BR112020018332A2

BR112020018332A2 - Aparelho de processamento de reação

Info

Publication number: BR112020018332A2
Application number: BR112020018332-6A
Authority: BR
Inventors: Takashi Fukuzawa; Hidemitsu Takeuchi; Osamu Kawaguchi
Original assignee: Nippon Sheet Glass Company, Limited
Priority date: 2018-03-23
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2020-12-29
Also published as: IL277170A; WO2019181636A1; SG11202009139WA; EP3770244A1; CN111819276A; EP3770244A4; JP7369426B2; JP2019193670A; CN111819276B

Abstract

este aparelho de processamento de reação (30) compreende: um vaso de processamento de reação (10); um primeiro dispositivo de detecção de fluorescência (50) que irradia uma amostra com a primeira luz de excitação e detecta a primeira fluorescência gerada pela amostra; e um segundo dispositivo de detecção de fluorescência (54) que irradia uma amostra com a segunda luz de excitação e detecta a segunda fluorescência gerada pela amostra. a faixa de comprimento de onda da primeira fluorescência e a faixa de comprimento de onda da segunda luz de excitação se sobrepõem pelo menos parcialmente. o contraste de fase da pulsação da primeira luz de excitação e da segunda luz de excitação quando a primeira luz de excitação e a segunda luz de excitação são pulsadas em um ciclo de trabalho prescrito, sendo o ciclo de trabalho do pulsar da primeira luz de excitação e da segunda luz de excitação, é definida em uma faixa de 2p(pm - ¿pm) (rad) a 2p(pm + ¿pm) (rad) ou em uma faixa de 2p[(1 - pm) - ¿pm] (rad) a 2p[(1 - pm) + ¿pm] (rad), em que pm = d - d2 e ¿pm = 0,01 * pm.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “APA- RELHO DE PROCESSAMENTO DE REAÇÃO”.

CAMPO DA TÉCNICA

[0001] A presente invenção refere-se a aparelhos de processa- mento de reação usados para reações de cadeia de polimerase (PCR). Técnica Antecedente

[0002] Testagem genética é amplamente usada para os exames em uma ampla variedade de campos médicos, identificação de produ- tos da fazenda e micro-organismos patogênicos, avaliação de segu- rança quanto aos produtos alimentícios, e ainda para exames quanto a vírus patogênicos e uma variedade de doenças infecciosas. A fim de detectar com alta sensibilidade uma quantidade minuta de DNA, mé- todos de análise dos resultados obtidos por ampliação de uma porção de DNA são conhecidos. Sobretudo, um método que usa PCR é uma tecnologia notável onde uma certa porção de uma quantidade muito pequena de DNA coletada a partir de um organismo ou similares é se- letivamente ampliada.

[0003] Na PCR, um ciclo térmico predeterminado é aplicado a uma amostra em que uma amostra biológica contendo DNA e um reagente de PCR que consiste de iniciadores, enzimas, e similares são mistu- rados de modo a levar reações de desnaturação, anelamento e alon- gamento a serem repetidas de modo que uma porção específica de DNA seja seletivamente ampliada.

[0004] É uma prática comum realizar PCR por colocação de uma quantidade predeterminada de uma amostra alvo em um tubo de PCR ou um vaso de processamento de reação tal como microplaca (micro- cavidade) em que uma pluralidade de orifícios são formados. No en- tanto, nos últimos anos, PCR que usa um vaso de processamento de reação (também chamado de “chip”) provido de um microcanal que seja formado em um substrato é praticada (por exemplo, Documento de Patente 1).

[0005] [Documento de Patente 1] Publicação de Pedido de Patente Japonesa No. 2009-232700 Descrição da Invenção Problema a Ser Resolvido pela Invenção

[0006] Na PCR onde um vaso de processamento de reação pro- vido de um canal tal como uma descrita acima, um dispositivo de de- tecção de fluorescência pode ser usado para a finalidade de, por exemplo, detecção de uma mudança quantitativa de uma amostra. Um corante fluorescente é adicionado à amostra, e luz de excitação é aplicada à amostra usando um dispositivo de detecção de fluorescên- cia durante PCR de modo a detectar fluorescência emitida a partir da amostra. Uma vez que a intensidade de fluorescência emitida a partir da amostra aumenta quando a ampliação do DNA prossegue, o valor de intensidade da fluorescência pode ser usado como um índice que serve como um material de decisão para o progresso da PCR ou tér- mino da reação.

[0007] Na PCR, um reagente em que uma pluralidade de corantes fluorescentes são misturados é frequentemente usado dependendo de um alvo de ampliação, e neste caso, é necessário instalar uma plura- lidade de dispositivo de detecção de fluorescências. Em particular, em um aparelho de processamento de reação que detecta fluorescência a partir de uma amostra enquanto move a amostra em um canal formou vaso de processamento de reação semelhante à placa, a fim de de- tectar fluorescência a partir de uma amostra passando através de um canal simples cuja área de seção transversal é, por exemplo, 2 mm2 ou menos, é necessário dispor uma pluralidade de dispositivo de de- tecção de fluorescências na direção de prolongamento do canal.

[0008] Por exemplo, quando da ampliação de O-157 por PCR, VT1 e VT2 são medidos ao mesmo tempo. Por exemplo, um kit de teste

(FIK-362) por Toyobo Co., Ltd., usa ROX (um corante fluorescente que é excitado por irradiação com luz substancialmente verde e emite flu- orescência substancialmente vermelho, e aqui em seguida, tal como característica de fluorescência é chamada de “excitação ver- de/fluorescência vermelha”) e Cy5 (excitação vermelha/infrafluores- cência vermelha). Nesse caso, dois dispositivos de detecção de fluo- rescência são necessários.

[0009] Quando da detecção de norovírus, G1 e G2 devem ser me- didos simultaneamente. Por exemplo, um kit de teste (RR255A) por Takara Bio Inc., e um kit de teste (FIK-253) por Toyobo Co., Ltd., am- bos usam FAM (excitação azul/fluorescência verde), ROX (excitação verde/fluorescência vermelha), e Cy5 (excitação vermelha/infrafluores- cência vermelha) como corantes fluorescentes. Nesse caso, três dis- positivos de detecção de fluorescência são necessários.

[0010] Quando detecção de fluorescência é realizada em uma amostra que passa através de um canal usando uma pluralidade de dispositivo de detecção de fluorescências como descrita acima, inter- ferência pode ocorrer entre os dispositivos de detecção de fluorescên- cia. Uma explanação será dada usando exemplos a seguir.

[0011] Quando FAM e ROX são usados enquanto sendo adicio- nados a uma amostra na mesma hora que os corantes fluorescentes, a faixa de comprimento de onda de luz que corresponde à cor subs- tancialmente verde da luz de excitação radiada para excita o ROX e a faixa de comprimento de onda da luz que corresponde à cor substan- cialmente verde de luz de excitação emitida a partir do FAM pode par- cialmente se sobrepor. Naquele caso, quando uma parte da luz de ex- citação radiada para o ROX entra em um fotodetector tal como um elemento de conversão fotoelétrica para a detecção de fluorescência emitida a partir do FAM, a parte da luz de excitação se torna ruído, e medição altamente sensível não seja capaz de ser realizada. Normal-

mente, a quantidade de luz de excitação é várias dezenas de μW, en- quanto a quantidade de fluorescência a ser detectada está na ordem de vários pW ou menos. Isso é porque os dispositivos de detecção de fluorescência são configurados para detectar tal quantidade fraca de fluorescência e ainda uma parte pequena de luz de excitação que al- cança o fotodetector aparece como um grande ruído.

[0012] Quando ROX e Cy5 são usados enquanto sendo adiciona- dos a uma amostra na mesma hora que corantes fluorescentes, a faixa de comprimento de onda de luz substancialmente vermelha de luz de excitação radiada para excitar o Cy5 e a faixa de comprimento de onda da luz que corresponde à cor substancialmente vermelha de fluores- cência emitida a partir do ROX pode parcialmente se sobrepor. Na- quele caso também, quando uma parte da luz de excitação radiada para excitar o Cy5 entra em um fotodetector para a detecção de fluo- rescência emitida a partir do ROX, a parte da luz de excitação se torna ruído, e medição de fluorescência altamente sensível pode não ser capaz de realizar.

[0013] Nessa base, uma finalidade da presente invenção é prover uma tecnologia capaz de suprimir interferência entre dispositivo de detecção de fluorescências in a aparelho de processamento de reação provido de uma pluralidade de dispositivo de detecção de fluorescên- cias. Meio para Resolver o Problema

[0014] Um aparelho de processamento de reação de acordo com uma concretização da presente invenção inclui: um vaso de proces- samento de reação em que um canal onde uma amostra que se move é formada; um primeiro dispositivo de detecção de fluorescência que irradia uma amostra dentro de um primeiro conjunto de região de de- tecção de fluorescência no canal com uma primeira luz de excitação e também detecta primeira fluorescência produzida a partir da amostra pela irradiação com a primeira luz de excitação; e um segundo disposi- tivo de detecção de fluorescência que irradia uma amostra dentro de um segundo conjunto de região de detecção de fluorescência no canal com a segunda luz de excitação e também detecta segunda fluores- cência produzida a partir da amostra pela irradiação com a segunda luz de excitação. A faixa de comprimento de onda da primeira fluores- cência e a faixa de comprimento de onda da segunda luz de excitação se sobrepõem pelo menos parcialmente. O primeiro flash de luz de ex- citação e o segundo flash de luz de excitação em uma razão de taxa predeterminada, e dado que a razão de taxa do flashing da primeira luz de excitação e o flashing da segunda luz de excitação é d, a dife- rença de fases entre o flashing da primeira luz de excitação e o flashing da segunda luz de excitação é ajustado dentro de uma faixa de 2π(pm − Δpm) (rad) to 2π(pm + Δpm) (rad) ou dentro de uma faixa de 2π[(1 - pm) - Δpm] (rad) a 2π[(1 - pm) + Δpm] (rad), onde pm = d − d2 e Δpm = 0,01 * pm.

[0015] Uma outra concretização da presente invenção também re- fere-se a um aparelho de processamento de reação. Esse aparelho in- clui: um vaso de processamento de reação em que um canal onde uma amostra que se move é formada; um primeiro dispositivo de de- tecção de fluorescência que irradia uma amostra dentro de um primei- ro conjunto de região de detecção de fluorescência no canal com uma primeira luz de excitação e também detecta uma primeira fluorescência produzida a partir da amostra pela irradiação com a primeira luz de ex- citação; e um segundo dispositivo de detecção de fluorescência que irradia uma amostra dentro de um segundo conjunto de região de de- tecção de fluorescência no canal com a segunda luz de excitação e também detecta segunda fluorescência produzida a partir da amostra pela irradiação com a segunda luz de excitação. A faixa de compri- mento de onda da primeira fluorescência e a faixa de comprimento de onda da segunda luz de excitação se sobrepõem pelo menos parcial- mente, e o primeiro flash de luz de excitação e o segundo flash de luz de excitação em uma razão de taxa predeterminada. Dado que a razão de taxa do flashing da primeira luz de excitação e o flashing da se- gunda luz de excitação é d, a diferença de fases entre o flashing da primeira luz de excitação e o flashing da segunda luz de excitação é ajustado dentro de uma faixa de 2π(pm − Δpm) (rad) para 2π(pm + Δpm) (rad) ou dentro de uma faixa de 2π[(1 - pm) - Δpm] (rad) para 2π[(1 - pm) + Δpm] (rad), onde pm = d − d2 e Δpm = (d − d2)/[k * (No’) / V10], No’ re- presenta ruído de uma saída de sinal do primeiro dispositivo de de- tecção de fluorescência quando a diferença de fases entre o flashing da primeira luz de excitação e o flashing da segunda luz de excitação é 0 rad, V10 representa uma saída de sinal do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência quando o segundo dispositivo de detecção de fluorescência não está operando, e k é 20.

[0016] Na concretização acima, k pode ser 100/3. Alternativamente, k pode ser 100.

[0017] O primeiro dispositivo de detecção de fluorescência pode incluir uma primeira cabeça ótica que emite a primeira luz de excitação e recebe a primeira fluorescência. O segundo dispositivo de detecção de fluorescência pode incluir uma segunda cabeça ótica que emite a segunda luz de excitação e recebe a segunda fluorescência. Quando os respectivos aparelhos numéricos da primeira cabeça ótica e da se- gunda cabeça ótica estão em uma faixa de 0,07 a 0,23, a distância en- tre o centro da primeira região de detecção de fluorescência e o centro da segunda região de detecção de fluorescência pode ser ajustada para 4 mm ou mais.

[0018] O canal pode incluir uma primeira região de temperatura mantida em uma primeira região de temperatura, uma segunda região de temperatura mantida em uma segunda temperatura mais alta do que a primeira temperatura, e uma região de conexão que conecta a primeira região de temperatura e a segunda região de temperatura. O movimento de uma amostra dentro do canal pode ser controlado com base em um sinal de fluorescência detectado pelo primeiro dispositivo de detecção de fluorescência. A primeira região de detecção de fluo- rescência pode ser ajustada em um ponto substancialmente interme- diário da região de conexão.

[0019] O primeiro dispositivo de detecção de fluorescência pode emitir uma luz azul como a primeira luz de excitação e pode detectar uma luz verde como a primeira fluorescência. O segundo dispositivo de detecção de fluorescência pode emitir uma luz verde como a se- gunda luz de excitação e pode detectar uma luz vermelha como a se- gunda fluorescência.

