KR100479782B1 - 생물학적공정모니터링방법및시스템 - Google Patents

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Abstract

열 싸이클링 방법 및 장치가 발표된다. 이 장치는 DNA 폴리메라제 연쇄반응과 같은 수많은 생물학적 절차를 수행하는데 필요한 온도 범위에 걸쳐서 온도가 신속하고 정확하게 조절될 수 있는 샘플챔버를 포함한다. 생물학적 샘플은 유리 마이크로 모세관 튜브에 놓이고 샘플 챔버에 위치된다. 프로그램가능한 제어기가 샘플 챔버 내부의 샘플 온도를 조절한다. DNA 증폭의 모니터링은 싸이클당 한 번 또는 싸이클당 수회 형광에 의해서 탐지된다. 본 발명은 DNA 정량에 강력한 도구인 PCR 형광 모니터링 방법을 제공한다.

Description

생물학적 공정 모니터링 방법 및 시스템
본 발명은 폴리메라제 연쇄반응과 같은 생물학적 공정을 수행하는데 사용되는 장치에 관계한다. 특히 본 발명은 폴리메라제 연쇄반응과 같은 생물학적인 반응을 열싸이클링 및 모니터링하는 방법 및 장치에 관계한다.
다양한 산업, 기술 및 연구 분야에서 비교적 적은 샘플을 신뢰성 있고 재현성 있게 열 싸이클링을 받게할 필요가 있다. 샘플을 반복된 열 싸이클을 받게할 필요성은 특히 생물공학 분야에서 절실하다. 생물공학 분야에서 짧은 기간에 걸쳐서 작은 샘플을 반복적으로 가열 및 냉각할 필요가 자주 발생한다. 정기적으로 수행되는 이러한 생물학적 과정은 주기적 DNA 증폭이다.
열안정성 DNA 폴리메라제를 사용하는 주기적 DNA 증폭은 "폴리메라제 체인 반응"이라고 널리 알려진 프라이머 특이성 DNA의 자동 증폭을 허용한다. 이러한 과정의 자동화는 통상 복수의 용기에 담긴 반응 혼합물의 조절되고 정확한 열 싸이클링을 필요로 한다. 과거에 선호되는 용기는 플라스틱 마이크로 튜브였다.
시간에 대한 필요한 온도구배를 통해서 마이크로 튜브에서 샘플의 열 싸이클링을 하기 위해서 과거에는 프로그램가능한 금속 열 블럭이 사용되었다. 그러나, 짧은 기간에 걸쳐서 넓은 온도 범위에서 열블럭의 온도를 신속하고 정확하게 조절할 수 없으므로 폴리머아제 체인 반응을 수행할 때 열 제어 시스템으로서 열블럭 형태의 장치가 바람직하지 않게 되었다.
게다가, 일반적으로 사용된 마이크로 튜브는 단점이 있다. 마이크로 튜브 재료, 이의 벽두께, 및 마이크로 튜브의 모양은 그속에 담긴 샘플의 신속한 가열 및 냉각에 장애가 된다. 마이크로 튜브의 벽두께 및 플라스틱 재료는 담긴 샘플과 주변 매체간에 절연체로서 작용하여 열에너지 전달을 방해한다. 또한 마이크로튜브의 모양은 열에너지 전달에 어떠한 매체가 사용되는지에 관계없이 작은 표면적을 제시한다. 당해 분야에서 최적이 아닌 모양을 가진 마이크로 튜브의 계속된 사용은 개선된 열전달(일정한 부피의 샘플에 대해서 샘플용기의 표면적을 증가시킴으로써 가능한)의 장점이 여태까지 인식되지 않았음을 표시한다.
게다가, 유체식 전환(또는 기계적 전달)을 하는 수조를 사용하는 장치가 폴리메라제 연쇄반응을 위한 열적 순환기로 사용된다. 수조는 반응에 필요한 시간대 온도 구배를 통해 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물을 싸이클링시키는데 사용되었지만 물의 높은 열질량과 플라스틱 마이크로 튜브의 낮은 열 전도성은 장치의 성능 및 반응의 수율을 크게 제한시켰다.
수조를 사용한 장치는 성능에 있어서 제한적이다. 그 이유는 물의 열질량이 달성될 수 있는 시간에 대한 최대 온도 그래디언트를 크게 한정시키기 때문이다. 또한, 수조 장치는 크기, 물전달 호스의 수, 및 외부 온도 조절 장치로 인하여 매우 복잡하다. 게다가, 수조 장치의 누수를 탐지할 목적으로 피팅의 주기적인 보수 및 조사는 귀찮고 시간 소모적이다. 마지막으로, 샘플 튜브내 온도를 필요한 정확도로 제어하는 것이 수조장치로는 곤란하다.
미국특허 3,616,264(Ray)는 생물학적 샘플을 일정한 온도로 가열 또는 냉각시키기 위해서 공기를 순환시키는 장치를 보여준다. Ray의 장치가 에어 챔버내의 온도를 일정하게 유지시키는데 다소 효과적이지만 폴리메라제 연쇄반응과 같은 생물학적 과정에 필요로 하는 시간대 온도 프로파일에 따라 주기적 방식으로 온도를 신속히 조절할 필요성에 대해서 강조하지 않는다.
미국특허 4,420,679(Howe) 및 4,286,456(Sisti)는 가스 크로마토그래피 오븐을 발표한다. Howe 및 Sisti 특허에서 발표된 장치는 가스 크로마토그래피 과정을 수행하는데 적합하지만 이전에 언급된 장치에 의해 제공되는 것보다 빠른 열적 싸이클링을 제공하지 못한다. 신속한 열적 순환은 많은 과정을 수행하는데 유용하다. Howe 및 Sisti 특허에서 발표된 장치는 이러한 반응을 빠르고 효과적으로 수행하는데는 부적합하다.
특히, 폴리메라제 연쇄반응(PCR)은 분자생물학의 기본이며 임상 실험실에서 중요한 분자공학 기술이다. 이의 유용성 및 대중성에도 불구하고 PCR에 대한 현재의 지식은 그다지 진보하지 못했다. 증폭은 시행착오에 의해 최적화되어야 하며 프로토콜은 맹목적이었다. 당해분야에서 PCR에 대한 제한된 이해는 당해분야의 숙련된 자가 이해없이 강력한 기술을 활용하는데 얼마나 만족하는가에 대한 좋은 예이다.
PCR과 같은 생물학적 공정은 샘플의 온도 순환을 필요로 한다. 공지기술이 온도 순환을 느리게 시킬 뿐만 아니라 PCR의 기본 원리를 무시하며 PCR을 더욱 유용하게 하는데 사용될 수 있는 기본원리를 무시한다. 따라서, PCR을 빠르게 수행하며 일어나는 반응을 분석하는 장치 및 방법을 제공한다면, 특히 이러한 반응이 실시간으로 분석된다면 당해분야에서 큰 진보일 것이다.
도 1 은 본 발명의 개념에 따라 순환적 DNA 증폭에 사용될 수 있는 생물학적 샘플의 열적 싸이클링 장치의 사시도이다.
도 2 는 도 1 장치의 유체 챔버부위의 측면도이다.
도 3 은 도 1 에 도시된 장치의 유체 챔버부위의 내부 평면도이다.
도 4 는 본 발명의 또다른 구체예의 유체 챔버부위의 내부 평면도이다.
도 5 는 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용하여 폴리메라제 연쇄반응에 대한 최적화된 시간대 온도 프로파일을 보여준다.
도 6 은 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용할 때 어닐링 시간이 PCR 특이성 및 수율에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7 은 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용할 때 변성 시간이 PCR 수율에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8a 및 8b 는 본 발명의 또다른 구체예의 사시도와 단면도를 보여준다.
도 8c 는 도 8a 및 8b 에 도시된 구체예에서 생물학적 샘플을 담는 모세관 튜브와 열발생요소의 관계를 나타내는 다이아그램이다.
도 9a 는 4개의 상이한 온도/시간 프로파일(A-D)의 결과와 30싸이클후 증폭 생성물(A-D)을 보여준다.
도 9b 는 본 발명에 의해 사용된 또다른 온도/시간 프로파일의 싸이클을 보여준다.
도 9c-g 는 본 발명에서 사용되는 다른 온도/시간 프로파일의 싸이클을 보여준다.
도 10 은 본 발명에 따른 온도 기울기 제어회로의 블록선도이다.
도 10a 는 생성물 변성온도로 부터 프라이머 어닐링온도로의 온도전이속도가 반응생성물 특이성에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 11 은 본 발명에 따라서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러의 개략도이다.
도 11a 는 도 11 의 장치의 작동을 보여주는 시간대 온도 차트이다.
도 12 는 SYBR Green I 존재에서 헤파티스 B DNA의 증폭동안 시간, 온도 및 형광의 3차원 플롯이다.
도 12a-c 는 3차원 플롯으로도 도시된 시간대 온도, 시간대 형광, 온도대 형광을 2차원 플롯으로 보여주는 차트이다.
도 13 은 인간 β-글로블린 유전자의 536 베이스 쌍 조각에 대한 온도대 형광 투영도이다.
도 14 는 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 형광대 싸이클 횟수 플롯이다.
도 14a 는 상이한 초기 템플레이트 복제물 갯수를 표시하는 수치이다.
도 15 는 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 형광비대 싸이클 횟수 플롯이다.
도 16 은 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 온도대 형광비 플롯이다.
도 17 은 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 온도대 형광비 플롯이다.
도 18a 는 평형 PCR 패러다임을 보여주는 그래프이다.
도 18b 는 동적 PCR 패러다임을 보여주는 그래프이다.
도 18c 는 어닐링 온도 근처에서 상이한 시간/온도 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 19 는 샘플의 연속 모니터링을 위해 구성된 본 발명의 또다른 구체예를 보여준다.
도 19a-d 는 상이한 샘플 용기 구성을 보여준다.
도 19e 는 도 19a-d 의 샘플용기구성이 샘플자체의 온도응답에 미치는 효과를 보여주는 차트이다.
도 19f, g 는 본 발명의 선호되는 샘플 용기의 측부 및 단부도면이다.
도 19h, i 는 샘플의 형광을 탐지할 때 두가지 가능한 직사각 샘플튜브 방향을 보여준다.
도 20 은 DNA 증폭동안 연속 모니터링을 제공하는 본 발명의 또다른 광학적 배치도이다.
도 21 은 샘플용기의 팁에서 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러이다.
도 21a-d 는 생물학적 샘플이 충진되는 복합 플라스틱/유리 용기를 보여준다.
도 22 는 형광 교합 모니터링에 유용한 온도대 시간 세그멘트이다.
도 22a 는 모세관 샘플용기의 측부보다 팁을 관찰함으로써 광 파이핑 효과를 보여주는 차트이다.
도 22b 는 두가지 상이한 크기의 모세관 샘플 튜브에 의한 광파이핑 효과를 보여주는 차트이다.
도 22c 는 에피플루오데센스 탐지를 위한 신속한 온도 싸이클러를 포함하는 구체예에 의해서 수행되는 업무를 보여주는 고급 블록 선도이다.
도 22d 는 형광 피이드백이 반응 매개변수 조절에 사용된 PCR 반응동안 온도대 시간 플롯이다.
도 22e 는 형광 피이드백이 반응 매개변수 조절에 사용된 PCR 반응동안 형광대 시간 플롯이다.
도 23 은 온도와 형광간에 반비례 관계를 보여주는 형광대 시간 플롯이다.
도 24 는 온도와 형광간에 반비례 관계를 보여주는 온도대 시간 플롯이다.
도 25 는 생성물 용융온도까지 초당 0.2도의 온도전이를 하는 동안 수득되는 SYBR Green I 존재하에서 3개의 상이한 PCR 생성물에 대한 형광대 온도 플롯이다.
도 26 은 SYBR Green I의 존재하에서 상이한 농도의 PCR 생성물에 대해서 생성물 어닐링을 보여주는 형광대 시간 플롯이다.
도 27a, b 는 실행모드, 충진모드에서 도 28 에 도시된 구체예의 단면도이다.
도 28 은 샘플용기의 팁에서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러이며 최적화된 탐지를 위해서 2차원으로 형광탐지를 시키는 본 발명의 또다른 구체예이다.
도 29 는 도 28 에 도시된 성분을 포함하는 본 발명 구체예의 외부에 대한 사시도이다.
도 30a-v 는 본 발명의 선호되는 구체예의 전기성분의 상세도이다.
도 31a, b 는 본 발명에 따른 샘플취급 시스템의 사시도 및 단면도이다.
도 32 는 다중 샘플 취급 트레이를 수용하는 또다른 구체예이다.
* 부호 설명
10 ... 열적 싸이클링 장치 11 ... 챔버
12 ... 제어기 13 ... 하우징
14 ... 통기 도어 15 ... 하우징
16 ... 송풍기 장착 보오드 17 ... 솔레노이드 플랫포옴
18 ... 솔레노이드 19 ... 솔레노이드 전기자
20 ... 로드 21 ... 상부단부
22 ... 스프링 23 ... 지지 포스트
24 ... 전송 케이블 25 ... 입력키
26 ... 디스플레이 27 ... 샘플구획
28 ... 송풍기 29 ... 가열구획
30 ... 반응구획 31 ... 가열코일
32 ... 배플 33 ... 배플
34 ... 유체 복귀 구획 35 ... 열전쌍 센서
36 ... 입구 37 ... 출구
39 ... 가열구획 100 ... 장치
102 ... 하우징 104 ... 피트
106 ... 브라켓 108 ... 모세관 튜브
110 ... 발포물 112 ... 램프
112A ... 램프 소켓 112B ... 지지부
114 ... 하우징 입구 116 ... 팬
118 ... 모터 122 ... 모터 샤프트
124 ... 패들 126 ... 챔버입구
128 ... 통기도어 129 ... 힌리
130 ... 하우징 입구 132 ... 솔레노이드
136 ... 경로 200 ... 열전쌍
206 ... 집적회로 212 ... 회로
214 ... 전위차계 218 ... 연산 증폭기
222 ... 회로 224, 226 ... 디지탈 아날로그 전환기
230 ... 전위차계 236, 238, 244 ... 저상
240 ... 합산회로 242, 246 ... 연산증폭기
248 ... 트랜지스터 250 ... 공급원
252, 256 ... 저장 254 ... 회로
260 ... AC 전류원 262 ... 램프
300 ... 온도싸이클너 302 ... 고온 공기원
304 ... 저온공기원 306, 308 ... 나일론 튜브
310 ... 샘플챔버 312 ... 통기구
314 ... 배출팬 316 ... 열전쌍
318 ... 샘플챔버팬 320 ... 모세관 튜브
322 ... 카루셀 324 ... 스테핑 모터
326 ... 구동 모듈 328 ... 형광 활성화 소스
332 ... 유리 334 ... 혼채
336, 340 ... 평철 렌즈 338 ... 간섭 필터
342, 344 ... 실리카 윈도우 348 ... 필터
350 ... 셔터 352 ... 셔터제어부
354 ... 비구면렌즈 356, 358 ... 필터
360A, 360B ... 평철렌즈 362A, 362B ... 광 배증관
364 ... 제어모듈 366A, 366B ... PMT 셔터
400 ... 온도싸이클러 402, 404 ... 샘플홀터
403A ... 모세관 튜브 406, 412 ... 하우징
408 ... 팬 420 ... 비구면 렌즈
424 ... 필터 426 ... 광탐지기
450 ... 샘플용기 451 ... 슬리이브
454 ... 조준렌즈 456A, B ... 필터
458 ... 거울 459 ... 형광계 어셈블리
466A, 466B ... 광탐지기 470 ... 구멍
471 ... 배출 포트 472 ... 경로
474 ... 가열 카트리지 476 ... 배플
480 ... 카루셀 484 ... 기어
490 ... 하우징 494, 488 ... 모터
496, 486 ... 샤프트 498 ... 팬
502 ... 온도 싸이클러 504 ... 모터
506 ... 샤프트 514 ... 샘플용기
518 ... 화살표
본 발명의 목적은 생물학적 샘플의 온도를 정확히 조절하는 장치를 제공하는 것이다.
예정된 시간 대 온도 프로파일에 따라서 생물학적 샘플의 온도를 빠르고 정확하게 변화시키는 열순환 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.
다양한 생물학적 샘플을 빠르게 열순환시키는데 적합한 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.
매우 짧은 기간에 걸쳐 샘플이 큰 온도 그래디언트를 받게 할 수 있는 낮은 열량의 열전달 매체를 가지는 열순환 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.
열전달 매체로서 공기를 사용하여 생물학적 샘플이 신속한 열 순환을 받게 하는 장치 제공도 본 발명의 목적이다.
내부 히터를 사용하여 유체 챔버에 위치된 샘플을 가열하고 열순환에서 적절한 시기에 샘플을 냉각시키기 위해서 주변 유체를 챔버에 이동시켜 샘플을 냉각하는 열순환 장치 제공도 본 발명의 목적이다.
PCR을 빠르게 수행하며 반응을 동시에 모니터링하는 시스템 및 방법 제공도 본 발명의 목적이다.
PCR을 빠르게 수행하며 반응을 연속으로 모니터링하고 반응이 진행되는 동안 반응 매개변수를 조절하는 시스템 및 방법 제공도 본 발명의 목적이다.
합성 핵산 유사체 또는 유도체, 예컨대 펩티드 핵산(PNA)이 형광 화합물로 라벨링될 수 있다면 핵산 프로브는 상기 물질로 대체하는 것도 본 발명의 목적이다.
본 발명은 수많은 절차 또는 공정을 수행하기 위해서 생물학적 샘플을 빠르게 열순환시키는데 특히 적합한 장치이다. 선호되는 예에서 장치는 생물학적 샘플 유지수단을 포함한다. 생물학적 샘플 유지수단 또는 샘플 챔버에는 열에너지 유지를 위한 절연수단과 샘플챔버 내부를 가열하는 수단이 제공된다. 특히 고출력 백열등이 샘플 챔버 내부를 가열하는 수단으로 기능을 한다. 열 절연체는 샘플 챔버 내부에 라이닝 되어서 샘플 챔버내에서 램프에 의해 발생되는 열을 유지하고 절연 수단으로서 작용한다.
샘플 챔버를 신속히 냉각하기 위해서, 장치는 공기를 샘플챔버에 강제 주입하는 수단과 샘플챔버에 주입된 공기를 분산시키는 수단을 포함한다. 고속팬이 공기를 샘플챔버에 주입하며 회전 패들이 공기를 챔버에 분산시키는 작용을 한다. 통기 수단은 샘플 챔버로 부터 공기를 빼내서 불필요한 열을 제거하는 수단이다. 본 발명은 샘플의 가열 및 냉각이 신속하고 균일하게 이루어질 수 있도록 한다.
본 발명의 장치는 필요한 온도대 시간 프로파일을 통해서 장치를 작동시키는 제어수단을 포함한다. 본 발명은 자동화된 폴리메라제 연쇄반응을 수행하는데 특히 적합하다.
본 발명의 제어기는 챔버와 샘플구획내에 위치된 샘플이 폴리메라제 연쇄반응에서 변성, 어닐링 및 신장단계에 해당하는 예정된 온도 싸이클을 받게 한다. 사용시, 본 발명의 장치는 시간 및 온도 측면에서 변성, 어닐링 및 신장단계의 신속한 최적화와 각 단계에서 온도간의 짧아진 기간(램프타임)을 허용한다.
본 발명은 특이성 및 수율을 크게 증가시키면서 공지 기술의 열 순환 장치에 비해서 폴리메라제 연쇄반응의 완결에 필요한 총시간을 단축시킨다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면 DNA 증폭의 연속 형광 모니터링 장치 및 방법을 제공한다. 선호되는 구체예에서 다양한 형광 기술에 의해서 DNA 증폭을 연속 모니터링 하기 위해서 신속한 온도 순환을 제공하는 구조와 광학적 성분이 조합된다. 유리 모세관 샘플 튜브와 복합 플라스틱/유리샘플 튜브가 공기로 부터 신속한 열전달(15분 미만에서 30싸이클)과 반응의 동시적 광학모니터링을 허용한다. 회전체상의 단일 샘플 또는 다중샘플로 부터 형광이 연속으로 수득되며 모든 샘플은 동시에 신속한 열순환을 받는다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면 반응이 진행되는 과정을 모니터링하는데 광학 기술이 사용된다. 선호되는 구체예에서 형광 프로브가 반응혼합물에 첨가된다. 본 발명은 이후에 온도전이동안 적어도 한 번 형광을 모니터링하며, 특히 단일샘플 또는 다중샘플로 부터 온도전이동안 2회이상 형광이 수득된다. 선호되는 구체예에서 샘플을 순차적으로 모니터링 지점에 이동시키기 위해서 회전 카루셀이 포함되며 모든 샘플은 동시에 신속한 열 싸이클링을 받는다. 본 발명은 증폭싸이클마다 한 번 형광을 모니터링 하며 각 증폭싸이클내내 온도, 시간 및 형광을 연속 모니터링한다.
본 발명을 사용하여 온도, 시간 및 형광에 대한 3차원 플롯이 획득될 수 있다. 교합 프로브의 형광대 온도 플롯은 엑소누클레아제 절단의 누적적이고 비가역적인 신호와 인접한 프로브의 온도종속적 가역적 교합을 구별해준다. 교합 프로브는 형광이 온도 종속성 때문에 가수분해 프로브보다 유용하며 생성물 서열의 변화, 예컨대 다형성 및 돌연변이를 탐지하는데 사용될 수 있다. 이중쇄 DNA의 존재하에서 형광하는 염료를 사용하여 생성물 변성, 재어닐링 및 신장이 각 싸이클내에서 추구될 수 있다. 본 발명은 15분이내, 특히 10분이내에 반응의 분석 및 정량을 조합하는 DNA 증폭반응을 신속히 수행하는 장치 및 방법을 제공한다.
