KR20030096877A - 핵산증폭반응 산물의 실시간 모니터링 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다수의 미량 시료를 중합효소연쇄반응과 같은 핵산 증폭반응을 수행하면서 반응 중에 생성되는 반응산물의 생성을 실시간으로 모니터링 하기 위한 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치에 관한 것이다. 구체적으로는, 다수의 미량 핵산시료를 담기 위한 반응 용기와 반응용기의 열원이 되는 열전소자로 이루어지는 시료반응부와, 핵산시료의 반응정도를 실시간으로 측정하기 위한 발광소자부 및 수광소자부로 이루어지는 핵산증폭반응산물의 생성을 실시간으로 측정하기 위한 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치에 관한 것이다.

Description

핵산증폭반응 산물의 실시간 모니터링 장치{Apparatus for Real Time Monitoring of Products of Nucleic Acid Amplification Reaction}

본 발명은 미량 시료의 중합효소연쇄반응과 같은 핵산증폭반응을 수행하면서 반응 중에 생성되는 반응산물의 생성을 실시간으로 모니터링하기 위한 장치에 관한 것이다.

근래 중합효소 연쇄반응을 수행하면서 반응산물을 실시간으로 모니터링할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 방법이 개발되었다. 이 방법은 젤 상에서의 전기영동이 필요 없고, 반응사이클 도중에 증폭산물을 확인할 수 있으며, 정량적인 결과를 얻을 수 있는 이점이 있는 방법이다. 이러한 실시간 PCR을 위해 사용되는 장치는 PCR 반응을 위한 온도순환장치(thermal cycler)와 반응물의 실시간 검출을 위한 형광분석기(fluorometer)를 합체한 기기이다. 통상 실시간 PCR의 모니터링은 형광시약을 이용한 형광검출이 사용되는데, 대표적으로는 다음의 방법을 들 수 있다. 1) Interchelating법으로서 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(Interchelator; 예를들면 SYBR Green I, EtBr 등)을 반응계에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로서 중합효소 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 interchelator가 결합하면 형광을 나타내는데 이 형광강도를 검출하여 정량뿐 아니라 증폭 DNA의 융해온도를 측정할 수 있다. 2)TaqMan^TMprobe법으로서 5' 말단을 형광물질(FAM 등)로, 3' 말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드를 첨가한다. 어닐링 조건하에서 TaqMan^TM프로브는 주형 DNA와 특이적으로 혼성화하지만 형광은 quencher에 의해 억제되어 있다. 확장반응시 Taq DNA 중합효소가 가진 5'-> 3'엑소누클레아제 활성에 의해 주형이 분해되고 capture에의한 억제가 해소되어 나타나는 형광을 검출하는 방법이다. 3) Molecular Beacon법으로서 양 말단을 형광물질(FAM, TAMRA 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 2차 구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 반응에 첨가한다. Molecular Beacon probe는 어닐링 조건하에서 주형과 상보적인 영역에 특이적으로 혼성화한다. 이때 형광물질과 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소되어 나타나는 형광을 검출하는 방법이다. 또한 혼성화하지 않았던 Molecular Beacon probe는 2차 구조를 가지고 있어 quencher 물질에 의해 억제되어 있어 형광을 나타내지 않는다.

종래의 실시간(real-time) PCR을 위한 장치는 도6에 도시한 바와 같이 열전소자(5), 시료(7)가 들어있는 반응튜브(6)에 열을 전달하기 위한 블록(3)과 튜브(6) 내부의 시료(7)에 광을 조사하기 위한 조사광원(1) 그리고 시료로부터 발광되는 형광을 수광하기 위한 수광부로(2) 구성되어 있다. 상기 기술의 작동원리는 튜브 안의 핵산시료용액을 반응시키기 위해 열전 소자(5)를 이용하여 냉각 또는 가열 사이클을 반복적으로 실행하면서 매 사이클이 끝날 때 마다 조사광원(1)과 수광부(2)를 작동시켜 시료로부터 발광하는 형광량을 측정하여 반응의 정도를 실시간으로 표시하게 한다. 상기의 실시간 모니터링 장치에서 튜브형태(6)의 반응 용기에 많은 양의 시료, 예를들면, 50㎕이상의 시료를(7) 채우고 반응시키기 위해 열전 소자(5)와 열 전달 블록(3)을 사용하게 되는데 50㎕이상의 시료를 반응시켜야 하기 때문에 반응튜브(6)의 형태가 크고 깊이가 깊어 열전달블록(3)의 사이즈가 필요 이상으로 커지게 된다. 열전달블록의 사이즈가 커지게 되면 블록의 열용량이 크게 되어 열전 소자로부터 열원 전달이 실시간으로 이루어지기 힘들다. 그러므로 반응시간이 길어지는 문제점이 생기게 된다.