[0020] O aparelho de processamento de reação pode ainda incluir: um terceiro dispositivo de detecção de fluorescência que irradia uma amostra dentro de um terceiro conjunto de região de detecção de flu- orescência no canal com uma terceira luz de excitação e também de- tecta uma terceira fluorescência produzida a partir da amostra pela ir- radiação com a terceira luz de excitação. O terceiro dispositivo de de- tecção de fluorescência pode emitir uma luz vermelha como a terceira luz de excitação e detectar luz infravermelha como a terceira fluores- cência.

[0021] Uma primeira cabeça ótica do primeiro dispositivo de de- tecção de fluorescência pode ser disposta no centro, e uma segunda cabeça ótica do segundo dispositivo de detecção de fluorescência e uma terceira cabeça ótica do terceiro dispositivo de detecção de fluo- rescência podem ser dispostas sobre os respectivos lados da primeira cabeça ótica. Efeitos Vantajosos

[0022] De acordo com a presente invenção, uma tecnologia capaz de suprimir interferência entre dispositivos de detecção de fluorescên- cia em um aparelho de processamento de reação provido de uma plu- ralidade de dispositivo de detecção de fluorescências pode ser provi- da. Breve Descrição dos Desenhos

[0023] As Figs. 1A e 1B são diagramas para a explicação de um vaso de processamento de reação utilizável em um aparelho de pro- cessamento de reação de acordo com uma concretização da presente invenção; a Fig. 2 é um diagrama esquemático para a explicação do aparelho de processamento de reação de acordo com a concretização da presente invenção; a Fig. 3 é um diagrama para a explicação da configuração de um dispositivo de detecção de fluorescência; a Fig. 4 é um diagrama que mostra um estado onde uma primeira cabeça ótica de um primeiro dispositivo de detecção de fluo- rescência e uma segunda cabeça ótica de um segundo dispositivo de detecção de fluorescência são dispostas; a Fig. 5 é um diagrama para a explicação da configuração de circuito de um amplificador de lock-in que processa um sinal de flu- orescência a partir de um detector de fluorescência; a Fig. 6 é um diagrama que mostra o resultado de medição de uma primeira saída de sinal de acordo com o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência quando a diferença de fases entre um primeiro sinal de modulação e um segundo sinal de modulação é mu- dada; a Fig. 7 é um diagrama que mostra a relação entre uma saída de sinal e uma diferença de fases com base em um sinal de flu- orescência oriundo de uma solução aquosa de FAM; a Fig. 8 é um diagrama que mostra a relação entre um ruí-

do e uma diferença de fases quando as respectivas razões de taxas do primeiro sinal de modulação e do segundo sinal de modulação são ambas 50%; a Fig. 9 é um diagrama que mostra a relação entre ruído e uma diferença de fases quando as respectivas razões de taxas do primeiro sinal de modulação e do segundo sinal de modulação são ambas 30%; a Fig. 10 é um diagrama que mostra a relação entre ruído e uma diferença de fases quando as razões de taxas respectivas do primeiro sinal de modulação e do segundo sinal de modulação são ambas 40%; as Figs. 11A, 11B, 11C e 11D são diagramas para a expli- cação da operação do amplificador de “lock-in” quando um dos dois dispositivos de detecção de fluorescência é parado; as Figs. 12A, 12B, 12C, 12D, 12E e 12F são diagramas para a explicação da operação do amplificador de “lock-in” quando ambos os dois dispositivos de detecção de fluorescência são opera- dos; a Fig. 13 é um diagrama para a explicação de como se de- terminar uma faixa permissível para uma diferença de fases que cor- responde ao valor mínimo de uma saída de sinal de ruído; a Fig. 14 é um diagrama que mostra uma relação entre uma saída de sinal oriunda do primeiro dispositivo de detecção de fluores- cência e tempo quando o segundo dispositivo de detecção de fluores- cência é parado; a Fig. 15 é um diagrama que mostra uma relação entre uma saída de sinal oriunda do primeiro dispositivo de detecção de fluores- cência e tempo quando o segundo dispositivo de detecção de fluores- cência é operado; a Fig. 16 é um diagrama para a explicação de uma concre-

tização exemplar da presente invenção; a Fig. 17 é um diagrama que mostra uma saída de sinal de fluorescência oriunda do primeiro dispositivo de detecção de fluores- cência quando uma distância de ponto de interfluorescente é ajustada para 4 mm na primeira concretização exemplar; a Fig. 18 é um diagrama que mostra um resultado de am- pliação por PCR na primeira concretização exemplar; a Fig. 19 é um diagrama que mostra uma saída de sinal de fluorescência oriunda do primeiro dispositivo de detecção de fluores- cência em um exemplo comparativo; a Fig. 20 é um diagrama que mostra um resultado de am- pliação por PCR no exemplo comparativo; e a Fig. 21 é um diagrama para a explicação de um aparelho de processamento de reação de acordo com uma outra concretização de a presente invenção. Modo para a Realização da Invenção

[0024] Uma explicação será dada na seguinte relação a um apa- relho de processamento de reação de acordo com uma concretização da presente invenção. Os mesmos ou equivalentes elementos, mem- bros e processos constituintes ilustrados em cada desenho serão mostrados pelos mesmos números de referência, e explicações dupli- cadas serão apropriadamente omitidas. Além disso, as concretizações não limitam a invenção e são mostradas para finalidades ilustrativas, e nem todas as características descritas nas concretizações nas suas combinações são necessariamente essenciais à invenção.

[0025] As Figs. 1A e 1B são diagramas para a explicação de um vaso de processamento de reação 10 utilizável em um aparelho de processamento de reação de acordo com uma concretização da pre- sente invenção. A Fig. 1A é uma visão plana do vaso de processa- mento de reação 10, e a Fig. 1B é uma visão dianteira do vaso de processamento de reação 10.

[0026] Como mostrado nas Figs. 1A e 1B, o vaso de processa- mento de reação 10 compreende um substrato 14 e uma película de vedação de canal 16.

[0027] O substrato 14 é de preferência formado de um material que é estável sob mudanças de temperaturas e é resistente a uma solução de amostra que é usada. Além disso, o substrato 14 é de pre- ferência formado de um material que tem boa moldabilidade, uma boa transparência e propriedade de barreira, e uma baixa propriedade de autofluorescência. Como tal material, um material inorgânico tais como vidro, silícico (Si), ou similares, uma resina tais como acrílica, polipro- pileno, poliéster, silicone, ou similares, e particularmente ciclo-olefina são preferidos. Um exemplo das dimensões do substrato 14 inclui um lado longo de 75 mm, um lado curto de 25 mm, e uma espessura de 4 mm.

[0028] Um canal semelhante a sulco 12 é formado sobre a super- fície inferior 14a do substrato 14, e esse canal 12 é vedado pela pelí- cula de vedação de canal 16. Um exemplo das dimensões do canal 12 formado sobre a superfície inferior 14a do substrato 14 inclui uma al- tura de 0,7 mm e uma profundidade de 0,7 mm. Uma primeira porta de comunicação 17, que se comunica com o lado de fora, é formada na posição de uma extremidade do canal 12 no substrato 14. Uma se- gunda porta de comunicação 18 é formada na posição da outra extre- midade do canal 12 no substrato 14. O par, a primeira porta de comu- nicação 17 e a segunda porta de comunicação 18, formado nas res- pectivas extremidades do canal 12 é formado de modo a ser exposto sobre a superfície superior 14b do substrato 14. Tal substrato pode ser produzido por moldagem por injeção ou trabalho de corte com uma máquina de processamento de NC ou similar.

[0029] Como mostrado na Fig. 1B, sobre a superfície inferior 14a do substrato 14, a película de vedação de canal 16 está fixada. No vaso de processamento de reação 10 de acordo com a concretização, a maior parte do canal 12 é formada na forma de um sulco exposto sobre a superfície inferior 14a do substrato 14. Isso é para permitir fácil moldagem por moldagem por injeção usando um molde de metal ou similar. A fim de selar esse sulco de modo a fazer uso do sulco como um canal, a película de vedação de canal 16 está fixada sobre a su- perfície inferior 14a do substrato 14.

[0030] A película de vedação de canal 16 pode ser pegajosa e/ou adesiva sobre uma das suas principais superfícies ou pode ter uma camada funcional que exibe viscosidade e/ou adesividade através da pressão, irradiação de energia com raios ultravioleta ou similares, aquecimento, etc., formadas sobre uma das principais superfícies. As- sim, a película de vedação de canal 16 tem uma função de ser facil- mente capaz de se tornar integral com a superfície inferior 14a do substrato 14 enquanto estando em contato próximo com a superfície inferior 14a. A película de vedação de canal 16 é desejavelmente for- mada de um material, incluindo um adesivo, que tem uma baixa pro- priedades de autofluorescência. Nesse aspecto, uma película transpa- rente feita de uma resina tal como ciclo-olefina, poliéster, polipropileno, polietileno ou acrílica é adequada mas não é limitada a mesma. Além disso, a película de vedação de canal 16 pode ser formada de um vi- dro semelhante à placa ou resina. Uma vez que a rigidez pode ser esperada nesse caso, a película de vedação de canal 16 é útil para a prevenção de empenamento e deformação do vaso de processamento de reação 10.

[0031] O canal 12 é provido de uma região de reação onde o con- trole de temperaturas de uma pluralidade de níveis é possível por um aparelho de processamento de reação descrito mais tarde. Um ciclo térmico pode ser aplicado a uma amostra por movimentação da amos-

tra tal que a amostra continuamente retribui na região de reação onde as temperaturas de uma pluralidade de níveis são mantidas.

[0032] A região de reação do canal 12 mostrada nas Figs. 1A e 1B inclui um canal de forma serpiginosa onde por sua vez é continua- mente feito por combinação de porções curvadas e porções retas. Quando o vaso de processamento de reação 10 é montado em um aparelho de processamento de reação descrito mais tarde, o lado di- reito do canal 12 nas figuras é esperado se tornar uma região de tem- peratura relativamente alta (cerca de 95°C) (aqui em seguida chamada de “região de alta temperatura”), e o lado esquerdo do canal 12 é es- perado se tornar uma região de uma temperatura mais baixa (cerca de 60°C) (aqui em seguida chamada de “região de baixa temperatura”). Além disso, a região de reação do canal 12 inclui uma região de co- nexão para a conexão da região de alta temperatura e a região de baixa temperatura entre as mesmas. Essa região de conexão pode ser um canal linear.

[0033] Quando a região de alta temperatura e a região de baixa de temperatura são os canais de forma serpiginosa como na presente concretização, a área eficaz de um aquecedor ou similar que constitui um meio de controle de temperatura descrito mais tarde pode ser efi- cazmente usada, e há vantagens que variação de temperatura na re- gião de reação é facilmente reduzida e que o tamanho substancial do vaso de processamento de reação pode ser reduzido, permitindo que o aparelho de processamento de reação seja pequeno.

[0034] A amostra submetida a um ciclo térmico é introduzida den- tro do canal 12 através de qualquer uma da primeira porta de comuni- cação 17 e da segunda porta de comunicação 18. O método para a in- trodução não é limitado a esse. Alternativamente, por exemplo, uma quantidade apropriada da amostra pode ser diretamente introduzida através da porta de comunicação usando uma pipeta, um conta-gotas,

uma seringa, ou similar. Alternativamente, um método de introdução pode ser usado que é realizado enquanto prevenção de contaminação via um chip de agulha em forma de cone, em que um filtro feito de PTFE ou polietileno poroso é incorporado. Em geral, muitos tipos de tais chips de agulha são vendidos e podem ser obtidos facilmente, e os chips de agulha podem ser usados enquanto estando fixados à extre- midade de uma pipeta, um conta-gotas, um seringa, ou similares. Além do mais, a amostra pode ser movida para uma posição predetermina- da no canal por descarregamento e introdução da amostra por uma pipeta, um conta-gotas, uma seringa, ou similares e então ainda em- purrando a amostra através da pressurização.

[0035] A amostra inclui, por exemplo, aquela obtida por adição de um corante fluorescente, uma enzima termoestável e quatro tipos de trifosfato de desoxirribonucleosídeo (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) como reagentes de PCR a uma mistura contendo um ou mais tipos de DNA. Além disso, um iniciador que especificamente reage com o DNA sub- metido a processamento de reação, e em alguns casos, uma sonda fluorescente tal como TaqMan (TaqMan é uma marca registrada da Roche Diagnostics Gesellschaft mit beschränkter Haftung) são mistu- rados. Kits de reagente de PCR em tempo real, comercialmente dispo- níveis e similares podem ser também usados.

[0036] A Fig. 2 é um diagrama esquemático para a explicação de um aparelho de processamento de reação 30 de acordo com a concre- tização da presente invenção.

[0037] O aparelho de processamento de reação 30 de acordo com a concretização é provido de um vaso de processamento de reação que coloca a porção (não mostrado) em que o vaso de processamento de reação 10 é colocado, um sistema de controle de temperatura 32, e uma CPU 36. Como mostrado na Fig. 2, em relação ao vaso de pro- cessamento de reação 10 colocado no vaso de processamento de re-

ação que coloca a porção, o sistema de controle de temperatura 32 é configurado de modo a ser capaz de manter e controlar com precisão a temperatura da região do lado direito do canal 12 do vaso de pro- cessamento de reação 10 na figura ser cerca de 95°C (alta faixa de temperatura) e a temperatura da sua região do lado esquerdo na figura ser cerca de 60°C (baixa faixa de temperatura).