본 발명은 열싸이클링을 실시하고 생물학적 반응을 모니터하기 위한 장치와 방법에 관한다. 한 구체예에서, 적어도 한 개의 생물학적 샘플을 신속 열싸이클링처리하는 방법을 기술한다. 상기 방법은 다음과 같이 구성된다.
(a) 제 1 생물학적 샘플은 적어도 제 1 용기에 위치시키고;
(b) 제 1 생물학적 샘플의 온도는 수초이내에 백분도 단위로 표시되는 T2 - T1 수치와 동등하게 제 1 온도(T1)에서 제 2 온도(T2)로 상승시키고,
(c) 제 1 생물학적 샘플은 제 1 유지 기간이하의 기간동안 적어도 제 2 온도만큼 높게 유지하고, 여기서 제 1 유지 기간은 10초 이하고;
(d) 제 1 생물학적 샘플의 온도는 수초이내에 백분도 단위로 표시되는 T2- T1 수치와 동등하게 제 2 온도에서 적어도 제 1 온도로 하강시키고;
(e) 제 1 생물학적 샘플은 제 2 유지 기간이하의 기간동안 적어도 제 1 온도만큼 낮게 유지하고, 여기서 제 1 유지 기간은 20초 이하다.
한 구체예에 따라, 제 1 생물학적 샘플을 적어도 제 1 용기에 위치시키는 단계는 제 1 용기에 제 1 생물학적 샘플의 체적을 위치시키는 단계로 구성되고, 제 1 생물학적 샘플의 체적은 10,000㎕이하다. 대안으로, 제 1 생물학적 샘플을 적어도제 1 용기에 위치시키는 단계는 제 1 생물학적 샘플을 10,000㎕ 이하 체적의 제 1 용기에 위치키는 단계로 구성된다. 한 구체예에서, 제 1 용기는 적어도 부분적으로 유리로부터 만들어진다.
한 구체예에서, 제 1 생물학적 샘플의 온도를 상승시키는 단계는 제 1 생물학적 샘플의 온도를 수초이내에 (T2 - T1)/4 수치와 동등하게 제 1 온도(T1)에서 제 2 온도(T2)로 상승시키는 단계로 구성된다. 대안으로, 제 1 생물학적 샘플의 온도는 수초이내에 (T2 - T1)/10 수치와 동등하게 제 1 온도(T1)에서 제 2 온도(T2)로 상승시킬 수 있다. 한 구체예에서, 제 1 생물학적 샘플의 온도를 상승시키는 단계는 제 1 생물학적 샘플의 온도를 적어도 초당 1℃만큼 높은 제 1 속도로 제 1 온도에서 제 2 온도로 상승시키는 단계로 구성되는데, 여기서 제 1 온도는 제 2 온도와 20℃이상 차이가 난다. 대안으로, 제 1 생물학적 샘플의 온도를 제 1 온도에서 제 2 온도로 상승시키는 단계는 적어도 초당 10℃만큼 높은 제 1 속도로 실시하는데, 여기서 제 1 온도는 제 2 온도와 20℃이상 차이가 난다. 다른 구체예에서, 제 1 생물학적 샘플의 온도를 상승시키는 단계는 제 1 생물학적 샘플의 온도를 적어도 초당 20℃만큼 높은 제 1 속도로 제 1 온도에서 제 2 온도로 상승시키는 단계로 구성된다.
한 구체예에 따라, 적어도 제 1 생물학적 샘플을 신속 열싸이클링 처리하는 방법을 실시하는데, 여기서 제 1 유지기간과 제 2 유지기간은 10초 이하다. 좀더 바람직하게는, 제 1 유지기간과 제 2 유지기간은 1초 이하다. 한 구체예에 따라, 생물학적 샘플을 신속 열싸이클링 처리하는 방법을 실시하는데, 여기서 상기 방법은 복수의 생물학적 샘플을 복수의 용기에 위치시키는 단계를 추가로 포함한다.
한 구체예에 따라, PCR을 실시하고 온도 싸이클링동안 실시간으로 반응을 모니터하기 위한 시스템은 다음과 같이 구성된다:
복수의 PCR 샘플을 유지하기 위한 복수의 샘플 용기, 여기서 상기 샘플 용기는 밀봉 단부 및 다른 단부에 밀봉 마개가 달린 개방 단부를 갖는 1㎖미만의 샘플을 유지하는 광학적으로 투명한 모세관 튜브로 구성되고,
복수의 샘플 용기를 유지하기 위한 수단, 상기 유지 수단은 샘플 용기를 유지하는 회전가능한 카우셀로 구성되고;
복수의 샘플 용기와 뜨거운 유체를 접촉시키는 수단;
복수의 샘플 용기와 차가운 유체를 접촉시키는 수단;
PCR 샘플을 열싸이클링 처리하기 위하여 각각 뜨거운 유체와 차가운 유체를 강제로 밀어내는 수단을 반복적으로 작동하는 수단;
샘플을 광학적으로 여기시켜 샘플이 형광을 방출하도록 하는 수단;
제 1 파장과 제 2 파장에서 여기된 샘플의 형광을 감지하는 수단;
감지된 형광에 따라 적어도 한가지의 반응 매개변수를 결정하고 반응 매개변수를 시각적으로 인식가능한 방식으로 실시간 전시하는 수단.
상기 시스템은 반응이 실시간으로 조절되도록, 반응 매개변수에 따라 반복적으로 작동하는 수단을 조절하는 수단을 추가로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 감지된 형광에 따라 적어도 한가지의 반응 매개변수를 결정하고 반응 매개변수를 시각적으로 인식가능한 방식으로 실시간 전시하는 수단은 변성 온도와 시간, 프라이머 어닐링 온도와 시간, 프로브 어닐링 온도와 시간, 효소 신장 온도와 시간, 싸이클 횟수에서 선택되는 반응 매개변수를 결정하는 수단으로 구성된다.
본 발명의 한 구체예에서, 핵산 증폭을 실시하는 방법을 제시한다. 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
생물학적 샘플을 제공하고;
샘플의 온도를 제 1 온도로 상승시키고;
제 1 기간을 초과하지 않는 일정기간동안 샘플을 냉각시키고, 여기서 제 1 기간은 1초이고;
샘플의 온도를 제 2 온도로 하강시키고, 여기서 제 2 온도는 제 1 온도보다낮고;
제 1 기간이하의 기간동안 샘플을 제 2 온도로 유지시키고;
샘플의 온도를 제 2 온도에서 제 3 온도로 상승시키고, 여기서 제 3 온도는제 2온도보다 높다.
한 구체예에 따라, 핵산 증폭 방법을 실시하는데, 여기서 샘플의 온도를 제 1 온도까지 상승시키는 단계 및 샘플의 온도를 제 2 온도까지 하강시키는 단계는 20분동안 적어도 30회 실시한다. 한 구체예에서, 제 1 기간은 0.2초 이하다.
또한, 본 발명은 샘플을 유지하고 이를 분석용 샘플 용기에 전달하기 위한 카우셀을 제시한다. 한 구체예에서, 상기 카우셀은 상부면, 하부면, 이들 사이의 외부 엣지 신장부를 보유하는 디스크, 상부면에 샘플 수용 포트, 외부 엣지에 샘플용기 포트 및 샘플 수용 포트와 샘플 용기 포트를 연결하는 샘플 통로로 구성되는데, 여기서 상기 샘플 용기 포트와 통로는 샘플 용기를 수용하고 이를 디스크에 고정시키는 형태를 취한다.
카우셀은 샘플 용기 포트에 수용되는 샘플 용기를 추가로 포함할 수 있는데,한 구체예에서 상기 샘플 용기는 표면 영역에 대하여 1mm이상의 체적을 보유하는 모세관 튜브다. 한 구체예에서, 카우셀의 통로는 샘플 용기 포트, 샘플 수용 포트, 상기 상부면에 형성된 적어도 하나의 추가적인 포트를 연결한다. 한 구체예에 따라, 카우셀은 샘플 수용 포트와 샘플 용기 포트간의 통로에 사전결정된 반응 혼합물을 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 샘플 전달 포트 및 용기를 채우기 위한 퍼넬 캡을 보유하는용기로 구성되는 생물학적 샘플의 조종 수단을 제시하는데, 상기 용기는 광학적으로 투명한 재료의 벽으로 구성되고, 상기 벽은 체적을 한정하고, 여기서 외부 용기표면 영역에 대한 용기 체적의 비율은 1mm이하이고, 상기 퍼넬 캡은 제 1 샘플 수용 용기, 제 2 샘플 수용 용기 및 퍼넬 캡의 수용 전달 포트와 용기의 샘플 전달 포트가 정렬되도록 용기에 퍼널 캡을 고정시키는 수단을 보유한다. 샘플 조종 시스템은 퍼넬 캡의 샘플 수용 포트와 마찰성 핏 밀봉 맞물림(frictional fit sealing engagement)을 위한 플러그를 추가로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 용기는 모세관 튜브이고, 바람직하게는 외부 표면 영역에 대한 용기의 체적 비율은 0.25mm이하다.
또한, 본 발명은 유체 샘플을 모세관 샘플 용기에 첨가하는 방법을 제시한다. 상기 방법은 다음과 같이 구성된다:
샘플을 수용하고 샘플 용기를 유지하기 위한 카우셀을 선택하고, 상기 카우셀은 상부면, 하부면, 이들 사이의 외부 엣지 신장부를 보유하는 디스크, 상부면에샘플 수용 포트, 외부 엣지에 샘플 용기 포트, 샘플 수용 포트와 샘플 용기 포트를 연결하는 샘플 통로로 구성되는데, 여기서 상기 샘플 용기 포트와 통로는 샘플 용기를 수용하고 이를 디스크에 고정시키는 형태를 취하고;
유체 샘플을 샘플 수용 포트에 전달하고;
모세관 샘플 용기를 샘플 용기 포트에 위치시키고;
카우셀을 회전시켜 샘플을 모세관 샘플 용기에 전달한다.
한 구체예에서, 상기 방법은 샘플 용기를 샘플 용기 포트에 위치시키기에 앞서 샘플 용기에 사전결정된 혼합물을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 이에 더하여. 사전결정된 혼합물은 유체 샘플을 샘플 수용 포트에 전달하기에 앞서 샘플 통로에 위치시킬 수 있다. 한 구체예에서, 사전결정된 혼합물은 유체 샘플의 분석을 실시하기 위한 반응물로 구성된다.
유체 샘플을 모세관 샘플 용기에 첨가하기 위한 다른 구체예에서, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
샘플을 수용하고 샘플 용기를 유지하기 위한 카우셀을 선택하고, 상기 카우셀은 상부면, 하부면, 이들 사이의 외부 엣지 신장부를 보유하는 디스크, 상부면에샘플 수용 포트, 외부 엣지에 샘플 용기 포트, 샘플 수용 포트와 샘플 용기 포트를 연결하는 샘플 통로로 구성되는데, 여기서 상기 통로는 샘플 수용 포트를 통하여 전달되는 유체 샘플이 이에 대한 편향력이 부재된 샘플 용기 포트로 흘러가는 것을막기 위한 장벽을 포함하고, 상기 샘플 용기 포트와 통로는 샘플 용기를 수용하고 이를 디스크에 고정시키는 형태를 취하고;
유체 샘플을 샘플 수용 포트에 전달하고;
모세관 샘플 용기를 샘플 용기 포트에 위치시키고;
카우셀을 회전시켜 샘플을 모세관 샘플 용기에 전달한다.
통로가 샘플 용기 포트, 샘플 수용 포트, 상기 상부면에 적어도 하나의 추가적인 포트를 연결하는 한 구체예에서, 상기 방법은 카우셀을 회전시키기에 앞서 추가적인 포트를 통하여 2차 유체를 통로에 전달함으로써, 카추셀이 회전하여 유체 샘플과 2차 유체에 편향력을 제공하는 경우에 이들이 모세관 용기로 전달되는 동안혼합되는 단계를 추가로 포함한다. 한 구체예에서, 통로는 추가적인 포토를 통하여 통로로 전달되는 2차 유체에 대한 편향력이 부재된 샘플 용기 포트로 2차 유체 가 흘러가는 것을 예방하는 추가적인 장벽을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 추가 장벽은 제 1 샘플이 도세관 샘플 용기로 전달되는 사전결정된 회전율로 카우셀을 회전시키는 경우에 2차 유체 샘플이 샘플 용기 포트로 흘러가는 것을 예방한다. 이후, 카우셀은 2차 유체가 모세관 용기로 전달되는 좀더 높은 2차 회전율로 회전시킨다.
상기 방법은 모세관 샘플 용기를 샘플 용기 포트에 위치시키기에 앞서 샘플용기에 사전결정된 혼합물을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 한 구체예에서, 카우셀은 카우셀을 회전시키기 위한 스테핑 모터에 결합시킨다. 한 구체예에 따라, 사전결정된 혼합물은 샘플의 분석을 실시하기 위한 반응물로 구성된다.
또한, 본 발명은 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 감지하는 시스템을 제시하는데, 상기 시스템은 다음과 같이 구성된다.
표적 핵산 서열의 인접 영역과 하이브리드를 형성하는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브, 상기 프로브중 하나는 형광 에너지 전달 쌍의 수용 형광단으로 라벨되고, 다른 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨되는데, 여기서 제공 형광단 방출과 수용 형광단 흡수는 25%이하로 중복되고, 수용 형광단은 100,000 M-2cm-1이상의 피크 흡수계수(extinction coefficient)를 갖고, 표적과 두 프로브의 하이드리브형성 직후에 제공 형광단과 수용 형광단은 서로의 15개 뉴클레오티드이내에 존재한다. 한 구체예에 따라, 공명 에너지 전달 쌍은 제공 형광단인 플루레신 및 수용 형광단인 Cy5로 구성된다. 한 구체예에서, 프로브가 표적 핵산서열에 하이브리드되는 경우에, 제공 형광단과 수용 형광단은 서로의 0-5개 뉴클레오티드이내에 존재한다.
도 1 에서 열적 싸이클링 장치(10)는 통기도어(14)를 통해 순환되며 샘플을 수용하는 폐쇄루우프 유체(특히 공기)챔버(11)를 포함한다. 폐쇄 루우프 유체 챔버(11)는 복수의 구획을 포함한다. 장치(10)는 입력키(25) 및 디스플레이(26)를 수단으로 프로그램될 수 있는 제어기(12)를 포함하여서 예정된 기간에 걸쳐서 일련의 온도를 통해 챔버(11)가 싸이클링 받을 수 있다. 챔버(11)의 열적 싸이클링은 여러 절차를 수행하는데 사용되며 특히 샘플 함유 반응 혼합물로 부터 프라이머 특이성 DNA의 증폭에 적합하다.
폐쇄 루우프 유체 챔버(11)는 박스형태로 하우징(13)에 의해 에워싸인다. 필요하다면 송풍기 장착 보오드(16)가 챔버(11)의 직사각형 섹션을 구획하고 거기에 실린더형 하부 하우징(15)을 지탱 및 고정하도록 위치될 수 있다. 혹은, 송풍기(28)의 팬이 챔버 하우징(13)내에 일체로 수용될 수 있다.
송풍기 하우징(15)의 내부는 날개와 샤프트를 포함한다. 송풍기 모터(도시안된)는 송풍기 하우징(15) 외부, 챔버(11) 외부에 위치된다. 이러한 구성에서 날개와 샤프트는 챔버(11)내에서 순환하는 고온 유체에 노출되는 송풍기의 부분이다. 모터에 온도변화를 주며 가열 및 냉각을 겪는 챔버에 모터의 열량을 첨가시키는 챔버내 모터 장착은 단점이 된다. 챔버(11)에서 유체에 노출된 열량의 감소는 예정된 시간대 온도 프로파일을 샘플이 받게하는 기능에 있어서 장치(10)의 전체 성능에 중요하다.
송풍기(28)는 낮은 열량의 프로펠러형 팬 또는 다람쥐장 형태의 팬을 사용하는 "인 라인"형 송풍기이며 팬은 분당 75세제곱피트의 최소 용량을 가진다.
솔레노이드 플랫포옴(17)은 솔레노이드(18)를 고정시킨다. 솔레노이드 전기자(19)는 통기 도어(14)에 부착되며 통기 도어(14) 상하 지점에서 하우징(13)에 회전가능하게 부착되는 로드(20)의 상부단부에 부착된다. 그러므로 로드(20)는 통기 도어(14)를 로드의 종축 주위로 하우징(13)에 대해서 자유 회전시킬 수 있다.
스프링(22)은 지지 포스트(23)에 의해서 한 단부에서 하우징(13)에 부착된다. 스프링(22)의 반대단부는 솔레노이드 전기자(19) 부착부에 인접한 로드(20)의 상부단부(21)에 부착된다. 스프링(22)은 두 부착점 사이에서 인장된다. 그러므로 스프링(22)은 지지포스트(23)쪽으로 상부 단부(21)를 당겨서 통기 도어(14)를 폐쇄 위치로 회전시킨다. 솔레노이드(18)가 활성화될 때 전기자(19)는 로드(20)의 상부단부(21)를 스프링(22) 당김 방향과 반대인 솔레노이드(18) 방향으로 당겨서 통기 도어(14)를 개방시킨다.
제어기(12)는 전송 케이블(24)에 의해 챔버(11)에 전기적으로 부착된다. 케이블(24)은 송풍기 모터(도시안된)와 가열코일(31)에 전력을 공급하기도 한다. 게다가, 제어기(12)는 온도 데이타에 해당하는 신호를 수신하는 열전쌍 센서(35)와 솔레노이드 전기자를 활성화시키는 솔레노이드(18)에 연결된다.
제어기(12)는 챔버(11)내에서 시간의 함수로서 예정된 온도를 달성하도록 가열코일(31), 통기도어(14), 및 송풍기를 조절하도록 프로그램되며 예정된 기간과 챔버온도에서 솔레노이드를 구동하는 릴레이 출력을 활성화시키도록 프로그램될 수 있는 공지형태의 온도 제어기일 수 있다. 도 1-3 의 구체예에서 사용하는 온도 제어기(12)는 Omega Engineering Inc.(Stanford, Connecticut)로 부터 모델번호 CN8600 프로세스 컨트롤러로 구매가능한 Partlow MIC-6000 비율 온도 제어기이다.
도 2 및 도 3 에서, 챔버(11)의 내부는 4개의 주요 구획으로 나뉘어진다. 송풍기 구획(28)은 송풍기 하우징(15) 및 송풍기 장착판(16)으로 구성된다. 송풍기 구획(28) 전체는 팬과 샤프트로 채워진다. 송풍기는 공지된 디자인을 가진다. 송풍기 구획(26)에 위치된 팬은 유체를 입구(36)를 통해 송풍기 구획(28)안으로 들여보내고 출구(37)를 통해 유체를 내보낸다.
유체는 송풍기에 의해 분당 75세제곱 피트 이상의 속도로 흐를 수 있다. 그러나, 본 발명에서 중요한 점은 챔버(11)에 위치된 유체가 송풍기의 팬과 구동 샤프트 부분만을 접촉하며 송풍기 모터 자체는 송풍기 하우징(15)밖에 위치되어서 챔버(11)의 유체와의 접촉이 방지된다는 것이다. 싸이클링 과정동안 가열 또는 냉각되어야 하는 재료의 열량을 최소화하기 위해서 챔버(11) 내부에서 유체와 접촉하는 재료를 최소화 하는 것이 본 발명의 작동속도에 중요하다. 유체에 의해서 가열 또는 냉각되어야 하는 열량을 최소화 함으로써 챔버(11) 내용물을 균일한 온도가 되게 하는데 필요한 응답시간이 크게 단축된다.
출구(37)를 통해 송풍기 구획(28)을 빠져나가는 유체는 가열구획(29)에 들어온다. 가열구획(29)으로 들어온 유체는 가열 코일(31)을 통과한다. 가열 코일(31)이 가열구획(29)에 들어오는 유체보다 뜨거워진다면 유체는 이 구획을 통과할 때 가열된다. 가열코일은 마이크로서포트 주위에 감긴 1000와트(125VAC) 니크롬선 코일이다. 그러나 챔버에 존재하는 유체의 가열에 적합한 모든 가열 유닛이 사용될 수 있다. 도 1-3 의 가열코일은 Johnstone Supply (Portland, Oregon)에 의해 제조된다.
가열코일은 제어기(12)에 포함된 출력 릴레이에 의해 활성화된다. 선호되는 릴레이는 Omega Engineering Inc. (Stanford, Connecticut)에 의해 모델번호 Omega SSR 240 D25로 제조되는 25A, 125VAC 고체상태 릴레이이다.
가열구획(29)을 통과하는 유체는 반응구획(30)에 통과하기 전에 배플(32, 33)에 충돌한다. 배플(32, 33)은 층흐름 유체를 파괴하여 교란을 일으켜서 균질온도에서 반응구획(30)에 도달하도록 유체를 효과적으로 혼합한다.
열전쌍 센서(35)는 반응구획(30)에서 유체온도에 대응하는 전기적 입력신호를 제어기(12)에 제공한다. 열 싸이클링 장치(10)의 작동동안 온도 모니터링은 30-게이지 철-콘스탄탄 "J-형" 열전쌍으로 이루어진다. 제어기는 이 정보를 사용하여 프로그램된 시간대 온도 프로파일에 따라 가열 코일(31)을 제어하고 솔레노이드(18)를 활성화시킨다.
반응구획(30)으로 부터 복귀 공기 구획(34)으로 통과하는 유체는 샘플 구획(27)(점선으로 도시된)을 통과한다.
