送液用ポンプ１３９および第２送液用ポンプ１６５はいずれも動作していないので一次側と二次側の圧力が等しく、すなわち二次側の第１連通口１１７と第２連通口１１８の圧力も加圧チャンバ１３８内の圧力と等しくなっている。従って、反応処理容器１１０の流路１１２内の試料１２０の両側の空間（第１連通口１１７側と第２連通口１１８側）の圧力は均等であるので試料１２０は移動しない。試料１２０とそれを含む流路１１２内の圧力は常に反応処理装置１３０の周辺環境の気圧より高め、より好ましくは１気圧かそれ以上であるので、高地などの低い大気圧環境下においても、主に水溶液からなる試料１２０の沸点が低下して試料１２０が沸騰・発泡することを防ぐことができる。

続いて、温度制御システム１３２を動作させて、反応処理容器１１０中の各温度領域の温度制御を開始する。各温度領域の温度が安定するまで所定の時間待機してもよい。温度制御の開始は流路１１２内の圧力が、送液システム１３７によりある一定以上の圧力に維持された後に行うほうが好ましい。

ここで、試料１２０の初期位置が例えば高温領域１４０にあるものとする。試料１２０が高温領域１４０に一定時間あることで、ＤＮＡの変性がなされる。はじめに、第１送液用ポンプ１３９を動作させる。これにより試料１２０の両側の空間のうち、第１連通口１１７側の流路１１２内の圧力が第２連通口１１８側のそれより高くなるので、試料１２０は第２連通口１１８の方に流路１１２内を押されて、高温領域１４０から中温領域１４１を経て低温領域１４２に移動することができる。試料１２０が低温領域１４２に至ったとき第１送液用ポンプ１３９を停止させる。第１送液用ポンプ１３９は停止すると、先述のように送液用ポンプの一次側圧力と二次側圧力が等しくなるので、試料１２０の第１連通口１１７側の空間と第２連通口１１８側の流路空間の圧力が、ともに加圧チャンバ１３８内の圧力と等しくなり（すなわち差がなくなり）、試料１２０の移動が停止する。ここで試料１２０を一定時間低温領域１４２におくことでＤＮＡのアニーリングがなされる。

続いて第２送液用ポンプ１６５を動作させて、試料１２０が低温領域１４２から中温領域１４１に移動が完了したときに、第２送液用ポンプ１６５を停止させる。ここで試料１２０を一定時間中温領域１４１におくことでＤＮＡの伸長がなされる。さらに第２送液用ポンプ１６５を動作させて、試料１２０が中温領域１４１から高温領域１４０に移動が完了したときに、第２送液用ポンプ１６５を停止させる。ここで試料１２０を一定時間高温領域１４０におくことでＤＮＡの変性がなされる。

以上のような試料１２０の動きを繰り返しさせるように、送液システム１３７を動作制御することによって、試料１２０が流路１１２内を往復移動する。具体的には、高温（変性）－低温（アニーリング）－中温（伸長）－高温（変性）－低温（アニーリング）－中温（伸長）－・・・・・・の各温度領域をサイクル的に試料１２０が通過する。また、２水準の温度領域が設定された反応処理装置の場合は、高温（変性）－中低温（アニーリング・伸長）－高温（変性）－中低温（アニーリング・伸長）－・・・・・・の各温度領域をサイクル的に試料１２０が通過する。これにより、試料１２０は所定回数のサーマルサイクルを与えられ、ＰＣＲが起こり、所定のＤＮＡを選択的に増幅させることができる。