[0038] O sistema de controle de temperatura 32 é para a manu- tenção da temperatura de cada região de temperatura da região de reação e especificamente provido de um aquecedor de alta tempera- tura 60 para o aquecimento da região de alta temperatura do canal 12, um aquecedor de baixa temperatura 62 para o aquecimento da região de baixa de temperatura do canal 12, um sensor de temperatura (não mostrado) tal como, por exemplo, um termopar ou similar para a me- dição da temperatura real de cada região de temperatura, um aciona- dor de aquecedor de alta temperatura 33 para o controle da tempera- tura do aquecedor de alta temperatura 60, e um acionador de aque- cedor de baixa temperatura 35 para o controle da temperatura do aquecedor de baixa temperatura 62. Informação sobre a temperatura real medida pelo sensor de temperatura é enviada para a CPU 36. Com base na informação sobre a temperatura real de cada região de temperatura, a CPU 36 controla cada acionador de aquecedor tal que a temperatura de cada aquecedor começa com uma temperatura pre- determinada. Cada aquecedor pode ser, por exemplo, um elemento de aquecimento com resistência, um elemento Peltier, ou similar. O sis- tema de controle de temperatura 32 pode ser ainda provido de outros componentes para o aperfeiçoamento da contrabilidade da temperatu- ra de cada região de temperatura.

[0039] O aparelho de processamento de reação 30 de acordo com a presente concretização é ainda provido de um sistema de alimenta- ção de líquido 37 para movimentação, dentro do canal 12, a amostra

20 introduzida no canal 12 do vaso de processamento de reação 10. O sistema de alimentação de líquido 37 é provido de uma primeira bom- ba 39, uma segunda bomba 40, um primeiro acionador de bomba 41 para o acionamento da primeira bomba 39, um segundo acionador de bomba 42 para o acionamento da segunda bomba 40, um primeiro tu- bo 43, e um segundo tubo 44.

[0040] Uma extremidade do primeiro tubo 43 está conectada à primeira porta de comunicação 17 do vaso de processamento de rea- ção 10. Um material de embalagem 45 ou uma vedação para garantia de hermeticidade é de preferência disposta na junção da primeira porta de comunicação 17 e na extremidade do primeiro tubo 43. A outra ex- tremidade do primeiro tubo 43 está conectada à saída da primeira bomba 39. Do mesmo modo, uma extremidade do segundo tubo 44 está conectada à segunda porta de comunicação 18 do vaso de pro- cessamento de reação 10. Um material de embalagem 46 ou uma ve- dação para a garantia de hermeticidade é de preferência disposto na junção da segunda porta de comunicação 18 e na extremidade do se- gundo tubo 44. A outra extremidade do segundo tubo 44 está conec- tada à saída da segunda bomba 40.

[0041] A primeira bomba 39 e a segunda bomba 40 podem ser, por exemplo, bombas microssopradoras cada uma compreendendo uma bomba de diafragma. Como a primeira bomba 39 e a segunda bomba 40, por exemplo, bombas microssopradoras (MZB1001 modelo T02) fabricada pela Murata Manufacturing Co., Ltd., ou similares podem ser usadas. Embora essa bomba microssopradora possa aumentar a pressão sobre um lado secundário a ser mais alta do que um lado primário durante a operação, a pressão sobre o lado primário e a pressão sobre o lado secundário começam iguais no momento quando a bomba é parada ou quando a bomba é parada.

[0042] A CPU 36 controla a pressurização e o fornecimento de ar oriundos da primeira bomba 39 e da segunda bomba 40 via o aciona- dor da primeira bomba 41 e um acionador da segunda bomba 42. O fornecimento de ar e a pressurização oriundos da primeira bomba 39 e da segunda bomba 40 agem sobre a amostra 20 dentro do canal atra- vés da primeira porta de comunicação 17 e da segunda porta de co- municação 18 e se tornam uma força propulsora para mover a amostra

20. Mais especificamente, por alternadamente operação da primeira bomba 39 e da segunda bomba 40, a pressão aplicada a qualquer superfície de extremidade da amostra 20 se torna maior do que a pressão aplicada à outra extremidade, e uma força propulsora em re- lação ao movimento da amostra 20 pode assim ser obtida. Por opera- ção alternada da primeira bomba 39 e da segunda bomba 40, a amos- tra 20 pode ser movida de maneira recíproca no canal de modo a passar através de cada região de temperatura do canal 12 do vaso de processamento de reação 10. Como um resultado, um ciclo térmico pode ser aplicado à amostra 20. Mais especificamente, DNA alvo na amostra 20 é seletivamente ampliado por aplicação repetida de uma etapa de desnaturação na região de alta temperatura e uma etapa de anelamento e alongamento na região de baixa temperatura. Em outras palavras, a região de alta temperatura pode ser considerada como sendo uma região de temperatura de desnaturação, e a região de bai- xa temperatura pode ser considerada como sendo uma região de temperatura de anelamento e alongamento. O tempo para permanecer em cada região de temperatura pode ser apropriadamente ajustado por mudança do tempo durante o qual a amostra 20 para em uma po- sição predeterminada em cada região de temperatura.

[0043] O aparelho de processamento de reação 30 de acordo com a concretização é ainda provido de um primeiro dispositivo de detec- ção de fluorescência 50 e um segundo dispositivo de detecção de flu- orescência 54. Como descrito acima, um corante fluorescente prede-

terminado é adicionado à amostra 20. Uma vez que a intensidade de um sinal de fluorescência emitida a partir da amostra 20 aumenta quando a ampliação do DNA prossegue, o valor do sinal de intensida- de da fluorescência pode ser usado como um índice que serve como um material de decisão para o progresso da PCR ou o término da re- ação.

[0044] Quando o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 e o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54, detecto- res de fluorescência de tipo fibra ótica FLE-510 fabricados pela Nippon Sheet Vidro Co., Ltd., podem ser usados, que são sistemas óticos muito compactos que permite medição rápida e a detecção de fluo- rescência independentemente de se o lugar é um lugar claro ou um lugar escuro. Esses detectores de fluorescência de tipo fibra ótica permitem a característica de comprimento de onda da luz de excita- ção/fluorescência a ser ajustada tal que a característica do compri- mento de onda é adequada para a característica de fluorescência emi- tida a partir da amostra 20 e assim permitem um ótimo sistema ótico e de detecção para uma amostra tendo várias características a serem providas. Além disso, os detectores de fluorescência de tipo fibra ótica são adequados para detecção de fluorescência de uma amostra que existe em uma região pequena ou estreita tal como um canal devido ao diâmetro pequeno de um raio de luz trazido pelos detectores de fluorescência de tipo fibra ótica.

[0045] O primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 é provido com uma primeira cabeça ótica 51, uma primeira fonte de luz de excitação de detecção de fluorescência/módulo detector 52, e uma fibra ótica F12 que conecta a primeira cabeça ótica 51 e a primeira fonte de luz de excitação de detecção de fluorescência/módulo detec- tor 52. Do mesmo modo, o segundo dispositivo de detecção de fluo- rescência 54 é provido da segunda cabeça ótica 55, uma segunda fonte de luz de excitação de detecção de fluorescência/módulo detec- tor 56, e uma fibra ótica F22 que conecta a segunda cabeça ótica 55 e a segunda fonte de luz de excitação de detecção de fluorescên- cia/módulo detector 56.

[0046] A primeira fonte de luz de excitação de detecção de fluo- rescência/módulo detector 52 e a segunda fonte de luz de excitação de detecção de fluorescência/módulo detector 56 cada um inclui uma fonte de luz para luz de excitação, um multiplexador/desmultiplexador de comprimento de onda, um detector de fluorescência, e um aciona- dor ou similar para o controle desses. Cada uma da primeira cabeça ótica 51 e da segunda cabeça ótica 55 é formada de um sistema ótico tal como lente e tem uma função de irradiação direcional da amostra com luz de excitação e coleta de fluorescência emitida a partir da amostra. Fluorescência condensada pela primeira cabeça ótica 51 e fluorescência coletada pela segunda cabeça ótica 55 são separadas da luz de excitação pelos respectivos multiplexadores/desmultiplexa- dores de comprimento de onda na primeira fonte de luz de excitação de detecção de fluorescência/módulo detector 52 e na segunda fonte de luz de excitação de detecção de fluorescência/módulo detector 56 via as fibras óticas F12 e F22, respectivamente, e são convertidas em sinais elétricos pelos respectivos detectores de fluorescência. Os de- talhes da configuração dos dispositivos de detecção de fluorescência serão descritos mais tarde.

[0047] No aparelho de processamento de reação 30 de acordo com a presente concretização, a primeira cabeça ótica 51 é disposta tal que fluorescência a partir da amostra 20 que passa através de uma região parcial 12a (chamada de “primeira região de detecção de fluo- rescência 12a”) dentro da região de conexão que conecta a região de alta temperatura e a região de baixa temperatura podem ser detecta- das. Além disso, a segunda cabeça ótica 55 é disposta tal que a fluo-

rescência pode ser detectada a partir da amostra 20 que passa através de uma outra região parcial 12b (chamada de “segunda região de de- tecção de fluorescência 12b”) dentro da região de conexão. Uma vez que a reação prossegue enquanto a amostra 20 é repetidamente mo- vida de um modo recíproco no canal tal que o DNA predeterminado contido na amostra 20 é ampliado, por monitoramento de uma mu- dança na quantidade de fluorescência detectada, o progresso da am- pliação de DNA pode ser aprendido em tempo real.

[0048] A Fig. 3 é um diagrama para a explicação da configuração de um dispositivo de detecção de fluorescência. A configuração do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 é explicada na Fig. 3. No entanto, o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54 também tem a mesma configuração exceto que o comprimento de onda do centro do filtro passa-banda é diferente.

[0049] Como mostrado na Fig. 3, o primeiro dispositivo de detec- ção de fluorescência 50 é provido com uma primeira cabeça ótica 51, uma primeira fonte de luz de excitação de detecção de fluorescên- cia/módulo detector 52, e uma fibra ótica F12 que conecta a primeira cabeça ótica 51 e a primeira fonte de luz de excitação de detecção de fluorescência/módulo detector 52. A primeira fonte de luz de excitação de detecção de fluorescência/módulo detector 52 inclui uma primeira fonte de luz de excitação 64, um primeiro multiplexador/desmultiple- xador de comprimento de onda 65, e um primeiro detectador de fluo- rescência 66. Esses elementos funcionais são conectados por fibras óticas, e a luz de excitação e a fluorescência se propagam dentro das fibras óticas.

[0050] Um filtro passa-banda A1 está disposto perto de uma pri- meira fonte de luz de excitação 64 tal que luz de excitação emitida a partir de uma primeira fonte de luz de excitação 64 é transmitida. O primeiro multiplexador/desmultiplexador de comprimento de onda 65 tem um filtro passa-banda B1. Um filtro passa-banda C1 está disposto perto do primeiro detectador de fluorescência 66 tal que fluorescência incidente sobre o primeiro detectador de fluorescência 66 é transmitida. A característica do comprimento de onda desses filtros de pas- sa-banda é projetada de acordo com as características do compri- mento de ondas relacionadas com excitação/fluorescência de um co- rante fluorescente tal como FAM. Cada um dos filtros de passa-banda tem uma função espectrocópica de transmissão de luz em uma faixa de comprimento de onda específica com alta eficácia (por exemplo, transmitância de 75% ou mais) e refletindo luz de outros comprimentos de onda com alta eficácia (por exemplo, refletância de 75% ou mais, e de modo desejável 85% ou mais).

[0051] Na presente concretização, o primeiro dispositivo de de- tecção de fluorescência 50 é formado para ser capaz de detectar fluo- rescência a partir de uma amostra contendo FAM como um corante fluorescente.

[0052] A primeira fonte de luz de excitação 64 não é particular- mente limitada contanto que uma primeira fonte de luz de excitação 64 é uma fonte de luz que pode dispersar luz de um comprimento de on- da alvo mais tarde, e por exemplo, LD, LED, fonte de luz branca, ou similar pode ser usada. Luz de excitação emitida a partir de uma pri- meira fonte de luz de excitação 64 é dispersa pelo filtro passa-banda A1, e apenas luz tendo um comprimento de onda em uma faixa pre- determinada com um comprimento de onda de centro de cerca de 470 nm (aqui em seguida, chamada de “luz de excitação OE1”) propaga dentro da fibra ótica F11.

[0053] A luz de excitação OE1 entra no primeiro multiplexa- dor/desmultiplexador de comprimento de onda 65, é colimada pela lente L1, e então alcança o filtro passa-banda B1. Uma vez que o filtro passa-banda B1 é projetado para refletir a luz de excitação OE1, a luz de excitação OE1 é condensada novamente pela lente L1 e entra na fibra ótica F12. A luz de excitação OE1 se propaga dentro da fibra ótica F12 e alcança a primeira cabeça ótica 51. Uma lente objetiva OB1 é provida dentro da primeira cabeça ótica 51, e a luz de excitação OE1 é aplicada à amostra 20 quando a luz de excitação e uma distância de trabalho predeterminada.