또한, 50㎕이상의 시료를 반응시키면서 모니터링해야 하기 때문에 반응튜브(6)의 형태가 크고 깊이가 깊어 조사광원과(1) 수광소자부의(2) 위치가 튜브의 상부에서 거의 수직에 가깝게 작은 예각(Ang2)으로 구성해야 가능하게 된다. 이렇게 작은 예각으로 유지하면 여기광에 대한 표면 반사가 크게 되어 여기광에 대한 차단이 어려워 진다. 또한 시료로부터 발광하는 형광량을 증가시키기 위해 여기광의 세기를 높이게 되면 표면에서 반사되는 반사광의 광량 또한 증가하게 된다. 이러한 반사광을 제거하기 위해 시료중의 핵산분자에 결합된 형광분자로부터 발광하는 형광 신호만 통과하고 반사광은 제거되는 선택적 투과 특성을 갖는 필터를 사용하게 된다. 그러나, 이렇게 반사광을 제거하기 위해 투과특성을 조절하게 되면 시료중의 핵산분자에서 발광하는 형광신호 또한 줄어들게 되어 낮은 신호로 검출되게 되는 문제가 생기게 된다. 따라서, 종래기술은 반사광에 의한 샘플 주위의 잡음이 증가하게 되어 충분한 다이나믹 레인지의 확보가 어려워지므로, 미량 반응시료의 검출이 어렵게 되며, 검출 신호의 명암비를 확보하기 어렵게 되어 선명한 신호를 검출하기 힘들게 되는 문제가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 다수의 미량시료, 예를들면 20㎕ 이하, 바람직하게는 10㎕이하 시료로 핵산증폭반응을 수행하면서 실시간으로 생성산물의 형광을 검출할 수 있는 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 시료중의 형광분자를 여기시키기 위해 조사하는 광원에 의해 발생되는 반사광을 최소화하여 발광신호의 백그라운드 노이즈를 줄여 다이나믹 레인지를 확대함으로써 미량의 반응시료로부터 발생되는 형광의 검출을 가능하게 하며 형광 검출신호의 명암비를 증대시켜 보다 선명한 신호를 검출할 수 있는 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 빠른 반응 시간과 넓은 다이나믹레인지를 확보하여 시료의 반응 정보를 신속하게 처리할 수 있는 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치에 관한 개략도이다.

도 2는 본 발명의 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치의 시료반응부에 관한 개략도이다.

도 3은 본 발명의 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치에서 발광소자부와 수광소자부에 대한 상세도이다.

도 4는 본 발명의 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치에 사용되는 반응용기에 관한 도면이다.

도 5는 본 발명의 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치에서 발광소자부와 수광소자부의 구성 원리에 관한 도이다.

도 6은 종래 기술의 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치에 관한 도이다.

따라서 본 발명은 상기 문제점들을 해소하기 위하여 다수의 미량 생물학적 시료를 담기 위한 다수의 웰을 가지는 반응용기와 반응용기를 가열 및 냉각시키기 위한 열원이 되는 열전소자로 이루어지는 시료반응부, 및 실시간으로 반응시료로부터 발생되는 형광을 측정하기 위한 발광소자부와 수광소자부로 이루어진 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치를 제공한다.

본 발명은 상기에서 다수의 미량 시료를 신속하게 가열 및 냉각시키기 위해 열전소자의 상부에 얇은 평판형 열전달체를 더 구성하고 그 위에 깊이가 낮은 평판형 반응용기와 반응용기를 덮어 시료의 누출을 방지하기 위한 커버를 구성하였다.