本第２実施形態に係る反応処理装置１３０では、複数の温度領域を接続する一本の流路１１２内を試料１２０が連続して往復移動するため、その試料１２０の位置の制御が重要となる。そのため、上述の蛍光検出器１５０を位置センサとして機能させることができる。流路１１２中のある特定の場所の試料１２０から発せられる蛍光を検出するように蛍光検出器１５０の光学ヘッドが配置された場合、試料１２０がその特定の場所にないときは蛍光信号はゼロかバックグラウンドレベルにあるが、試料１２０がその特定の場所を通過するときには、蛍光信号はゼロかバックグラウンドレベルから上昇し、再びゼロかバックグラウンドレベルになる出力変動を示す。従ってこれらの試料１２０の通過に基づく蛍光信号の出力に基づいて、例えば送液システム１３７を駆動させるドライバを制御することにより、試料１２０の適切な位置決めを伴う往復送液が可能となる。また蛍光検出器１５０の光学ヘッドは、流路１１２に沿って複数配置することも可能である。例えば蛍光検出器１５０の光学ヘッドを各反応領域の直下に配置することで、各反応領域における試料１２０の有無を検出できるため、より確実な試料１２０の位置決めが可能となる。

また、本第２実施形態に係る反応処理装置１３０を用いた反応処理方法では、第１実施形態に係る反応処理装置３０を用いた反応処理方法とは異なり、サーマルサイクルによる反応処理の間も、継続して試料１２０からの蛍光を検出することができ、先述のようにリアルタイムでＤＮＡ増幅の進捗管理も可能である点が有利である。

このように、本第２実施形態に係る反応処理装置１３０では、反応処理中に、反応処理容器１１０の流路１１２内の圧力は、常に反応処理装置１３０の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧以上に維持される。すなわち、反応処理中は、試料１２０は常に反応処理装置１３０の周辺環境の気圧より高く、好ましくは１気圧以上の加圧がなされている。そのため、高地や航空機内のような気圧の低い場所でも、試料の沸騰や気泡の発生を防止しつつ安定したＰＣＲを行うことができる。

［第３実施形態］
図８は、本発明の第３実施形態に係る反応処理装置２３０を説明するための模式図である。本第３実施形態に係る反応処理装置２３０では、反応処理容器は第２実施形態で説明した反応処理容器１１０（図５参照）と同じものを使用するので、同一の構成要素には同じ符号を付し、重複する説明を適宜省略する。また、反応処理装置２３０における温度制御システムおよび蛍光検出器についても第２実施形態で説明した温度制御システム１３２および蛍光検出器１５０と同じものを使用するため、同一の構成要素には同じ符号を付し、重複する説明を適宜省略する。本発明の第３実施形態に係る反応処理装置２３０は、送液システムの構成と、それに基づく反応処理方法が第２実施形態と異なる。

本発明の第３実施形態に係る反応処理装置２３０の送液システム２３７は、送液チャンバ２００と、加圧チャンバ２０１と、送液チャンバ用ポンプ２０２と、該送液チャンバ用ポンプ２０２を制御するための送液チャンバ用ポンプドライバ２０４と、加圧チャンバ用ポンプ２０３と、該加圧チャンバ用ポンプ２０３を制御するための加圧チャンバ用ポンプドライバ２０５と、第１方向切換バルブ２０６と、第２方向切換バルブ２０７と、第１チューブ２４６と、第２チューブ２４７とを備える。また、反応処理装置２３０は、第１方向切換バルブ２０６および第２方向切換バルブ２０７を制御するためのドライバ（図示せず）を備えていてもよい。

図９は、方向切換バルブの構成を説明するための模式図である。図９に示す方向切換バルブ９００は、図８に示す反応処理装置２３０で第１方向切換バルブ２０６、第２方向切換バルブ２０７として用いることができる。図９に示すように、方向切換バルブ９００は、第１供給ポート９０１と、第２供給ポート９０２と、排出ポート９０３とを備える。方向切換バルブ９００は、第１供給ポート９０１と排出ポート９０３との連通、および、第２供給ポート９０２と排出ポート９０３との連通を切り換えることができるものである。連通の切り換えの手段は、直動タイプの電磁式または別途の空気圧によって内部の弁を切り換えるパイロットタイプの電磁式であってもよい。また、第１供給ポート９０１と排出ポート９０３または第２供給ポート９０２と排出ポート９０３のそれぞれのパスは、双方向に空気が流れる、いわゆるユニバーサルタイプのバルブであってもよい。また４以上のポートを備える方向切換バルブも使用することができる。また、方向切換バルブはこれらに限定されず３方コックのようなものでもよい。さらにステッピングモータ等で３方コックの回転を制御するような構成を備えていてもよい。