[0054] Quando a luz de excitação OE1 é alicada à amostra 20, um corante fluorescente dentro da amostra 20 é excitado, e luz de fluo- rescência OF1 é emitida a partir da amostra 20. A fluorescência OF1 é condensada pela lente objetiva OB1 da primeira cabeça ótica 51, entra na fibra ótica F12, e propaga dentro da fibra ótica F12. A fluorescência OF1 que entra no primeiro multiplexador/desmultiplexador de compri- mento de onda 65, é colimada pela lente L1, e então alcança i filtro passa-banda B1.

[0055] Em geral, o comprimento de onda de fluorescência gerado por irradiação com luz de excitação é mais do que o comprimento de onda de luz de excitação. Isto é, dado que o comprimento de onda do centro de luz de excitação é λe e que o comprimento de onda do cen- tro de fluorescência é λf, λe < λf é satisfeito. Portanto, a fim de guiar apenas a fluorescência OF1 para o primeiro detectador de fluorescên- cia 66, um filtro passa-banda tendo uma característica de espectro de que reflete luz de um comprimento de onda de λe e que transmite luz de um comprimento de onda de λf é usada como o filtro passa-banda B1. O filtro passa-banda B1 é projetado para transmitir, na fluorescên- cia OF1, luz tendo um comprimento de onda em uma faixa que não sobrepõe com o comprimento de onda da luz de excitação OE1. A flu- orescência OF1 que passou através do filtro passa-banda B1 é con- densada pela lente L2 e entra na fibra ótica F13. Além disso, uma vez que o filtro passa-banda B1 tem uma função de que reflete luz de ex- citação e que transmite fluorescência, um filtro de borda capaz de re-

fletir luz em uma faixa de comprimento de onda incluindo λe e que transmite luz em uma faixa de comprimento de onda incluindo λf de acordo com os seus comprimentos de onda de centro respectivos po- dem ser usados ao invés de um filtro de passa-banda.

[0056] A fluorescência OF1 que propaga dentro da fibra ótica F13 alcança o primeiro detectador de fluorescência 66. A fim de precisa- mente ajustar a faixa de comprimento de onda, a fluorescência OF1 pode passar através do filtro passa-banda C1 antes de entrar no pri- meiro detectador de fluorescência 66. Apenas luz tendo um compri- mento de onda dentro de uma faixa predeterminada com um compri- mento de onda de centro de cerca de 530 nm que passou através dos filtros de passa-banda B1 e C1 entra no primeiro detectador de fluo- rescência 66. O primeiro detectador de fluorescência 66 é um elemen- to de conversão fotoelétrica tal como PD, APD, ou fotomultiplicador. Um sinal convertido em um sinal elétrico pelo primeiro detectador de fluorescência 66 é submetido a um processo de sinal descrito mais tarde.

[0057] No primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 mostrado na Fig. 3, cada elemento pode incluir uma lente para trans- missão ou acoplamento eficaz da luz ou para o aperfeiçoamento da eficácia de utilização de um filtro de passa-banda. Como a lente, uma lente de índice de gradiente, uma lente de bola, uma lente esférica, ou similar pode ser usada. Além disso, no primeiro dispositivo de detec- ção de fluorescência 50 mostrado na Fig. 3, fibras de monomodo ou fibras de multimodos podem ser usadas para as fibras óticas F11, F12, e F13.

[0058] O primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 for- mado como descrito acima irradia a amostra com luz tendo um com- primento de onda de centro de 470 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 450 a 490 nm como a primeira luz de excitação OE1,

e detecta a primeira fluorescência OF1 tendo um comprimento de onda de centro de 530 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 510 a 550 nm emitida pela amostra. Uma pessoa versada na técnica apreciaria que as características que se relacionam com os compri- mentos de onda são determinadas pela combinação das característi- cas de transmissão ou das características de reflexão de cada filtro passa-banda como descrito acima e que essas características podem ser mudadas ou customizadas.

[0059] Por outro lado, na presente concretização, o segundo dis- positivo de detecção de fluorescência 54 é formado para ser capaz de detectar fluorescência a partir de uma amostra contendo ROX como um corante fluorescente. O segundo dispositivo de detecção de fluo- rescência 54 irradia a amostra com luz tendo um comprimento de onda de centro de 530 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 510 a 550 nm como uma segunda luz de excitação OE2, e detecta uma segunda fluorescência OF2 tendo um comprimento de onda de centro de 610 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 580 a 640 nm.

[0060] A Fig. 4 mostra um estado onde a primeira cabeça ótica 51 do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 e a segunda cabeça ótica 55 do segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54 são dispostas. A cabeça ótica 51 está disposta de modo a ser ca- paz de detectar fluorescência a partir da amostra 20 que passa através da primeira região de detecção de fluorescência 12a do canal 12. A segunda cabeça ótica 55 está disposta de modo a ser capaz de de- tectar fluorescência a partir da amostra 20 que passa através da se- gunda região de detecção de fluorescência 12b do canal 12. Além disso, qualquer uma da primeira cabeça ótica 51 do primeiro dispositi- vo de detecção de fluorescência 50 e da segunda cabeça ótica 55 do segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54 podem ser dis-

postas próxima do meio da região de conexão ou do meio do caminho entre a região de baixa temperatura e a região de alta temperatura.

[0061] Como mostrado na Fig. 4, a primeira cabeça ótica 51 per- mite que a primeira luz de excitação OE1 se propague dentro da fibra ótica F12 a ser condensada pela lente objetiva OB1, irradia a amostra 20 que passa através da primeira região de detecção de fluorescência 12a com a primeira luz de excitação resultante OE1, e permite que a primeira fluorescência OF1 gerada a partir da amostra 20 seja con- densada pela lente objetiva OB1 e entra na fibra ótica F12. Do mesmo modo, a segunda cabeça ótica 55 permite que a segunda luz de exci- tação OE2 se propague dentro da fibra ótica F22 a ser condensada pela lente objetiva OB2, irradia a amostra 20 que passa através da segunda região de detecção de fluorescência 12b com a segunda luz de excitação resultante OE2, e permite que a segunda fluorescência OF2 gerada a partir da amostra 20 seja condensada pela lente objetiva OB2 e entra na fibra ótica F22.

[0062] Os respectivos diâmetros da primeira cabeça ótica 51 e da segunda cabeça ótica 55 são, por exemplo, de 1 a 4 mm, e a primeira cabeça ótica 51 e a segunda cabeça ótica 55 são dispostas em um in- tervalo arbitrário maior do que isso. A distância entre o centro da pri- meira região de detecção de fluorescência 12a irradiada com a pri- meira luz de excitação OE1 a partir da primeira cabeça ótica 51 e do centro da segunda região de detecção de fluorescência 12b irradiada com a segunda luz de excitação OE2 a partir da segunda cabeça ótica 55 é chamada de “distância de ponto de interfluorescente tp”.

[0063] Como as lentes objetivas OB1 e OB2, lentes ou um grupo de lentes tendo potência positiva, por exemplo, microlentes Selfoc (marca registrada), que são lentes com índice de gradiente, podem ser usadas. Como as lentes objetivas OB1 e OB2, por exemplo, essas tendo um diâmetro de 1,8 mm, uma abertura numérica (NA) de 0,23, e uma WD de 1 mm a 3 mm podem ser usadas.

[0064] Na presente concretização, uma primeira fonte de luz de excitação do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 é modulada pelo primeiro sinal de modulação e emite luz de flashing. Do mesmo modo, a segunda fonte de luz de excitação do segundo dispo- sitivo de detecção de fluorescência 54 é modulada pelo segundo sinal de modulação e emite luz de flashing.

[0065] A Fig. 5 é um diagrama para a explicação da configuração de circuito de um amplificador de lock-in que processa um sinal de flu- orescência a partir de um detector de fluorescência.

[0066] Na presente concretização, o primeiro sinal de fluorescên- cia oriundo do primeiro detectador de fluorescência 66 do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 é processado por um pri- meiro amplificador de lock-in 68. O primeiro amplificador de lock-in 68 inclui um amplificador IV 70, um filtro de alta passagem 80, um ampli- ficador de inversão/não inversão 81, e um filtro de baixa passagem 82. A saída do primeiro sinal de fluorescência oriundo do primeiro detec- tador de fluorescência 66 é apropriadamente ampliado pelo amplifica- dor IV 70, e então o componente CC é removido pelo filtro de alta passagem (HPF) 80. Esse sinal é ainda detectado sincronicamente pelo amplificador de inversão/não inversão 81 com o primeiro sinal de modulação e é convertido em uma corrente direta. O filtro de baixa passagem (LPF) 82 remove ruído do sinal convertido em uma corrente direta, e uma primeira saída de sinal de acordo com o primeiro disposi- tivo de detecção de fluorescência 50 pode ser finalmente obtida.

[0067] O segundo sinal de fluorescência oriundo do segundo de- tectador de fluorescência 67 do segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54 é processado por um segundo amplificador de lock-in

69. A configuração do segundo amplificador de lock-in 69 é a mesma que aquela do primeiro amplificador de lock-in 68. Por processamento do segundo sinal de fluorescência a partir do segundo detectador de fluorescência 67 usando o segundo amplificador de lock-in 69, uma segunda saída de sinal de acordo com o segundo dispositivo de de- tecção de fluorescência 54 pode ser finalmente obtida.

[0068] Na presente concretização, a primeira cabeça ótica 51 e a segunda cabeça ótica 55 são dispostas lado a lado a fim de detectar a amostra 20 que passa através de um canal simples 12. Como descrito acima, o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 emite a primeira luz de excitação OE1 tendo um comprimento de onda de cen- tro de 470 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 450 a 490 nm, e detecta primeira fluorescência OF1 tendo um comprimento de onda de centro de 530 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 510 a 550 nm. O segundo dispositivo de detecção de fluo- rescência 54 emite a segunda luz de excitação OE2 tendo um com- primento de onda de centro de 530 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 510 a 550 nm, e detecta segunda luz de excitação OE2 tendo um comprimento de onda de centro de 610 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 580 a 640 nm. Portanto, a faixa de comprimento de onda da segunda luz de excitação OE2 (cerca de 510 a 550 nm) e a faixa de comprimento de onda da primeira fluores- cência OF1 (cerca de 510 a 550 nm) se sobrepõem. Nesse caso, quando uma parte da segunda luz de excitação OE2 emitida a partir da segunda cabeça ótica 55 é detectada pela primeira cabeça ótica 51, a segunda luz de excitação OE2 pode não ser removida pelos filtros de passa-banda pós-estágios B1 e C1 da primeira cabeça ótica 51 e pode alcançar o primeiro detectador de fluorescência 66. A segunda luz de excitação OE2 é ruído no primeiro detectador de fluorescência 66, e a primeira fluorescência OF1, que seria essencialmente detectada, pode não ser capaz de ser detectada.

[0069] Quando a primeira cabeça ótica 51 e a segunda cabeça ótica 55 são dispostas de modo a ser suficientemente separadas entre si, tal problema não surge. No entanto, o tamanho do aparelho de processamento de reação 30 se torna maior nesse caso. A fim de re- solver tal problema contraditório, os presentes inventores diligente- mente estudados e investigados, que tipo de influência a detecção de fluorescência teria quando as duas cabeças óticas são dispostas lado a lado.

[0070] Os presentes inventores realmente examinaram que tipo de influência foi causado na detecção de fluorescência a partir de uma amostra pela diferença de fases entre um primeiro sinal de modulação (primeiro sinal de modulação de fonte luz de excitação) de acordo com o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 e um segundo sinal de modulação (segundo sinal de modulação de fonte luz de exci- tação) de acordo com o segundo dispositivo de detecção de fluores- cência 54, em outras palavras, a diferença de fases entre flashing da primeira luz de excitação e flashing da segunda luz de excitação. As condições experimentais são mostradas abaixo.

[0071] (1) Como mostrado na Fig. 4, a primeira cabeça ótica 51 e a segunda cabeça ótica 55 foram dispostas lado a lado tal que fluo- rescência a partir da amostra 20 no canal 12 poderia ser condensada. A distância de ponto interfluorescente tp, que é a distância entre o centro da primeira região de detecção de fluorescência 12a e o centro da segunda região de detecção de fluorescência 12b, foi ajustada para 4,5 mm. (2) Um primeiro sinal de modulação tendo uma primeira fre- quência de modulação (110 Hz) foi gerada por um gerador de pulso ou similar, e primeira luz de excitação oriunda da primeira fonte de luz de excitação foi modulada usando o primeiro sinal de modulação. Do mesmo modo, um segundo sinal de modulação tendo uma segunda frequência de modulação (110 Hz) foi gerado, e a segunda luz de ex- citação oriunda da segunda fonte de luz de excitação foi modulada usando o segundo sinal de modulação. As respectivas razões de taxa do primeiro sinal de modulação e do segundo sinal de modulação eram ambas 50%. (3) A diferença de fases Δφ entre a modulação pelo primeiro sinal de modulação e a modulação pelo segundo sinal de modulação foi mudada, e uma primeira saída de sinal de acordo com o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 foi medida. Nessa concretização exemplar, um ciclo térmico não foi aplicado uma vez que apenas a dependência de diferença de fases foi detectada para um sinal de fluorescência.