그리고 상기 반응용기 내부의 시료로부터 발광하는 형광에 대한 다이나믹 레인지를 확보하기 위해 시료와 커버의 입사면에 대해 수직 편광된 여기광을 부루스터 각(Brewster Angle)(Ang1)으로 조사되도록 함으로써 입사면의 표면으로부터 반사되는 여기광을 최소화하였다.

그리고 시료 반응 용기의 내벽을 흑색과 유사한 광흡수체로 표면처리함으로써 커버를 통과하여 시료로 들어간 여기광을 반사됨이 없이 광흡수층으로 흡수되도록 함으로써 반사광을 제거하였다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참고로 하여 상세히 설명하지만 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치는 도 1의 개략도에 나타낸 바와 같이 다수의 미량시료를 담기 위한 다수의 웰을 가지는 반응용기와 반응용기의 열원이 되는 열전소자로 이루어지는 시료반응부(10), 시료로부터 발생되는 형광을 실시간으로 측정하기 위한 발광소자부(20) 및 수광소자부(30)를 포함하여 구성된다.

시료반응부(10)는 다수의 미량시료(18a, 18b)를 담기 위한 다수의 웰을 구비한 평판형 반응용기(11), 반응용기의 냉각 및 가열 사이클을 반복적으로 실행하기 위한 열전 소자(13), 반응용기내의 시료의 누출을 방지하기 위한 실링커버(12)로 이루어진다. 또한 시료반응부(10)는 선택적으로 반응용기(11)를 열전달체상에 고정시키기 위한 고정커버(15)와 고정단자(16), 및 열전소자와 반응용기사이에 위치하는 평판형 열전달체(14)를 더 포함하여 구성될 수 있다.

반응용기(11)에 시료를 넣고 시료의 누출을 방지하기 위해 실링커버(14)를 덮은 다음, 반응용기를 열전소자(13) 상에 올려 놓고, 투명한 창을(17) 갖는 고정 커버(15)를 덮고 고정커버를 고정시키기 위한 고정 단자(16)로 반응용기와 실링커버가 열전달체상에 고정되게 고정시킨다. 19는 방열판을 나타낸다.

반응용기(11)는 도 4에 도시된 바와 같이 다수의 미량 시료, 즉 20㎕ 이하의 시료를 넣을 수 있도록 다수의 웰로 이루어진 평판형 반응기이고, 각각의 웰 사이에는 용액의 넘침으로 인한 오염을 방지하기 위해서 격리홈이 형성되어 있다. 본 실시예에서는 웰은 4x4 의 배열로 되어 있으나 이는 조절될 수 있다. 바람직한 반응용기로는 본 출원인에 의한 한국특허출원 제2002-16264호에 제시된 것을 들 수 있다.

본 발명에서 실링커버(14)는 투명한 커버이어야 한다. 실링커버가 투명하여야 용기내의 반응시료를 확인할 수 있으며, 반응중 실링커버가 덮혀있는 반응용기로 여기광의 조사 및 시료로부터 발생되는 형광을 수광소자부에서 실시간으로 검출할 수 있다. 본 발명에서 실링커버는 반응용기의 실링을 용이하게 하기 위해서 투명 실리콘, 우레탄, 투명 PVC 또는 이들의 혼합재료로 되어 있는 것이 좋으며, 특히 가볍고, 신축성과 탄력성이 있으며 100도 이상의 내열온도를 갖는 재질로 된 것이 좋다. 본 발명의 실링커버를 반응용기 위에 덮고, 고정커버와 고정단자로 고정할 경우 신축성이 있는 실링커버가 반응용기를 밀폐시키게 되므로 반응시 버블이나, 시료용액이 밖으로 새는 경우가 없어지게 된다.

고정커버(15)와 고정단자(16)는 반응용기와 실링커버를 열전달체(13)상에 고정시키는 역할을 한다. 고정커버(15)는 반응용기로부터 발생되는 형광을 검출하기 위해 투명한 창(17)을 가지고 있으며, 고정단자에 도 1에 도시된 바와 같이 고정되게 된다.