유체 복귀 구획(34)은 샘플구획(27)에 위치된 샘플로의 열전달 때문에 약간 냉각된다. 유체 복귀 구획(34)의 유체는 입구(36)를 통해 송풍기 구획(28)으로 흐르고 팬의 작용에 의해 출구(37)를 통해 가열구획(39)으로 흐른다. 따라서, 통기 도어(14)가 폐쇄될 때 유체챔버(11)는 각 구획을 통해 폐쇄된 루우프 경로를 따라 유체를 연속으로 재순환시켜서 내용물이 균일한 온도가 되게 하는 폐쇄된 루우프 유체 챔버이다. 공기 챔버(11)에서 공기의 연속 순환은 샘플구획(27)내 샘플이 가능한 빨리 예정된 온도가 되게 하며 이 온도로 유지될 수 있게 한다.
장치(10)가 반응구획(27)에 위치된 재료를 주변유체(공기)온도 이상의 온도로 가능한 빨리 가열해서 냉각시키는데 사용될 때 제어기(12)는 통기 도어(14)를 개방시켜 많은 양의 주변유체를 가열된 유체가 탈출하는 동안 구획(11)에서 범람시키도록 솔레노이드(18)를 작동시키도록 프로그램될 수 있다.
통기도어(14)를 개방시켜 송풍기를 연속으로 활성화시키는 동안 가열 코일(31)을 활성제거하면 주변유체가 복귀 구획(34) 및 송풍기 구획(28)으로 흐른다. 송풍기는 주변유체를 가열구획(29)으로 흐르게 하고 코일(31)에 의해 가열됨이 없이 반응구획(30)으로 직접 통과시킨다. 주변유체는 이후에 샘플구획(27)을 통과하고 통기 도어(14)를 통해 챔버(11) 밖으로 탈출한다. 챔버(11)에 위치된 재료의 최소의 열량과 송풍기 팬의 작용으로 인하여 많은 양의 주변유체가 샘플구획(27)을 통과하고 챔버(11) 밖으로 나온다. 따라서, 반응 구획(27)에 위치된 샘플 또는 재료의 신속한 냉각이 이루어진다.
샘플구획(27)은 샘플을 담은 길쭉한 중공 유리 튜브와 같은 복수의 샘플이 이격된 방향에 쉽게 위치되도록 하는 크기를 가져서 유체가 각 샘플 주위에 균일하게 통과할 수 있다. 필요하다면 샘플구획(27)은 균일한 간격으로 복수의 샘플을 수용하여서 샘플챔버(27)에 샘플충진을 단순화시키도록 구성된 랙 또는 바스켓의 삽입을 허용하는 크기와 모양을 가질 수 있다.
샘플구획(27)으로의 접근은 통기도어(14)를 개방위치까지 회전시켜 이루어진다. 통기도어(14)가 폐쇄위치로 부터 90도만큼 회전된다면 샘플구획(27)에 쉽게 접근할 수 있다. 또한, 폐쇄위치로 부터 통기도어(14)의 90도 회전은 복귀유체 구획(34)을 반응 구획(30)으로 부터 폐쇄시킨다. 따라서 본 발명의 장치(10)가 "냉각"모드에 있을 때 주변유체가 복귀유체구획(34)으로 직접 들어오고 폐쇄 루우프 유체 흐름 경로와 동일한 경로를 따라 송풍기 구획(28), 가열구획(29), 반응구획(30) 및 샘플구획(28)으로 흐른다. 이후에 유체는 공기챔버(11) 밖으로 나와 샘플구획(27)과 복귀 유체 구획(34) 사이에 통기도어(14)의 위치 선정에 의해 공기 복귀 구획(34)으로 복귀하는 것을 방지한다.
따라서, 통기도어(14)는 주변유체를 챔버(11)에 들어오게 할뿐만 아니라 챔버(11)를 통해 유체가 루우프 형태로 재순환 하는 것을 방지할 수 있다. 대신에, 유체는 샘플구획(27)을 통과하고 이후에 챔버(11) 밖으로 나와서 샘플 내용물과 챔버(11)의 신속한 냉각을 돕는다.
본 발명의 장치(10)가 순환적 DNA 증폭에 사용될 때 시간대 온도 프로파일을 통한 반복적 순환이 필요하다. PCR동안 반응 혼합물 함유 샘플은 증폭과정의 변성, 어닐링 및 신장 단계에 대응하는 시간대 온도 프로파일을 통해 약 30회 순환되어야 한다.
본 발명의 장치(10)는 낮은 열량으로 인하여 공지기술에 비해서 단축된 시간대 온도 프로파일을 통해서 샘플을 싸이클링 받게할 수 있다. 도 1-3 구체예의 DNA 증폭응용은 30-60초후에 시간대 온도 프로파일 싸이클을 통과한다(도 5). 공지기술 사용시 동일한 싸이클은 5-10배 더 오래 걸린다. 이러한 낮은 싸이클 시간은 공지기술의 싸이클링에 비해서 PCR의 수율 및 특이성을 증가시켰다.
실시예 1
폴리메라제 연쇄반응이 50ng DNA 템플레이트, 0.5㎃ 데옥시누클레오타이드, 500nM 올리고누클레오타이드 프라이머가 50mM Tris-HCl(25℃에서 pH 8.5), 3.0mM 염화마그네슘, 20mM HCl 및 500㎍/㎖ 소과 혈청 알부민으로 구성된 반응 버퍼에 들어있는 10㎕ 부피에서 수행된다. 내열성 폴리메라제 (Tag 폴리메라제 0/4 유닛 － Stratagene)가 첨가되고 샘플이 8㎝ 길이의 얇은 벽 모세관 튜브(Kimble, Kimax 46485-1)에 담기고 튜브의 양 단부에 공기방울이 존재하도록 단부가 실험실 가스버너로 융합된다.
이후에 모세관 튜브는 1㎜ 두께의 "사전 펀칭된 보오드"로 구성된 홀더(Radio Shack에 의해 제조)에 수직으로 놓인다. 혼합물은 도 5 의 시간대 온도 프로파일에 표시된 시간동안 30회 변성(90-92℃), 어닐링(50-55℃), 및 신장(72-75℃)된다. 10㎕ 탈이온수에 놓이고 열전쌍 모니터(BAT-12, Sensortek)에 연결된 소형 열전쌍(IT-23, Sensortek, Clifton, NJ)을 써서 모세관 튜브의 온도 모니터링이 수행된다. 증폭 생성물은 1.5% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분별된다. 양호한 결과가 수득되었다.
본 발명의 장치(10)가 열전달 매체로서 물대신에 공기를 순환시키기 때문에 빠르게 데워질 수 있는 저열량 매체(공기)를 통해 열전달이 이루어지는 장점이 있다.
샘플냉각 응답시간을 공지 공정에서 사용된 플라스틱 마이크로 튜브대신에 샘플유지에 얇은벽 유리 모세관 튜브를 사용하고 챔버(11) 내부의 재료의 열량을 최소화함으로써 매우 빠르다(도 5). 이러한 응답시간은 시간 및 온도 측면에서 폴리메라제 연쇄반응의 변성, 어닐링 및 신장 단계의 최적화를 허용한다.
게다가, 단축된 "램프"시간이 획득된다. 즉, 샘플의 온도는 한 온도 수준에서 다음 온도 수준이 되게 하는데 필요한 시간이 단축된다. 이것은 완전한 증폭에 필요한 시간을 감소시키고 폴리메라제 연쇄반응 프로토콜내에서 어닐링, 변성 및 효소반응의 특이성 연구를 허용한다.
필요시 샘플구획(27)내에서 적당한 온도 균일성을 달성하는데 배플(32, 33)이 사용될 수 있다. 배플(32, 33)은 반응 구획(30)의 온도 변화를 10℃에서 2℃로 감소시킨다. 필요시 반응구획(30)의 온도변화를 더욱 감소시키기 위해서 추가 배플이 사용될 수 있다. 혹은, 도 4 에 도시된 바와 같이 팬이 가열 코일(31)의 하류, 샘플구획(27)앞에 위치되어서 더욱 균일한 혼합을 할 수 있다.
장치(10)의 사용을 통해 수득된 증폭 생성물은 수동 수조 싸이클링 방법을 통해서 수득된 것과 정량적 및 정성적으로 유사하다. 그러나, 특이성 및 수율에서 향상과 반응 혼합물의 신속한 열제어가 가능하다. 도 6 은 본 발명의 열순환 장치(10)를 사용할 때 도 5 의 시간대 온도 프로파일의 변성 시간 변화가 DNA 증폭 수율에 미치는 효과를 보여준다. 밝은 수직 라인은 변성 온도에서 특정 시간에 대응한다. 수율은 변성시간이 짧을수록 크다. 이러한 신속한 응답은 공지 시스템으로는 불가능하다.
도 7 은 열순환 장치(10) 사용시 도 5 의 시간대 온도 프로파일이 특이성에 미치는 효과를 보여준다(즉, 복수의 유사한 또는 "새도우" 생성물에 대응하는 특이성 생성물 수율). 램프 및 어닐링 시간이 짧을수록 생성물 특이성은 크다. 장치(10)의 신속한 온도 응답은 공지 시스템으로는 불가능한 특이성 및 수율향상을 가져왔다.
장치(10)의 열용량을 감소시킴으로써 본 발명은 폴리메라제 연쇄반응에 필요한 총시간을 크게 감소시킬 수 있다. 추가로, 적은 샘플의 사용은 최대 90%까지 사용되어야 하는 값비싼 시약의 양을 감소시켜서 본 발명을 사용하여 절차를 수행하는 비용을 절감시킨다. 예컨대, 0.25 내지 1.0㎜의 내경을 가진 모세관 튜브(108)가 사용될 수 있다. 어떤 경우에 0.02 내지 1.0㎜의 내경을 가진 모세관 튜브(108)가 사용될 수도 있다.
본 발명의 장치(10)는 임의의 소스로 부터 DNA를 증폭하는데 유용하다.
본 발명의 또다른 구체예가 도 8a-c 에 나타난다. 도 8a 는 사시도이고 도 8b 는 단면도이다. 도 8a-c 에서 열발생 요소는 생물학적 샘플 용기에 인접하여서 생물학적 샘플의 가열 및 냉각 시간을 더 빠르게 한다.
도 8a-c 의 장치는 열순환이 수행되는 속도에 있어서 공지 기술에 비해 귀다한 진보를 제공한다. 즉, 30, 15, 10 내지 5분 이내에 DNA 증폭을 15 또는 30 싸이클 할 수 있다. 게다가, 장치(100)는 더 양호한 열 균일화가 가능하게 한다.
도 8a 에 하우징(102)의 일반 구성이 도시된다. 하우징(102)은 피트(104)상에 놓이며 (도 8b) 구조물을 제자리에 유지시키며 뜨거운 구조물을 주변환경으로 부터 분리시키는 작용을 한다. 도 8a 의 장치(100)에 입력키(25) 및 디스플레이(26)가 포함된다.
도 8b 의 단면도에서 샘플챔버는 브라켓(106)으로 표시된다. 힌지(131)에 의해 하우징(102)에 연결된 뚜껑(138)이 개방되어서 샘플 챔버(106)에 접근할 수 있다. 샘플 챔버(106)는 원통형일 수 있다.
샘플챔버(106)는 흑색 발포물(110)로 라이닝되어서 이의 표면은 광흡수성을 가지며 발포물의 대부분 두께는 절연성을 가진다. 흑색 발포물은 쉽게 구매할 수 있다. 발포물(110)은 통과하는 공기에 의해 쉽게 냉각되는 물질이다. 즉, 이 물질은 낮은 열전도성과 다공성 표면을 가진다.
흑색 다공성 표면은 표면에 입사하는 짧은 파장의 복사에너지를 장파 에너지로, 즉 샘플 챔버에 복사되는 열로 전환한다.
발포물(110)은 샘플챔버를 하우징의 주변공기공간으로 부터 분리시키고 램프(112)에 의해 방출된 빛을 열에너지로 전환시킨다. 발포물(110)은 다른 구조물로 대체될 수 있다. 예컨대, 한면이 흑색 도장된 폴리카보네이트 박판과 같은 흑색 비반사 표면을 가지는 재료가 유리섬유 또는 발포물과 같은 절연재료에 의해 보강될 수 있다. 다양한 기질에 도장될 수 있는 흑색 표면은 입사한 단파장의 복사에너지를 열복사에너지로 전환시키며 절연재료는 샘플챔버를 주변환경으로 부터 절연시킨다.
램프(112)는 500와트 할로겐 램프일 수 있다. 적절한 제어장치가 사용된다면 더 높은 출력의 램프나 복수의 램프가 사용될 수 있다. 램프소켓(112A)은 지지부(112B)에 의해 하우징(102)에 부착된다. 램프(112)는 샘플챔버(106)를 필요한 온도까지 신속하고 균일하게 가열할 수 있다. 니크롬선과 같은 적외선 복사원이 본 발명의 범위내에 사용될 수도 있다.
도 8b 에 2개의 얇은벽 모세관 튜브(108)가 도시된다. 두 개의 얇은벽 모세관 튜브(108)가 도시될지라도 샘플챔버(106)는 여러개의 이러한 튜브를 유지할 수 있다. 얇은벽 모세관 튜브(108)는 공지 장치에 비해서 몇가지 장점을 가지며 생물학적 샘플 유지 수단으로 사용된다.
얇은벽 모세관 튜브(108)는 접근의 용이성을 위해 구멍(140)을 통해 샘플챔버 밖으로 부분 연장될수도 있지만 특정한 용도에 적합한 다른 수많은 유체 유지 구조물과 같이 샘플챔버(106)내에 완전히 내장될 수 있다. 선호되는 얇은벽 모세관 튜브(108)는 약 10㎕의 용량을 가진다. 샘플의 부피는 적게 유지되어야 하며 샘플 유지 구조물의 표면적은 비교적 커야 하며 비교적 적은 열용량을 가져야 한다. 샘플 유지 구조물은 0.1 내지 10,000㎕의 부피를 가질 수 있다.
램프(112)와 절연성 발포물(110)은 함께 얇은벽 모세관 튜브(108)에 담긴 샘플과 샘플챔버(106)내의 공기를 빠르고 균일하게 가열한다. 열전쌍(134)이 샘플 챔버(106)내에 포함되어서 챔버내 온도를 감지하고 샘플챔버내에서 필요한 온도를 유지시키는데 사용된다.
열전쌍(134)은 이의 열응답이 생물학적 샘플과 이를 유지하는 용기의 열응답과 일치하며 구매가능한 것이다. 이러한 열전쌍은 Idaho Labs로 부터 금속 외장 J-형 열전쌍 형태로 구매할 수 있다. 생물학적 샘플과 용기의 열응답과 열전쌍의 열응답의 일치는 PhysiTem로 부터 구매가능한 모델 IT-23 열전쌍과 같은 마이크로 열전쌍을 선택된 용기에 담긴 생물학적 샘플속에 삽입하고 샘플과 열전쌍은 동일한 온도변화를 받게 함으로써 달성된다. 테스트중인 열전쌍은 열전쌍의 열응답이 샘플 및 용기의 열응답에 일치할때까지 변화될 수 있다.
도 8b 의 배열은 기존의 장치보다 더 균일한 샘플의 가열 및 냉각을 제공한다. 기존의 장치에서 샘플을 통한 열전달은 샘플을 통한 대류에 의해 이루어진다. 샘플유지에 어떠한 구조물이 사용되든 샘플의 대류 유도 운동이 적은 생물학적 샘플(10-100㎕)의 온도차에 의해 야기된다.
샘플내의 온도차의 효과는 샘플에 대한 싸이클시간이 감소될 때 더욱 제어하기 곤란하다. 샘플내 불균일 온도의 존재와 샘플내에서 "대류에 의한 혼합"에 대한 의존성은 샘플에 대한 싸이클시간을 증가시키고 생물학적 샘플에 악영향을 준다. 장치(100)는 10㎕ 샘플내의 열차이가 30초 싸이클동안 ±1℃ 미만이 되도록 가열 및 냉각을 할 수 있다.
더욱 균일한 냉각 및 가열을 촉진하기 위해서 얇은벽 모세관 튜브(108)가 램프(112)와 같은 열원으로 부터 다소 떨어지는 것이 좋다. 도 8c 는 도 8a-b 에서 도시된 장치(100)에 배열된 램프(112)와 복수의 얇은벽 모세관 튜브(108)의 평면도이다.
도 8c 에서 램프(112)로 부터 가장 멀리있는 (F로 표시된) 얇은벽 모세관 튜브(108)는 램프에 가장 가까운 (N으로 표시된) 얇은벽 모세관 튜브(108)와 램프(112)간의 거리보다 램프(112)로 부터 40%, 특히 25% 정도 더 멀리 있다. 예컨대 N으로 표시된 거리는 7.3㎝이고 F로 표시된 거리는 8.5㎝이다. 얇은벽 모세관 튜브(108)의 배열은 원형 또는 반원형일 수 있다.
게다가 열발생 요소와 샘플용기간의 거리를 측정하는 점은 열발생 요소의 크기 및 종류에 따라 변한다. 예컨대, 열발생요소는 크기 및 모양이 다양한 복수 램프 또는 전기저항요소일 수 있다. 샘플 챔버벽으로 부터 샘플 용기가 위치되는 거리를 고려하는 것도 중요하다. 구멍(140)(도 8a)은 샘플용기 유지수단으로 작용하지만 다른 구조물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
장치(100)는 모세관 튜브(108)에 담긴 샘플을 빠르고 균일하게 냉각하기도 한다. 샘플챔버(106)를 냉각하기 위해서, 하우징(102) 외부로 부터 공기가 모터(118)에 의해 구동되는 모터 샤프트(122)에 연결된 팬(116)에 의해 하부 하우징 입구(114)를 통해 하우징 내부로 들어온다. 샘플챔버의 신속한 냉각이 필요하므로 모터(118)와 팬(116)의 조합은 충분한 부피의 공기를 샘플챔버(106)에 이동시키고 이후에 공기를 샘플챔버(106) 내부에 분산시킬 수 있어야 한다. 도 8b 에 도시된 모터(118) 및 팬(116) 이외의 장치가 사용될 수 있다.
액체와 다른 가스에 비해서 열전달 매체로서 공기를 사용하는 것은 저렴하며 쉽게 구할 수 있으며 쉽게 혼합되는 장점이 있다. 샘플을 담는 모세관 튜브의 높은 부피대 표면적 비는 열전달 매체로서 공기를 사용하여 신속하게 열을 전달시킨다.
열싸이클중 냉각단계에서 팬(116)의 작용은 주변공기를 하우징(102)으로 들여보내는 것이다. 힌지(129)로 움직이는 통기도어(128)가 제공된다. 통기도어(128)는 솔레노이드(132)에 의해 자동으로 개방되어서 하우징(102)의 내부가 상부 하우징 입구(130)로 부터 밀폐된다. 솔레노이드(132)는 당해분야에 공지된 스테핑 모터로 대체될 수 있다. 스테핑 모터의 사용은 통기 도어(128)를 정확하고 증분적으로 샘플의 가열 및 냉각 필요성에 따라 개폐시킬 수 있게 한다. 당해분야 숙련자는 SC-149 스테핑 모터 제어기(Alpha products)를 사용하여 적절한 제어를 할 수 있다.
상부 샘플챔버 입구(126)의 위치 및 더 큰 단면적과 하부 샘플챔버 입구(120)의 배치로 인하여 실온의 공기가 샘플챔버(106)로 이동되고 분산되고 모터 샤프트(122)에 연결된 패들(124)에 의해 샘플 챔버(106)내에서 혼합된다. 패들(124)은 샘플챔버(106)내에서 분당 250미터, 특히 500미터, 더더욱 1000미터 정도의 공기 속도를 일으키기에 충분한 속도로 회전해야 한다. 고속회전하는 단일 또는 다중패들일 수 있는 패들(124)을 사용하여 공기가 샘플 챔버(106)내로 유입되거나 점선(136)으로 표시된 경로를 따라 챔버(106)로 부터 유출된다. 패들(124)의 회전은 샘플챔버(106)에 들어오는 공기의 혼합을 촉진하고 얇은벽 모세관 튜브(108)의 표면으로 부터 샘플 챔버(106)를 통과하는 공기로 가장 효과적인 열에너지 전달을 보장한다.
솔레노이드(132)가 통기도어(128)를 개방시키도록 활성화될 때 샘플챔버(106)에 유입된 실온의 공기는 샘플챔버 상부입구(126)와 상부 하우징 입구(130)를 통해 배출되어 샘플챔버(106)로 부터 열을 주변대기에 전달한다. 샘플 챔버(106)를 통과하고 분배된 공기의 빠른 혼합은 샘플의 균일하고 신속한 냉각을 가져온다.
실시예 2
도 9a 는 4개의 온도/시간 프로파일(A-D)의 결과와 30싸이클후 증폭 생성물을 보여준다. 프로파일 A와 B는 공지기술의 마이크로 튜브를 사용하는 공지 가열블럭 장치를 사용하여 수득된다. 도 9a 에 도시된 바와 같이 온도간의 전이는 느리며 프로파일 A 및 B에 수많은 비특이성 밴드가 존재한다. 프로파일 B는 각 샘플이 각 온도에서 유지되는 시간을 제한함으로써 비특이성 밴드의 일부가 제거됨을 (프로파일 A에 비해서) 보여주는데, 이것은 시간이 짧을수록 바람직한 결과가 얻어짐을 보여준다.
프로파일 c 및 b는 도 8a-b 의 장치를 사용하여 획득된다. 도 9a 에 도시된 바와 같이 증폭이 특이적이며 수율이 c에서 최대일지라도 (60초 신장) D에서도 적절하다(10초 신장).