[0072] A Fig. 6 mostra o resultado de medição de uma primeira saída de sinal de acordo com o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 quando a diferença de fases entre um primeiro sinal de modulação e um segundo sinal de modulação é mudada. Na Fig. 6, gráfico de círculo preto mostra o resultado da medição quando uma solução aquosa de FAM foi usada como uma amostra (indicada como “solução aquosa de FAM”). Uma solução aquosa de FAM (concentra- ção de 30 nM) foi posta dentro do canal 12 do vaso de processamento de reação 10, e a diferença de fases Δφ entre o primeiro sinal de mo- dulação e o segundo sinal de modulação foi mudada de 0° para 360°, uma primeira saída de sinal de acordo com o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 foi medida. Também, na Fig. 6, um grá- fico de círculo branco mostra o resultado (exibido como “branco”) de medição da primeira saída de sinal em um estado onde nada foi posto dentro do canal 12 do vaso de processamento de reação 10 (isto é, um estado em branco).

[0073] Como pode ser visto da Fig. 6, tanto na “solução aquosa de FAM” quanto os casos “em branco”, a primeira saída de sinal também muda de acordo com a mudança na diferença de fases Δφ, e a pri- meira saída de sinal se torna máxima quando a diferença de fases Δφ é 0° e 360° (isto é, não há diferença de fases), e a primeira saída de sinal se torna mínima quando a diferença de fases Δφ é 180°.

[0074] A saída de sinal com base em um sinal de fluorescência emitida a partir da solução aquosa de FAM como a amostra é obtida por subtração do valor da primeira saída de sinal no caso de “em branco” do valor da primeira saída de sinal no caso de “solução aquo- sa de FAM” mostrada na Fig. 6. Por esse cálculo, a saída de sinal com base no sinal de fluorescência de rede a partir da solução aquosa de FAM pode ser obtida. A relação entre essa saída de sinal e a diferença de fases Δφ (°) é mostrada por um gráfico de quadrado branco (exibida como solução aquosa de FAM (excluindo branco)) na Fig. 7.

[0075] Com base em Fig. 7, pode ser verificado que a intensidade de sinal com base no sinal de fluorescência de rede oriunda da solu- ção aquosa de FAM varia dependendo do valor da diferença de fases Δφ entre o primeiro sinal de modulação da primeira fonte de luz de ex- citação e o segundo sinal de modulação da segunda fonte de luz de excitação. Isso significa que a segunda luz de excitação tem uma in- fluência na detecção de fluorescência do primeiro dispositivo de de- tecção de fluorescência 50 e que o grau da influência difere depen- dendo da diferença de fases Δφ.

[0076] Então, depois da parada da segunda fonte de luz de exci- tação , as respectivas intensidades das primeiras saídas de sinal para o “branco” e a “solução aquosa de FAM” foram medidas, e a diferença entre as intensidades foi calculada de modo a se obter a intensidade de sinal com base no sinal de fluorescência de rede a partir da solução aquosa de FAM. Nesse caso, uma vez que a segunda fonte de luz de excitação foi parada, não havia conceito da diferença de fases Δφ, e a primeira saída de sinal era constante (4.0). Esse valor é com base no sinal de fluorescência da solução aquosa de FAM que exclui o branco e não é afetado por outros sistemas de luz de excitação/detecção de fluorescência. Esse valor é mostrado por uma linha sólida na Fig. 7

(exibido como “sinal de rede s”).

[0077] O valor absoluto obtido por subtração do valor do “sinal de rede s” do valor da “solução aquosa de FAM (excluindo branco)” cor- responde a ruído. A relação entre esse ruído (N’) e a diferença de fa- ses Δφ (°) é mostrada na Fig. 8. Com base na Fig. 8, pode ser verifi- cado que, mesmo na presença da segunda luz de excitação de acordo com o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54, o ruído do sinal de fluorescência obtido através do primeiro amplificador de lock-in 68 a partir do primeiro detectador de fluorescência 66 de acordo com o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 é mínimo quando a diferença de fases Δφ é 90° e quando a diferença de fases Δφ é 270°.

[0078] A Fig. 9 mostra a relação entre o ruído e a diferença de fa- ses quando as respectivas razões de taxas do primeiro sinal de modu- lação e do segundo sinal de modulação são ambas 30%. A Fig. 10 mostra a relação entre o ruído e a diferença de fases quando as res- pectivas razões de taxas do primeiro sinal de modulação e do segundo sinal de modulação são ambas 40%. Em ambas as Figs. 9 e 10, a dis- tância de ponto interfluorescente tp foi ajustada para 4,5 mm. Como mostrado na Fig. 9, diferenças de fases Δφ em que ruído N’ se tornou mínimo quando as razões da taxa eram 30% eram cerca de 76° e cerca de 284°. Além disso, como mostrado na Fig. 10, diferenças de fases Δφ em que ruído N’ se tornou mínimo quando as razões da taxa eram 40% eram cerca de 86° e cerca de 274°.

[0079] A partir dos resultados experimentais acima, pode ser veri- ficado que a ótima diferença de fases em que o ruído N’ se torna mí- nimo muda dependendo da diferença nas respectivas razões de taxa do primeiro sinal de modulação e do segundo sinal de modulação. Isso pode ser expresso usando uma expressão matemática, como pode ser derivada da seguinte consideração.

[0080] As Figs. 11A, 11B, 11C e 11D são diagramas para a expli- cação da operação de um amplificador de lock-in quando um dos dois dispositivos de detecção de fluorescência é parado. Um caso é agora considerado onde, o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 e o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54, o segun- do dispositivo de detecção de fluorescência 54 é parado (sem levar a segunda fonte de luz de excitação a emitir luz de flashing) e um sinal recebido pelo primeiro detectador de fluorescência 66 do primeiro dis- positivo de detecção de fluorescência 50 é processado pelo primeiro amplificador de lock-in 68. Uma vez que o segundo dispositivo de de- tecção de fluorescência 54 é parado, o primeiro sinal de fluorescência a ser detectado pelo primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 não é afetado pela segunda luz de excitação do segundo dispositi- vo de detecção de fluorescência 54.

[0081] No primeiro amplificador de lock-in 68 mostrado na Fig. 5, a saída depois da passagem através do amplificador IV 70 é mostrada como V11, a saída depois da passagem através do filtro de alta passa- gem 80 é mostrada como V12, a saída depois da passagem através do amplificador de inversão/não inversão 81 é mostrada como V14a, e a saída depois da passagem através do filtro de baixa passagem 82 é mostrada como V14. Na explicação de amplificador de lock-in incluindo a seguinte explicação, símbolos relacionados com a saída que incluem V são unidades arbitrárias de acordo com a voltagem (Volt).

[0082] A Fig. 11A mostra a saída V11 depois da passagem através do amplificador IV. A Fig. 11B mostra a saída V12 depois da passagem através do filtro de alta passagem. A Fig. 11C mostra a saída V14a de- pois da passagem através do amplificador de inversão/não inversão. A Fig. 11D mostra a saída V14 depois da passagem através do filtro de baixa passagem. Nas Figs. 11A, 11B, 11C e 11D, o eixo horizontal re- presenta a fase e o eixo vertical representa a saída de sinal. Um ciclo assim chamado é 360° ou 2π rad. A fase arbitrária φ (°) mostra uma relação de φ*π/180 (rad). Em consideração de facilidade de cálculo, a fase é principalmente representada por rad (radiano).

[0083] Para simplicidade, um caso é considerado onde a saída V11 depois da passagem através do amplificador IV é um sinal retangular como mostrado na Fig. 11A. V11 é um sinal retangular tendo um valor de saída de 1 na região de uma fase que corresponde a uma seção α e um valor de saída de 0 na região de uma fase que corresponde a uma seção β em um ciclo simples sob uma frequência constante. A razão de taxa desse sinal retangular é expressa por d = α / (α + β) (0 < d < 1) ou d = α / 2π. Embora a razão de taxa da saída V11 depois da passagem através do amplificador IV seja descrita aqui, essa razão de taxa é a mesma que a razão de taxa da primeira luz de excitação emi- tida a partir de uma primeira fonte de luz de excitação 64 que está li- gada/desligada sob a mesma frequência.

[0084] Quando um sinal retangular como mostrado na Fig. 11A passa através do filtro de alta passagem 80, o componente de corrente direta é cortado. Assim, um sinal de saída como mostrado na Fig. 11B é obtido. Quando o sinal mostrado na Fig. 11B passa através do ampli- ficador de inversão/não inversão 81, o sinal de um sinal de saída que pertence à região acima de uma fase que corresponde à seção β é in- vertido, e um sinal de saída como mostrado na Fig. 11C é, portanto, obtido. Além disso, quando um sinal como mostrado na Fig. 11C passa através de o filtro de baixa passagem 82, o componente de corrente alternada é cortado. Assim, um sinal de saída como mostrado na Fig. 11D é obtido. O valor de saída V14 depois da passagem através do fil- tro de baixa passagem pode ser expresso pela seguinte expressão (1) usando uma razão de taxa d. V14 = 2 * d * (1 - d) (1)

[0085] As Figs. 12A, 12B, 12C, 12D, 12E e 12F são diagramas para a explicação da operação do amplificador de lock-in quando am- bos os dois dispositivos de detecção de fluorescência são operados. Um caso é considerado onde o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 e o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54 são operados e um sinal recebido pelo primeiro detectador de fluo- rescência 66 do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 é processado pelo primeiro amplificador de lock-in 68. Uma vez que o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54 está sendo ope- rado, o primeiro sinal de fluorescência a ser detectado pelo primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 é afetado pela segunda luz de excitação do segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54.

[0086] A Fig. 12A mostra a saída V11 do primeiro amplificador de lock-in 68 depois da passagem através do amplificador IV 70 quando não há nenhuma influência da segunda luz de excitação de acordo com o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54. Como do mesmo modo que na Fig. 11A, um sinal retangular é considerado que tem um valor de saída de 1 na região de uma fase que corresponde à seção α e um valor de saída de 0 na região de uma fase que corres- ponde à seção β em um ciclo simples sob uma frequência constante e tem a mesma razão de taxa d que aquela na Fig. 11A.

[0087] A Fig. 12B mostra um sinal depois que a luz derivada da segunda luz de excitação de acordo com o segundo dispositivo de de- tecção de fluorescência 54 é recebida pelo primeiro detectador de flu- orescência 66 e passa através do amplificador IV 70 do primeiro ampli- ficador de lock-in 68. Esse sinal tem um valor de saída a (0 < a < 1) na região de uma fase que corresponde à seção α e um valor de saída de 0 na região de uma fase que corresponde à seção β em um ciclo sim- ples sob a mesma frequência que aquela para V11. Esse sinal tem a mesma razão de taxa d que aquele para V11. No entanto, o sinal deri- vado da segunda luz de excitação é atrasado por 2πp (rad) (p é um parâmetro, 0 < p < 1) a partir do sinal de saída V11 mostrado na Fig. 12A. Há uma relação de Δφ = 360*p entre a diferença de fases ex- pressa por Δφ (°) e a diferença de fases pressionada por 2πp (rad).

[0088] A Fig. 12C mostra a saída V11 realmente do amplificador IV

70. Essa é a soma do sinal de saída mostrado na Fig. 12A e do sinal de saída mostrado na Fig. 12B.

[0089] A Fig. 12D mostra a saída V12 depois da passagem através do filtro de alta passagem 80. A tendência associada ao corte do com- ponente de corrente direta devido à passagem através do filtro de alta passagem 80 é admitida como sendo (-x). Na área de uma região en- cerrada pela saída e pela fase, a área de uma região no lado positivo e a área de uma região no lado negativo são as mesmas com 0 que o limite. Portanto, a seguinte expressão (2) é satisfeita. de (1 - x) * p + ( 1 + a - x) * (d − p) + (a - x) * p + (−x) * {1 - (d + p)} = 0, x = (1 + a) * d (2)

[0090] A Fig. 12E mostra a saída V14a depois da passagem através do amplificador de inversão/não inversão 81. A Fig. 12F mostra a saída V14 depois da passagem através do filtro de baixa passagem 82. Quando o sinal mostrado na Fig. 12D passa através do amplificador de inversão/não inversão 81, o sinal de um sinal de saída que pertence à região de uma fase que corresponde à seção β de acordo com o pri- meiro dispositivo de detecção de fluorescência é invertido, e um sinal de saída como mostrado na Fig. 12E é, portanto, obtido. Além disso, quando um sinal como mostrado na Fig. 12E passa através do filtro de baixa passagem 82, o componente de corrente alternada é cortado. Assim, um sinal de saída como mostrado na Fig. 12F é obtido.