図８に戻り、反応処理容器１１０の第１連通口１１７には、第１チューブ２４６の第１端部２４６ａが接続される。第１連通口１１７と第１チューブ２４６の第１端部２４６ａの接続部には、気密性を確保するためのパッキンやシールが配置されることが好ましい。第１チューブ２４６の第２端部２４６ｂは、第１方向切換バルブ２０６の排出ポートに接続される。また、第１方向切換バルブ２０６の第１供給ポートは、中空チューブ２１０によって送液チャンバ２００に接続される。また、第１方向切換バルブ２０６の第２供給ポートは、中空チューブ２１１によって加圧チャンバ２０１に接続される。

同様に、反応処理容器１１０の第２連通口１１８には、第２チューブ２４７の第１端部２４７ａが接続される。第２連通口１１８と第２チューブ２４７の第１端部２４７ａの接続部には、気密性を確保するためのパッキンやシールが配置されることが好ましい。第２チューブ２４７の第２端部２４７ｂは、第２方向切換バルブ２０７の排出ポートに接続される。また、第２方向切換バルブ２０７の第１供給ポートは、中空チューブ２１２によって送液チャンバ２００に接続される。また、第２方向切換バルブ２０７の第２供給ポートは、中空チューブ２１３によって加圧チャンバ２０１に接続される。

送液チャンバ２００は、その内部に一定の体積を有する空間を形成している。送液チャンバ２００には、送液チャンバ用ポンプ２０２が接続されている。送液チャンバ用ポンプドライバ２０４は、ＣＰＵ２３６からの指示に従い、送液チャンバ２００内の空間が所定の圧力となるよう送液チャンバ用ポンプ２０２を制御する。

同様に、加圧チャンバ２０１は、その内部に一定の体積を有する空間を形成している。加圧チャンバ２０１には、加圧チャンバ用ポンプ２０３が接続されている。加圧チャンバ用ポンプドライバ２０５は、ＣＰＵ２３６からの指示に従い、加圧チャンバ２０１内の空間が所定の圧力となるよう加圧チャンバ用ポンプ２０３を制御する。

送液チャンバ用ポンプ２０２および加圧チャンバ用ポンプ２０３としては、電装産業株式会社製の小型ＤＣダイアフラムポンプ（型式ＤＳＡ－１－１２ＢＬ）等を使用することができるほか、簡易的なところではゴム球やシリンジ等による加圧手段も使用することができる。

本第３実施形態では、送液チャンバ２００および加圧チャンバ２０１内の圧力は、反応処理中、反応処理装置１３０の周辺環境の気圧より高め、より好ましくは１気圧（１０１３ｈＰａ）以上に維持される。また、送液チャンバ２００内の圧力は、反応処理中、加圧チャンバ２０１内の圧力よりも高い圧力に維持される。

送液チャンバ２００および加圧チャンバ２０１にはそれぞれ、大気圧開放バルブ２２０および２２１が設けられている。大気圧開放バルブ２２０および２２１により、繰り返し反応処理装置２３０を使用する際にチャンバ内部の圧力状態をリセットすることができ、反応処理容器１１０の脱着時に試料１２０の急激な移動や飛び出しを防ぐことができる。

以上のように構成された反応処理装置２３０を用いた反応処理方法について説明する。初期の装置の状態において、第１チューブ２４６の第２端部２４６ｂは第１方向切換バルブ２０６の排出ポートに接続されており、第１チューブ２４６の第１端部２４６ａは開放されているものとする。また、第２チューブ２４７の第２端部２４７ｂは第２方向切換バルブ２０７の排出ポートに接続されており、第２チューブ２４７の第１端部２４７ａは開放されているものとする。