인간 유전자 DNA로 부터 β-글로블린의 536bp의 증폭에 최적의 시간 및 온도 역시 결정된다. 변성(93℃) 및 어닐링(55℃)이 1초 미만일 때 증폭 수율 및 생성물 특이성이 최적이다. 더 긴 변성 또는 어닐링 시간으로 잇점이 없다. 77℃에서 더 오랜 신장시간으로 수율이 증가하지만 10-20초보다 긴 신장시간으로는 변화가 거의 없다. 이러한 예기치 못한 결과는 DNA 증폭에 사용된 기존의 장치가 반응의 물리적 및 효소적 조건을 최적화하는데 필요한 조건을 최대화하지 못함을 나타낸다.
추가 정보가 다음으로 부터 획득될 수 있다:
Wittwer, Carl T., Marshall, Bruce C., Reed, Gudrun B., and Cherry, Joshua L., "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis △F50B Locus," 39 Clinical Chemistry 804 (1993) and Wittwer, Carl T., Reed, Gudrun H., and Rire, Kirk M., "Rapid DNA Amplification," THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174 (1994).
도 9a 에 제공된 정보로 부터 샘플은 신속한 열순환이 되며 샘플의 온도는 0.5℃/초 이상의 속도로 증감된다. 폴리메라제 연쇄반응은 수행하는 본 발명의 경우에 온도변화는 30 내지 50℃에 대해서 수행된다. 열 싸이클은 40분후에 30이상의 열싸이클, 특히 20분후에 30회의 열싸이클, 더더욱 10분후에 30회의 열싸이클을 완료시키도록 충분히 빠르게 수행되는 것이 좋다.
장치(100)는 1.0℃/초 이상, 특히 4.0℃/초 이상, 더더욱 10.0℃/초 이상의 속도로 샘플의 온도를 증감시킨다. 주변매체나 샘플용기가 아니라 생물학적 샘플이 지정된 열적 변화를 겪어야 한다. 기존의 장치의 본 발명의 장치만큼 빠르게 열적변화를 수행할 수 없으며 주변매체 및 용기의 온도가 아니라 샘플의 온도를 빠르고 균일하게 변화시키는 문제에 대한 인식이 없었다.
도 9b 에서, 본 발명의 방법은 20℃ 이상, 특히 30℃ 이상, 더더욱 40℃ 이상의 온도범위에 걸쳐서 10℃/초이상, 특히 20℃/초이상의 속도로 열적 싸이클링을 이룰 수 있다. 도 9b 는 생물학적 샘플이 열싸이클을 받을 때 생물학적 샘플의 온도(℃)가 주변공기 또는 용기의 온도가 아님을 보여준다. 도 9b 는 74℃에서 시작되며 D로 표시된 변성온도 92℃에서 2초간 가열되는 PCR 샘플을 보여준다. 샘플은 이후에 A로 표시된 어닐링 온도 55℃까지 2초간 냉각된다. 변성온도와 어닐링온도간의 전이는 4초간 37℃로서 10℃/초 이상의 속도를 제공한다. 이후에 샘플은 도 9b 에서 E로 표시된 신장온도 74℃에서 5초간 데워진다. 변성온도, 어닐링온도 및 신장온도를 통한 샘플의 싸이클링은 30회 반복된다.
도 9c-g 는 본 발명에 의해 달성되는 다른 선호되는 온도/시간 프로파일의 예시적인 싸이클을 보여준다. 당해분야 숙련자는 본 발명에 따라서 지정된 공정을 수행하기 위해서 표시된 온도/시간 프로파일을 변경할 수 있을 것이다. 당해분야 숙련자는 고체 또는 액체르 통해 샘플에 열을 전도하는 공지 장치 및 방법이 여기서 기술된 온도/시간 프로파일을 제시하지 않음을 인식할 것이다. 게다가 크로마토그래피 오븐과 같은 공기 및 전달매체를 활용하는 공지장치 및 방법은 여기서 기술된 온도/시간 프로파일을 제시하지 않음을 알 수 있을 것이다.
가장 빠른 열 싸이클링 시간을 제공하기 위해서 램프(112, 도 8a, 8b)의 정격전력은 2000와트이거나 유사한 출력의 복수의 램프가 포함될 수 있다. 또한 Alpha products(모델번호 SP-127)(Darian, Connecticut)로 부터 구매가능한 하이레벨 프로그램 인터프리터와 클록과 함께 8052 마이크로컨트롤러를 사용하는 A-버스 컨트롤러/획득 시스템과 관련하여 도 10 에 나타난 온도 기울기 제어회로를 포함시키는 것이 선호된다. 마이크로컨트롤러에 사용되는 프로그램 코드는 프로그램 코드 부록에 포함된다. 부록에 제공된 프로그램 코드는 마이크로컨트롤러에 다운로드를 위한 BASIC52 파일이며 열싸이클링동안 예시적인 온도 기울기 제어를 한다. 2000와트 열 발생장치와 제어기는 20℃/초의 속도가 달성될 수 있게 한다.
도 10 에 도시된 온도 기울기 제어회로는 샘플온도응답에 일치되는 열전쌍(200)을 포함한다. 열전쌍(200)은 당해분야에서 AD595로 알려진 집적회로(206)에 연결되며, 이의 출력은 100㎐의 컷오프 주파수로 4차 저역 필터(208)와 출력이 온도의 디지탈 표시에 사용되는 12비트 아날로그-디지탈 전환기(210)에 전달된다.
회로(206)의 출력은 측정된 기울기 회로(212)에도 전달된다. 측정된 기울기 회로(212)는 353 연산 증폭기(218), 100㏀ 전위차계(214), 1㏁ 전위차계(230), 22㎌ 축전기를 포함한다. 측정된 기울기 회로(212)는 353 연산 증폭기(246)의 역전 입력에 신호를 출력한다.
기울기 설정 회로(222)는 양의 기울기 설정 디지탈-아날로그 전환기(226)와 음의 기울기 설정 디지탈-아날로그 전환기(224)를 포함한다. 디지탈-아날로그 전환기(224, 226)는 당해분야에서 DA147로 알려진 8비트 디지탈-아날로그 전환기이다. 기울기 설정 회로는 퍼스널 컴퓨터와 같은 또다른 디지탈 장치(도 10 에 도시안된)로 부터의 지령을 수신할 수 있다. 기울기 설정회로(228)의 출력은 합산 회로(240)에 전송된다.
합산회로(240)는 100㏀ 저항기(236, 238, 244)와 353 연산증폭기(242)를 포함한다. 합산회로(240)의 출력은 연산증폭기(246)의 비-역전 입력에 전달되고 필요한 온도변화 기울기를 나타낸다. 연산증폭기(246)의 출력은 전력전환회로(262)내에 포함된 트랜지스터(248)에 제공된다.
전력전환회로(262)는 트랜지스터(248)에 전류를 제공하는 5VDC 공급원(250)을 포함한다. 트랜지스터(248)는 330Ω 저항과 같은 저항(252)을 수단으로 3010회로(254)에 연결된 이미터를 가진다. 3010 회로(254)는 180Ω 저항과 같은 저항(256)과 직렬 연결된 출력을 포함한다. 트라이액(258)이 AC 전류원(260)으로 부터 램프(262) 또는 다른 열발생장치에 전달되는 전류 제어에 사용된다.
다른 시스템 성분과 함께 도 10 에 도시된 온도기울기 제어회로는 생물학적 샘플을 30℃의 온도 범위에서 20℃/초, 특히 40℃의 온도 범위에서 20℃/초로 열 싸이클링을 받게 하며 전체 생물학적 샘플의 균일성이 유지되게 한다.
여기서 발표된 장치는 다음과 같은 응용분야에 사용될 수 있다: 폴리메라제 연쇄 반응; 싸이클 시이퀀싱; 리가아제 연쇄반응과 같은 다른 증폭 프로토콜. 본 발명은 샘플 챔버내에 위치된 샘플의 온도를 정확히 제어하는 장치를 제공하여서 예정된 시간대 온도 프로파일에 따라서 챔버에 위치된 샘플온도를 빠르고 정확하게 변화시킨다.
앞서 기술된 바와 같이 폴리메라제 연쇄 반응은 신속히 수행될 수 있다. 기술된 장치 및 방법을 사용하여 필요한 횟수의 온도 싸이클이 공지 기술에서 보다 빠르게, 예컨대 15분 미만에 완결될 수 있다. 변성시간과 어닐링 시간을 최소화함으로써 신속히 싸이클링된 증폭의 특이성 및 수율이 이전보다 개선된다. 게다가, 신속한 열전달 촉진 뿐만 아니라 광학적으로 투명한 모세관 튜브의 사용은 본 발명에 따라서 DNA 증폭의 연속 형광 모니터링을 가능하게 한다.
형광 프로브는 DNA 증폭을 탐지 및 모니터링 하는데 사용될 수 있다. 유용한 프로브는 이중쇄 DNA 특이성 염료와 서열특이성 프로브를 포함한다. 삽입물질 에티듐 브로마이드를 사용하여 모세관튜브 또는 마이크로 튜브에서 증폭후 UV활성화된 적색 형광이 증가한다. 서열 특이성 형광 탐지는 올리고누클레오타이드 교합 프로브를 사용하여 가능하다. 예컨대, 이중-라벨링된 형광제/로오다민 프로브는 폴리메라제 신장동안 5'-엑소누클레아제 활성에 의해 절단되고 형광단을 분리하여 형광제/로오다민 형광비를 증가시킬 수 있다.
온도 싸이클링 완료후 생성물 축적을 모니터링하여 싸이클마다 한 번 또는 각 싸이클내에서 연속으로 형광이 측정될 수 있다. 본 발명과 대비하여 이전의 이용가능한 방법은 느리게 싸이클링이 이루어지며 온도 변화동안 형광의 획득 및 분석을 제시하지 않는다.
본 발명은 초기 템플레이트 복제물 갯수의 정량화를 위해 싸이클마다 모니터링을 할 수 있다. 이러한 모니터링을 수행하기 위해서 각 싸이클의 신장 또는 조합된 어닐링/신장 단계동안 형광이 획득되고 생성물 농도와 관련된다. 삽입물질 YO-PRO-1을 사용하여 헤파티스 C RNA 정량분석이 당해분야에 공지된다. 형광 삽입물질의 존재하에서 PCR에 의한 헤파티스 C 바이러스 RNA의 균질 정량분석(Anal. Biochem. 229:207-213, Ishiguro, T., J. Saitch, H. Yawata, H. Yamagishi, S. Iwasaki, Y. Mitoma, 1995)참조. 본 발명 이전에는 각 싸이클내에서 연속 형광 모니터링이 효과적이고 정확하게 수행되지 못했다.
연속 형광 모니터링을 제공하는 2-칼라 형광 광학과 집적된 신속한 온도 싸이클러가 발표된다. DNA 증폭에 선호되는 3개의 형광 기술이 본 발명의 특수예로서 제공된다. 당해분야 숙련자는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 형광기술에서 에티듐 브로마이드의 사용에 익숙할 것이다. SYBR Green I(Molecular Probes of Eugene, Oregon)이 이중쇄 특이성 염료로 사용된다. 본 발명에 따라서 시간, 온도 및 형광이 200msec마다 획득된다. 이러한 데이타는 기존의 장치 및 방법으로는 얻을 수 없는 신속한 싸이클링동안 생성물 변성, 재어닐링 및 신장의 세부사항을 나타낸다.
DNA 증폭을 겪고 있는 다중샘플의 싸이클마다 한 번 모니터링은 강력한 정량도구이다. 한 싸이클내에서 연속 모니터링은 프로브 형광의 성질을 식별하여 공지기술에서는 얻을 수 없는 DNA 증폭 메카니즘에 대한 직관을 제공하며 증폭생성물과 돌연변이를 식별하기 위해서 PCR 생성물과 프로브 용융 곡선을 평가한다.
도 11 에서, 형광을 탐지하는 온도 싸이클러(300)가 개략적으로 도시된다. 고온 공기원(302)은 1600와트 가열코일과 팬을 포함한 시판장치이다. 냉각 공기원(304)은 Dayton(Niles, Illinois)으로 부터 모델번호 4C006B로 구매가능한 2200rpm 송풍기이다. 냉각 공기원(304)은 주변공기를 보통 제공하지만 주변공기보다 낮은 온도의 유체를 제공하는 수단을 활용할 수도 있다. 도 11 에서, 2.5㎝ 직경의 주름진 흑색 나일론 튜브(306, 308)가 고온 공기원(302)과 냉각 공기원(304)을 샘플챔버(310)에 연결시키는데 사용된다. 통기구(312)와 방출팬(314)을 샘플챔버(310) 밖으로 공기를 제거한다. 샘플챔버(310)의 내부는 외부의 빛으로 부터 차단된다.
샘플챔버(310)내의 샘플온도는 Idaho Technology(Idaho Falls, Idaho)로 부터 모델번호 1844로 구매가능하며 모세관 튜브에 담긴 샘플의 열응답에 일치되는 관형 금속외장 열전쌍(316)에 의해 모니터링된다. 샘플챔버(310)내의 온도 균일성은 중앙 샘플챔버팬(318)에 의해 달성된다. 샘플 챔버팬은 Idaho Technology로 부터 모델번호 1862로 구매가능한 1.7×11㎝ 팬날개와 샘플챔버(310)내에서 800 내지 1000m/분의 공기속도를 일으키는 모터(Idaho Technology, 모델번호 1861)를 포함한다.
샘플챔버(310)내에 모세관 튜브(320)에 담긴 복수의 샘플이 회전가능한 카루셀(322)에 수직으로 위치된다. 카루셀(322)은 14㎝ 직경을 가지며 마이크로스테핑 구동 모듈(326)에 의해 제어되는 400스텝/회전 스테핑 모터(324)에 회전된다. 스테핑 모터(324)는 New England Affiliated Technologies(Lawrence, Massachusetts)로 부터 모델번호 2198364로 구매가능하며 마이크로스테핑 구동 모듈(326)은 New England Affiliated Technologies로 부터 모델번호 MDM7로 구매가능한 것으로서, 카루셀(322) 회전당 12,800 스텝을 제공한다.
도 11 에서, 형광 활성화 소스(328)가 제공된다. 형광 활성화 소스(328)는 타원형 반사기로 촛점이 잡히는 75와트 크세논 아아크 소스이며, Photon Technology International (South Brunswick, New Jersey)로 부터 모델번호 A1010으로 f/2.5 타원형 반사기와 함께 구매할 수 있다. 혹은, 광방출 다이오드가 사용될 수 있다. 형광 활성화 소스(328)에 의해 방출된 빛은 Rolyn(Covina, California)로 부터 모델번호 75.0125로 구매가능한 홍채(334)를 사용하여 2㎜까지 촛점이 잡힌다. 형광 활성화 소스(328)로 부터 방출된 빛은 Rolyn으로 부터 모델번호 60.4400으로 구매가능한 저온 거울(330)상에 입사하고 Rolyn으로 부터 모델번호 65.3130으로 구매가능한 열흡수 유리(332)를 통과한다. Rolyn으로 부터 모델번호 10.0260으로 구매가능한 평철 렌즈(336)를 통해 조준된 후 Omega Optical (Brattleboro, Vermont)로 부터 모델번호 470RDF40으로 구매가능한 450-490㎚ 대역 간섭 필터(338), Rolyn으로 부터 모델번호 10.0260으로 구매가능한 평철 촛점 렌즈(340), Omega로 부터 구매가능한 1㎜ 실리카 창(342)을 통과한다. 기술된 활성화 경로를 사용하여 모세관 샘플 튜브(320A)의 5-7㎜ 섹션이 조사된다.
샘플(320A)로 부터 방출된 형광을 수집하기 위한 수집 경로가 도 11 을 참조로 기술될 것이다. 수집 경로의 광학성분은 다른 광학 성분상의 응축을 막기 위해서도 포함되는 1㎜ 실리카 유리(344)를 포함한다. 방출된 형광을 2×10㎜ 슬릿(348)에 촛점을 잡게 하며 Rolyn으로 부터 모델번호 17.1175로 구매가능한 비구면 렌즈(346A, 346B)가 대향하며, 슬릿은 공간 필터로서 기능을 하는 X-선 필름을 절단하여 제조된다. 공간 필터(348) 이후에 방출된 형광은 전자 셔터 제어기(352)를 통해 작동하는 35㎜ 전자 셔터에 입사한다. 35㎜ 전자셔터(350)는 Uniblitz 셔터 모델번호 VS35이며 전자 셔터 제어기(352)는 드라이버 모델번호 D122로서, 둘다 Vincent Associates (Rochester, New York)으로 부터 구매가능하다. Rolyn 모델번호 17.1175 조준 비구면 렌즈(354)가 제공된다.
SYBR Green I 방출의 탐지가 요구될 때 필터(356)가 포함된다. 필터(356)는 Omega로 부터 모델 550RDF60으로 구매가능한 520-580㎚ 대역 통과 필터이며 단색 습득을 위해 사용된다. 다른 방출의 탐지를 위해 2색 필터(358)과 파장 필터(358A, 358B)의 조합이 필터블럭에 사용된다. 형광제와 로오다민 방출의 분리를 위해 Omega로 부터 모델 560 DRLP로 구매가능한 560㎚ 통과 2색 필터와 Omega로 부터 모델 535DF30으로 구매가능한 520-550㎚ 대역 통과 필터(358A)(형광제 탐지용), Omega 모델 660DF40으로 구매가능한 580-620㎚ 대역 통과 필터(358B)(로오다민 탐지용)로 구성된 2색 필터(358)이 사용된다. 형광제와 Cy5 방출의 분리를 위해 2색 필터(358)는 Omega 모델 590 DRLP로 구매가능한 590㎚ 대역 통과 2색 필터와 Omega 모델 535DF30으로 구매가능한 520-550㎚ 대역 통과 필터(358A)(형광제 탐지용)와 Omega 모델 670DF20으로 구매가능한 660-680㎚ 대역 통과 필터(358B)(Cy5 탐지용)가 사용된다.
도 11 에서, 필터(358) 이후에 형광은 Edmund(Barrington, New Jersey)으로 부터 모델 32970으로 구매가능한 두 개의 평철 렌즈(360A, 360B)를 통해 광전 배중관(362A, 362B)상에 촛점이 잡힌다. 광전 배증관(362A, 362B)은 Hamamatsu (Middlesex, New Jersey)로 부터 모델 R928로 구매가능하며 Photon Technology International으로 부터 모델 714로 구매가능한 하우징에 수용된다. PMT 및 데이타 획득제어 모듈(364)이 또한 제공된다. 당해분야에 공지된 수동 PMT 셔터(366A, 366B)가 제공된다.
앞서 기술된 광학 성분은 5㎝ 직경을 가지며 Rolyn으로 부터 모델 90.0190으로 구매가능한 5㎝ 범용 렌즈 장착부에 장착된다. 필요한 구조성분은 black Delrin으로 부터 기계가공된다.
도 11 에 도시된 장치를 사용하여 50mM Tris, pH 8.5(25℃), 3mM MgCl2, 500㎍/㎖ 소과 혈청 알부민, 0.5μM 프라이머, 0.5mM 데옥시누클레오사이드 트리포스페이트, 5㎕ 샘플당 Tag 폴리메라제 0.2U에서 DNA 증폭이 수행된다. 인체 유전자 DNA(1분간 끓여서 변성된) 또는 정제된 증폭 생성물이 DNA 템플레이트로 사용된다. 정제된 증폭 생성물은 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 수득된다[Guide to Molecular Cloning Techniques (Methods in Enzymology, Vol. 152), S.L. Berger, A.R. Kimmel (Eds.), 대규모 및 소규모 페놀 추출 및 핵산의 침전(33-48)(Wallace, D.M. 1997) 참조]. 이어서, Centricon 30 마이크로농축기(Amicon, Danvers, MA로 부터 구매가능)를 통해 반복된 세척에 의해 프라이머가 제거된다. 템플레이트 농도는 260㎚에서 흡수에 의해 결정된다. 템플레이트의 A260/A280 비는 1.7 이상이다.
프라이머는 표준 포스포아미다이트 화학, 예컨대 Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, NJ)에 의해 합성된다. 헤파티스 B 표면 항원 유전자의 180 염기쌍 조각은 프라이머 5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:1)와 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO:2) (Genbank sequence HVHEPB)를 사용하여 증폭된다. SYBR Green I은 몰레큘라 프로브(Eugene, Oregon)으로 부터 수득된다. β-액틴 프라이머와 형광제/로오다민 이중 프로브는 Perkin Elmer (Foster City, California)로 부터 모델 N808-0230으로 획득된다. 인체 β-글로블린 프라이머 RS 42/KM29(536 염기쌍) 및 PC03/PC04(110 염기쌍)은 고온공기를 사용한 모세관 튜브에서 자동화된 PCR, Nucl. Acids. Res. 17:4353-4357, (Wittwer, C.T., G.C. Fillmore, D.R. Hillyard)에 기술된다.
단일 라벨링된 프로브5'-CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA-fluorescein -3' (SEQ ID NO:3)와 5'-Cy5-AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-phosphate-3' (SEQ ID NO:4)은 형광제 포스포아미다이트(Glen Research (Sterling, Virginia)로 부터 모델 10-1963으로 구매가능한), Cy5 포스포아미다이트(Pharmacia로 부터 모델 27-1801-02로 구매가능)과 화학적 인산화 작용제(Glen Research로 부터 모델 10-1900)으로 구매가능)를 사용하여 합성된다. 이러한 인접한 프로브는 동일한 DNA쇄상에서 PC03/PC04 β-글로블린 프라이머쌍에 내부적으로 교합하고 한 개의 염기쌍만큼 분리된다. 프로브는 역상 C-18 HPLC에 의해 정제되고 균일성은 폴리아크릴아미드 전기영동 및 흡수성(A260과 형광단의 최대 흡수)에 의해 검사된다. 교합 프로브(β-액틴 및 β-글로블린)가 0.2μM로 각각 사용된다.