[0091] Quando a saída (isto é, a primeira saída de sinal) V14 de- pois da passagem através do filtro de baixa passagem 82 é expresso em consideração da relação na expressão (2), a saída é expressa na seguinte expressão (3). V14 = -2 * (1 + a) * d2 + 2 * (1 + a) * d – 2 * a * p (3)

[0092] Da consideração acima, na primeira saída de sinal, a quan- tidade de saída (o seu valor absoluto) obtida por subtração da expres- são (1) da expressão (3) é superimposta na primeira saída de sinal como ruído. Assim, o valor de um componente de ruído V1N é expresso pela seguinte expressão (4). V1N = |-2 * a * (d2 - d + p)| (4)

[0093] Na expressão (4), quando d2 - d + p = 0 é satisfeito, V1N se torna o mínimo (0), e o valor pm do parâmetro p nesse momento é ex- presso pela seguinte expressão (5). pm = d − d2 (5)

[0094] Dessa expressão (5), os valores de pm quando a razão de taxa é de 0,5 (50%), 0,4 (40%), e 0,3 (30%) podem ser calculados como sendo 0,25, 0,24, e 0,21, respectivamente. Além disso, as óti- mas diferenças de fases que minimizam o componente de ruído V1N que corresponde a essas pm podem ser obtidas como sendo 0,5π rad, 0,48π rad, e 0,42π rad. Também, na notação nos graus (°), Δφm = 90,0°, Δφm = 86,4°, e Δφm = 75,6° podem ser obtidos. Esses são quase os mesmos que os resultados experimentais acima, e a validade dos resultados experimentais é assim confirmada. Além disso, em compa- ração com os resultados experimentais acima, pode ser entendido que o componente de ruído V1N é também mínimo quando a diferença de fases é 2π(1 - pm) (rad) e Δφm = 360(1 - pm) (°).

[0095] Como descrito acima, no aparelho de processamento de reação 30 de acordo com a presente concretização, por ajuste da di- ferença de fases entre flashing da primeira luz de excitação emitida a partir da primeira cabeça ótica 51 e flashing da segunda luz de excita- ção emitida a partir da segunda cabeça ótica 55 a ser 2πpm (rad) ou 2π(1 - pm) (rad) que usa o conjunto pm pela expressão (5) (notação nas unidades de graus (°) é 360pm (°) ou 360(1 - pm) (°)), a interferência entre o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 e o se- gundo dispositivo de detecção de fluorescência 54 pode ser suprimida.

[0096] A Fig. 13 é um diagrama para a explicação de como deter- minar uma faixa permissível Δpm em pm que corresponde ao valor mí- nimo de uma saída de sinal de ruído N’, onde N’ é a notação de ruído acima descrito V1N. A Fig. 13 mostra a relação entre a saída de sinal de ruído N′ e a diferença de fases 2πp (rad).

[0097] Dado que o ruído N′ quando a diferença de fases 2πp é 0 rad é N0′, que o valor permissível do ruído N′ é Nm′, e que a primeira saída de sinal de acordo com o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 quando o segundo dispositivo de detecção de fluo- rescência 54 não está operando é V10, a faixa permissível Δpm em pm do parâmetro p é expressa pela seguinte expressão (6) em conside- ração da expressão acima (5). Δpm = (Nm′) * (d − d2) / (N0’) = (Nm’ / V10) * (d − d2) / [(N0’) / V10] (6)

[0098] Uma vez que a razão de Nm′ para a primeira saída de sinal V10 de acordo com o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 quando o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54 não está operando é exigida como sendo 0,05 (5%), a faixa permissível Δpm é ajustada para um valor obtido pela seguinte expressão (7). Δpm = (d − d2) / [20 * (N0’) / V10] (7)

[0099] Por exemplo, quando V10 = 4 é satisfeito e N0′ de cerca de 50 é exigido, e quando a taxa do dispositivo de detecção de fluores- cência é de 0,4, pm = 0,24 e a diferença de fases 2πpm = 0,48π rad (86,4°) são satisfeitas. Da expressão (7), Δpm = 0,00096 é satisfeito, e a faixa permissível da diferença de fases é obtida como sendo 0,00192π rad (0,35°). Portanto, a faixa apropriada da diferença de fa- ses pode ser 0,48π ± 0,00192π (rad) (86,4 ± 0,35 (°)), e ainda pode ser 1,52π ± 0,00192π (rad) (273,6 ± 0,35 (°)).

[0100] Além disso, uma vez que a razão de Nm′ para a primeira saída de sinal V10 é mais desejavelmente 0,03 (3%), a faixa permissí- vel Δpm é ajustada para um valor obtido pela seguinte expressão (8). Do mesmo modo, dado que V10 = 4, N0′ = 50, e d = 0,4 são satisfeitos, Δpm = 0,00058 é satisfeito, e a faixa permissível da diferença de fases é obtida como sendo 0,00116π rad (0,21°). Portanto, a faixa apropria- da da diferença de fases pode ser 0,48π ± 0,00116π (rad) (86,4 ± 0,21 (°)), e ainda pode ser 1,52π ± 0,00116π (rad) (273,6 ± 0,21 (°)). Δpm = 3 * (d − d2) / [100 * (N0’) / V10] (8)

[0101] Além disso, uma vez que a razão de Nm′ para a primeira saída de sinal V10 é ainda desejavelmente 0,01 (1%), a faixa permis- sível Δpm é ajustada para um valor obtido pela seguinte expressão (9). Do mesmo modo, dado que V10 = 4, N0’ = 50, e d = 0,4 são satisfeitos, Δpm = 0,00019 é satisfeito, e a faixa permissível da diferença de fases é obtida como sendo 0,00038π rad (0,07°). Portanto, a faixa apropria- da da diferença de fases pode ser 0,48π ± 0,00038π (rad) (86,4 ± 0,07 (°)), e ainda pode ser 1,52π ± 0,00038π (rad) (273,6 ± 0,07 (°)). Δpm = (d − d2) / [100 * (N0’) / V10] (9)

[0102] Dos resultados de exame acima, a faixa desejável da dife- rença de fases é expressa como sendo de 2π(pm - Δpm) (rad) a 2π(pm + Δpm) (rad) ou de 2π[(1 - pm) - Δpm] (rad) a 2π[(1 - pm) + Δpm (rad) em unidades de rad (radiano), e podem ser em geral expressos como sendo de 360(pm - Δpm) (°) a 360(pm + Δpm) (°) ou de 360[(1 - pm) – Δpm] (°) a 360[(1 - pm) + Δpm] (°) nas unidades de graus (°). No entanto, onde d representa a razão de taxa, pm = d − d2 é satisfeita, e Δpm = (d − d2) / [20 * (N0’) / V10], mais desejavelmente Δpm = 3 * (d − d2) / [100 * (N0’) / V10], e mais desejavelmente Δpm = (d − d2) / [100 * (N0′) / V10] é satisfeito.

[0103] Por outro lado, Δpm pode ser ajustado para satisfazer Δpm = 0,01 * pm com base na relação com pm. Desse modo, Δpm pode ser unicamente ajustado para 1% de pm.

[0104] Do seguinte experimento e consideração, pode ser verifi- cado que ruído ocorre em um sinal obtido por processamento, usando um amplificador de lock-in, um sinal de fluorescência detectado por um detector de fluorescência quando a amostra passa através da região de detecção de fluorescência mesmo quando a diferença de fases en- tre flashing da primeira luz de excitação de acordo com o primeiro dis- positivo de detecção de fluorescência 50 e flashing da segunda luz de excitação de acordo com o segundo dispositivo de detecção de fluo- rescência 54 é ajustada tal que o ruído seja minimizado.

[0105] As Figs. 14 e 15 mostram uma relação entre uma saída de sinal do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 e tempo quando uma amostra foi movida dentro do canal 12 e foi passada através de uma região de detecção de fluorescência predeterminada no aparelho de processamento de reação 30 mostrado na Fig. 2. A Fig. 14 mostra uma saída de sinal de fluorescência do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 quando a amostra foi movida dentro do canal 12 enquanto o segundo dispositivo de detecção de fluores- cência 54 estava sendo parado (isto é, sem flashing da segunda fonte de luz de excitação). Por outro lado, a Fig. 15 mostra uma saída de sinal de fluorescência do primeiro dispositivo de detecção de fluores- cência 50 quando a amostra foi movida dentro do canal 12 enquanto o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54 estivesse sendo operando (isto é, enquanto flashing da segunda fonte de luz de exci- tação).

[0106] Tanto a primeira luz de excitação quanto a segunda luz de excitação foram “flashed” na mesma frequência (110 Hz) e a mesma taxa de razão de 0,5 (50%), e a diferença de fases Δφ entre a primeira luz de excitação e a segunda luz de excitação foi ajustada para 0,5π rad (90,0°). Além do mais, cada luz de excitação e detectador de fluo-

rescência foram independentemente dispostos com relação ao canal tal que a intensidade de fluorescência a partir da amostra no canal 12 foi maximizada.

[0107] Em primeiro lugar, o comportamento de um sinal de fluo- rescência no momento da passagem da amostra através da região de detecção de fluorescência será descrito com referência à Fig. 14. A in- tensidade de um sinal de fluorescência mostrado na Fig. 14 desloca em uma linha de base durante um tempo e eleva em um certo tempo (11 × 1/10 segundos). Pode ser considerado que a amostra entrou na primeira região de detecção de fluorescência 12a nesse momento. Além disso, o sinal de fluorescência desloca para um valor substanci- almente constante (substancialmente 14 a uma intensidade arbitrária) durante um tempo. Pode ser considerado que isso corresponde ao tempo durante o qual a amostra tendo um certo comprimento estava passando através da primeira região de detecção de fluorescência 12a dentro do canal 12. Então, em um certo tempo, o sinal de fluorescên- cia cai novamente para a linha de base. Pode ser considerado que a amostra sai da primeira região de detecção de fluorescência 12a nes- se momento (18 × 1/10 segundos). Depois disso, o sinal de fluores- cência desloca na linha de base.

[0108] A explicação acima refere-se ao comportamento de um si- nal de fluorescência quando uma amostra passa através da primeira região de detecção de fluorescência 12a apenas uma vez. No caso de PCR, uma amostra repetidamente se move de um modo recíproco em um canal 12 e é repetidamente exposta a regiões de temperatura pre- ajustada de diferentes níveis (isto é, ciclo térmico), e DNA específico ou similar contido na amostra é desse modo aplicado.

[0109] No caso de uma amostra contendo um corante fluorescente, a intensidade de fluorescência emitida a partir da amostra aumenta quando DNA predeterminado ou similar é ampliado. Então, por moni-

toramento do valor máximo de um sinal de fluorescência obtido quan- do a amostra passa através de a região de detecção de fluorescência com relação à intensidade de fluorescência crescente, PCR de tempo real que acompanha ampliação do DNA predeterminado pode ser rea- lizado.

[0110] A seguir, o comportamento de um sinal de fluorescência na hora da passagem da amostra através da região de detecção de fluo- rescência será descrito com referência à Fig. 15. O comportamento do sinal de fluorescência mostrado na Fig. 15 é diferente daquele do sinal de fluorescência mostrado na Fig. 14. O sinal de fluorescência mos- trado na Fig. 15 exibe uma grande ultrapassagem em uma parte de ascendente e exibe intensidade de fluorescência mais alta do que substancialmente intensidade de fluorescência constante mostrado no tempo subsequente. A ocorrência de uma grande ultrapassagem em um sinal de fluorescência como descrita acima leva o sinal de fluores- cência a variar, que se torna difícil monitorar a intensidade exata do sinal de fluorescência, e PCR em tempo real pode ser assim impedido.

[0111] A partir do exposto acima, é sugerido que, em uma plurali- dade de combinações de luz de excitação/fluorescência, quando a faixa de comprimento de onda que corresponde à luz de excitação que pertence a qualquer combinação e a faixa de comprimento de onda que corresponde à fluorescência que pertence a outras combinações se sobrepõem, a detecção do sinal de fluorescência é afetada mesmo quando a diferença de fases de lock-in é otimizada. O comportamento do sinal de fluorescência mostrado na Fig. 15 pode existir mesmo quando a diferença de fases de flashing entre a luz de excitação do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 e a luz de excita- ção do segundo dispositivo de detecção de fluorescência 54 é otimi- zada.

[0112] Assim, os presentes inventores fizeram estudos e experi-

mentos sérios para reduzir tal ultrapassagem de um sinal de fluores- cência e verificou-que a causa para a ultrapassagem está na distância de ponto interfluorescente tp. Mais especificamente, verificou-se que em um caso onde o NA de um sistema ótico de uma cabeça ótica para uma amostra estava dentro de uma faixa predeterminada, o valor do ruído (Nv) se tornou 0,2 ou menos, que era um valor adequado, quando a distância de ponto interfluorescente tp era de 4 mm ou mais.