반응용기(11)와 평판형 열 전달체(13)는 열용량을 최소화하고, 열전달률을 최대화하기 위해서 각각의 부피를 최소화하였다. 이렇게 함으로써 반응시 시료의 반응시간을 줄일 수 있게 된다. 본 발명의 실시예에서는 평판형 열 전달체의 두께를 5mm이하, 바람직하게는 2mm이하로 하였으며, 평판형 반응 용기는 1내지 20㎕, 바람직하게는 1 내지 10㎕의 시료를 반응시키기에 알맞은 용량으로 하였으며, 전체두께는 8mm이하, 바람직하게는 5mm이하가 되도록 하였다.

또한, 본 발명에서 발광소자부(20)는 시료반응 용기(11)에 들어있는 핵산시료의 반응 정도를 실시간으로 모니터링 하기 위해 투명창을 갖는 고정커버 상으로 여기광원(21)을 조사시 단일 파장에 가깝게 조사되도록 여기광원 앞에 선택적 투과 필터(22)를 구성하고 선택적 투과 필터(22)를 통과한 비선편광된 광원을 선편광시키기 위해 선편광자(23)를 구성하였다. 상기 선편광자는 상기 투명창(17)의 입사면에 대해 수직하게 편광되는 광원만 입사면을 투과하도록 하는 선편광자를 사용하였다. 따라서, 도 5에 표시된 바와 같이, 표면 반사의 주성분이 되는 입사면(17)에 평행한 반사광(44)의 반사가 최소화되도록 하였다. 본 발명의 실시예에서는 여기광원으로서 LED(light emitting diode)를 사용하였다.

여기광원으로부터 나온 여기광은 커버를 통과하여 시료용액으로 들어가게 된다. 이로부터 발생되는 형광을 수광하기 위해 수광소자부(30)는 발광소자부의 선편광자(23)의 편광방향에 대해 수직한 방향으로 형성되어있는 선편광자(33)를 사용하여 표면으로부터 반사된 여기광의 투과를 최소화하였다. 그리고 형광을 감지하는 형광 감지 소자의(31) 감지면 앞에 형광을 집광하기 위해 렌즈 어레이로(32) 구성된 집광렌즈를 구성하였다. 렌즈 어레이로 구성된 집광렌즈를 통과한 형광은 시료로부터 발광된 형광만 선택적으로 투과하는 필터(34)를 통과하게 됨으로써 더욱더 감도를 높였다. 또한 여기광의 차단을 높이기 위해 발광소자부의 입사각과 수광소자부의 반사각이 입사표면, 즉, 투명창(17)의 굴절율 및 입사층의 굴절률과 관련된 수식 1에 의한 부루스터 각(Brewster Angle)으로 입사 및 반사되게 구성하였다.

i = atan( n'/n )

여기서, n' 은 입사매질의 굴절율, n은 입사층의 굴절율, i는 입사각(Brewster Angle)을 의미한다. 공기의 경우, 입사매질의 굴절율이 1.5이고 입사층의 굴절율이 1.0이기 때문에, 상기식에서 입사각은 56.3도의 부루스터 각을 나타내게 된다.

따라서, 부루스터 각은 입사층에서의 굴절률과 입사매질의 굴절률과 관련되어 수학식 1과 같이 주어지며, 도 5에 나타낸 바와 같이 부루스터 각으로 입사되는 여기광중 입사면에 수직으로 편광되어 있는 빛(41)은 입사매질을 굴절 투과하게 되어(43) 시료용액으로 들어가게 되고, 입사면에 평행되게 선편광되어 있는 빛(42)은 반사각 i'로 반사(44)되게 된다. 이와 같이 입사면에 수직되게 선편광된 여기광(41)을 부루스터 각으로 투명창(17) 표면에 입사시키게 되면 입사면에서의 반사광은 최소화되어 반사광에 의한 노이즈를 최소화할 수 있다.