5㎕의 증폭샘플이 모세관 튜브(230)에 충진된다. 모세관 샘플 튜브는 Idaho Technology로 부터 모델 1705로 구매가능한 1.02㎜ 외경과 0.56㎜ 내경을 가진 튜브이다. 충진후 모세관 샘플 튜브는 부탄 화염으로 밀폐된다. 모세관 샘플 튜브는 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(300)의 카루셀(322)에 들어가기 이전에 광학등급 메탄올로 세정된다.
도 11 에 도시된 성분의 제어는 LabView(National Instruments, Austin, Texas)으로 알려진 그래픽 프로그램 언어와 120㎒의 클록속도로 작동하는 80486 Intel 마이크로프로세서를 사용하는 PC상용성 컴퓨터(366)에서 12-비트 다기능 입/출력 카드(National Instruments, AT-MIO-E2)를 사용하여 이루어진다. 입/출력 카드상의 아날로그 출력 채널은 민감도 제어, 즉 각 광전 배증관(362A, B)의 PMT 전압을 제어하는데 사용된다. 입/출력 카드상의 아날로그 입력채널은 광전 배증관(362A, B)으로 부터 신호를 수신한다. PC상용성 컴퓨터는 입/출력 카드를 통해서 카루셀의 운동 방향, 위치 및 속도를 제어한다. 다중 모세관 샘플튜브가 충진될 때 카루셀(322)은 100msec동안 모니터링 위치에서 각 모세관 샘플 튜브(320)를 순차적으로 위치선정한다. 단일 모세관 샘플튜브(320A)의 연속 모니터링 동안 데이타는 200mses마다 평균되고 습득한다. 온도, 시간 및 형광 2채널은 싸이클 횟수대 형광과 온도대 형광 플롯으로 표시된다. 카루셀은 최대 형광 및 신호가 습득되는 곳에 위치되어야 한다. 단일 모세관 샘플 튜브(320A)가 분석될 때 신호는 200msec마다 습득되며 광전 배증관(364)상의 적분시간상수는 50msec로 설정된다. 다중 광전배증관(366A, B)이 사용될 때 시간상수는 0.5msec로 설정되고 각 모세관 샘플튜브(320)가 각 채널에 최대 형광을 제공하는 정확한 위치를 선정하기 위해서 카루셀이 다시 회전한다. 최대 형광이 수득되는 지점에 모세관 샘플 튜브(320A)가 위치선정된 이후에 각 PMT(362A, B)의 민감도가 조절되고 모든 모세관 샘플튜브(320)의 위치를 계산 및 선정하기 위해서 카루셀이 다시 한 번 회전한다. 100msec동안 모니터링 위치에서 카루셀(322)상에 각 모세관 샘플 튜브(320)를 위치시킴으로써 신장동안 각 증폭싸이클마다 신호가 수득된다. Systronics(Salt Lake City, Utah)로부터 BCI51로 구매가능한 8051 크로스 컴파일러와 Dallas development system(Systronics로 부터 DPB2로 구매가능한)을 사용하여 Idaho Technology로 부터 Rapidcycler로 구매가능한 신속한 온도 싸이클러로 부터 온도제어 프로그램이 변경된다.
사실상, 형광 탐지용 신속 온도 싸이클러(300)의 온도 응답은 도 11a 에서 시간대 온도 차트로 표시된 20-30초 싸이클(10-15분후에 30싸이클)을 허용하는 도 8a-b 의 장치로 수득되는 응답과 유사하다. 2중쇄 특이성 형광 염료가 증폭동안 존재할 경우에 더 많은 2중쇄 생성물이 형성되므로 형광이 증가한다. 특이성 DNA 서열의 동시증폭 및 탐지, Bio/Technology 10:413-417 (Higuchi, R., G. Dollinger, P.S. Walsh, R. Griffith, 1992) 참조.
형광은 온도 싸이클링동안 온도와 교란 효과의 영향을 받으며, 이것은 일정한 신장온도에서 싸이클마다 형광을 고려함으로써 제거된다. 그러나, 신속한 싸이클 증폭동안 200msec마다 온도, 시간 및 형광이 수득된다면 도 12 에 표시된 공간에 3차원 나선이 나타난다. 도 12 에 표시된 3차원 곡선은 도 12 에서 시간대 온도, 시간대 형광, 온도대 형광의 2차원 플롯으로 투영된다. 도 12 의 시간대 온도 투영은 싸이클마다 반복되고 도 11a 와 동일한 정보를 제공한다. 형광은 온도에 대해 반비례하므로 매 싸이클마다 도 12 에 도시된 시간대 온도 투영은 시간대 온도 플롯의 거울 영상이다. 생성물이 축적됨에 따라 2중쇄 생성물의 경우 형광이 모든 온도에서 증가한다. 그러나 변성온도에서 형광은 기준선으로 복귀하는데, 그 이유는 단일쇄 DNA만이 존재하기 때문이다.
도 12 에 도시된 2중쇄 염료의 온도대 형광 투영도는 시간축을 제거하고 DNA 증폭동안 쇄 상태의 온도 종속성을 보여준다. 도 12 에 도시된 온도대 형광 투영도는 헤파티스 B 바이러스 DNA의 180 염기쌍 조각에 대한 것이다.
도 13 에 도시된 온도대 형광 투영도는 인체 β-글로블린 DNA의 536 염기쌍 조각에 대한 것이다. 도 13 에 표시된 초기 싸이클은 동일하게 나타나며 저온에서 형광이 비선형으로 증가한다. 증폭이 진행함에 따라 이후 싸이클은 어닐링 온도와 변성온도 사이에 상승하는 루우프로서 나타나는데 이것은 상당한 히스테리시스를 보여준다. 즉, 가열동안 관찰되는 형광이 냉각동안 형광보다 크다. 샘플이 가열될 때 형광은 변성이 나타날때까지 높다(형광에서 예리한 강하). 샘플이 변성온도로 부터 어닐링 온도로 냉각될 때 2중쇄 신호는 빠르게 증가한다. 형광은 신장동안 계속 증가하며 온도는 일정하게 유지된다.
이중쇄 특이성 염료가 본 발명에 사용될 수도 있다. PCR 생성물의 쇄상태는 dsDNA의 존재하에서 형광하는 염료를 사용하여 알 수 있다. SYBR Green I이 증폭동안 존재할 때 더 많은 dsDNA가 형성됨에 따라 형광이 증가한다. 그러나, 도 26a 및 b 에 도시된 바와 같이 형광은 온도에 반비례하므로 온도 싸이클링은 복잡한 영향을 준다. 생성물이 축적됨에 따라 형광이 도 12c 에 도시된 기준선으로 복귀하는 변성온도를 제외하고는 형광이 증가한다.
다중 샘플이 SYBR Green I에 대해 싸이클마다 모니터링될 때 초기 템플레이트 농도중 107-108 범위가 도 14 에 표시된다. 도 14a 는 도 14 에서 상이한 플롯에 제공된 표시에 대한 부호설명이 제공된다. 데이터는 각 모세관 샘플튜브(320)의 최대형광 비율로 정규화될 때 100개의 초기 복제물이 명백히 10개의 복제물과 분리된다. 그러나, 1개의 복제물과 10개의 복제물간의 차이는 적으며 모세관 샘플튜브(320)마다 0과 1개의 평균 복제물간의 차이는 없다.
이중쇄 염료는 증폭 프라이머에서 고유한 특이성에 의해 좌우된다. 높은 싸이클 횟수에서 비특이성 증폭은 약 백개의 초기 템플레이트 복제물로 탐지 민감성을 제한할 수 있다(도 14). 본 발명에 의한 신속한 싸이클링을 사용하여 증폭 특이성이 더욱 개선되어 전체 DNA 증폭 성능을 향상시킨다.
서열 특이성 프로브를 사용한 정량화는 이중쇄 DNA 염료와 유사한 동적범위를 가지지만 도 15a 및 b 에 도시된 바와 같이 음의 비교부로 부터 단일한 초기 템플레이트 조차 구별하는 것으로 나타난다.
적은 수의 복제물 탐지 및 정량이 필요할 때 신호발생을 위해 교합을 필요로 하는 형광 프로브에 의해서 추가 특이성이 제공될 수 있다. 이중-라벨링된 엑소누클레아제의 절단이 한가지 방법이다(형광 프로브를 사용한 닉-번역 PCR에 의한 대립형질 판별, Nucl. Acids Res. 21:3761-3766, L.G., C.R. Connell, W. Bloch. 1993; 반대 단부에서 형광 염료를 갖는 올리고누클레오타이드를 사용하여 PCR 생성물과 핵산 교합의 탐지에 유용한 퀀칭된 프로브 시스템, PCR Meth. Appl. 4:357-362, Livak, K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, K. Deetz, 1995 참조). 도 25 는 형광제와 로오다민 라벨간에 5개의 염기가 있는 프로브로 부터 나오는 PCR 결과를 보여준다. 45싸이클 증폭이 도 11 의 온도 싸이클러(300)를 사용하여 20분 후에 완결된다. 싸이클마다 한 번 형광비를 모니터링 함으로써 초기 템플레이트 농도의 109배 범위가 구별될 수 있다. 정량곡선은 초기 템플레이트 농도에서 10배 변화에 대해 약 3-4싸이클 이동된다. 이것은 음의 비교 신호로 부터 단일한 템플레이트 복제물을 구별할 수 있다(도 15). 적은 수의 복제물이 증폭될 때 감소된 증폭 효율로 인하여 최종형광신호가 감소될지라도 0과 백개의 복제물간의 정량화가 가능하다. 엑소누클레아제 프로브에 의해 발생된 신호는 축적적이며 간접적으로 생서물 농도에 관련된다. 그러므로 생성물의 양이 평형에 도달한 후에도 형광 신호는 계속 증가한다. 증폭 및 절단 효율의 제어에 대한 표준이 절대적인 정량화에 필요하다.
5'-엑소누클레아제 프로브의 온도대 형광 플롯은 프로브 가수분해가 신호발생 메카니즘임을 확인시켜 준다. 도 16 에서, 2-온도 싸이클링의 온도대 형광 플롯이 β-액틴 엑소누클레아제 프로브에 대해 도시된다. 싸이클마다 형광비는 온도에 따라 선형으로 변하며 히스테리시스는 거의 없다. 프로브 가수분해가 일어날 때 어닐링/신장 단계동안 각 싸이클마다 신호가 증가한다. 형광제와 로오다민의 형광이 온도 증가시 감소할지라도 변화율은 로오다민이 더 커서 온도 증가시 비율이 증가한다. 5'-엑소누클레아제 프로브에서는 온도 종속적 교합 효과가 명백하지 않다.
이에 반하여, 형광 신호가 교합에만 의존할 때 도 17 에 도시된 바와 같이 2-온도 싸이클링동안 온도대 형광비 플롯은 다양한 패턴을 보이며 히스테리시스가 명백하다. 2개의 인접한 교합 프로브, 형광제로 3' 라벨링된 상류 프로브와 Cy5으로 5'라벨링된 하류 프로브가 존재한다. 이 프로브는 1개의 염기쌍만큼 분리된다. 어닐링/신장 단계동안 프로브는 축적생성과 Cy5, 형광제로 교합하여서 형광비가 증가한다. 생성물 변성 온도까지 가열하는 동안 프로브는 65 내지 75℃에서 해리되어서 기준 레벨까지 형광비가 복귀된다. 교합동안 형광비의 변화는 공명에너지 전달로 부터 Cy5 형광의 증가 때문이다. 교합의 온도종속성은 용융곡선의 이동에 의해 돌연변이 탐지에 사용될 수 있다. 도 15b 에 도시된 대로 인접한 교합 프로브는 정량화에 매우 유용하다.
DNA 증폭동안 형광 모니터링은 강력한 분석기술이다. 실시간 모니터링을 제공하는 장치를 사용하여 존재하는 초기 템플레이트 복제물 갯수에 따라서 서열 특이성 탐지 및 정량화가 5 내지 20분후에 달성될 수 있다.
게다가, 도 11-17 에 도시된 시스템과 결과는 형광염료를 사용하여 생물학적 샘플을 연속 모니터링 하는데 특히 적합하다. 예컨대, 정확한 온도조절과 이중쇄 특이성 염료를 사용하여 용융 곡선에 의해 생성물 순도가 추정될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 신속한 온도 제어로 재어닐링 반응에 의해 생성물 절대농도가 측정될 수 있다. 본 발명은 공지기술에서 이용할 수 없는 신속한 온도 변화와 엄격한 샘플내 온도 균일성을 제공한다. 공지 기술에 비해서 본 발명은 높은 부피대 표면적비를 갖는 샘플용기를 하고(예컨대 도 11 의 모세관 샘플튜브(320)를 사용함으로써) 샘플 온도의 신속한 조절을 하는 열전달 매체로서 공기를 사용한다. 예컨대, 본 발명의 샘플 용기에서 샘플을 처리할 때 수득되는 샘플 온도대 시간 플롯은 모든 샘플이 열평형에 도달하는데 수초 걸리는 공지기술의 원추형 플라스틱 튜브에 비해서 변성온도 및 어닐링 온도에서 예리한 스파이크를 보인다(신속한 온도 응답을 보인다). 게다가 본 발명의 샘플용기는 본 발명의 열싸이클 횟수와 열 균일성이 다른 구조를 사용하여 가능한 열 싸이클 횟수와 열 균일성보다 우월하기 때문에 샘플 용기로서 엣칭된 실리콘 또는 유리칩을 사용하는 것보다 개선된 결과를 제공한다.
본 발명을 사용함으로써 지금까지 이해가 적었던 DNA 증폭의 여러 측면이 구별될 수 있다. 예컨대 생성물 변성은 일초이내에 일어나지만 공지 기술에서는 변성에 10초 내지 1분이 걸린다. 본 발명에 따라서 이중쇄 염료를 사용한 실시간 형광 모니터링에 의해 생성물 용융 관찰은 더 짧은 변성시간의 사용이 효과적임을 보여준다. 또다른 예로서 "평형 효과"의 여러 원인이 제안되었지만 이들을 구별하는데 이용가능한 데이타는 적었다. 도 13 에 도시된 바와 같이 생성물 재어닐링은 신속하다. 사실상 증폭의 후반기 싸이클동안 대부분의 생성물은 프라이머 어닐링 온도에 도달하기 이전에 냉각동안 싸이클마다 재어닐링된다. 이것은 본 발명에 의해 5-10℃/초의 냉각속도로 일어난다. 더 느린 공지기술의 온도 싸이클러를 사용한 생성물 재어닐링은 변성온도와 어닐링 온도간의 전이에 더 많은 시간이 필요하므로 훨씬 더 크다. 이러한 바람직하지 않은 효과는 생성물 수율을 제한시키고 당해 분야에 공지된 "평형 효과"의 주원인이다.
게다가, 본 발명은 상업적으로 사용될 수 있으며 신속한 싸이클 증폭동안 형광을 연속 모니터링하는 값싼 기기를 제공한다. 본 발명의 열 싸이클러는 10-20분후에 DNA 증폭을 수행할 수 있으며 본 발명의 광학적 탐지 성분은 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 형광단을 구별한다. 본 발명의 선호되는 구체예는 예컨대 24개의 샘플을 수초에 한 번, 특히 1초에 한 번, 더더욱 매초 10회 모니터링 한다.
열 싸이클링 및 분석을 위해서 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(도 11 에서 300)에 놓이는 모세관 샘플 튜브(320)와 공지의 96웰 장치를 사용하여 샘플을 준비하는 것도 본 발명의 범위내에 있다.
본 발명의 선호되는 구체예는 공정이 진행될 때 DNA 증폭과 같은 생물학적 공정의 실시간 제어 및 최적화를 위해 형광 피이드백을 활용한다. 따라서 탐지되는 형광이 온도 싸이클링 제어에 사용된다. 본 발명의 구체예와 dsDNA-특이성 염료를 사용한 연속 모니터링 기술에 의해서 탐지된 형광이 증가를 중단한 후에 열싸이클마다 신장이 종결된다. 게다가, 본 발명에 따라서 생성물이 완전 용융될때까지 온도를 증가시킴으로써 변성조건이 또한 조절된다. 형광제와 Cy5-라벨링된 올리고누클레오타이드간의 공명에너지 전달을 사용하여 프라이머 어닐링이 탐지된다. 게다가, 본 발명을 사용하여 샘플의 온도 싸이클링이 예정된 양의 생성물 형성후 자동으로 종료된다.
본 발명에 따라서 본 발명의 장치를 사용하여 최소의 어닐링 및 변성시간으로 신속한 온도 싸이클링을 하면 PCR 정량을 개선하며 대립유전자 특이성 증폭의 식별성을 증가시킨다. 서열화를 위한 신속한 싸이클링은 서열 모호성을 감소시키고 디누클레오타이드 반복 증폭에 있어서 "섀도우 밴딩"을 최소화 한다. 본 발명에 따라서 최대 35kb까지의 긴 PCR동안 샘플이 높은 변성온도에 가능한 적게 노출될 때 수율이 향상된다.
PCR을 세가지 반응, 즉 3가지 상이한 온도에서 일어나는 변성, 어닐링, 신장(도 18a)으로 취급하는 PCR에 대한 기존의 접근방법에 비해서 본 발명은 PCR동안 동적 패러다임을 개선시킨다. PCR동안 동적 패러다임을 사용하여(도 18b) 온도대 시간 곡선은 중첩 반응간의 연속 전이로 구성된다. 본 발명의 방법 및 장치는 동적 패러다임 하에서 PCR 수행에 특히 효과적이다. 도 18c 는 55℃의 어닐링 온도 근처에서 상이한 시간/온도 프로파일을 보여주는 그래프이다. 도 18c 에서 고체 트레이스는 10㎕ 샘플에 대한 응답온도를 나타내는 중앙에 위치된 "스파이크"를 보여준다. 대조적으로 도 18c 에서 길고 짧은 세그멘트로 도시된 트레이스는 열블럭 기기를 사용하여 수득된 샘플의 온도 응답을 나타낸다. 도 18c 에서 본 발명의 구체예는 당해분야의 공지기술에 따른 온도 "평형"에 비해서 어닐링 세그멘트 "스파이크"를 발생한다.
이전의 탐지용 기기는 수많은 결함을 가진다. 5 내지 10배 더 느린 공지 기기에 비해서 본 발명의 시스템에서는 신속하고 정확한 온도 싸이클링이 제공된다. 본 발명의 시스템에 의해 제공되는 연속 형광 모니터링을 사용하여 교합의 온도 의존성이 추구될 수 있다. 온도 싸이클링 동안 교합을 추적함으로써 필요한 프로브 갯수나 스펙트럼 색상이 최소화 될 수 있다. 즉, 탐지될 각 DNA 종에 대해 상이한 형광단 라벨링된 프로브를 합성하기 보다는 동적 용융 특성에 의해 상이한 생성물과 돌연변이가 탐지될 수 있다.
가장 경제적으로 본 발명의 구체예를 제공하기 위해서 샘플 조사를 위해 크세논 아아크원이나 레이저 대신에 고밀도 발광 다이오드가 사용되어 포토다이오드가 탐지에 사용된다. 샘플은 열밀봉을 요하지 않는 96-웰 포맷으로 복합 유리/플라스틱 샘플용기나 유리 모세관 샘플튜브에 충진된다(도 21a-d). 따라서 본 발명은 저렴한 비용으로 실시간 형광 분석을 제공한다. 온도 싸이클링의 실시간 형광 제어는 증폭 품질을 개선한다. 예컨대, 샘플온도가 변성이 일어날 때 까지만 증가된다면 고온에 대한 샘플의 노출이 최소화 된다. 이것은 생성 및 효소 분해를 최소화 시킴으로써 수율을 증가시키고 높은 용융온도를 갖는 생성물의 증폭을 제한함으로써 특이성을 증가시킨다.
도 19 는 단일 샘플의 연속 모니터링을 위한 본 발명의 구체예를 다이아그램으로 도시한다. 그러나, 도 19 및 20 에 도시된 구조는 도 11 에 도시된 장치와 같은 다중샘플을 자동 처리하는 시스템에 포함될 수 있다. 도 19 의 구체예에서 단일 샘플 홀더(402)가 온도조절된 공기흐름과 선형 광학경로의 교점에 위치된 유지 브라켓(404)에 놓인다. 샘플 홀더(402)는 바람직한 특성을 가지는 튜브(402A)를 포함한다. 본 발명에 따라서 상이한 구성의 모세관 튜브가 사용될 수 있으며 튜브(402A)는 특히 직사각형 단면을 가진다. 생물학적 샘플은 튜브(402A)의 바닥 단부(402B)에 유지된다. 캡(402)이 샘플 홀더(402)상에 또한 제공된다.
도 19a-e 는 샘플용기의 상이한 구성이 샘플의 온도응답에 미치는 효과를 비교한다. 도 19e 에 도시된 온도-시간은 도 19a-c 에 도시된 샘플용기를 사용하여 수득되는 응답에 대응한다. 도 19a-d 에 도시된 샘플용기 구성에 대한 추가 정보는 다음과 같다.
도 19 의 장치에서, 활성화 복사원(418), 특히 LED, 더더욱 청색 LED가 샘플홀더(402)를 조사하도록 제공된다. 활성화 복사원(418)에 의해 방출된 빛은 비구면 촛점 렌즈(420) 및 활성화 대역 필터(422)를 통과하여 샘플 홀더(420)상에서 촛점이 잡힌다.