[0113] A Fig. 16 é um diagrama para a explicação de uma concre- tização exemplar da presente invenção. Do mesmo modo que na con- cretização descrita acima, a primeira cabeça ótica 51 e a segunda ca- beça ótica 55 foram dispostas lado a lado tal que a fluorescência a par- tir da amostra 20 disposta no canal 12 do vaso de processamento de reação 10 poderia ser detectada. A primeira cabeça ótica 51 inclui uma lente objetiva OB1, e a segunda cabeça ótica 55 inclui uma lente obje- tiva OB2. Uma primeira região de detecção de fluorescência 12a e uma segunda região de detecção de fluorescência 12b são ajustadas no canal 12. A primeira cabeça ótica 51 irradia a amostra 20 localizada na primeira região de detecção de fluorescência 12a com luz de exci- tação e recebe fluorescência. A segunda cabeça ótica 55 irradia a amostra 20 localizada na segunda região de detecção de fluorescência 12b com luz de excitação e recebe fluorescência. A luz de excitação emitida a partir da primeira cabeça ótica 51 e a luz de excitação emiti- da a partir da segunda cabeça ótica 55 foram “flashed” tanto em uma frequência de 110 Hz quanto em uma razão de taxa de 0,5. Um pro- cesso lock-in foi realizado sobre a fluorescência recebida pela primeira cabeça ótica 51 e a fluorescência recebida pela segunda cabeça ótica 55 por um amplificador de lock-in (vide Fig. 5) no estágio subsequente de modo que um sinal de fluorescência tivesse saída. Além disso, com relação ao flashing da luz de excitação emitida a partir da primeira ca- beça ótica 51 e a luz de excitação emitida a partir da segunda cabeça ótica 55, as respectivas fases foram ajustadas tal que a diferença de fases entre elas foi de 0,5π rad (90,0°). Como mostrado na Fig. 16, a distância entre o centro da primeira região de detecção de fluorescên- cia 12a e o centro da segunda região de detecção de fluorescência 12b representa a distância de ponto interfluorescente tp. Primeira Concretização Exemplar

[0114] Na primeira concretização exemplar, quando a lente objeti- va OB1 da primeira cabeça ótica 51 e a lente objetiva OB2 da segunda cabeça ótica 55, essas tendo uma abertura numérica (NA) de 0,23 fo- ram usadas. O primeiro dispositivo de detecção de fluorescência cor- responde a FAM usando uma combinação de excitação azul/fluores- cência verde, e o segundo dispositivo de detecção de fluorescência corresponde a ROX usando uma combinação de excitação ver- de/fluorescência vermelha.

[0115] A Fig. 17 mostra uma saída de sinal de fluorescência do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 quando a distân- cia de ponto interfluorescente tp é 4 mm na primeira concretização exemplar. Uma solução aquosa de FAM foi usada para a amostra. Na Fig. 17, o eixo horizontal representa o tempo (×1/10 segundos), e o eixo vertical representa a intensidade de fluorescência (unidade arbi- trária). Em um sinal de fluorescência mostrado na Fig. 17, dois picos aparecem como um conjunto a intervalos de tempo aproximadamente constantes. A amostra repetidamente se move de um modo recíproco no canal 12 (no entanto, a velocidade de movimento foi ajustada tal que o tempo de trânsito da amostra através da primeira região de de- tecção de fluorescência 12a foi cerca de 0,5 segundo). Portanto, como o sinal de fluorescência da Fig. 17, o valor de intensidade de fluores- cência em uma rota externa e o valor de intensidade de fluorescência em uma rota de retorno aparece como um conjunto.

[0116] Segunda Concretização Exemplar

Na segunda concretização exemplar, uma vez que a lente objetiva OB1 da primeira cabeça ótica 51 e a lente objetiva OB2 da segunda cabeça ótica 55, essas tendo uma abertura numérica (NA) de 0,18 foram usadas. Terceira Concretização Exemplar No terceiro concretização exemplar, uma vez que a lente objetiva OB1 da primeira cabeça ótica 51 e a lente objetiva OB2 da segunda cabeça ótica 55, essas tendo uma abertura numérica (NA) de 0,12 foram usadas. Quarta Concretização Exemplar Na quarta concretização exemplar, uma vez que a lente objetiva OB1 da primeira cabeça ótica 51 e a lente objetiva OB2 da segunda cabeça ótica 55, essas tendo uma abertura numérica (NA) de 0,07 foram usadas.

[0117] Na primeira até na quarta concretizações exemplares, a distância de ponto interfluorescente tp foi mudada em 2,5 mm, 2,75 mm, 3 mm, 3,5 mm, 4 mm, 4,5 mm, e 5 mm, e uma saída de sinal de fluorescência do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 foi obtida para cada distância de ponto interfluorescente tp. A fim de avaliar a variação na intensidade de fluorescência obtida de acordo com o movimento recíproco da amostra, o desvio padrão do valor má- ximo da intensidade de fluorescência em cada pico obtido por 50 ocorrências do movimento recíproco da amostra foi calculado como um valor de ruído Nv e usado como um índice.

[0118] A seguinte tabela sumariza a relação entre a distância de ponto interfluorescente tp (mm) e o valor do ruído Nv obtido para a primeira até quarta concretizações exemplares. Tabela 1 tp NA [MM] 0,23 0,18 0,12 0,07 2,5 1,715 1,417 1,162 0,281

2,75 1,204 1,131 0,813 0,162 3 0,794 0,772 0,705 0,161 3,5 0,458 0,454 0,235 0,136 4 0,155 0,175 0,162 0,119 4,5 0,171 0,139 0,172 0,131 5 0,177 0,177 0,128 0,123

[0119] Com relação à primeira concretização exemplar onde a abertura numérica (NA) era 0,23, quando a distância de ponto interflu- orescente tp era de 4 mm a 5 mm, o valor do ruído Nv foi menos do que 0,2, e um bom resultado foi obtido. Com relação à segunda con- cretização exemplar onde a abertura numérica (NA) era 0,18, quando a distância de ponto interfluorescente tp era de 4 mm a 5 mm, o valor do ruído Nv foi menos do que 0,2, e um bom resultado foi obtido. Com relação à terceira concretização exemplar onde a abertura numérica (NA) era 0,12, quando a distância de ponto interfluorescente tp era de 3,5 mm a 5 mm, o valor do ruído Nv foi menos do que 0,3, e um bom resultado foi obtido, e, quando a distância de ponto interfluorescente tp era de 4 mm a 5 mm, o valor do ruído Nv foi menos do que 0,2, e um melhor resultado foi obtido. Com relação à quarta concretização exemplar onde a abertura numérica (NA) era 0,07, quando a distância de ponto interfluorescente tp era 2,5 mm a 5 mm, o valor do ruído Nv foi menos do que 0,3, e um bom resultado foi obtido, e, quando a dis- tância de ponto interfluorescente tp era de 2,75 mm a 5 mm, o valor do ruído Nv foi menos do que 0,2, e um melhor resultado foi obtido. Com base nesses resultados experimentais, os presentes inventores verifi- caram que o valor do ruído Nv começou de 0,2 ou menos, que era um valor adequado quando a distância de ponto interfluorescente tp era de 4 mm ou mais em um caso onde a abertura numérica NA da cabe- ça ótica estava em uma faixa de 0,07 a 0,23.

[0120] A fim de confirmar o efeito das presentes concretizações exemplares, PCR foi realmente realizada nas amostras mostradas na seguinte tabela usando o aparelho de processamento de reação 30 mostrado na Fig. 2, e um sinal de fluorescência foi medido em tempo real. Em uma tentativa de detectar Vero toxina VT1, amostras de PCR foram preparadas usando um kit de KAPA3G Plant PCR, que é uma enzima de PCR oriunda de KAPA Biosystems, do modo mostrado na tabela abaixo. Tabela 2 Agentes Concentração Observações químicos, etc. final enzima 0,1 U/μL KAPA 3G Plant (fabricada por KAPA Biosystems) Iniciador F 720 nM 5’-GGA TAA TTT GTT TGC AGT TGA TGT-3’ (número de se- quência 1) (fabricada por NIHON GENE RESEARCH LABO- RATORIES Inc.) Iniciador R 720 nM 5’-CAA ATC CTG TCA CAT ATA AAT TAT TTC GT-3’ (número de sequência 2) (fabricada por NIHON GENE RESEARCH LABORATORIES Inc.) sonda 240 nM 5’-CCG TAG ATT ATT AAA CCG CCC TTC CTC TGG A-3’ (número de sequência 3) FAM é usado para corante fluores- cente e supressor (“quencher”) é de um tipo escuro (fabricado por NIHON GENE RESEARCH LABORATORIES Inc.) Mg adicional 1,25 mM fixado a KAPA 3G Plant Tampão De acordo com o manual de KAPA 3G Plant, tampão e água + são combinados tal que a concentração do tampão fixado é Água diminuída para 1/2 com relação ao reagente total.

[0121] PCR foi realizada para a primeira concretização exemplar em que a abertura numérica NA da lente objetiva foi ajustada para 0,23. A Fig. 18 mostra um resultado de ampliação por PCR na primeira con- cretização exemplar. Na Fig. 18, o eixo horizontal representa o número de ciclos, e o eixo vertical representa a intensidade de fluorescência (unidade arbitrária). Usando o aparelho de processamento de reação 30 descrito acima, a intensidade de um sinal de fluorescência detec- tada pelo primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 com re- lação ao número de ciclos foi medida. Uma vez que uma espécie na amostra foi ampliada, a intensidade de fluorescência foi aumentada. Como mostrado na Fig. 18, a intensidade de fluorescência nitidamente se eleva por volta de 30 ciclos. Tal elevação acentuada na intensidade de fluorescência indica que a espécie na amostra é ampliada, e pode ser verificada que boa PCR pode ser realizada quando a primeira con- cretização exemplar é usada.

[0122] A seguir, um exemplo comparativo é mostrado. No exemplo comparativo, a distância de ponto interfluorescente tp foi ajustada para 3 mm, e as outras condições foram ajustadas como sendo as mesmas que aquelas na primeira concretização exemplar (vide Fig. 17).

[0123] A Fig. 19 mostra uma saída de sinal de fluorescência do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 50 no exemplo comparativo. Comparado o sinal de fluorescência mostrado na Fig. 19 com o caso da primeira concretização exemplar mostrado na Fig. 17, pode ser verificado que uma ultrapassagem muito grande ocorreu no exemplo comparativo mostrado na Fig. 19.

[0124] A Fig. 20 mostra o resultado de ampliação de PCR no exemplo comparativo. Quando o resultado de ampliação de PCR mos- trado na Fig. 20 é comparado com o caso da primeira concretização exemplar mostrado na Fig. 18, pode ser verificado que a variação na in- tensidade de fluorescência é muito grande no exemplo comparativo mos- trado na Fig. 20. Quando a variação na intensidade de fluorescência é grande como descrita acima, é difícil detectar a elevação da intensidade de fluorescência, e assim a precisão da PCR em tempo real pode dimi- nuir. Da comparação com esse exemplo comparativo, a superioridade das presentes concretizações exemplares foi demonstrada.

[0125] A Fig. 21 é um diagrama para a explicação de um aparelho de processamento de reação 130 de acordo com uma outra concreti- zação da presente invenção. O aparelho de processamento de reação 130 mostrado na Fig. 21 é a diferenciação do aparelho de processa- mento de reação 30 mostrado na Fig. 2 pelo fato de que o aparelho de processamento de reação 130 é provido com três dispositivos de de- tecção de fluorescência (um primeiro dispositivo de detecção de fluo-

rescência 131, um segundo dispositivo de detecção de fluorescência 132, e um terceiro dispositivo de detecção de fluorescência 133). Na Fig. 21, apenas os três dispositivos de detecção de fluorescência e uma parte do vaso de processamento de reação 10 são mostrados, e a ilustração das outras estruturas é omitida.

[0126] O primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 131 é formado para ser capaz de detectar fluorescência a partir de uma amostra contendo FAM como um corante fluorescente. O primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 131 inclui uma primeira ca- beça ótica 134, irradia a primeira região de detecção de fluorescência 12a do canal 12 com uma primeira luz de excitação (luz azul) tendo um comprimento de onda de centro de cerca de 470 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 450 a 490 nm, e detecta primeira fluorescência (luz verde) tendo um comprimento de onda de centro de cerca de 530 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 510 a 550 nm.

[0127] O segundo dispositivo de detecção de fluorescência 132 é formado para ser capaz de detectar fluorescência a partir de uma amostra contendo ROX como um corante fluorescente. O segundo dispositivo de detecção de fluorescência 132 inclui uma segunda ca- beça ótica 135, irradia a segunda região de detecção de fluorescência 12b do canal 12 com a segunda luz de excitação (luz verde) tendo um comprimento de onda de centro de cerca de 530 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 510 a 550 nm, e detecta uma se- gunda fluorescência (luz vermelha) tendo um comprimento de onda de centro de cerca de 610 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 580 a 640 nm.

[0128] O terceiro dispositivo de detecção de fluorescência 133 é formado para ser capaz de detectar fluorescência a partir de uma amostra contendo Cy5 como um corante fluorescente. O terceiro dis-

positivo de detecção de fluorescência 133 inclui uma terceira cabeça ótica 136, irradia a terceira região de detecção de fluorescência 12c do canal 12 com uma terceira luz de excitação (luz vermelha) tendo um comprimento de onda de centro de cerca de 630 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 610 a 650 nm, e detecta terceira fluorescência (luz infravermelha) tendo um comprimento de onda de centro de cerca de 690 nm e uma faixa de comprimento de onda de cerca de 660 a 720 nm.

[0129] O aparelho de processamento de reação 130 de acordo com a presente concretização é caracterizado pela ordem de disposi- ção das cabeças óticas dos três dispositivos de detecção de fluores- cência. Mais especificamente, as cabeças óticas são dispostas na or- dem da segunda cabeça ótica 135 de acordo com o segundo disposi- tivo de detecção de fluorescência 132, a primeira cabeça ótica 134 de acordo com o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 131, e a terceira cabeça ótica 136 de acordo com o terceiro dispositivo de detecção de fluorescência 133 oriundo do lado da região de baixa temperatura. Em outras palavras, a primeira cabeça ótica 134 está disposta no centro, a segunda cabeça ótica 135 está disposta sobre o lado da região de baixa temperatura da primeira cabeça ótica 134, e a terceira cabeça ótica 136 está disposta sobre o lado de região de alta temperatura da primeira cabeça ótica 134. A posição do segundo dis- positivo de detecção de fluorescência 132 e a posição do terceiro dis- positivo de detecção de fluorescência 133 podem ser trocadas. Isto é, a terceira cabeça ótica 136 pode ser disposta no lado da região de baixa temperatura da primeira cabeça ótica 134, e a segunda cabeça ótica 135 pode ser disposta no lado de região de alta temperatura da primeira cabeça ótica 134.