한편, 입사면에 대해 수직되게 편광되는 여기광(41)은 투명창의 매질을 통과하게 되고 시료용액을 통과하여 반응 용기 내벽에 도달하게 되는데, 이는 다시 반사되어 수광소자부의 형광검출기 속으로 입사되어 백그라운드 노이즈로 작용하게 된다. 그래서 본 발명에서는 상기 반응용기로부터 발생하는 반사광을 최소화하기 위해 반응 용기의 내벽을 불투명한 광흡수체, 예를들면 흑색 안료 등을 함유한 폴리머와 같은 재질로 반응용기 표면을 처리함으로써 반사광을 최소화하였다. 또는 상기 불투명한 광흡수체를 함유한 재질로 된 반응기를 사용하여도 좋다. 여기에 사용되는 폴리머로는 테프론, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리에스테르수지 및 이들의 변성수지 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 흑색계통의 테프론이 사용될 수 있다.

상기와 같이 본 발명에서는 입사되는 여기광으로부터 발생되는 반사광을 최소화하여 미량의 시료로부터 발광되는 형광 신호만을 높은 다이나믹 레인지를 갖는 선명한 신호로 분석 가능하게 하였다.

상기와 같이 구성된 발광소자부와 수광소자부는 매 반응 사이클 마다 작동하여 반응의 정도를 실시간으로 측정하여 나타낼 수 있게 하였으며 동시에 다수의 반응시료를 분석하기 위해 상기의 발광소자부와 수광소자부는 특정 위치(18a)의 시료의 반응 정도를 측정한 후 이동하여 다른 특정 위치의 시료(18b)의 반응 정도를 검출하기 위해 도 1에 도시된 화살표 방향 즉, 좌우로 이동하게 구성하였다. 또한 본 발명에서는 발광소자부를 여러 개 장착하여 동시에 다수의 시료로부터 발생되는 형광을 측정할 수 있게 하였다.

본 발명의 장치는 각종 PCR(Polymerase Chain Reaction), LCR(Ligase ChainReaction), 프로브(Probe) 반응 등 각종 핵산 증폭 반응을 수행하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치는 입사매질에 대해 수직하게 선편광된 단일 파장에 가까운 여기광만을 입사시키도록 하여 입사면에서의 표면 반사를 최소화하였고, 또한 입사매질에 대해 수직하게 선편광된 여기광을 부루스터각으로 입사시킴으로써 여기광의 표면 반사를 최소화하였다. 그리고 반응 용기의 내벽을 광흡수체에 가까운 매질을 함유한 폴리머로 표면처리하여 여기광의 반사를 최소화하였다. 또한 반응용기와 열전달체의 열 용량을 최소화하여 반응 시간이 최소화되게 하였다. 상기와 같이 본 발명에서 여기광의 표면 반사 및 용기 내벽으로부터의 반사를 최소화함으로써 반사광에 의한 백그라운드 노이즈를 최소화하여 더 넓은 다이나믹 레인지를 확보함과 동시에 최대 신호와 최소 신호 차를 넓힘으로써 다수의 미량 시료를 실시간으로 모니터링 가능하게 하였다.

Claims (6)

1. 다수의 미량시료를 담기위한 다수의 웰을 가지는 반응용기와 상기 반응용기를 덮기 위한 투명한 실링커버, 및 반응용기에 열원을 공급하기 위한 열전소자로 이루어지는 시료반응부;

   여기광원 앞에 위치하는 선택적 투과 필터, 필터를 통과한 광을 선편광시키기 위한 선편광자로 이루어지는 발광소자부;

   발광소자부의 선편광자에 수직한 방향으로 되어 있는 선편광자, 선편광자를 통과한 광을 집광하는 집광렌즈, 집광렌즈를 통과한 광을 선택적으로 투과시키는 선택적 투과필터 및 형광감지소자로 이루어지는 수광소자부를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 발광소자부와 수광소자부가 입사면에 대해 부르스터 각으로 위치되는 것을 특징으로 하는 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 반응용기는 10㎕이하의 시료용량을 가지는 것임을 특징으로 하는 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 반응용기는 광흡수체를 함유한 폴리머로 표면처리 되어 있는 것임을 특징으로 하는 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 반응용기의 두께는 8mm 이하인 것을 특징으로 하는 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치.
6. 제 1 항에 있어서, 열전소자 상에 위치하여 반응용기에 열을 전달하는 5mm 이하의 두께를 가지는 열전달체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치.