도 19 에 도시된 광학성분은 특히 광학 하우징(412)에 유지된다. 하우징(406) 역시 제공된다. 공기 덕트(414)를 통해 샘플 브라켓(404)에 유지된 샘플 홀더(402)위로 공기를 이동시키도록 팬(408)이 제공된다. 온도유닛(410)이 공기 흐름 경로에 위치되어서 샘플 홀더(404)위로 공기가 통과하는 동안 가열 또는 냉각을 시킨다. 노즐(416)은 공기를 샘플홀더(404)위로 효과적으로 안내한다.
샘플에 의해 방출된 빛은 두 개이상의 비구면렌즈(420)와 방출대역 필터(424)를 통과하고 포토 다이오드와 같은 광탐지기(426)에 의해 수신된다.
도 19f 와 19g 는 직사각형 모세관 튜브(403A)를 활용하는 샘플 용기(403)의 측부 및 단면도면이다. 모세관 튜브(403A)는 Vitro Dynamics Inc.에 의해 구매가능하다(1㎜×3㎜×5㎜). 제 1 캡 부재(403B) 및 제 2 캡부재(403C)는 스크루(403D)에 의해 연결되며 스크루(403D)는 모세관 튜브(403A) 홀더로서도 기능을 한다.
도 19h 와 19i 는 속에 담긴 샘플의 형광을 탐지할 때 직사각형 모세관 튜브(403A)의 두가지 가능한 방향을 보여준다. 도 19h 는 모서리가 활성화 및 탐지 광학장치의 축과 일직선이 되도록 배향된 직사각형 모세관 튜브(403A)를 보여준다("엣지 활성화 및 탐지"). 도 19i 는 면이 활성화 및 탐지 광학장치의 축과 일직선이 되도록 배향된 직사각형 모세관 튜브(403A)를 보여준다("페이스 활성화 및 탐지"). 놀랍게도 도 19h 에 도시된 엣지 탐지 방향으로 부터 수득된 형광신호는 도 19i 에 도시된 페이스 탐지 방향으로 부터 수득된 신호보다 3 내지 5배 더 높다. 도 19h 에 도시된 엣지 탐지 방향을 사용하여 수득되는 바람직한 특성은 형광신호를 모세관 튜브(403A)의 극단에 집중시키는 모세관 튜브(403A)에서 발생하는 총 내부반사 때문이다.
도 20 은 본 발명에 따른 또다른 광학 성분을 보여준다. 도 20 에 도시된 광학성분은 도 21 에 도시된 열 싸이클링 및 샘플 취급 구조물에 포함된다.
도 20 및 도 21 의 구체예에서는 광학적 활성화 및 탐지경로가 선형경로 보다는 에피플루오레센트 경도로서 조합된다. 도 20 및 21 에서 활성화 및 방출에너지는 활성화 경로에 사용된 2색 요소와 모세관 튜브사이에서 동일한 광학 경로를 따른다. 활성화 및 방출 세기를 둘다 증가시키기 위해서 이용되는 모세관 튜브의 길이를 따른 총 내부반사("광파이핑") 때문에 도 20 및 21 의 구체예에 사용되도록 모세관 튜브가 개조된다.
도 20 및 21 의 구체예에서, 최대 광 파이핑을 수용하기 위해서 광학적 축은 모세관 튜브의 길이에 평행하며 모세관 튜브의 팁은 촛점에 위치된다. 샘플의 굴절계수가 1.33이다면 방출된 빛의 12.3%가 팁으로 안내된다. 샘플을 모세관 튜브의 팁으로 이동시키는데 원심력이 사용될 수 있다.
도 22a 는 모세관 튜브의 팁에서 형광을 탐지할 때 광파이핑 효과를 보여주는 것으로 모세관 샘플 용기의 측부(개방원)보다 팁(폐쇄다이아몬드)을 관찰할 때 신호세기가 10배 증가한다. 도 22b 에 표시된 바와 같이 두가지 상이한 크기의 모세관 샘플 튜브를 사용하며 SYBR Green I으로 염색된 dsDNA로 상이한 길이만큼 충진된 튜브를 사용하여 수득된 결과가 도시된다. 도 22a 및 22b 로 부터 더 많은 샘플이 튜브에 첨가될 때 형광 효율을 감소하지만 관찰된 에피플루오레센스는 증가한다.
모세관에서 나오는 방출의 광학적 성질이 형광제 용액으로 채워진 모세관에서 나오는 형광을 470㎚에서 자극함으로써 검사된다. 모세관의 단부로 부터 나오는 방출은 방출이 미소한 파장의 형광의 결과일 경우에 기대되는 유리에 집중되기 보다는 모세관 페이스를 가로질러 균질적이다.
도 20 에 나타난 광학적 성분은 모세관 튜브의 평행 에피플루오레센트 조사를 수행한다. 도 20 에서 활성화 복사원(468)은 LEDtronics로 부터 구매가능하며 매우 밝은 LED로서 공지되는 청색 LED이다. 방출된 형광신호는 광 탐지기(466A, 466B)에 의해 인식된다. 활성화 복사원(468)과 광 탐지기(466A, 466B)는 필요한 회로를 포함하며 필터를 광탐지기(466A, 466B)와 집적시키는 장착보오드(468)상에 유지된다. 선호되는 장착 보오드는 Ealing Electronics로 부터 구매가능하며 TO5 패키지에 고성능 실리콘 포토다이오드와 0.5인치 간섭필터를 포함하는 것이다. 활성화 및 탐지성분은 관련 전자소자와 함께 장착 보오드(468)에 직접 유지된다. 광학 성분의 직경은 1.0인치 이하가 선호된다. 조준렌즈(454), 두 개의 2색 필터(456A, 456B), 거울(458), 간섭필터(460A-C) 및 비구면 촛점 렌즈(462A-C)가 복사광을 샘플로 인도한다.
도 20 에서 분석 수행시 단지 2가지 색상/파장을 사용했을지라도 3가지 이상의 색상분석이 가능하다. 3가지 이상의 색상분석을 제공하기 위해서 도 20 에 도시된 장치는 추가 2색 필터와 광 탐지기를 수용할 수 있다. 게다가, 다색 습득을 위해 선형 광 탐지기 배열상에 파장을 동시 분리할 수 있다. 선형 광 탐지기 배열이 본 발명에 사용될 때 프리즘 또는 회절격자가 다중파장 탐지를 위해 렌즈 및 광탐지기 배열 또는 CCD와 함께 활용되는 것이 좋다. 당해 산업에서 이용가능한 한가지 선형 광 탐지기 배열은 500 내지 800㎚ 사이에서 15-30개의 10-20㎚ 파장 빈을 수집한다. 대개의 단색측정계에 사용된 격자를 위해 Littrow 자체조준 구성과 같은 다양한 광학 성분 구성이 수집효율, 스펙트럼 분해 및 공간 조건을 최상으로 조절할 수 있다. 도 20 의 장치는 도 21 의 자동 열 순환장치에 포함된다.
도 21 은 신속한 온도 싸이클링 성분, 샘플취급 성분, 및 도 20 에 도시된 광학적 성분을 포함하는 본 발명의 또다른 구체예의 개략도로서 샘플용기의 팁에서 형광 탐지를 제공한다(에피플루오레센스). 도 21 에 도시된 에피플루오레센스 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)는 특별한 장점을 제공한다.
도 21 에 도시된 구체예에서 공기는 구멍(470)을 통해 유입되고 라인(472)으로 표시된 흐름 경로를 따른다. 공기의 온도와 플라스틱/유리 샘플용기(450)의 온도는 Reheat, Inc.으로 부터 구매가능한 400와트 가열 카트리지(474)를 사용하여 조절된다. 가열 카트리지(474)는 중앙 덕트(476)내에 위치된다. 표시된 경로(472)로 공기를 이동시키기 위해서 팬(498)이 제공된다. 팬은 샤프트(496) 및 모터(494)를 경유하여 구동된다. 모터(494)는 Excap AG.로 부터 구매가능하며 최대 15,000의 rpm을 가지는 DC 회토류 브러쉬 모터이다. 플라스틱/유리 샘플튜브(450)를 가열할 때 가열 카트리지가 비례적으로 조절되고 팬이 저속(12볼트, 0.5암페어)으로 작동되어서 모든 플라스틱/유리 샘플 용기(450)에 온도 균질성을 제공한다. 플라스틱/유리 샘플 용기(450)를 냉각할 때 가열 카트리지(474)가 작동중지되고 모터(494)가 고속으로(27볼트, 1.4암페어를 적용하여 최대속도가 획득된다) 작동된다. 팬(498)은 구멍(470)으로 공기를 유입시키고 배출포트(471)를 경유하여 배출시킨다.
에피플루오레센스 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)에서 24개의 플라스틱/유리 샘플 용기(450)(도 21 에 두 개가 도시된)가 가열 카트리지(474)와 중앙 덕트(476) 주위에 대칭적으로 배열된다. 플라스틱/유리 샘플 용기(450)는 원형 카루셀(480)에 각 플라스틱/유리 샘플용기(450)의 위치를 정확히 조절하는 (오프셋 구조로 인하여) 슬리이브(451)에 의해 수용된다. 슬리이브(451)는 황동으로 제조된다. 유리/플라스틱 샘플용기(450)의 팁이 도 21 에 도시된 광학적 촛점에 있도록 측부 및 종방향으로 정확히 조절되고 동시에 에피플루오레센스 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)가 조립되도록 슬리이브(451)의 오프-축 구조물은 슬리이브(451)가 정렬되게 한다.
카루셀(480)은 하우징(490) 위로 베어링(482)상에 지탱된다. 카루셀(480)은 샤프트(486)를 통해 모터(488)에 연결된 구동 기어(474)가 제공된 스테핑 모터(488)에 의해 위치선정된다. 스테핑 모터(488)는 New England Affiliated Technologies로 부터 구매가능한 제어기를 사용하여 마이크로 스테핑되어서 카루셀(480) 회전당 10,000 스텝 이상을 제공하여서 각 플라스틱/유리 샘플 용기(450)의 정확한 위치르 선정시킨다. 하우징(490)의 내부에는 절연재료가 제공된다. 배플(476)은 배출포트(471)를 형성하고 주변 빛을 차단하는 작용을 한다.
도 21a-d 는 플라스틱/유리 샘플용기(450)의 세부도면이다. 플라스틱/유리 샘플 용기(450)는 한 단부가 폐쇄된 모세관 튜브 부위(450B)를 포함한다. 모세관 튜브 부위(450B)는 다양한 모양을 가질 수 있다. 그러나 샘플 온도 균일성과 신속한 온도 싸이클링을 위해서 플라스틱/유리 샘플 용기(450)에 의해 유지되는 유체의 부피는 1밀리미터 이상이지 않는 것이 좋다. 예컨대, 모세관 튜브부위(450B)를 제조하는 재료는 식(cal.㎝/㎠s.℃)×100에 따라서 20 내지 35의 열전도성을 가지는 것이 좋다. 게다가, 다양한 유리의 열전도성에 관한 추가정보는 R.C. Weast & M.J. Astle, HANDBOOK OF CHEMISTRY AND PHYSICS, page E-6 (1982) (CRC Press)로부터 획득된다. 플라스틱/유리 샘플 용기(450)에는 적절한 플라스틱으로 제조되며 모세관 튜브 부위(450b)의 개방단부에 연결된 저장원 부위(450c)가 제공된다. 다양한 재료가 저장원 부위(450c) 제조에 사용될 수 있지만 플라스틱 재료가 퍼넬형으로 형성되어 모세관 튜브 부위(450B)에 부착되는 것이 선호된다.
샘플(S)은 피펫(P) 또는 적당한 기구를 사용하여 수동 또는 자동으로 복합 플라스틱/유리 샘플 용기(450)에 충진된다. 샘플의 부피는 0.01 내지 10,000㎕, 특히 0.01 내지 100㎕, 더더욱 0.01 내지 10㎕이며 5㎕가 가장 선호된다. 샘플이 각 플라스틱/유리 샘플용기(450)에 첨가되면 플라스틱/유리 샘플 용기(450)가 저속으로 원심력을 받아서 샘플을 모세관 부위(450B) 폐쇄 단부의 팁에 위치시켜서 도 21b 에 도시된 것처럼 샘플이 0.2-2.0㎝의 유체 칼럼(450A)을 형성한다. 플라스틱 플러그로 구성될 수 있는 스토퍼(450D)가 이후에 저장원 부위(450C)에 놓여서 도 21C 에 도시된 것처럼 플라스틱/유리 샘플 용기(450)를 밀봉시키고 플라스틱/유리 샘플 용기(450)가 에피플루오레센스 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)에서 슬리이브(451)에 놓인다. 모세관 튜브 부위(450B)를 밀봉하기 위해서 상이한 구조를 제공할 수 있다.
유리/플라스틱 샘플 용기(450)의 모세관 튜브 부위(450B)는 0.8㎜ 내경과 1.0㎜ 외경을 가지며 한 단부가 폐쇄되며 플라스틱 저장원(450C)을 수용하기 위해서 다른 단부가 벌어진 유리 모세관 튜브이다. 유리/플라스틱 샘플 용기(450)는 용이하고 경제적으로 제조될 수 있다. 모세관 튜브 부위(450B)의 팁(450E)의 모양은 광학적 효율을 위해 최적화 된다. 평평한 팁 뿐만 아니라 다양한 외부곡률 및 내부 곡률을 갖는 팁이 본 발명에서 사용될 수 있다.
도 21a-d 에서 모세관 튜브에 플라스틱 충진 및 밀봉 구조물의 첨가는 바람직한 열적 특성을 유지하면서 유리 모세관 튜브의 효과적인 사용을 가능하게 한다. 샘플을 플라스틱/유리 샘플용기(450)에 첨가하고 96-웰 포맷으로 샘플이 원심력을 받게 할 수 있다. 게다가, 플라스틱/유리 샘플 용기를 에피플루오레센스 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)에 적재하고 플라스틱/유리 샘플 용기(450)를 96-웰 포맷 또는 다른 포맷으로 적재할 수 있다.
복합 플라스틱/유리 샘플용기(450)는 편리하고 값싼 샘플홀더를 제공한다. 도 21 에서 매초 1 내지 10회 단일 샘플로 부터 형광이 획득된다. 다중 샘플로 부터 형광을 획득할 때 카루셀(480)을 빠르게 회전시켜서 샘플이 제위치에 이동될 필요가 있다. 스테핑 모터(488)와 제어장치를 사용하여 24개의 샘플이 도 21 에 도시된 모니터링 위치에 빠르고 정확하게 이동될 수 있다.
각 샘플에서 나오는 형광 신호가 100msec동안 획득될 때 신호분산은 1% 미만이다. 신호획득시간을 감소시키고 변화속도를 증가시키고 반복된 샘플링으로 부터 분산계수를 관찰하는 것도 본 발명의 범위내에 있다. 24개의 샘플이 처리되고 초당 1 내지 10회전의 속도로 중단없이 카루셀이 회전될 때 각 샘플은 0.37-3.7msec의 활성화 및 탐지시간을 가진다.
기술된 정보를 사용하여 당해분야 숙련자는 형광신호가 소프트웨어나 하드웨어를 통해 적분되는지를 선택할 수 있다. 선호되는 구체예에서, 피크 탐지 및 적분을 위해 하위 프로그램을 갖는 LabView (National Instrument)와 같은 그래픽 프로그래밍 언어가 신속한 온도 싸이클러(400)와 관련하여 사용된다. 또다른 구체예에서, 신호가 아날로그 디지탈 전환에 최적인 수준에 도달하도록 가변적 적분시간(사용자 조절가능한 민감도 제어)으로 하드웨어에서 적분이 행해진다.
도 21 에 도시된 신속한 온도 싸이클러(400)를 사용하여 반응이 진행될 때 샘플의 연속 모니터링을 어닐링, 신장 및 변성의 연속 관찰에 기초하여 증폭동안 온도 싸이클링의 조건을 결정할 수 있게 한다. 이것은 모든 싸이클링 매개변수가 증폭 시작 이전에 결정되고 프로그램되는 공지기술과 대비된다. 공지 기술에 따르면 최저 용융 프라이머와 등가인 상보적 올리고누클레오타이드를 사용하여 초기 싸이클동안에 어닐링 효율이 조절된다. 많은 경우에 충분한 생성물이 형성되는 나중 싸이클동안 신장 및 변성이 dsDNA 염료를 써서 모니터링 될 수 있다. 이러한 조건은 변성 및 신장 조건이 대개의 생성물을 증폭하는데 충분하며 제 1 증폭에서 나오는 데이타가 후속 시행의 최적화에 사용될 수 있기 때문에 일반적으로 문제가 아니다.
도 21 에서, 도 11 의 구체예와 관련하여 기술된 정보를 사용하여 사용자 인터페이스 및 제어부(500)가 제조될 수 있다. 사용자 인터페이스 및 기기 제어부(500)의 선호되는 일례로서 12비트 다기능 입/출력 카드(National Instruments)로 LabView 프로그래밍 언어를 실행하는 펜티엄 마이크로컴퓨터가 데이타 습득 및 제어를 제공한다. 아날로그 출력신호가 광 탐지기(466A, 466B)와 관련된 증폭기를 조절하는데 사용된다. 아날로그 입력 채널은 열전쌍을 통한 샘플온도 측정과 포토다이오드에 의한 형광을 측정한다. 도 21 에 도시된 사용자 인터페이스 및 기기 제어부(500)는 또한 활성화 복사원(468) 스테핑 모터(488)의 방향, 가열 카트리지(474), 및 팬(498)의 디지탈 I/O 제어를 한다.
dsDNA 염료 SYBR Green I 또는 형광 라벨링된 올리고 누클레오타이드 프로브를 함유하는 PCR 샘플의 연속 형광 모니터링이 각 증폭 싸이클동안 교합 및 용융을 모니터링 하는데 사용될 수 있다. 이 정보는 사용자 인터페이스 및 기기 제어부(500)의 배열에 의해 사용되어서 열 싸이클링 조건을 개선시킬 수 있다. 온도 싸이클링 동안 교합 정보를 사용하는 장점은 다음과 같다:
(A) 높은 변성온도에 노출을 최소화함으로써 증폭 생성물 및 폴리메라제에 대한 열유도손상을 방지하며, 의도된 증폭생성물보다 높은 Tm을 갖는 생성물을 가려내는 변성온도를 최소화함으로써 반응특이성을 증가시키면서 각 싸이클동안 PCR생성물의 완전 변성이 일어나게 하며;
(B) 생성물 신장 완료에 필요한 시간보다 짧게 함으로써 증폭에 필요한 시간을 최소화하고, 의도된 증폭 생성물보다 긴 생성물을 가려냄으로써 반응특이성을 증가시키면서 각 싸이클에 생성물 신장에 적절한 시간을 보장함으로써 증폭 효율을 최대화하고;
(C) 생성물 신장 완료에 필요한 시간보다 짧게 함으로써 증폭에 필요한 시간을 최소화하고, 생성물 신장 완료에 할당된 시간보다 짧은 시간이 필요로 하는 의도된 증폭 생성물보다 긴 생성물을 가려냄으로써 반응 특이성을 증가시키면서 각 싸이클에 생성물 신장에 적절한 시간을 보장함으로써 증폭 효율을 최대화하며;
(D) 수득되는 형광의 수준이나 증폭의 효율에 종속적인 열싸이클링 변화를 초기화하며, 예컨대 과증폭 및 비특이성 반응 생성물은 효율이 일정수준으로 떨어질 때 열싸이클링을 종료함으로써 최소화되고, 형광이 탐지가능해질 때 용융곡선 습득을 위해 더 느린 온도기울기를 일으키도록 온도사이클링이 변조되어서 더 느린 기울기를 이전 싸이클에서 사용될 필요가 없기 때문에 시간을 절감하며;
(E) 과증폭이 비특이성 반응 생성물의 배경을 증가시키기 이전에 PCR 생성물에 대한 과증폭 손상을 최소화 하거나 용융 곡선 습득의 최기화 단계.
본 발명에 따라서 사용자 인터페이스 및 기기 제어부(500)는 사전 프로그램된 시간/온도 설정점을 따르거나 탐지된 형광값을 수득하고 이후에 수득된 형광값을 사용하여 실시간으로 하나이상의 반응매개변수를 조절하여 수득된 결과를 최적화할 수 있다. "반응매개변수"는 반응 조절의 기초로 사용되는 매개변수이다. 이러한 반응 매개변수는 변성온도 및 시간, 프라이머 어닐링온도 및 시간, 프로브 어닐링온도 및 시간, 효소 신장 온도 및 시간, 및 싸이클 횟수를 포함한다. 일반적으로 반응의 제어는 형광데이타로부터 수득되는 반응매개변수에 기초한다. 최초의 형광 데이터는 시간에 따라 형광변화(변성, 어닐링 및 신장의 온도 특이성 속도), 온도에 따른 형광변화(생성물 또는 프로브 Tm), 또는 증폭정도의 변화(증폭수율 및 효율)로서 수득된다. 이들 속도, Tm, 및 이들의 1 차 및 2 차 도함수가 변성온도 및 시간, 프라이머 어닐링온도 및 시간, 프로브 어닐링 온도 및 시간, 효소 신장온도 및 시간, 및 싸이클 횟수와 같은 최적화된 반응 매개변수 결정에 사용된다.
도 22 의 블록에 도시된 바와 같이 사용자 인터페이스 및 기기 제어부(500)(IBM 호환 컴퓨터일 수 있음)에 의해 수행된 업무(도 22c에서 블록 500A-500E)와 형광탐지를 하는 온도 싸이클러(400)의 나머지 성분에 의해 수행된 업무(블럭 500A, 500G-500S)로 업무가 분할된다. 도 22c 의 블록 다이아그램은 단지 예시적인 것이며 많은 변형이 가능하다.