[0130] Como mencionado acima, a interferência entre os disposi- tivos de detecção de fluorescência é causada pela sobreposição da faixa de comprimento de onda de luz de excitação e a faixa de com- primento de onda de fluorescência. Portanto, quando da disposição de uma pluralidade de cabeças óticas lado a lado, uma disposição é evi- tada em que as cabeças óticas cuja faixa de comprimento de onda de luz de excitação e a faixa de comprimento de onda de fluorescência se sobrepõem são adjacentes entre si. Por exemplo, se a segunda cabe- ça ótica 135 estiver disposta no centro e a primeira cabeça ótica 134 e a terceira cabeça ótica 136 forem dispostas nos seus respectivos lados, a faixa de comprimento de onda da segunda luz de excitação de acordo com a segunda cabeça ótica 135 (cerca de 510 a 550 nm) e a faixa de comprimento de onda da primeira luz fluorescente da primeira cabeça ótica 134 (cerca de 510 a 550 nm) se sobrepõem. Além disso, a faixa de comprimento de onda da segunda fluorescência (cerca de 580 a 640 nm) de acordo com a segunda cabeça ótica 135 e a faixa de comprimento de onda da terceira fluorescência (cerca de 610 a 650 nm) de acordo com a terceira cabeça ótica 136 parcialmente se so- brepõem. Nesse caso, interferência é provável ocorrer entre o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 131 e o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 132 e entre o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 132 e o terceiro dispositivo de detecção de fluorescência 133.

[0131] Por outro lado, quando a primeira cabeça ótica 134 está disposta no centro e a segunda cabeça ótica 135 e a terceira cabeça ótica 136 são dispostas sobre os seus respectivos lados como na pre- sente concretização, a segunda cabeça ótica 135 e a terceira cabeça ótica 136 são separadas. Portanto, interferência entre o segundo dis- positivo de detecção de fluorescência 132 e o terceiro dispositivo de detecção de fluorescência 133 pode ser menos provável de ocorrer.

[0132] Alternativamente, a terceira cabeça ótica 136 pode ser dis- posta no centro, e a primeira cabeça ótica 134 e a segunda cabeça ótica 135 podem ser dispostas sobre os seus respectivos lados. Nesse caso também, a primeira cabeça ótica 134 e a segunda cabeça ótica 135 são separadas entre si. Portanto, interferência entre o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 131 e o segundo dispositivo de detecção de fluorescência 132 pode ser menos provável de ocorrer.

[0133] No aparelho de processamento de reação, há casos onde a flutuação da intensidade de fluorescência de acordo com qualquer uma da pluralidade de dispositivos de detecção de fluorescência é usada como um parâmetro para o controle do movimento da amostra (deslocamento e parada da amostra) que repetidamente se move de um modo recíproco no canal. A cabeça ótica do dispositivo de detec- ção de fluorescência usada para tal finalidade é desejavelmente dis- posta em um ponto substancialmente intermediário da região de co- nexão entre a região de alta temperatura e a região de baixa tempera- tura no canal. Se a cabeça ótica usada para o controle do movimento da amostra está disposta mais próxima para qualquer lado da região de alta temperatura ou da região de baixa temperatura da região de conexão do canal do que a outra, o controle da alimentação líquida e parada da alimentação podem ser tornar um problema. Disposição da cabeça ótica usada para o controle do movimento da amostra subs- tancialmente no meio da região de conexão do canal se torna fácil de controlar a alimentação de líquido e parada da amostra. A facilidade de controle também leva a uma melhoria na precisão.

[0134] Por outro lado, em uma amostra que é submetida a um processo de reação tal como PCR, é frequentemente o caso de que um corante fluorescente que excita a amostra com luz de excitação cujos centros de comprimento de luz em cerca de 470 nm, tal como FAM, é adicionado. Pela excitação usando luz tendo um comprimento de onda de cerca de 470 nm, a fluorescência correspondente neces- sariamente inclui luz tendo um comprimento de onda de cerca de 500 a 560 nm. Isso corresponde à especificação do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência 131, e como um resultado, um dispositivo de detecção de fluorescência que tem tais características de luz de ex- citação/comprimento de onda de fluorescência é frequentemente usa- do em um aparelho de processamento de reação.

[0135] Devido às circunstâncias mencionadas cima, é apropriado que a primeira cabeça ótica 134, que está disposta no centro das três cabeças óticas, está disposta em um ponto substancialmente interme- diário C da região de conexão do canal 12. As circunstâncias mencio- nadas acima também aplicam no aparelho de processamento de rea- ção 30 mencionado acima incluindo apenas dois dispositivos de de- tecção de fluorescência. Isto é, no aparelho de processamento de re- ação 30 mostrado na Fig. 2, a primeira cabeça ótica 51 pode ser dis- posta em um ponto substancialmente intermediário C da região de conexão do canal 12.

[0136] Descrito acima é uma explicação com base nas concreti- zações da presente invenção. Pretende-se que essas concretizações sejam apenas ilustrativas, e será óbvio por aqueles versados na téc- nica que várias modificações que constituem elementos e processos poderiam ser desenvolvidos e que tais modificações estão também dentro do escopo da presente invenção. Aplicabilidade Industrial

[0137] A presente invenção é aplicável a uma reação de cadeia de polimerase (PCR). Descrição dos Números de Referência

[0138] 10, vaso de processamento de reação, 12 ca- nal, 14 substrato, 16 película de vedação de canal, 17 pri- meira porta de comunicação, 18 segunda porta de comunicação, 20 amostra, 30, 130 aparelho de processamento de rea- ção, 32 sistema de controle de temperatura, 33 acionador de aquecedor de alta temperatura, 35 acionador de aquecedor de baixa temperatura, 36 CPU, 37 sistema de alimentação de líquido, 39 primeira bomba, 40 segunda bomba, 41 acionador de primeira bomba, 42 acionador de segunda bomba, 43 pri- meiro tubo, 44 segundo tubo, 45, 46 material de embalagem, 50, 131 primeiro dispositivo de detecção de fluorescência, 51, 134 primeira cabeça ótica, 52 primeira fonte de luz de excitação de detecção de fluorescência /módulo detector, 54, 132 se- gundo dispositivo de detecção de fluorescência, 55, 135 se- gunda cabeça ótica, 56 segunda fonte de luz de excitação de detecção de fluorescência /módulo detector, 60 aquecedor de alta temperatura, 62 aquecedor de baixa temperatura, 64 pri- meira fonte de luz de excitação, 65 primeiro multiplexa- dor/desmultiplexador de comprimento de onda, 66 primeiro detec- tor de fluorescência, 67 segundo detector de fluorescência, 68 primeiro amplificador de lock-in, 69 segundo ampli- ficador de lock-in, 70 amplificador IV, 80 filtro de alta passagem, 81 amplificador de inversão/não inversão, 82 filtro de baixa passagem, 133 terceiro dispositivo de detecção de fluorescência, 136 terceira cabeça ótica Texto Livre de Listagem de Sequências

[0139] Número de sequência 1: iniciador de PCR para frente Número de sequência 2: iniciador de PCR reverso Número de sequência 3: Sonda [Listagem de Sequências] NSG-70058WO Sequence Lis- ting.txt

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Aparelho de processamento de reação, caracterizado pelo fato de que compreende: um vaso de processamento de reação em que um canal onde uma amostra se move é formado; um primeiro dispositivo de detecção de fluorescência que irradia uma amostra dentro de um primeiro conjunto de região de de- tecção de fluorescência no canal com uma primeira luz de excitação e também detecta primeira fluorescência produzida a partir da amostra pela irradiação com a primeira luz de excitação; e um segundo dispositivo de detecção de fluorescência que irradia uma amostra dentro de um segundo conjunto de região de de- tecção de fluorescência no canal com a segunda luz de excitação e também detecta segunda fluorescência produzida a partir da amostra pela irradiação com a segunda luz de excitação, em que a faixa de comprimento de onda da primeira fluorescência e a faixa de comprimento de onda da segunda luz de excitação se so- brepõem pelo menos parcialmente, o primeiro flash de luz de excitação e o segundo flash de luz de excitação em uma razão de taxa predeterminada, e dado que a razão de taxa do flashing da primeira luz de ex- citação e o flashing da segunda luz de excitação é d, a diferença de fases entre o flashing da primeira luz de excitação e o flashing da se- gunda luz de excitação é ajustada dentro de uma faixa de 2π(pm − Δpm) (rad) a 2π(pm + Δpm) (rad) ou dentro de uma faixa de 2π[(1 - pm) - Δpm] (rad) a 2π[(1 - pm) + Δpm] (rad), onde pm = d − d2 e Δpm = 0,01 * pm.

2. Aparelho de processamento de reação, caracterizado pelo fato de que compreende: um vaso de processamento de reação em que um canal onde uma amostra se move é formado; um primeiro dispositivo de detecção de fluorescência que irradia uma amostra dentro de um primeiro conjunto de região de de- tecção de fluorescência no canal com uma primeira luz de excitação e também detecta primeira fluorescência produzida a partir da amostra pela irradiação com a primeira luz de excitação; e um segundo dispositivo de detecção de fluorescência que irradia uma amostra dentro de um segundo conjunto de região de de- tecção de fluorescência no canal com a segunda luz de excitação e também detecta segunda fluorescência produzida a partir da amostra pela irradiação com a segunda luz de excitação, em que a faixa de comprimento de onda da primeira fluorescência e a faixa de comprimento de onda da segunda luz de excitação se so- brepõem pelo menos parcialmente, o primeiro flash de luz de excitação e o segundo flash de luz de excitação em uma razão de taxa predeterminada, dado que a razão de taxa do flashing da primeira luz de ex- citação e do flashing da segunda luz de excitação é d, a diferença de fases entre o flashing da primeira luz de excitação e o flashing da se- gunda luz de excitação é ajustado dentro de uma faixa de 2π(pm − Δpm) (rad) a 2π(pm + Δpm) (rad) ou dentro de uma faixa de 2π[(1 - pm) - Δpm] (rad) a 2π[(1 - pm) + Δpm] (rad), onde pm = d − d2 e Δpm = (d − d2)/[k * (No’) / V10], No’ representa ruído de uma saída de sinal do pri- meiro dispositivo de detecção de fluorescência quando a diferença de fases entre o flashing da primeira luz de excitação e o flashing da se- gunda luz de excitação é 0 rad, V10 representa uma saída de sinal do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência quando o segundo dispositivo de detecção de fluorescência não está operando, e k é 20.

3. Aparelho de processamento de reação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que k é de 100/3.

4. Aparelho de processamento de reação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que k é 100.

5. Aparelho de processamento de reação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência inclui uma primeira cabeça ótica que emite a primeira luz de excitação e re- cebe a primeira fluorescência, o segundo dispositivo de detecção de fluorescência inclui uma segunda cabeça ótica que emite a segunda luz de excitação e recebe a segunda fluorescência, e quando os respectivos aparelhos numéricos da primeira cabeça ótica e da segunda cabeça ótica estão em uma faixa de 0,07 a 0,23, a distância entre o centro da primeira região de detecção de flu- orescência e o centro da segunda região de detecção de fluorescência é ajustado para 4 mm ou mais.

6. Aparelho de processamento de reação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o canal inclui uma primeira região de temperatura mantida em uma primeira temperatura, uma segunda região de temperatura mantida em uma segunda temperatura mais alta do que a primeira temperatura, e uma região de conexão que conecta a primeira região de temperatura e a segunda região de temperatura , o movimento de uma amostra dentro do canal é controlado com base em um sinal de fluorescência detectado pelo primeiro dispo- sitivo de detecção de fluorescência, e a primeira região de detecção de fluorescência é ajustada em um ponto substancialmente intermediário da região de conexão.

7. Aparelho de processamento de reação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o primeiro dispositivo de detecção de fluorescência emite uma luz azul como a primeira luz de excitação e detecta luz verde co- mo a primeira fluorescência, e o segundo dispositivo de detecção de fluorescência emite luz verde como a segunda luz de excitação e detecta luz vermelha como a segunda fluorescência.

8. Aparelho de processamento de reação, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: um terceiro dispositivo de detecção de fluorescência que irradia uma amostra dentro de um terceiro conjunto de região de de- tecção de fluorescência no canal com uma terceira luz de excitação e também detecta uma terceira fluorescência produzida a partir da amostra pela irradiação com a terceira luz de excitação, em que o terceiro dispositivo de detecção de fluorescência emite luz vermelha como a terceira luz de excitação e detecta luz infravermelha como a terceira fluorescência.

9. Aparelho de processamento de reação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que uma primeira cabeça ótica do primeiro dispositivo de detecção de fluorescência está dis- posta no centro e uma segunda cabeça ótica do segundo dispositivo de detecção de fluorescência e uma terceira cabeça ótica do terceiro dispositivo de detecção de fluorescência são dispostas sobre os res- pectivos lados da primeira cabeça ótica.

Região de baixa Região de Região de alta temperatura ligação temperatura

Petição 870200114044, de 09/09/2020, pág. 8/99 1/19