まず、反応処理容器１１０に試料１２０を導入し初期位置まで移動させた後、反応処理容器１１０を反応処理装置２３０の反応処理容器載置部に設置する。

次に、大気圧開放バルブ２２０および２２１を開け、送液チャンバ２００、加圧チャンバ２０１、第１方向切換バルブ２０６、第２方向切換バルブ２０７、第１チューブ２４６、第２チューブ２４７内の圧力を大気圧と同じくする。続いて、第１方向切換バルブ２０６から延びる第１チューブ２４６の第１端部２４６ａを反応処理容器１１０の第１連通口１１７に接続し、第２方向切換バルブ２０７から延びる第２チューブ２４７の第１端部２４７ａを反応処理容器１１０の第２連通口１１８に接続する。送液チャンバ用ポンプ２０２および加圧チャンバ用ポンプ２０３はいずれも、この時点では動作させない。続いて、大気圧開放バルブ２２０および２２１を閉める。

次に、第１方向切換バルブ２０６および第２方向切換バルブ２０７を操作し、加圧チャンバ２０１と連通している第２供給ポートと排出ポートとが連通するパスに切り換えた後に、加圧チャンバ用ポンプ２０３を動作させる。加圧チャンバ２０１は、反応処理装置１３０の周辺環境の気圧より高め、より好ましくは１気圧（１０１３ｈＰａ）以上に昇圧される。加圧チャンバ２０１は、第１方向切換バルブ２０６および第２方向切換バルブ２０７の第２供給ポートと排出ポートを介して反応処理容器１１０の第１連通口１１７および第２連通口１１８に連通している。従って、加圧チャンバ２０１の昇圧によっても試料１２０の両側（第１連通口１１７側と第２連通口１１８側）の圧力は均等となるため、流路の圧力バランスは影響を受けず試料１２０は移動しない。

続いて、温度制御システム１３２を動作させて反応処理容器１１０中の各温度領域の温度制御を開始する。各温度領域の温度が安定するまで所定の時間待機してもよい。

続いて、送液チャンバ用ポンプ２０２を動作させて送液チャンバ２００内を昇圧させる。この時点では送液チャンバ２００は、反応処理容器１１０の流路内の試料１２０の両側の空間（第１連通口１１７側と第２連通口１１８側）に連通していないので、送液チャンバ２００の昇圧によって流路の圧力は影響を受けず、試料１２０は移動しない。但し、上述したように送液チャンバ２００内の圧力は、加圧チャンバ２０１内の圧力より高い。この圧力の差が試料１２０を移動させる推進力となる。

ここで、試料１２０の初期位置が例えば図７で示す高温領域１４０にあるものとする。試料１２０が高温領域１４０に一定時間あることで、ＤＮＡの変性がなされる。はじめに、第１方向切換バルブ２０６を操作し第１供給ポートと排出ポートとが連通するパスに切り替える。これにより、試料１２０の第１連通口１１７側の空間は送液チャンバ２００内の圧力と等しくなり、第１連通口１１７側の空間の圧力が第２連通口１１８側の圧力より高くなるので、試料１２０は第２連通口１１８の方に流路１１２内を推されて、高温領域１４０から中温領域１４１を経て低温領域１４２に移動することができる。試料１２０が低温領域１４２に至ったとき、第１方向切換バルブ２０６を操作し第２供給ポートと排出ポートとが連通するパスに切り替える。これにより、試料１２０の第１連通口１１７側の空間も加圧チャンバ２０１内の圧力と同じになり、第１連通口１１７側の空間の圧力と第２連通口１１８側の圧力とが等しくなるので、試料１２０の移動が停止する。ここで試料１２０を一定時間低温領域１４２におくことでＤＮＡのアニーリングがなされる。