도 22c 에 도시된 배열의 장점으로서 생성물 용융 제어가 설명된다. 용융 피크 형광값이 의도된 PCR 생성물에 대해 수득되며 생성물이 완전 용융되는 온도에서 기준선 형광이 반응혼합물 함유 샘플에 대해 수득된다. 반응의 각 싸이클은 형광값을 타겟으로 사용한다. 이 실시예에서 기술된 방법은 별도의 PCR 컴퓨터에 형광값을 보내는 조건을 수용할 타임래그를 제공하기 위해서 두 단계를 사용한다. 각 생성물 용융 단계에서 형광이 중간값에 도달할때까지 온도가 증가되고 이후에 가열 장치에 공급되는 전력이 감소되어서 초당 3℃의 온도 기울기가 부과되어 PC 컴퓨터가 형광을 분석해서 생성물 변성이 일어난 다른 성분에 전달할 적절한 시간을 가지게 된다. 결과의 시간/온도 플롯은 도 22d에 도시된다. 도 22d 는 증폭생성물의 농도가 증가함에따라 20싸이클후 용융곡선에서 증가를 보여준다. 이것은 생성물 Tm이 생성물 농도의 함수이기 때문이다.
도 22c 에 도시된 또다른 장점으로 생성물 어닐링/신장이 설명된다. 조합된 어닐링/신장온도에서 지연된 유지동안 샘플의 형광이 모니터링되고 이러한 정보는 적절한 시간이 생성물 신장에 허용되도록 사용된다. 형광이 10초 간격으로 모니터링되고 형광이 사전 설정된 비(1.00 내지 1.05)보다 증가했다면 어닐링/신장 단계가 계속된다. 그렇지 않다면 다음 생성물 용융단계가 개시된다. 조합된 어닐링/신장 온도에서 최소 20초를 부여하도록 10초의 간격이 선택된다.
도 22c 에 도시된 배열의 또다른 장점으로서 증폭 평형이 설명된다. 각 어닐링/신장단계의 끝무렵에 형광값이 수득되어 저장된다. 이 값이 최저 종말-싸이클 형광값의 1.2배만큼 증가하고 사용자 설정가능한 비율(1.00-1.02) 아래로 증가를 중단하면 열싸이클이 종결된다. 혹은, 생성물 Tm까지 0.1 내지 0.2℃/초 온도 기울기에 들어가고 샘플 형광을 연속 모니터링 함으로써 용융곡선 평가단계가 개시된다. 도 22d 에 도시된 형광/온도 플롯은 25 증폭싸이클이후에 싸이클별 형광성장비가 1.00 미만으로 떨어지고 반응이 종료됨을 보여준다. 이 방법은 각 샘플에 대해 고해상도의 용융곡선을 수득하는데 사용될 수 있다. 샘플이 증폭 평형에 도달할 때 이 샘플에 대해 용융곡선이 수득되고 또다른 반응이 증폭평형에 도달할때 까지 정규적인 온도 싸이클링이 재개될 수 있다.
도 22e 는 형광 교합 모니터링에 유용한 온도대 시간 세그멘트이다. 생성물 용융곡선은 변성온도까지 느린 온도 증가동안 수득된다. 일정 온도로 변성후 온도를 빠르게 낮춤으로써 생성물, 프로브 또는 프라이머 어닐링이 탐지될 수 있다. 프로브 용융곡선은 프로브 Tm 온도까지 느리게 가열함으로써 수득된다. 당해분야 숙련자는 도 21 에 도시된 시스템을 활용하여 기술될 하드웨어와 소프트웨어를 사용하여 생성물, 프로브 및 프라이머의 특성에 대해서 여태까지는 이용할 수 없었던 정보를 제공하도록 온도 싸이클링동안 실시간으로 필요한 분석을 할 수 있을 것이다.
생성물의 절대 정량화가 본 발명에 따라 수행된다. 이중쇄 DNA 형성의 연속 모니터링은 재어닐링 반응에 의해 직접적이고 절대적인 DNA 정량을 허용한다. 샘플온도는 변성온도로 부터 신속하게 떨어지고 프라이머 어닐링을 방지하기에 충분한 더 낮은 온도로 일정하게 유지된다. 생성물 재어닐링 속도는 2차 반응을 따른다. 상이한 농도의 DNA가 테스트될 때 재어닐링 곡선의 모양은 DNA 농도의 특성이다(도 26). 주어진 PCR 생성물 및 온도에서 2차 속도 상수가 측정될 수 있다. 속도상수가 알려지면 미지의 DNA 농도가 재어닐링 실험 데이타로 부터 결정될 수 있다. 곡선은 LabView 프로그램 환경을 사용하여 온도 싸이클링동안 실시간으로 비선형 최소자등 회귀분석될 수 있다. 냉각은 순간적이지 않으며 일정온도 도달전에 일부 재어닐링이 일어나지만 회귀분석은 이를 허용한다. 이 기술은 순수한 PCR 생성물을 필요로 하지만 온도 싸이클링동안 수득되는 용융곡선에 의해 검증될 수 있다. 재어닐링 반응에 의한 정량화는 신호 레벨에 무관하며 샘플 부피 차이의 영향을 받지 않는다.
도 28 은 도 21 의 구체예에 포함된 다양한 구조를 포함하는 본 발명의 또다른 구체예이다. 도 21 과 도 28 에 도시된 성분의 차이가 설명된다. 도 27a 및 27b 는 도 28 에 도시된 구체예를 각각 실행모드와 충진모드에서 단면도로 보여준다.
도 28 의 구체예는 샘플용기의 팁에서 형광을 탐지하는 신속한 온도 싸이클러(502)이며 샘플용기의 자동위치선정으로 샘플로 부터 수득되는 형광 신호를 개선한다. 도 29 는 도 28 에 도시된 성분을 포함하는 본 발명의 구체예의 외부의 사시도이다.
도 28 및 29 에 도시된 바와 같이 착탈식 원형 샘플 트레이(483)는 32개의 샘플을 유지한다. 착탈식 원형 샘플 트레이(483)는 모터(488)에 의해 구동되는 카루셀(481)에 맞물리도록 온도 싸이클러(502)에 놓인다. 카루셀(481)이 회전할 때 카루셀(481)을 정확히 위치선정하는데 위치 선정기가 사용되어서 샘플이 형광계 어셈블리(459) 위에 정확히 위치된다. 형광계 어셈블리(459)는 LED 소스(459A), 3개의 포토다이오드(459B), 촛점렌즈(459C) 및 필터 어셈블리(459D)를 포함한다. 형광계 어셈블리(459)는 도 20 에 도시된 구조 및 기능과 유사하다.
형광계는 측부 스테핑 모터(491)에 의해 이동되는 슬라이딩 베어링(493)상에 장착된다. 카루셀(481)이 회전하면 복합 플라스틱/유리 샘플용기(450)는 카루셀 방향으로 형광계 어셈블리(459)위에 정확히 위치되며 측부 스테핑 모터(491)가 형광계 어셈블리(459)의 위치를 조정하는 동안 위치선정기(495)를 통해 위치가 기록되고 2차원으로 조절된다. 따라서, 온도 싸이클러(502)는 착탈식 샘플 트레이(483)를 사용하여 복수의 샘플을 장치에 위치시키며 샘플에서 나오는 형광신호 탐지가 개선된다.
도 30a-v 에 도 28 및 29 에 도시된 온도 싸이클러(502)의 전기 성분의 선호되는 구성이 도시된다. 다이아그램을 명료하게 하기 위해서 당해 산업에서 통용되는 명명이 표시된다.
도 28, 19, 30A-V 의 성분과 관련하여 사용된 프로그래밍 코드가 프로그래밍 코드 부록 B에 포함된다.
본 발명에 따라서 적은 부피의 샘플용기에 액체 샘플, 특히 방출된 형광의 탐지에 의해 분석된 샘플을 충진하기 위해서 취급 시스템이 제공된다. 샘플용기는 1㎖ 미만의 부피를 가지며 튜브(즉, 모세관 튜브) 형태나 "평평한 모세관" 형태일 수 있으며, 이것은 모세관 공간이 가장자리를 따라 밀봉된 두 개의 간격이 떨어진 플레이트나 쉬이트에 의해 한정된다. 샘플용기는 약 1㎜, 특히 0.5㎜ 미만의 외부 표면적에 대한 부피비를 가진다. 1㎜ 미만의 내경을 가지는 모세관 튜브는 0.25㎜ 미만의 표면적에 대한 부피비를 가진다. 본 발명에 따라 사용된 용기는 광학적으로 투명한 재료로 형성된다. 선호되는 재료는 400 내지 800㎚의 파장을 가지는 빛에 대해서 광학적으로 투명하다. 이러한 재료의 사용은 용기에 의해 유지되는 액체 샘플에서 발생된 형광 신호의 탐지를 허용한다. 게다가, 형광 샘플로 부터 형광을 분석하기 위해서 낮은 표면적에 대한 부피비를 갖는 용기의 사용은 증가된 총내부반사로 인하여 더욱 효율적인 형광탐지를 가능하게 한다.
부피에 대한 높은 표면적비(또는 표면적에 대해 낮은 부피비)를 갖는 용기는 액체 샘플을 충진하기가 곤란하다. 본 발명의 샘플취급시스템은 이러한 곤란을 극복할 수 있게 한다. 한 구체예에 따르면 높은 부피에 대한 표면적비와 개방 단부를 가지는 용기에는 용기에 액체 샘플의 충진을 수월하게 하도록 용기의 개방단부에 끼워지는 퍼넬캡이 제공된다. 퍼넬캡은 용기의 개방단부와 퍼넬캡의 샘플 전달 포트가 일직선이 되도록 용기상에 퍼넬캡을 착탈식으로 고정하는 수단, 제 1 샘플 수용 포트 및 제 2 샘플 전달 포트를 포함한다. 한 구체예에서 퍼넬캡은 플라스틱 또는 고무로 구성되며 샘플전달포트의 내경이 개방단부에 근접하여 용기의 외경에 마찰식으로 맞물리도록 형성된다. 그러나, 퍼넬캡을 용기에 연결하는 다른 수단도 가능하다. 그 예로는 접착제, 클램프, 죔쇠등이 있다. 한 구체예에서 샘플 취급 시스템은 퍼넬캡의 샘플수용 포트와 마찰식 밀봉 맞물림을 하는 플러그를 포함한다. 그러나 퍼넬 입구를 효과적으로 밀폐하여 충진된 샘플의 증발 또는 오염을 방지하는 장치나 재료가 본 발명에 사용될 수도 있다.
본 발명의 용기는 형광단을 포함한 샘플에서 형광의 습득 효율 및 탐지를 개선하는 방법에 사용될 수 있다. 이 방법은 광학적으로 투명한 재료로 구성되며 제 1 및 제 2 차원을 갖는 부피를 한정하는 벽을 가지는 용기에 샘플을 위치시키는 단계를 포함한다. 제 1 차원은 제 2 차원보다 작으며 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비는 1㎜ 미만이다. 샘플에서 발생된 형광의 습득효율 및 탐지의 개선은 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 형광을 탐지함으로써 달성된다. 한 구체예에서, 샘플 형광은 샘플의 형광단 활성화 조사에 의해 유도되며, 샘플은 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 조사받는다. 선호된 구체예에서 형광 습득의 최적의 효율은 형광탐지축을 따라 샘플을 형광단 - 활성화 조사시켜 달성되며 형광은 최저의 표면적을 갖는 용기벽을 통해 축을 따라, 특히 용기 하부를 통한 축을 따라 탐지된다.
한 구체예에서, 생물학적 샘플의 형광은 온도 종속적이다. 예컨대, 용기는 핵산 서열을 포함하는 샘플을 포함할 수 있으며 형광체는 이중쇄 특이성 염료일 수 있다. 샘플의 온도가 변성온도까지 상승할 때 형광세기는 감소한다. 혹은 형광체가 타겟 핵산서열의 인접 지역에 교합하는 한쌍의 올리고누클레오타이드 프로브일 수 있으며, 이 경우 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 형광 에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링된다. 이 구체예에서 용기와 샘플은 형광 에너지 전달쌍중 적어도 하나의 형광을 모니터링 하는 동안 가열될 수 있다.
용기는 폴리메라제 연쇄반응에 의해 타겟 핵산서열의 증폭과 같이 샘플의 열 싸이클링을 필요로 하는 절차에서 사용될 수 있는 모세관 튜브나 평평한 모세관이다. 모세관 용기는 형광 탐지에 사용되는 장치나 열싸이클링에 사용되는 장치의 샘플 홀더에 삽입되도록 형성된다. 장치의 샘플 홀더는 단일 샘플을 유지할 수 있거나 복수의 샘플용기를 유지하는 카루셀 형태일 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 카루셀이 도 31a 및 b 에 도시된다. 카루셀(1)은 상부표면(3), 하부표면(4) 및 이들 사이에 연장된 외부 가장자리(5)를 가지는 디스크(2) 형태이다. 디스크(2)는 상부표면(3)에 복수의 방사상 정렬된 샘플 수용 포트(6A, 6B, 6C), 외부가장자리(5)에 샘플용기포트(7) 및 샘플수용포트(6A, 6B, 6C)와 각 샘플 용기 포트(7)와 통하는 샘플 통로(8)를 가진다. 카루셀(1)이 고정된 샘플용기(9)와 함께 도시된다. 샘플 용기 포트(7)와 샘플통로(8)는 샘플용기(9)를 수용하여 디스크(2)에 고정하도록 형성된다. 한 구체예에서 샘플용기(9)가 카루셀(1)에 착탈식으로 고정되어서 샘플 제거를 하고 또다른 샘플 용기로 대체하여서 카루셀(1)의 다중 사용을 허용한다. 또다른 구체예에서 샘플용기(9)는 디스크에 영구 고정하거나 디스크(2)의 일체 성분으로서 형성된다. 한 구체예에서 샘플용기(9)는 샘플용기(9)와 상기 용기포트(7)에 근접한 샘플통로(8)의 적어도 일부 사이에 마찰식 접촉에 의해 디스크(2)에 고정된다. 샘플용기와 통하며 샘플용기를 고정하는 공지수단이 사용될 수 있다. 예컨대 상보적인 스크루 나사가 샘플통로(8)의 표면과 샘플용기(9)의 외면에 형성될 수 있다. 추가로 샘플용기(9)를 디스크(2)에 고정하기 위해서 접착제 또는 다른 고정수단이 사용될 수 있다. 본 발명의 카루셀의 하부 및 상부표면은 서로의 위에 다중 카루셀 스택이 형성되어서 한 스택의 다중 카루셀이 모터 드라이브 샤프트와 착탈식으로 맞물리고 도 32 에 도시된 바와 같이 동시에 회전될 수 있다.
도 32 에 도시된 구체예는 카루셀(1)을 유지하고 회전시키는 스테핑 모터(504)와 구동 샤프트(506)를 포함한다. 챔버팬(508)은 화살표(512)로 표시된 공기 흐름을 발생시키는데 사용된다. 가열장치(510)는 샘플용기(9)를 통과하는 공기를 가열한다. 형광계 어셈블리(514)는 LED 소스(514A), 포토다이오드(514B), 촛점 렌즈(514C), 및 필터 어셈블리(514D)를 포함한다. 형광계 스테핑 모터(516)는 형광계 어셈블리(514)를 화살표(518) 방향으로 이동시킨다.
또다른 구체예에서 카루셀은 상부표면, 하부표면, 상부표면에 있는 샘플수용포트, 하부표면에 있는 샘플용기포트, 및 상기 샘플수용포트 및 샘플용기포트와 통하는 샘플통로를 가지는 디스크를 포함한다. 샘플용기포트와 샘플통로는 샘플용기를 수용하여 디스크에 고정하도록 형성된다. 샘플용기는 디스크의 하부 표면에 대해 방사상 연장하는 예각으로 유지된다.
한 구체예에서, 디스크의 샘플통로는 디스크의 상부 및 하부 표면에 평행한 중심축을 가지는 제 1 부위와 디스크의 상부 및 하부 표면과 예각을 형성하는 중심축을 가지는 제 2 부위를 포함한다. 이 구체예에서 샘플용기포트와 샘플통로는 샘플용기를 수용하여 샘플용기가 디스크의 하부표면에 대해 예각으로 디스크로 부터 연장되도록 샘플용기를 디스크에 고정된다.
카루셀(1)에는 샘플수용포트(6A, 6B, 6C)를 폐쇄하는 수단이 제공된다. 폐쇄수단은 샘플수용포트(6)에 끼워져서 샘플통로의 인접벽에 마찰식으로 맞물리는 플러그, 또는 샘플 수용포트의 구멍을 효과적으로 밀폐하여 충진된 샘플의 증발 또는 오염을 방지하기 위해 상부표면에 적용되는 접착제 테이프일 수 있다. 카루셀(1)은 회전을 위해 구동 샤프트와 착탈식으로 맞물린다. 마찰식 맞물림 또는 스크루, 볼트, 잠금핀 또는 클램프를 사용할 수도 있다. 한 구체예에서 디스크(2)는 구동 샤프트(도 32 에서 (506)) 수용을 위해 형성된 중앙구멍을 갖는 링으로 형성된다. 구동 샤프트의 단부에는 디스크(2)를 제자리에 위치시키는 구조물이 제공된다.
본 발명의 카루셀(1)은 액체샘플을 샘플용기(9)에 전달하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서 샘플용기(9)는 도입된 샘플의 하나이상의 성분과 작용하는 예정된 혼합물(예컨대, 시약 혼합물)을 함유한 모세관 용기이다. 한 구체예에 따르면 예정된 혼합물은 모세관 샘플용기를 샘플용기 포트에 위치시키기 이전에 샘플용기에 첨가된다. 혹은, 샘플용기가 예정된 혼합물로 사전 포장된다. 예정된 혼합물은 샘플과 반응하여 탐지가능한 신호를 발생하거나 유도 생성물을 생성하는 시약을 포함할 수 있다.
카루셀(1)의 샘플통로(8)에는 액체 샘플상에 편향력이 없으면 샘플수용포트(6A, 6B, 6C)를 통해 전달된 액체샘플이 샘플용기포트(7)로 흐르는 것을 방지하는 장벽이 제공된다. "장벽"은 샘플 수용포트로 전달된 액체샘플이 샘플용기포트에 자유롭게 흐르는 것을 방지하는 구조물이다. 본 발명의 카루셀의 샘플 통로에 사용하는 장벽은 샘플통로에 형성된 오목부 또는 우물, 샘플통로의 표면으로 부터 연장된 돌출부 또는 환형 림, 방향밸브 또는 폐쇄위치로 편향된 플랩을 포함한다.
장벽은 액체 샘플이 샘플통로에 존재하며 장벽에 의해 차단된 액체샘플에 대해 편향력을 적용함으로써 장벽을 극복할 수 있도록 형성된다. 샘플상에 편향력 적용은 카루셀 회전에 의해 발생된 구심력에 의해 제공된다. 그러므로, 상부표면에 다중 샘플수용포트(6A, 6B, 6C)를 가지는 카루셀에서 샘플이 다양한 샘플수용 포트에 첨가되고 장벽은 액체샘플을 국지화하며 샘플이 샘플용기 포트에 흐르는 것을 방지한다. 모든 샘플이 각 수용 포트에 전달된 이후에 카루셀이 회전되어 샘플은 각 샘플 용기 포트와 부착된 샘플용기에 전달된다.
한 구체예에서, 카루셀의 각 샘플통로는 단일샘플용기포트 및 복수의 샘플수용포트와 통한다. 이 구체예에서 샘플통로는 다중 샘플 수용포트와 통하도록 분지를 형성하는 중심통로를 포함하거나 도 31a 및 b 에 도시된 대로 다중 샘플 수용포트(6A, 6B, 6C)가 디스크 중심으로 부터 방사상 연장되는 공통축을 따라 정렬되며, 상기 각 포트는 샘플용기포트에 수용된 샘플용기와 한 통로를 통해서 통한다. 샘플통로에는 액체샘플상에 편향력이 없을 경우 복수의 샘플 수용포트중 하나에 첨가된 샘플이 샘플용기포트에 흐르는 것을 방지하는 하나이상의 장벽(9A)이 제공될 수 있다. 게다가, 각 샘플 통로에는 장벽위로 샘플을 전달하는데 상이한 편향력을 필요로 하는 다중장벽이 제공될 수 있다. 이 구체예에 따르면 각 샘플 수용포트에 샘플을 전달한 이후에 각 샘플이 카루셀 회전속도 조절에 의해서 샘플용기포트 및 샘플용기에 선택적으로 전달될 수 있다.
예컨대, 제 1 샘플이 제 1 샘플수용포트에 전달되고 제 2 샘플이 제 2 샘플수용포트에 전달되고, 제 1 및 제 2 샘플수용포트는 공통 통로와 통하며 제 1 및 제 2 샘플수용포트에는 제 1 및 제 2 샘플의 흐름을 막는 장벽이 제공된다. 장벽은 하나이상의 샘플수용포트를 통해 샘플 통로에 사전 충진된 시약, 촉매, 효소, 오일 등의 예정된 양이 있는 키트의 일부로서 디스크가 제공될 수 있게 한다.
한 구체예에서 제 2 샘플수용포트의 장벽은 제 1 샘플수용 포트에 전달된 샘플이 관련 장벽을 통과하는데 필요한 편향력보다 큰 편향력이 제 2 샘플수용 포트에 전달된 샘플의 관련 장벽을 통과하도록 적용되도록 형성된다.