続いて、第２方向切換バルブ２０７を操作し第１供給ポートと排出ポートとが連通するパスに切り替える。これにより、試料１２０の第２連通口１１８側の空間は送液チャンバ２００内の圧力と同じになり、第２連通口１１８側の空間の圧力が第１連通口１１７側の圧力より高くなるので、試料１２０は第１連通口１１７の方に流路内を推されて、低温領域１４２から中温領域１４１に移動することができる。試料１２０が中温領域１４１に至ったとき、第２方向切換バルブ２０７を操作し第２供給ポートと排出ポートとが連通するパスに切り替える。これにより試料１２０の第２連通口１１８側の空間も加圧チャンバ２０１内の圧力と同じになり、第２連通口１１８側の空間の圧力と第１連通口１１７側の圧力とが等しくなるので、試料１２０の移動が停止する。ここで試料を一定時間中温領域１４１におくことでＤＮＡの伸長がなされる。

さらに、第２方向切換バルブ２０７を操作し第１供給ポートと排出ポートとが連通するパスに切り替える。これにより、試料１２０は第１連通口１１７の方に流路１１２内を推されて、中温領域１４１から高温領域１４０に移動することができる。試料１２０が高温領域１４０に至ったとき、第２方向切換バルブ２０７を操作し第２供給ポートと排出ポートとが連通するパスに切り替える。これにより、試料１２０の第２連通口１１８側の空間も加圧チャンバ２０１内の圧力と同じになり、第２連通口１１８側の空間の圧力と第１連通口１１７側の圧力とが等しくなるので、試料１２０の移動が停止する。ここで試料を一定時間高温領域１４０におくことでＤＮＡの変性がなされる。

以上のような試料１２０の動きを繰り返しさせるように、送液システム２３７の第１方向切換バルブ２０６および第２方向切換バルブ２０７を動作制御することによって、試料１２０が流路１１２内を往復移動させることができる。具体的には、高温（変性）－低温（アニーリング）－中温（伸長）－高温（変性）－低温（アニーリング）－中温（伸長）－・・・・・・の各温度領域をサイクル的に試料１２０が通過する。また、２水準の温度領域が設定された反応処理装置の場合は、高温（変性）－中低温（アニーリング・伸長）－高温（変性）－中低温（アニーリング・伸長）－・・・・・・の各温度領域をサイクル的に試料１２０が通過する。これにより、試料１２０は所定回数のサーマルサイクルを与えられ、ＰＣＲが起こり、所定のＤＮＡを選択的に増幅させることができる。

このように、本第３実施形態に係る反応処理装置２３０では、反応処理中に、反応処理容器１１０の流路１１２内の圧力は、常に反応処理装置２３０の周辺環境の気圧より高め、より好ましくは１気圧以上に維持される。すなわち、試料１２０は常に加圧チャンバ２０１内で維持されている周辺の気圧より高め、より好ましくは１気圧（１０１３ｈＰａ）以上の加圧がなされているか、加圧チャンバ２０１内の圧力よりも大きい送液チャンバ２００内の圧力で加圧がなされている。そのため、高地や航空機内のような気圧の低い場所でも、試料の沸騰や気泡の発生を防止しつつＰＣＲを行うことができる。

以上、本発明に係る反応処理装置について説明した。本発明に係る反応処理装置によらない反応処理装置の場合、すなわち流路内の試料に加圧をしない態様による反応処理装置の場合、高地や航空機内の低い気圧環境下でＰＣＲを行ったときに、試料は容易に沸騰し発泡する場合がある。発泡した泡は試料の中間に生じることが多く、それが複数生じることが多い。そうなると試料の間に生じた泡内の圧力と送液のための圧力等とがバランスし始め、試料の一部が流路内で停止してしまったりなど、送液がスムースにできない現象が生じる。

上記の本発明に係る反応処理装置によれば、そもそも発泡の蓋然性を劇的に低減させることができるため、上記のような問題は生じず、どのような気圧環境下においても、試料の送液をほぼ完全にすることができ、その結果、安定した反応処理によってＤＮＡ等の増幅された試料を得ることができる。

以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

１０、１１０ 反応処理容器、 １２、１１２ 流路、１４、１１４ 基板、 １６、１１６ 流路封止フィルム、 １７、１１７ 第１連通口、 １８、１１８ 第２連通口、 ２０、１２０ 試料、 ３０、１３０、２３０ 反応処理装置、 ３２、１３２ 温度制御システム、 ３３、１３３ 高温用ヒータドライバ、 ３４、１３４ 中温用ヒータドライバ、 ３５、１３５ 低温用ヒータドライバ、 ３６、１３６、２３６ ＣＰＵ、 ３７、１３７、２３７ 送液システム、 ３８、１３８、２０１ 加圧チャンバ、 ３９ 送液用ポンプ、 ４０、１４０ 高温領域、 ４１、１４１ 中温領域、 ４２、１４２ 低温領域、 ４３ 送液用ポンプドライバ、 ４４、１４４、２０３ 加圧チャンバ用ポンプ、 ４５、１４５、２０５ 加圧チャンバ用ポンプドライバ、 ４６、１４６、２４６ 第１チューブ、 ４７、１４７、２４７ 第２チューブ、 ４８、１４８、２２０、２２１ 大気圧開放バルブ、 ５０、１５０ 蛍光検出器、 ５１ 光学ヘッド、 ５２ 蛍光検出器ドライバ、 ５３ 光ファイバ、 ６０、１６０ 高温用ヒータ、 ６１、１６１ 中温用ヒータ、 ６２、１６２ 低温用ヒータ、 １３９ 第１送液用ポンプ、 １４３ 第１送液用ポンプドライバ、 １５１ 第１光学ヘッド、 １５２ 第１蛍光検出器ドライバ、 １５３ 第１光ファイバ、 １５４ 第２光学ヘッド、 １５５ 第２蛍光検出器ドライバ、 １５６ 第２光ファイバ、 １６５ 第２送液用ポンプ、 １６６ 第２送液用ポンプドライバ、 ２００ 送液チャンバ、 ２０２ 送液チャンバ用ポンプ、 ２０４ 送液チャンバ用ポンプドライバ、 ２０５ 加圧チャンバ用ポンプドライバ、 ２０６ 第１方向切換バルブ、 ２０７ 第２方向切換バルブ、 ２１０、２１１、２１２、２１３ 中空チューブ、 ９００ 方向切換バルブ。

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に利用できる。

Claims (8)