이 구체예에서, 제 1 속도로 카루셀의 회전은 제 1 샘플을 샘플 용기포트와 샘플용기에 전달하지만 제 2 샘플은 샘플용기포트와 샘플용기에 흐르는 것이 방지된다. 증가된 제 2 속도로 회전은 제 2 샘플상에 구심력을 증가시켜서 제 2 샘플이 샘플 용기포트와 샘플용기에 전달되게 한다. 이러한 원리에 기초하여 다양한 샘플이 공통통로와 통하는 다중샘플용기 포트에 전달되어서 모든 샘플이 충진된 이후에 각 샘플이 카루셀의 회전속도 조절에 의해 한 번에 하나씩 또는 동시에 샘플용기포트 및 샘플용기에 전달될 수 있다. 한 구체예에서 형광단을 포함하는 제 1 샘플이 제 1 샘플 용기 포트에 첨가되고 오일을 함유한 제 2 샘플이 제 2 용기 포트에 전달된다. 카루셀이 회전되어서 제 1 샘플을 샘플용기에 전달하고 이후에 오일이 전달된다. 오일(또는 제 1 샘플을 샘플 용기내에 효과적으로 밀폐시키는 다른 액체)는 제 1 샘플의 증발을 감소시키고 제 1 샘플의 오염가능성을 감소시킨다.
한 실시예에서, 다중 샘플 카루셀이 다중샘플을 동시에 취급하는데 사용된다. 카루셀은 디스크 구조물의 상부표면에 다중샘플수용포트를 가지며 디스크에 부착된 샘플용기와 유체가 통하는 디스크형 구조물이다. 샘플수용포트에 첨가된 샘플은 카루셀 회전에 의해 해당 샘플용기에 전달된다. 카루셀은 각 샘플용기와 통하는 다중 샘플 수용포트를 가진다. 제 1 샘플 수용포트에 첨가된 또다른 샘플을 갖는 용기에 전달하기 위해 사용자에 의해 샘플용기와 통하는 제 2 샘플수용포트에 시약이 첨가되거나 예정된 시약이 제작자에 의해 제 2 샘플수용포트에 수용될 수 있다. 즉, 카루셀, 샘플용기 및 예정된 시약이 사전포장된 형태이다. 샘플과 함께 시약이 카루셀의 회전에 의해 샘플용기에 전달된다. 수성샘플 보호용 오일은 샘플용기(및 제 1 및 제 2 샘플 수용 포트)와 액체가 통하는 제 3 샘플 수용 포트에 첨가되거나 오일이 제작자에 의해 카루셀에 첨가될 수 있다.
혹은, 샘플, 시약 및 샘플보호용 오일이 단일한 샘플수용포트에 전달될 수 있다. 카루셀은 제 2 또는 후속 샘플 또는 다른 조성물이 샘플수용포트에 전달되기 이전에 각 조성물 또는 샘플을 각 용기에 전달하도록 회전될 수 있다.
본 발명의 선호되는 샘플용기 카루셀은 공통 샘플용기와 유체가 통하며 방사상으로 정렬된 3개의 샘플수용 포트를 포함한다. 이 구체예에서 1 내지 5㎕의 오일, 특히 염색된 블랙이 사전포장된 형태로 존재하거나 방사상으로 가장 안쪽의 샘플 수용 포트에 전달된다. 오일은 미네랄 오일과 Znica Inc.(Wilminton, DE)으로부터 구매가능한 Waxoline Blak OBP와 같은 0.01 내지 1% 유기 블랙 염료를 포함한다. 1 내지 9㎕의 시약 마스터 혼합물이 사전 포장된 형태로 존재하거나 방사상 최외곽 샘플수용포트에 전달된다. 시약 마스터 혼합물은 필요한 반응 성분의 일부 또는 전부를 포함한다. 테스트될 템플레이트 핵산을 포함한 액체샘플이 방사상 중간 샘플 수용 포트에 수동 또는 자동으로 전달된다. 이후에 샘플을 시약 구획에 전달하지만 혼합물을 샘플용기에 전달하기에는 불충분한 속도로 디스크가 회전된다. 샘플과 시약은 디스크 회전속도의 신속한 변화에 의해 혼합될 수 있다. 이후에 샘플과 시약혼합물(오일은 아님)을 샘플용기로 이동시키는 고속으로 디스크가 회전된다. 이후에 샘플에 오일을 전달하기 위해서 더 높은 회전속도로 디스크가 회전된다. 오일은 낮은 밀도로 인하여 수성 샘플을 보호하며 염료 함량 때문에 빛의 통과를 차단한다. 카루셀 회전속도 변화에 의한 오일, 시약 및 샘플의 선택적 전달이 다음의 조합에 의해 달성된다: 1) 유체가 통하는 통로의 직경변화; 2) 유체가 통하는 통로에 존재하는 물리적 장벽의 직경변화; 3) 디스크 중심으로 부터 각 샘플 수용포트의 반경에 대한 구심력의 종속성 사용.
본 발명의 카루셀은 카루셀을 회전시키는 구동 샤프트 및 모터(도 32 에서 506, 504)와 착탈식으로 맞물릴 수 있다. 게다가, 본 발명의 각 카루셀은 서로의 위에 쌓여져서 동시 회전을 위해 구동 샤프트와 맞물린다(도 32). 본 발명의 또다른 측면에 따르면 샘플용기내에 유지된 샘플의 형광을 모니터링하는 장치가 제공된다(도 32, 514). 샘플 용기는 광학적으로 투명한 재료를 포함하고 제 1 차원이 제 2 차원보다 적고 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비가 1㎜ 미만이도록 제 1 및 제 2 차원을 갖는 부피를 한정하는 벽을 가진다. 한 구체예에서 장치는 챔버 샘플용기홀더, 상기 챔버에 장착되며 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 샘플을 조사하도록 위치된 발광원, 및 상기 챔버에 장착되며 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 샘플용기로 부터 나오는 형광을 탐지하도록 위치된 광탐지기를 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서 발광원과 광탐지기는 상승 및 하강될 수 있는 (도 32 에서 화살표(518)로 표시된) 플랫포옴상에 장착된다. 이 구체예에서 발광원과 광탐지기는 각 카루셀이 서로의 위에 축적되어 동시 회전을 위해 구동 샤프트와 맞물릴 때 다중 카루셀의 샘플 용기로 부터 나오는 형광을 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 측정하도록 위치될 수 있다(도 32).
한 구체예에서, 샘플용기 홀더는 복수의 모세관 튜브를 유지하는 카루셀을 포함하며 카루셀은 상기 챔버에 회전가능하게 장착된다. 발광원은 튜브 하부를 통해 모세관 튜브를 조사하도록 위치되며 광탐지기는 모세관 튜브 하부를 통해 형광을 탐지하도록 장착된다. 추가로 장치에는 상기 카루셀을 회전시키는 스테핑 모터와 카루셀을 모터에 연결하는 수단이 제공된다.
형광 탐지 장치의 챔버에는 챔버와 공기가 통하게 장치에 장착된 히터(도 32, 510) 및 팬(도 32, 508), 예정된 시간 및 온도 매개변수를 사용하여 챔버온도를 신속히 순환시키기 위한 제어기가 제공된다. 이 장치는 카루셀에 의해 유지된 샘플용기에서 폴리메라제 연쇄반응을 수행할 수 있다. 특히, 이 장치는 반응의 진행이 실시간으로 모니터링될 수 있기 때문에 PCR반응 수행방법을 개선하며 반응동안 온도 및 시간 매개변수의 조절이 가능하여 증폭된 타겟 핵산서열의 수율 및 순도를 최적화할 수 있다.
게다가, 본 발명에 따라서 타겟 서열의 인접지역에 교합하는 두 개의 핵산 프로브의 유효량을 생물학적 샘플에 첨가하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 타겟 핵산서열 증폭을 개선하는 방법이 제공되며, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 형광에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링되어서 두 프로브가 타겟 서열과 교합할 때 도너 및 받게 형광단이 0-15 누클레오타이드, 특히 서로의 1-5 누 클레오타이드내에 있고, 폴리메라제 연쇄반응을 사용하여 타겟 핵산서열을 증폭하고, 폴리메라제 연쇄반응동안 상기 도너 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛으로 샘플을 조사하여 상기 샘플에서 나오는 형광을 측정하는 단계를 포함하며, 형광 단계에서 발생된 데이타에 따라서 온도 및 시간 매개변수를 조절하는 단계를 포함한다.
따라서 본 발명에 따라서 PCR반응 수행에 개선된 장치가 제공된다. 이 장치는 챔버, 상기 챔버와 공기가 통하게 장착된 히터 및 팬, 복수의 샘플용기를 유지하는 카루셀을 포함한다. 이 장치와 관련하여 사용되는 샘플용기는 광학적으로 투명한 재료를 포함하며 제 1 차원이 제 2 차원보다 크고 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비가 1㎜ 미만이도록 제 1 및 제 2 차원을 가지는 부피를 한정하는 벽을 가진다. 카루셀은 챔버에 회전가능하게 장착된다. 장치는 또한 상기 챔버에 장착되며 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 샘플용기를 조사하는 발광원과 상기 챔버에 장착되며 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 샘플용기에서 나오는 형광을 측정하는 광탐지기를 포함한다. 게다가 장치에는 상기 카루셀에 의해 유지된 모세관 튜브를 위치시켜서 조사 및 형광 탐지를 하도록 카루셀을 회전시키는 스테핑 모터가 설비된다. 실시간 PCR 반응 모니터링과 탐지된 형광에 따른 반응매개변수 결정으로 반응을 최적화하도록 반응조건을 조절할 수 있다. 선호되는 구체예에서 반응의 상태를 나타내는 하나이상의 값이 시각적으로 인식가능한 방식으로 실시간으로 표시된다.
본 발명의 카루셀은 액체샘플을 모세관 샘플용기에 전달하는데 사용된다. 카루셀은 상부표면, 하부표면, 이들 사이에 연장된 외부 가장자리, 상부표면에 있는 샘플수용포트, 외부가장자리에 있는 샘플 용기포트, 및 샘플수용포트와 샘플용기 포트와 통하는 샘플 통로를 가지는 디스크를 포함한다. 샘플용기포트와 샘플통로는 샘플용기를 수용하여 디스크에 고정하도록 형성된다. 액체샘플을 모세관 샘플용기에 전달하기 위해 카루셀을 사용하는 방법은 액체샘플을 수용하고 샘플용기를 유지하는 카루셀 선택단계, 액체샘플을 카루셀의 샘플수용포트에 전달하는 단계, 샘플용기를 샘플용기포트에 위치시키는 단계, 카루셀을 회전시켜 샘플을 모세관 샘플용기에 전달하는 단계를 포함한다.
본 발명은 샘플에서 타겟 핵산 서열의 존재를 탐지하는 시스템에도 관계한다. 이 시스템은 타겟 핵산 서열의 인접지역에 교합하는 한쌍의 올리고누클레오타이드 프로브를 포함하며, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 형광 에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링된다. 도너 형광단 방출과 받게 형광단 흡수는 25% 미만 중첩하며 받게 형광단은 10,000M-1㎝-1 이상의 피크 흡광계수를 가지며 두 프로브가 타겟 서열과 교합할 때 도너 및 받게 형광단은 서로의 15 누클레오타이드내에 있다. 또다른 구체예에서, 도너 형광단 방출과 받게 형광단 흡수는 20% 미만 중첩하고 두 프로브와 타겟 서열의 교합시 도너 및 받게 형광단은 서로의 5 누클레오타이드, 특히 3 누클레오타이드내에 있다.
본 발명은 예정된 온도대 시간 프로파일에 따라서 또는 실시간으로 하나 이상의 반응 매개변수를 조절하고 생물학적 샘플의 온도를 신속 정확하게 변화시키고 생물학적 샘플이 정확하게 열 싸이클링을 받게 하는 장치를 제공한다. 본 발명은 또한 매우 짧은 기간에 걸쳐 큰 온도 구배로 샘플이 열순환을 받게 하는 낮은 열량의 열전달 매체를 사용한 열 싸이클링 장치를 제공하며 다양한 생물학적 샘플이 신속한 열 싸이클링을 받게 하는 장치를 제공한다.
게다가, 본 발명은 열전달 매체로서 공기를 사용하여 생물학적 샘플이 신속한 열 싸이클링을 받게 하는 장치를 제공하며 PCR을 빠르게 수행하며 반응을 동시에 모니터링하는 방법 및 시스템을 제공한다. 또한 본 발명은 PCR을 수행하여 반응이 진행중일 때 반응은 연속 모니터링하여 반응이 진행중일 때 반응 매개변수를 조절하는 시스템 및 방법을 제공한다.
신속한 열 싸이클링을 하는 온-라인 DNA 분석 시스템에 관한 정보는 미국특허 출원 08/381,703 (1995, 1, 31 출원)에 발견된다.

Claims (32)

  1. 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.;
    PCR 샘플을 유지하는 복수개의 모세관, 여기서 각 모세관은 광학적으로 투명한 재료로 구성되며, 각 모세관은 1ml 미만의 샘플을 유지함;
    증폭시키는 동안 차례로 하나씩 PCR 샘플을 모니터링 위치에 순차적으로 이동시키는 회전 가능한 카루셀;
    아래를 포함하는 열 싸이클링 수단:
    모든 PCR 동시에 샘플을 가열하는 수단인 공기 히터;
    모든 PCR 샘플을 동시에 냉각하는 수단; 그리고
    열 싸이클링 수단을 반복적으로 작동시켜서 PCR 샘플이 열싸이클링을 받도록 하는 제어수단;
    샘플이 형광을 방출하게 하는 샘플을 광학적으로 활성화 시키는 수단; 그리고
    샘플이 모니터링 위치에 있을 때 활성화된 샘플의 형광을 탐지하는 수단.
  2. 제 1항에 있어서,
    탐지된 형광에 따라서 반응 매개변수를 결정하는 수단; 그리고
    반응 매개변수에 따라서 제어수단을 조절하는 수단을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  3. 제 2 항에 있어서, 제어수단이 반응 매개변수에 따라서 가열 수단 및 냉각 수단의 작동 시간을 변경하기 위해 가열 수단 및 냉각 수단의 작동을 조절하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  4. 제 2 항에 있어서, 제어수단이 반응 매개변수에 따라서 생물학적 샘플의 가열 및 냉각되는 속도를 변경하기 위해서 가열수단과 냉각수단의 작동을 조절하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 모세관은 일부가 유리로 제조되는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링하기 위한 장치.
  6. 제 1 항에 있어서, 광학적으로 활성화된 샘플을 위치시키는 수단 및 활성화된 샘플의 형광을 탐지하는 수단을 더욱 포함하여서 탐지되는 형광을 최적화시킴을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  7. 제 1 항에 있어서, 냉각 수단이 주변공기를 모세관에 전달하는 공기이동 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  8. 제 1 항에 있어서, 제어수단이 마이크로프로세서를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  9. 제 1 항에 있어서, 샘플을 광학적으로 활성화시키는 수단이 방출된 형광이 활성화된 샘플을 보유하는 모세관의 측부에 입사하도록 위치된 광방출기 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  10. 제 9 항에 있어서, 활성화된 샘플의 형광을 탐지하는 수단이 활성화된 샘플의 모세관의 측부로부터 방출된 형광이 탐지되도록 위치된 광 탐지기 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  11. 제 1 항에 있어서, 샘플을 광학적으로 활성화시키는 수단이 방출된 형광이 활성화된 샘플의 모세관의 단부에 입사하도록 위치된 광 방출기 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  12. 제 11 항에 있어서, 활성화된 샘플의 형광을 탐지하는 수단이 활성화된 샘플의 모세관의 단부로부터 방출된 형광이 탐지되도록 위치되는 광 탐지기 구조를 포항하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  13. 제 2항에 있어서, 탐지된 형광에 따라서 반응 매개변수를 결정하는 수단이 생성물 용융온도, 생성물 용융시간, 생성물 재어닐링 온도, 생성물 재어닐링 시간, 프로브 용융온도, 프로브 용융시간, 프라이머 어닐링/신장 온도 또는 프라이머 어닐링/신장시간으로 구성된 그룹에서 선택된 반응매개변수를 결정하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  14. 제 1 항에 있어서, 제어수단이 활성화된 샘플의 형광 탐지수단이 생성물이 완전히 용융되었다고 탐지할 때 샘플을 냉각하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  15. 제 1 항에 있어서, 제어수단이 활성화된 샘플의 형광 탐지수단이 더 이상 생성물 생성이 없다고 탐지할 때 샘플을 가열하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  16. 제 1항에 있어서, 생물학적 반응을 확인하기 위한 모니터링 수단; 그리고 카루셀의 작동을 제어하는 제어 수단, 열 싸이클링 수단 그리고 열 싸이클링이 발생함에 따라 생물학적 반응의 진행을 탐지하는 모니터링 수단을 포함하며,
    여기서 샘플을 광학적으로 활성화 시키는 수단은
    활성화 형광을 방출하는 활성화 소스; 그리고
    모니터링 위치에 위치된 샘플이 형광을 방출하도록 활성화 형광을 모니터링 위치로 안내하는 수단을 포함하며, 그리고
    활성화된 샘플의 형광을 탐지하는 수단은
    방출된 형광을 전기적 신호로 전환시키는 수단;
    전기적 신호를 반응 매개 변수로 처리하는 수단;
    반응 매개 변수를 표시하는 수단; 그리고
    반응 매개변수를 기록하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  17. 제 16항에 있어서, 반응 매개변수가 변성온도 및 시간, 프라이머 어닐링 온도 및 시간, 프로브 어닐링온도 및 시간, 효소신장온도 및 시간, 또는 싸이클 횟수에서 선택됨을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  18. 제 16항에 있어서,
    활성화 소스가 크세논 램프 또는 발광 다이오드에서 선택되는 광방출 소스를 포함하고;
    방출된 형광을 전기적 신호로 전환시키는 수단이 광-배증관 또는 포토다이오드에서 선택되는 광 탐지 장치를 포함하고; 그리고
    전기적 신호를 반응매개변수로 처리하는 수단이 마이크로프로세서를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  19. 제 18항에 있어서, 방출된 형광을 전기적 신호로 전환시키는 수단이 광 배증관 또는 포토 다이오드에서 선택되는 제 1 광 탐지장치와 제 2 광탐지장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링 동안 실시간으로 반응을 모니터링 하기 위한 장치.
  20. 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
    (a) 각 모세관에서 핵산 증폭이 일어나는, 복수의 생물학적 샘플을 유지하는 회전하는 카루셀을 제공하고;
    (b) 모든 모세관을 동시에 뜨거운 공기로 가열하여 생물학적 샘플이 제 1 온도로부터 제 2 온도로 제 1온도 전이를 겪게 하며;
    (c) 모든 모세관을 동시에 냉각하여 생물학적 샘플이 제 2 온도로부터 제 1온도로 제 2온도 전이를 겪게 하며;
    (d) 샘플로부터 형광이 방출되도록 온도전이동안 생물학적 샘플을 활성화시키고;
    (e) 증폭되는 동안 카루셀을 회전시켜 순차적으로 샘플을 하나씩 모니터링 위치로 이동시키고; 그리고
    (f) 각 모세관이 반응 매개변수를 결정하기 위하여 모니터링 위치에 있을 때 샘플로부터 방출되는 형광을 탐지하는 단계.
  21. 제 20 항에 있어서, 단계 (f)가 제 1 온도 전이동안 일어나며, 생성물 용융온도 결정단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 단계 (f)가 제 1 온도 전이동안 일어나며, 프로브 용융온도 결정단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
  23. 제 20 항에 있어서, 단계 (b)가 생물학적 샘플의 온도를 초당 2.5℃ 이상의 속도로 증가시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
  24. 제 20 항에 있어서, 단계 (b)가 생물학적 샘플의 온도를 10초에 40℃ 이상 증가시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
  25. 제 20 항에 있어서, 단계 (f)가 제 1 온도 전이 동안 일어나며, 활성화된 샘플에서 방출된 형광을 온도 전이동안 두 번 이상 탐지하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
  26. 제 20항에 있어서, 단계 (b)가 활성화된 샘플에서 생성물이 완전 용응될 때까지 생물학적 샘플의 온도를 증가시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
  27. 제 20항에 있어서, 활성화된 생물학적 샘플은 제 1 파장에서 핵산 증폭의 진행과 관련된 형광을 방출하는 물질을 포함하며 ;
    제 1 온도로부터 제 2 온도로의 온도 전이가 제 1 범위로 지정되며;
    단계 (f)는 샘플의 온도가 제 1 범위 내에 있을 때 활성화된 생물학적 샘플에 의해 방출된 형광을 복수 횟수로 탐지하는 단계를 더욱 포함하고;
    아래의 단계들을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.:
    (g) 모든 샘플의 온도를 제 2 온도, 그리고 제 2 온도와 상이한 제 3 온도를 포함하는 제 2 범위로 조절하고;
    (h) 샘플의 온도가 제 2 범위 내에 있을 때 활성화된 생물학적 샘플에 의해 방출된 형광을 복수횟수로 탐지하는 단계.
  28. 제 20 항에 있어서, 아래의 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
    (i) 단계 (d) 또는 단계 (h)에서 탐지된 형광에 따라서 증폭반응의 매개변수를 조절하는 단계.
  29. 제 20 항에 있어서, 단계 (b)가 생성물용융이 완료될 때 샘플의 온도를 제 1 범위에서 조절하는 것을 중단하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
  30. 제 20 항에 있어서 , 단계(g)가 프라이머 어닐링이 완료될 때 샘플의 온도를 제 2 범위에서 조절하는 것을 중단하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
  31. 제 20 항에 있어서, 아래의 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.:
    (j) 모든 샘플의 온도를 제 3 범위에서 조절하고 생성물축적이 유효 수준에 도달할 때 샘플의 온도를 제 3 범위에서 조절하는 것을 중단하는 단계
  32. 제 20 항에 있어서, 단계 (f) 및 (h)가 400 내지 800nm의 범위에서 활성화된 생물학적 샘플에서 방출된 형광을 탐지하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭의 진행을 모니터링 하는 핵산 증폭 방법.
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