1. 試料にサーマルサイクルを与えることによって該試料の反応処理を行う反応処理装置であって、
   基板と、前記基板に形成された試料が移動可能な流路と、該流路の両端に設けられた一対の連通口とを有する反応処理容器と、
   前記一対の連通口に接続されて前記流路内の試料を移動させるための一対の送液用ポンプと、
   前記流路の一部を異なる温度に維持される複数の温度領域とするための温度制御部と、
   前記流路内を移動する試料からの蛍光を検出するための蛍光検出器と、
   前記蛍光検出器による蛍光の変化に基づいて試料の通過を認識して前記送液用ポンプを制御する制御部と、
   を備え、
   前記制御部は、試料にサーマルサイクルを与えるために、前記一対の送液用ポンプのいずれかを作動することによって試料を前記複数の温度領域間で往復的に移動させ、且つ、前記一対の送液用ポンプのいずれもを停止することによって試料を温度領域内に停止させ、
   前記複数の温度領域は、試料に含まれるＤＮＡに対して変性反応を生じさせる第１温度領域と、アニーリングおよび伸長反応を生じさせる第２温度領域と、を含み、
   前記一対の連通口は、前記第１温度領域側の第１連通口と、前記第２温度領域側の第２連通口と、を含み、
   前記一対の送液用ポンプは、前記第１連通口に接続される第１送液用ポンプと、前記第２連通口に接続される第２送液用ポンプと、を含み、
   前記蛍光検出器は、前記第１温度領域と前記第２温度領域とを接続する、一定の流路内を通過する試料からの蛍光を検出するように配置され、
   試料が前記第１温度領域から前記第２温度領域に移動するとき、前記流路内における試料の両側の空間のうち前記第２連通口側の空間の圧力は、前記第１連通口側の空間の圧力より低く、且つ、当該反応処理装置の周辺環境の気圧より高く、
   試料が前記第２温度領域から前記第１温度領域に移動するとき、前記流路内における試料の両側の空間のうち前記第１連通口側の空間の圧力は、前記第２連通口側の空間の圧力より低く、且つ、当該反応処理装置の周辺環境の気圧より高く、
   試料が前記第１温度領域または前記第２温度領域に停止するとき、前記流路内における試料の両側の空間の圧力は等しく、且つ、当該反応処理装置の周辺環境の気圧より高い、
   ことを特徴とする反応処理装置。
2. 前記制御部は、前記蛍光検出器により検出された蛍光信号がゼロまたはバックグラウンドレベルから増加し、再びゼロまたはバックグラウンドレベルに低下する出力変動によって試料の通過を認識することを特徴とする請求項１に記載の反応処理装置。
3. 前記反応処理容器は、前記流路を封止するための封止フィルムを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の反応処理装置。
4. 前記送液用ポンプは、停止時に一次側と二次側の圧力が等しくなることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の反応処理装置。
5. 前記送液用ポンプは、マイクロブロアポンプであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の反応処理装置。
6. 励起光および蛍光の波長が異なる複数の前記蛍光検出器を流路に沿って備えることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の反応処理装置。
7. 前記温度領域に対応する流路は、直線部と曲線部とを含むことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の反応処理装置。
8. 基板と、前記基板に形成された試料が移動可能な流路と、該流路の両端に設けられた一対の連通口とを有する反応処理容器に試料を導入するステップと、
   前記反応処理容器を一対の送液用ポンプを備える反応処理装置にセットするステップと、
   前記一対の連通口に前記一対の送液用ポンプを接続するステップと、
   前記流路の一部を異なる温度に維持される複数の温度領域とするステップと、
   試料にサーマルサイクルを与えるために、前記一対の送液用ポンプのいずれかを作動することによって試料を前記複数の温度領域間で往復的に移動させ、且つ、前記一対の送液用ポンプのいずれもを停止することによって試料を温度領域内に停止させるステップと、
   反応中に蛍光検出器を用いて試料からの蛍光信号をモニタリングすることによって反応処理の進捗および終端をリアルタイムで把握するステップと、
   を備え、
   前記複数の温度領域は、試料に含まれるＤＮＡに対して変性反応を生じさせる第１温度領域と、アニーリングおよび伸長反応を生じさせる第２温度領域と、を含み、
   前記一対の連通口は、前記第１温度領域側の第１連通口と、前記第２温度領域側の第２連通口と、を含み、
   前記一対の送液用ポンプは、前記第１連通口に接続される第１送液用ポンプと、前記第２連通口に接続される第２送液用ポンプと、を含み、
   前記蛍光検出器は、前記第１温度領域と前記第２温度領域とを接続する、一定の流路内を通過する試料からの蛍光を検出するように配置され、
   前記試料を移動および停止させるステップにおいて、前記蛍光検出器により検出された蛍光の変化に基づいて試料の通過を認識して前記一対の送液用ポンプを制御し、
   試料を前記第１温度領域から前記第２温度領域に移動させるとき、前記流路内における試料の両側の空間のうち前記第２連通口側の空間の圧力は、前記第１連通口側の空間の圧力より低く、且つ、当該反応処理装置の周辺環境の気圧より高く、
   試料を前記第２温度領域から前記第１温度領域に移動させるとき、前記流路内における試料の両側の空間のうち前記第１連通口側の空間の圧力は、前記第２連通口側の空間の圧力より低く、且つ、当該反応処理装置の周辺環境の気圧より高く、
   試料を前記第１温度領域または前記第２温度領域に停止させるとき、前記流路内における試料の両側の空間の圧力は等しく、且つ、当該反応処理装置の周辺環境の気圧より高い、
   ことを特徴とする反応処理方法。

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